CN1786024B - 藻红蛋白、晶体生产工艺及制品 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种蛋白、晶体制造工艺及制品，尤其涉及的是在一般条件下从藻类中提取的能发射强烈荧光的藻红蛋白并将其转化为晶体形态，本发明藻红蛋白晶体具有能够长期保存，所需的保藏条件要求小，荧光活性高的的特点，其制作方法在普通的实验条件下就可以完成，简单易行。并在科研、医疗、检测、信电等领域得到广泛的应用。

Description

藻红蛋白、晶体生产工艺及制品

技术领域

本发明涉及一种蛋白、晶体制造工艺及制品，尤其涉及的是在一般条件下从藻类中提取的能发射强烈荧光的藻红蛋白并将其转化为晶体形态，并在科研、医疗、检测、信电等领域的应用。

背景技术

早在上个世纪初，国外就曾报道在蓝藻和红藻中存在具有强烈荧光性的红色、紫罗兰色和蓝色蛋白质。1910年，Kylin首次将这些色素蛋白定名为“藻色蛋白”(Phycochromo-proteins)。这种大量出现于红藻，蓝绿藻和隐藻中的捕光色素蛋白，就是目前亟待开发的藻胆蛋白(Phycobiliproteins，PBP)，它主要包括藻红蛋白(Phycoerythrin，PE)，藻蓝蛋白(Phycocyanin，PC)，藻红蓝蛋白(Phycoerythrocyanin，PEC)和别藻蓝蛋白(Allophycocyanin，APC)四种。藻胆蛋白把捕获的光能高效的传递给叶绿素，从而使藻类的光合作用得以发生。

与化学合成的荧光染料相比，藻红蛋白(Phycoerythrin，PE)纯天然来源，资源丰富，物理性质稳定，水溶性好，不与蛋白质、核酸、细胞等发生非特异性吸附，安全且无毒性，对生态环境无污染。另外藻红蛋白摩尔吸光系数大，荧光量子产率高，荧光发射波长大于550纳米(nm)，强烈吸收光谱带很宽，有利于选择激发光源，克服了传统荧光标记物荧光背景大、易淬灭等缺点，大大提高了荧光检测的灵敏性。

中国专利申请(01115003.3)公开了一种“R-藻红蛋白在制备光疗肿瘤的光敏剂中的应用”。该发明采用体内与体外实验相结合的方法，研究藻红蛋白的光敏效应对肿瘤细胞的光敏杀伤作用。虽然在实验过程该发明具有杀灭和抑制肿瘤细胞作用，但是由于实验中的细胞培养时要求的条件比较苛刻，或许细胞培养液条件的不同而使细胞的死亡。而中国专利申请(02150927.1)公开了一种“荧光藻蓝蛋白与荧光藻红蛋白及其应用”。该藻蓝蛋白与藻红蛋白的分子结构为通过硫醚键连接的载体蛋白与发色团--开链线性延展的四吡咯化合物，是从藻类中提取纯化的，在适宜波长激发下能发射强烈荧光。该发明还公开了一系列该荧光藻蓝蛋白与荧光藻红蛋白的用途，包括在荧光检测及免疫分析方面的用途，在制备抗癌抗肿瘤药物或食物方面的用途，在制备抗辐射增强免疫力消炎药物或食物方面的用途，在制备光子开关方面的用途，以及在制备食品或化妆品添加剂方面的用途。但是由于该藻红蛋白是以冻干粉或者沉淀形式的存在，在一般的蛋白质保藏条件下很容易失活，当受到某些物理或化学因素作用时，容易引起生物活性的丧失，不能长期应用。

发明内容

本发明的一个目的在于提供制备藻红蛋白溶液的方法，该方法与现有技术相比；只需通过两种填充介质的柱层析就能制备出不同纯度级别的藻红蛋白溶液。

本发明的另一个目的在于提供藻红蛋白晶体的制备方法，该方法与现有技术相比；在普通的实验条件下就可以完成，简单易行。

本发明还针对现有技术的蛋白质处在冻干粉状态或者沉淀状态，不能长期保存，生物活性容易丧失，不能长期利用，荧光活性低的缺点；提供一种能长期保存，所需的保藏条件要求小，荧光活性高的藻红蛋白晶体。

