CN101270148A - 一步层析法制备高纯度紫菜藻红蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一步层析法制备高纯度紫菜藻红蛋白方法，属于海洋生物功能成分制备技术。紫菜经50倍体积的PBS(1mM，pH6.8)缓冲液溶胀，捣碎，再用800瓦超声波进行细胞破碎800秒，得到粗提物，用饱和度45％硫酸铵沉淀，再经0.1um膜微滤、10kDa膜超滤及饱和度20％的硫酸铵反相沉淀，在4℃用饱和度65％的硫酸铵沉淀结晶，一周后，过DEAE cellulose－52阴离子交换层析柱，用不同浓度NaCl的PBS(1mM，pH6.8)缓冲液梯度洗脱，分离纯化得到紫菜藻红蛋白。纯度(A562nm/A280nm)达到5.24，符合试剂级要求。

Description

一步层析法制备高纯度紫菜藻红蛋白
一、技术领域
本发明一步层析法制备高纯度的紫菜藻红蛋白，属于海洋生物功能成分制备技术，用于研制开发医药保健品和功能食品的基料。
二、背景技术
藻胆蛋白是藻类藻胆体中的捕光色素蛋白，能把捕获的光能高效的传递给叶绿素，从而使海藻的光合作用得以发生。藻胆蛋白主要包括藻蓝蛋白(Phycocyanin)、藻红蛋白(Phycoerythrim)和别藻蓝蛋白(Allphycocyanin)三类，其中藻蓝蛋白(PC)和藻红蛋白(PE)在藻体中的含量较为丰富。藻胆蛋白在藻类中的含量可以达到细胞干重的28％以上。
藻胆蛋白是一种非常重要的光动力药物的原料，特有的光敏效应可辅助激光治癌，在病灶部位富集，吸收光后高效产生自由基和活泼态氧，从而实现对肿瘤细胞的杀伤。有光毒性而没有暗毒性，在人体内代谢快。藻胆蛋白还具有抗氧化清除自由基和提高免疫力的功效。其制作的免疫荧光标记抗体，检测灵敏度远远高于传统的荧光标记物，可用于特殊分子定位和重要分子检测，包括SARS病毒的免疫分子检测，能准确地诊断肿瘤、确定病变部位和病情轻重程度等。藻胆蛋白可作为功能因子用于保健食品和功能食品及特殊饲料，同时还是理想的天然色素，可大量用于食品工业和化妆品工业等，无毒副作用，是安全的添加剂。
目前我国对藻类开发利用的力度和深度还很小，大部分仅限于简单的食用，出口产品也只限于粗制品，还未应用高科技进行深层次的加工和利用。而藻类的一些高科技深加工产品则主要依靠进口，作为药物使用价格十分昂贵。目前藻胆蛋白的生产基本由美国Sigma公司的垄断，国内有以红毛菜、紫球藻和螺旋藻作为原料提取藻胆蛋白的报导，但仍处于研究阶段，未有成品进入市场销售。
我国海域宽广，藻类资源十分丰富，是世界上最大的紫菜生产大国，我国养殖和加工又主要集中在江苏沿海，其产量占全国的95％以上。江苏省如东县条斑紫菜生产量占全国总量的50％。紫菜的市场价格是红毛菜的1/10，小球藻和螺旋藻的1/3。紫菜中藻红蛋白含量很高，如条斑紫菜所含粗蛋白质约40％，其中藻胆蛋白约占4％，其藻胆蛋白绝大部分为藻红蛋白。选用紫菜提取藻红蛋白，具有成本低，得率高的优点，极具研究价值。
藻红蛋白往往经提取与纯化后，作为高附加值的深加工产品用于食品、化妆品、医药保健和检测试剂等领域，不同的应用领域对纯度有不同的要求。藻红蛋白的纯度通常以纯度值(或纯度系数)表示，即其在可见光区的最大吸收值与280nm吸光值的比值。要用作分子探针和光敏剂，其纯度要求大于4.0。
关于藻红蛋白的提取纯化方面，虽然方法各异，有的工艺简单，但蛋白纯度极低，有的工艺过于复杂，成本高且易使蛋白变性，还有些在提取过程中，要添加食用稳定剂、糖类、无机盐类、pH调节剂等，一般只能制得药品级(A562nm/A280nm＞2)的藻红蛋白，很难达到试剂级(A562nm/A280nm＞4)。