本发明的上述技术问题主要是通过下述技术方案得以解决的：

一种藻红蛋白溶液的制备方法，其特征在于，将藻细胞破碎后，通过过滤和高速冷冻离心分离，去除沉淀，收集上清，分级盐析后收集藻红蛋白沉淀，沉淀溶解于磷酸盐缓冲液后依次经过羟基磷灰石、葡聚糖凝胶Sephadex G-150(或Sephadex G-200)、羟基磷灰石柱层析，羟基磷灰石柱层析时使用浓度范围为0.005-0.1摩尔/升的线性梯度磷酸盐缓冲液洗脱，控制流速在0.5-2.5毫升/分钟，最后收集A₅₆₅/A₂₈₀＞4.0、A₅₆₅/A₂₈₀＞4.5、A₅₆₅/A₂₈₀＞5.0一种或多种不同纯度要求的藻红蛋白溶液，制成不同纯度级别的藻红蛋白溶液。

作为优选，所述制备藻红蛋白溶液的方法，其特征在于，所述藻红蛋白溶液在羟基磷灰石柱层析过程中使用浓度范围为0.005-0.05摩尔/升的线性梯度磷酸盐缓冲液洗脱。

作为优选，所述制备藻红蛋白溶液的方法，其特征在于，所述藻红蛋白溶液在羟基磷灰石柱层析过程中使用线性梯度磷酸盐缓冲液洗脱，洗脱流速控制在1.0-2.0毫升/分钟。

《水生生物学报》在1996年第20卷第3期曾发表一篇《Rhodosorusmarinus中藻红蛋白的纯化及其性质的研究》的文献。文献中藻红蛋白的纯化是将细胞破碎抽提液经过两次DEAE-52纤维素柱和两次Bio-gelp300柱，收集到的藻红蛋白最高纯度仅为4.7；与之相比，本发明藻红蛋白的纯化是将细胞破碎抽提液经过一次HA柱再过Sephadex G-100(或Sephadex G-200)，然后在过一次HA柱，操作过程简单，生产周期较短，生产成本低，同时可以得到A₅₆₅/A₂₈₀＞4.0、A₅₆₅/A₂₈₀＞4.5、A₅₆₅/A₂₈₀＞5.0一种或多种不同纯度要求的藻红蛋白溶液，制成不同纯度级别的藻红蛋白溶液制品；制成的藻红蛋白溶液产品性能更好，纯度更高，更重要的是生产工艺非常简单。

一种藻红蛋白制备成晶体的方法，其特征在于，将一定纯度的藻红蛋白放在闭光封闭的环境中，加入0.05-0.2％氯化镁和2-4％氯化钠，调节pH值使其在晶体的成长过程中始终稳定在pH6.5～7.4的范围内，并线性梯度地加入硫酸铵并轻微搅动，使其转变成粗晶体，通过重结晶，再结晶，即得最后的晶体产品。晶体产品极大提高了藻红蛋白的稳定性，更大限度地提高产品的纯度和保持产品的高生物活性。

作为优选，所述的藻红蛋白制备成晶体的方法，其特征在于，所述的在晶体的成长过程中始终稳定在pH6.8～7.2的范围内。

一种藻红蛋白晶体，分子结构为通过硫醚键连接的载体蛋白与发色团---开链线性延展的四吡咯化合物，脱辅蛋白单体由α、β、γ三种亚基组成，在适宜波长激发下能发射强烈荧光，特征吸收峰为560～570纳米(nm)，荧光激发峰为480～500纳米(nm)，荧光发射峰为575～580纳米(nm)。其特征在于所述的藻红蛋白为晶体结构。

作为优选，所述的藻红蛋白晶体的晶胞参数为：a＝b＝189.8埃

c＝60.1埃α＝β＝γ＝90°。

通过分子替代的方法，使用藻蓝蛋白(CPC)分子作为模型和精确的1.9埃

分辨率，测定藻红蛋白晶体的结构，虽然晶胞的参数是非常相似的和蛋白内部的螺旋组成几乎相同，但是藻蓝蛋白(CPC)和藻红蛋白晶体的组装有很大的不同，六棱柱围绕z轴旋转-40度，因此，不同的栏间空白之间联系形成了。由于柱子近似圆柱对称，不同的组装排列能够容纳在一个相似的晶胞内。

作为优选，所述的藻红蛋白晶体的组装为发色团和蛋白通过藻红胆素K139和相对称的β亚基半胱氨酸残基L159和谷氨酰胺L159连接；蛋白和蛋白之间通过α亚基和β亚基的螺旋G和螺旋H之间的环连接。

藻红蛋白晶体的组装有一个显著的特征，发色团和蛋白通过藻红胆素K139和相对称的β亚基半胱氨酸残基L159和谷氨酰胺L159连接；蛋白和蛋白之间通过α亚基和β亚基的螺旋G和螺旋H之间的环连接。藻红蛋白晶体的组装使得位于β亚基的B50/61位点的藻尿胆素可能靠近位于相对称的α亚基A139位点的藻红胆素，这两个发色团重心之间的距离约相互方向基本垂直，有一个短的距离是发色团藻红胆素K139和相对称的β亚基藻红胆素L158，两个发色团之间最近的距离是

这两个发色团的平行排列使得它们重心之间的距离有

更多的，有一个短的距离是发色团藻红胆素K139和相对称的β亚基藻尿胆素L50/61，它们重心之间的距离是

相互方向基本垂直，因此，藻红蛋白晶体组装在晶态条件下使得激发子相互作用成为可能。

作为优选，所述的藻红蛋白晶体的特征吸收峰为565纳米(nm)，荧光激发峰为495纳米(nm)，荧光发射峰为576纳米(nm)。

本发明藻红蛋白晶体具有能够长期保存，所需的保藏条件要求小，荧光活性高的的特点，其制作方法在普通的实验条件下就可以完成，简单易行。并在科研、医疗、检测、信电等领域得到广泛的应用。

附图说明

图1为构成藻红蛋白晶体的藻红胆素(Cys-PEB)的结构式。

图2为构成藻红蛋白晶体的藻尿胆素(PUB)的结构式。

具体实施方式

以下通过试验例来进一步阐述本发明所述藻红蛋白晶体的有益效果。

试验例1：藻红蛋白晶体在荧光检测方面的应用

1.藻红蛋白晶体与亲和素的交联制成荧光探针

试验材料：

选本发明的藻红蛋白晶体，分子量约229000道尔顿；pH值7.4的0.1摩尔/升磷酸盐缓冲液(PBS)，其中含0.1摩尔/升氯化钠(NaCl)；3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)，分子量312道尔顿；二硫代苏糖醇(DTT)，分子量154道尔顿。

试验方法：

1)藻红蛋白的衍生化

取4.58毫克藻红蛋白晶体溶于1.0毫升磷酸盐缓冲液(PBS)中，加入15微升3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)无水甲醇液(4毫克/毫升)，使得3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)与藻红蛋白摩尔比约为10，常温反应150分钟，经葡聚糖(Sephadex G-50)凝胶层析柱(Φ1×17厘米)脱盐，磷酸盐缓冲液(PBS)平衡和洗脱，收集藻红蛋白溶液峰。

2)亲和素的巯基化

1毫升亲和素(约2毫克/毫升，溶解于含有0.1摩尔/升氯化钠、pH7.4的0.1摩尔/升磷酸盐缓冲液中)，加入25微升上述3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)无水甲醇液，使得3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)与亲和素摩尔比约为10，常温反应60分钟，加入二硫苏糖醇(DTT)使得其终浓度为25微摩尔/升，常温反应90分钟，同上过葡聚糖凝胶层析(Sephadex G-50)，收集蛋白峰。