近年来，国内外在藻红蛋白的提取与纯化方面作了大量研究，技术工艺因所选的材料和研究目的的不同而异。目前用于藻红蛋白提取分离过程中细胞破碎的方法有反复冻融法、化学试剂处理法、溶胀法、组织捣碎和超声波法。反复冻融法虽然操作简单但耗时，化学试剂处理容易使藻红蛋白变性，溶胀法提取得率低且耗时。由于藻红蛋白是胞内蛋白质，细胞破碎程度越高，藻红蛋白的得率也越高，采用组织捣碎和超声细胞破碎辅助提取藻红蛋白，不仅提取得率高，还节省了很多时间。藻红蛋白的粗提液中含有很多杂蛋白，通常先用饱和度为20％的硫酸铵除杂蛋白后用饱和度为45％的硫酸铵分级盐析得到藻红蛋白沉淀，但其纯度还是远不能达到试剂级要求。也有再结合传统结晶法，将藻红蛋白沉淀在4℃条件下保存一个月以提高其纯度，虽然纯度能提高到药品级，但提取周期太长。常用的柱层析纯化藻红蛋白的方法有羟基磷灰石(HA)和DEAE-纤维素离子交换柱层析和葡聚糖凝胶过滤柱层析等。有报道通过羟基磷灰石(HA)一步柱层析得到纯度大于4的藻红蛋白，但HA填料颗粒太细，容易堵塞层析柱，只能用短小的柱子纯化，所以只适合实验室小型规模。DEAE-纤维素离子交换柱层析纯化效果仅次于HA柱层析，但可规模过柱，上样量大，效率高。葡聚糖凝胶过滤柱层析一步纯化藻红蛋白一般达不到试剂级要求。两步柱层析纯化藻红蛋白最为常见，通常采用两次离子交换柱层析联用或离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析联用的方法。还有用三步柱层析联用的方法纯化纯度要求较高的藻红蛋白。但是大大增加了成本。本采用了反相硫酸铵沉淀、膜分离技术和高效结晶法相结合的技术。膜分离技术在分离过程中不涉及相变、无二次污染，又由于分离中具有生物膜浓缩富集的功能，处理量较大，同时它操作方便、结构紧凑、维修费用低，易于自动化，因而它是现代分离技术中一种效率较高的分离手段。通过这三种方法的有效结合，使藻红蛋白的纯度达到药品级要求，而且使效率得到很大的提高，还缩短了周期。再结合DEAE cellulose-52离子交换柱层析可一步纯化藻红蛋白，使之纯度达到试剂级要求。
三、发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种提取高纯度紫菜藻红蛋白的制备方法。该方法简便，高效，得到的藻红蛋白纯度高，无毒、安全和高活性，达到试剂级要求，具有较高的应用于化妆品、医药保健和检测试剂等领域的价值。
技术方案
1、一步层析法制备高纯度的紫菜藻红蛋白，其特征在于：
(1)紫菜经50倍体积的1mM PBS pH6.8缓冲液溶胀，组织捣碎，再用800瓦功率超声波作用800秒进行细胞破碎，得到藻红蛋白的粗提物，用饱和度为45％的硫酸铵沉淀；
(2)将沉淀用1mM PBS pH6.8缓冲液溶解，经0.1um微滤膜微滤、10kDa超滤膜超滤后，透析，用饱和度为20％的硫酸铵进行反相沉淀，离心，对上清夜进行透析，用饱和度为65％的硫酸铵沉淀结晶，在4℃条件下存放一周；
(3)将晶体用1mM PBS pH6.8缓冲液溶解，透析，过DEAE cellulose-52阴离子交换层析柱，用含离子强度为0.1～0.6MNaCl的1mM PBS pH6.8缓冲液梯度洗脱，分步收集洗脱液，收集纯度A562nm/A280nm＞4的紫菜藻红蛋白，以满足试剂级要求，即为获得的紫菜藻红蛋白。
有益效果
本发明采用超声细胞破碎、反相硫酸铵沉淀、膜分离技术和高效结晶法相结合，通过DEAE cellulose-52离子交换柱层析一步纯化得到的藻红蛋白纯度(A562nm/A280nm)可达到4以上，达到试剂级要求，可应用于食品、化妆品、医药保健和检测试剂等领域，可用作分子探针和光敏剂等，大大提高了紫菜的深加工价值。一步层析法制备高纯度的紫菜藻红蛋白的得率为0.2％。
四、附图说明
图1藻红蛋白提取工艺
五、发明的具体实施方式
实施例1