3)藻红蛋白与亲和素的交联

取衍生化的藻红蛋白与巯基化的亲和素混合，摇床低速(小于20转/分钟)振荡，4℃反应过夜。

4)停止反应

第3)步反应溶液中加入100微升的50毫摩尔/升碘乙酸钠封闭残余巯基，常温反应30分钟。

5)产物的纯化

第4)步产物经丙烯葡聚糖(Sephacryl S-300HR)凝胶柱层析，收集第一个蛋白峰即为荧光藻红蛋白标记制品。

6)保存

藻红蛋白标记制品，最后溶于磷酸盐缓冲液(含有0.1摩尔/升乙二胺四乙酸(DETA)、1摩尔/升碘乙酰胺、1％牛血清白蛋白(BSA)和0.1％叠氮化钠(NaN3))，0～5℃保存。

2.藻红蛋白标记蛋白A

试验材料：

藻红蛋白晶体，分子量约229000道尔顿；pH值7.4的0.1摩尔/升磷酸盐缓冲液(PBS)，其中含0.1摩尔/升氯化钠(NaCl)；3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)无水甲醇液；二硫苏糖醇(DTT)pH7.4缓冲液；蛋白A；乙二胺四乙酸(DETA)；碘乙酰胺。

试验方法：

1)、藻红蛋白的衍生化

取4.58毫克藻红蛋白晶体溶于1.0毫升磷酸盐缓冲液(PBS)中，加入15微升3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)无水甲醇液(4毫克/毫升)，使得3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)与藻红蛋白摩尔比约为10，常温反应60分钟，经葡聚糖(SephadexG-50)凝胶层析脱盐(Φ1×17厘米)，磷酸盐缓冲液(PBS)平衡和洗脱，收集藻红蛋白溶液峰。

2)、蛋白A的巯基化

0.5毫升蛋白A(2毫克/毫升)100mmol/L PBS(含有100mmol/L NaCl)pH7.4，加入上述3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)无水甲醇液，使得3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)与蛋白摩尔比约为10，常温反应40分钟，加入二硫苏糖醇(DTT)使得其终浓度为25微摩尔/升，常温反应25分钟，同上过葡聚糖凝胶层析(Sephadex G-50)，收集蛋白峰。

3)、藻红蛋白与蛋白A的交联

取0.77毫克/毫升衍生化的荧光藻红蛋白与0.27毫克/毫升巯基化的蛋白A等量混合，摇床低速(小于20转/分钟)振荡，4℃反应过夜。

藻红蛋白标记制品，最后溶于磷酸盐缓冲液(含有0.1摩尔/升乙二胺四乙酸(DETA)、1摩尔/升碘乙酰胺、1％牛血清白蛋白(BSA)和0.1％叠氮化钠(NaN3))，0～5℃保存。

使用藻红蛋白晶体标记亲和素和蛋白A的标记率均在60％以上，而使用藻红蛋白冻干粉或沉淀标记亲和素的标记率一般为40％-50％，结果表明，使用藻红蛋白晶体进行分子标记的效果明显优于藻红蛋白冻干粉或沉淀的标记。

试验例2：藻红蛋白晶体在免疫分析方面的应用。

藻红蛋白与抗体的交联

试验材料：

选本发明的藻红蛋白晶体：分子量约229000道尔顿；pH值7.4的0.1摩尔/升磷酸盐缓冲液(PBS)；PD-10柱(葡聚糖凝胶层析柱SephadexG-25M)，安玛西亚Amersham公司产品，产品目录号No.17-0851-01；NAP5柱(葡聚糖凝胶层析柱Sephadex G-25 DNA grade)，安玛西亚Amersham公司产品，产品目录号No 17-0853-02；琥珀酰亚胺-4-(N-甲基马来酰亚胺)环己烷-1-碳酸酯)(SMCC)，Pierce公司，产品目录号No.22360；N-乙基马来酰胺(NEM)，Sigma公司，产品目录号E-1271；二甲基亚砜(DMSO)，Aldrich公司，产品目录号No.27，685-5。

试验方法：

1)、藻红蛋白晶体的预处理

将藻红蛋白晶体溶于1.0毫升磷酸盐缓冲液(PBS)中，于透析缓冲液中透析除盐。透析后的藻红蛋白浓度调整到5-10毫克/毫升为宜。

2)、藻红蛋白的衍生化

将琥珀酰亚胺-4-(N-甲基马来酰亚胺)环己烷-1-碳酸酯)(SMCC)溶解于无水二甲基亚砜(DMSO)配制成10毫克/毫升的母液，每毫克的藻红蛋白添加11微升的琥珀酰亚胺-4-(N-甲基马来酰亚胺)环己烷-1-碳酸酯)(SMCC)，铝箔封好后于室温旋转反应60分钟，使藻红蛋白分子上的氨基与琥珀酰胺反应生成衍生化的藻红蛋白。

交换缓冲液预先平衡凝胶柱，将衍生化的藻红蛋白过柱。

3)、抗体的处理

二硫苏糖醇(DTT)溶解于蒸馏水中，配制成1摩尔/升的二硫苏糖醇(DTT)母液，调整抗体的浓度，使其浓度至少为4毫克/毫升。

每毫升抗体溶液中加入20微升的二硫苏糖醇(DTT)母液，室温静置反应30分钟，将抗体的二硫键打开形成巯基。

交换缓冲液预先平衡凝胶柱，将反应液过柱，收集抗体部分。

4)、藻红蛋白和抗体的共价交联

每毫克抗体加入3.2毫克的琥珀酰亚胺-4-(N-甲基马来酰亚胺)环己烷-1-碳酸酯)(SMCC)衍生化的藻红蛋白，铝箔封好后于室温旋转反应60分钟，使藻红蛋白分子上的马来酰亚胺基和抗体上的巯基实现共价交联。

10毫克的N-乙基马来酰胺(NEM)溶解于1.0毫升的无水二甲基亚砜(DMSO)中制成N-乙基马来酰胺(NEM)母液(现配现用)。

每毫克抗体中加入3.4微升N-乙基马来酰胺(NEM)母液，铝箔封好后于室温旋转反应60分钟，反应后，使抗体上的巯基封闭。

5)、交联物的存储

将交联物于存储缓冲液中透析后保存于冰箱。

结果表明，当使用藻红蛋白的沉淀产品来实现该用途时，由于沉淀产品只是蛋白的硫酸铵沉淀物，在使用中存在一定的局限性和缺点，不能保证在实施荧光检测及免疫分析标记前藻红蛋白的同一性，故对分析结果的精准性产生一定影响。用藻红蛋白的晶体来实现该用途，更好地解决了藻红蛋白在此领域的缺陷，使标记和分析更加精准。将藻红蛋白的晶体用于荧光检测及免疫分析，或与其他物质如抗体、生物素、亲合素、免疫蛋白等结合，制成荧光探针或荧光标记用于荧光检测及分析。通过检测其发出的荧光，可以用于荧光显微检测、荧光免疫测定、双色或多色荧光分析、癌细胞表面抗原检测、疾病检测诊断、蛋白质和核酸等生物大分子的分析。

试验例3：藻红蛋白晶体用于疾病的治疗与预防。

试验材料：

选本发明的藻红蛋白晶体：分子量约229000道尔顿。

抑制肿瘤细胞生长：

运用半固体琼脂培养法和溴化3-(4，5)-二甲基-2-噻唑基-2，5二苯基四氮唑(噻唑蓝，MTT)检测法测定了藻红蛋白晶体对人血癌细胞株HL-60，K-562和U-937生长的影响。体外培养条件下用不同浓度的藻红蛋白晶体处理这3种肿瘤细胞，结果显示藻红蛋白晶体对这三种肿瘤细胞均有不同程度的抑制作用，并存在浓度剂量效应，高浓度抑制作用强。