(1)称取4克紫菜粉，按体积比1∶50的比例用PBS(1mM，pH6.8)的缓冲液浸泡1小时，充分溶胀。在冰浴中用800W功率的超声波超声20min进行细胞破碎。在5000rmp条件下离心20min，得藻红蛋白粗提物。用饱和度为45％的硫酸铵沉淀，离心(5000rmp，20min)，将沉淀溶于40mL，1mmol·L-1磷酸缓冲液(pH6.8)中；
(2)将经饱和度为45％的硫酸铵沉淀得到的藻红蛋白溶液先用0.1um的微滤膜过滤，再用膜孔径为10KDa的超滤膜过滤浓缩。透析，用饱和度为20％的硫酸铵反相沉淀，离心(5000rmp，20min)。再采用高效的结晶法，将上清夜用饱和度为65％的硫酸铵沉淀，在4％条件下结晶保存一周；
(3)将经膜过滤、高效结晶法结晶的藻红蛋白浓缩液离心(5000rmp，20min)，透析，取10mL预先用相同的初始缓冲液平衡的样品浓缩液过经初始缓冲液平衡的DEAEcellulose-52柱，用含离子强度为0.1～0.6MNaCl的pH6.8的PBS(1mM，pH6.8)缓冲液进行梯度洗脱，分步收集洗脱液，每管4ml，测定A280nm和A562nm值，收集到纯度(A562nm/A280nm)达5.08的藻红蛋白。藻红蛋白的得率0.05％。
实施例2
(1)称取4克紫菜粉，按1∶50的比例用PBS(1mM，pH6.8)的缓冲液浸泡1小时，充分溶胀。在冰浴中用800W功率的超声波超声20min进行细胞破碎。在5000rmp条件下离心20min，得藻红蛋白粗提物。用饱和度为45％的硫酸铵沉淀，离心(5000rmp，20min)，将沉淀溶于40mL，1mmol·L-1磷酸缓冲液(pH6.8)中；
(2)将经饱和度为45％的硫酸铵沉淀得到的藻红蛋白溶液先用0.1um的微滤膜过滤，用膜孔径为30KDa的超滤膜过滤浓缩，再用膜孔径为10KDa的膜超滤。透析，用饱和度为20％的硫酸铵反相沉淀，离心(5000rmp，20min)。再采用高效的结晶法，将上清夜用饱和度为65％的硫酸铵沉淀，在4％条件下结晶保存一周；
(3)将经膜过滤、高效结晶法结晶的藻红蛋白浓缩液离心(5000rmp，20min)，透析，取10mL预先用相同的初始缓冲液平衡的样品浓缩液过经初始缓冲液平衡的DEAEcellulose-52柱，用含离子强度为0.1～0.6MNaCl的pH6.8的PBS(1mM，pH6.8)缓冲液进行梯度洗脱，分步收集洗脱液，每管4ml，测定A280nm和A562nm值，收集到纯度(A562nm/A280nm)达5.24的藻红蛋白。藻红蛋白的得率为0.04％。

Claims (3)

1、一步层析法制备高纯度的紫菜藻红蛋白，其特征在于：
(1)紫菜经50倍体积的1mM PBS pH6.8缓冲液溶胀，组织捣碎，再用800瓦功率超声波作用800秒进行细胞破碎，得到藻红蛋白的粗提物，用饱和度为45％的硫酸铵沉淀；
(2)将沉淀用1mM PBS pH6.8缓冲液溶解，经0.1um微滤膜微滤、10kDa超滤膜超滤后，透析，用饱和度为20％的硫酸铵进行反相沉淀，离心，对上清夜进行透析，用饱和度为65％的硫酸铵沉淀结晶，在4℃条件下存放一周；
(3)将晶体用1mM PBS pH6.8缓冲液溶解，透析，过DEAE cellulose-52阴离子交换层析柱，用含离子强度为0.1～0.6MNaCl的1mM PBS pH6.8缓冲液梯度洗脱，分步收集洗脱液，即为获得的紫菜藻红蛋白。
2、根据权利要求1所述一步层析法制备高纯度的紫菜藻红蛋白，其特征在于：其步骤(3)分步收集洗脱液时，测定A280nm和A562nm值，收集A615nm/A280nm＞4的洗脱液即为获得的紫菜藻红蛋白。
3、权利要求1或2方法所获得的高纯度紫菜藻红蛋白产品。
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