(1)在较高浓度(100微克/毫升)时对HL-60细胞的生长有显著的抑制作用；

(2)在浓度(100微克/毫升和30微克/毫升)时对K-562细胞的生长有显著的抑制作用；

(3)在浓度(100微克/毫升)时对U-937细胞的生长有显著的抑制作用。

抗辐射作用：

从藻红蛋白晶体抗辐射作用的机理来看，造血干细胞的损伤和恢复在造血型放射病中起着重要的作用，降低造血干细胞的放射敏感性或防止照射动物体内存活干细胞的继续减少，促使其提前进入增殖期，对照射动物造血功能的恢复将起到有益的作用。预防性的给小鼠腹腔注射荧光藻红蛋白晶体的溶解液，能显著减轻辐射对小鼠外周血细胞和骨髓细胞的损伤，可促进小鼠外周白细胞的恢复，亦能促进骨髓有核细胞、粒单系祖细胞和多能造血干细胞的恢复和增殖。

免疫功能：

给注射有肝肿瘤细胞的实验小白鼠口服藻红蛋白晶体后，实验组的小白鼠比对照组的小白鼠的成活率明显提高；进一步的研究发现，实验组的小白鼠的淋巴细胞活性明显高于对照组以及正常小白鼠。因此，藻红蛋白晶体能提高免疫系统功能，以抵抗各种疾病。

表1：不同剂量组的藻红蛋白晶体的治疗效果

组别	剂量(毫克/千克)	动物数(只)	平均存活天数(天)
				对照组	0	15	9.7±4.6
低剂量组	3	15	11.2±4.5
				中剂量组	6	15	11.9±4.4
高剂量组	12	15	14.8±5.5

人类T淋巴细胞表面具有绵羊红细胞(SRBC)的受体，因此，绵羊红细胞能粘于T细胞的周围，形成玫瑰花样的细胞团，故名E玫瑰花形试验，形成此种玫瑰花结的T细胞称为红细胞玫瑰花形成细胞。人体T淋巴细胞E花环实验是鉴定与计数人外周血T淋巴细胞的功能和数量的常用方法，特别是活性细胞玫瑰花形成细胞(EaRFC)是一组对SRBC具有高度亲和力的T细胞特殊亚组，是T细胞中具有免疫活性功能的效应细胞。藻红蛋白晶体能够促进PHA(Phytohemagglutinin，植物血球凝集素)刺激淋巴细胞转化的作用，能恢复T细胞受环磷酰胺损伤后E玫瑰花环形成能力，特别是对活性E花环(Ea)的形成能力有较好的恢复作用。因此藻红蛋白晶体能提高免疫系统功能，以抵抗各种疾病。

消炎作用：

藻红蛋白晶体具有强抗氧化性，是一种活性氧自由基消除剂，在一定程度上具有消炎作用。

藻红蛋白晶体能消除葡萄糖氧化酶引起的炎症。

藻红蛋白晶体具有护肝功效：

能抑制Fe³⁺-抗坏血酸诱导的肝脏微粒体脂过氧化作用。口服50-300毫克/千克剂量的藻红蛋白晶体即能产生明显的消炎作用。其消炎活性不依赖于皮质类固醇的释放。且对急、慢性炎症组织都有作用。

藻红蛋白晶体能抑制红细胞的裂解，其作用方式与trolox(维生素E类似物)和抗坏血酸(维生素C)的作用方式相同，但抗氧化性较trolox强16倍，较维生素C强20倍。藻红蛋白晶体能通过消除水相中的过氧化物自由基来防止其诱导的红细胞裂解。

总之，炎症代谢产物，如白细胞三烯、氧自由基等能诱导白细胞迁移进入组织或黏附于血管内皮，而中性白细胞的黏附和浸润是炎症反应的核心。在体内及体外实验中，藻红蛋白晶体通过清除活性氧物质(ROS)，例如：羟自由基(OH·)、烷氧自由基(RO·)和超氧化物自由基等，在一定程度上起到缓解炎症的作用。

藻红蛋白晶体用于直肠癌辅助治疗

常用的放疗化疗方法，在杀死癌细胞的同时也对人体正常组织大量杀伤，造成病人身体虚弱痛苦，易由于免疫力下降引发其他疾病。将具有抗癌、抗辐射、增强免疫力作用的藻红蛋白晶体用于癌症病人的辅助治疗，可以起到良好的治疗、恢复作用。

直肠癌病人术前放射治疗采取俯卧位3-射野技术。放疗总剂量为45Gy，每周5次，每次1.8Gy。全身化疗静脉滴入四氢叶酸同时进行。

放疗化疗完成后四～六周，病人连续服用藻红蛋白晶体1克/天，结果显示：癌细胞大量坏死，肿瘤直径缩小40％，白细胞总数迅速上升，受损正常组织得到恢复，造血旺盛，免疫力上升。

放疗化疗完成后四～六周的病人分为2小组，每组125人，I组使用藻红蛋白晶体，II组作为对照组半个月后进行观察。

从表2的统计学意义可以看出藻红蛋白晶体用于直肠癌辅助治疗方面明显好于对照组(p＜0.01)

表2两种药物治疗结果比较

注：藻红蛋白晶体组和对照组相比：X²＝67.7，P＜0.01。说明藻红蛋白晶体与对照组相比有显差别，说明藻红蛋白晶体用于直肠癌辅助治疗方面有很好的疗效。

藻红蛋白晶体抗癌的机理：

抗癌机制：藻红蛋白能被肿瘤细胞选择性吸收到细胞膜中。根据对K-562细胞的作用研究发现，藻红蛋白能引起原癌基因(c-myc)的含量的增高，而对BCL-2的表达量没有影响。因此可见是原癌基因(c-myc)表达量的增高引起了细胞的凋亡，或存在另一种途径抑制了K-562细胞的生长，从而达到抗癌的效果。藻红蛋白可作为一种DNA稳定因子起作用，通过影响合成DNA和RNA的机制，来抑制肿瘤细胞生长，或以诱导细胞内信息分子的改变来达到抗癌效果。

以上机理表明可以将藻红蛋白晶体作为一种功效成分制成药物或食物，用于癌症、肿瘤疾病的治疗与预防。

结果表明：藻红蛋白晶体不仅可以制备抗癌抗肿瘤药物，还可将藻红蛋白晶体作为一种功效成分或中间体，制备成药物或食物用于癌症、肿瘤的预防与治疗；又可将藻红蛋白晶体作为一种功效成分或中间体，制备成药物或食物用于抗辐射、增强免疫力或消炎。

试验例5三种不同的藻红蛋白状态下的稳定性之间的比较

试验材料：藻红蛋白沉淀、藻红蛋白冻干粉、藻红蛋白晶体。

试验方法：藻红蛋白沉淀的适宜保存方法为：4℃条件下，悬浮于150mM磷酸钠，60％硫酸铵，pH 7.0，1mM EDTA，1mM NaN3溶液中；藻红蛋白冻干粉的适宜保存方法为4℃条件下保存。

本发明藻红蛋白晶体的适宜保存方法为：4℃条件下，悬浮于150mM磷酸钠，60％硫酸铵，pH 7.0，1mM EDTA，1mM NaN3溶液中。

将藻红蛋白沉淀、冻干粉和晶体三种形态的产品于各自的适宜保存条件下保存，不同的保存时间取出，用0.005摩尔/升的磷酸盐缓冲液(PBS)配成浓度为100ug/L的藻红蛋白溶液，测定565纳米波长下的吸光光度值，计算出相对吸光值。

表3：三种不同的藻红蛋白状态下的稳定性之间的比较

藻红蛋白晶体在其适宜的条件下保存两年后，相对吸光光度值的无变化，而藻红蛋白以沉淀和冻干粉的形态保存两年后，相对吸光光度值的降低量分别为65％和30％，这表明藻红蛋白以晶体的形态保存明显优于沉淀和冻干粉形态。分析其原因，藻红蛋白以晶体形态存在时，藻红蛋白分子按照特定的规律排列于晶胞中，色素基团包被于藻红蛋白分子内而受到保护，不易被氧化和微生物降解；而藻红蛋白以沉淀和冻干粉的形态保存时，藻红蛋白的分子为无序排列，色素蛋白大量暴露于分子外围，容易被氧化或微生物降解而导致藻红蛋白的变性，导致藻红蛋白在565纳米波长下的吸光光度值的降低。

实施例1

1、藻红蛋白的制备

细胞破碎

称取适量藻红蛋白原料(如紫菜、多管藻等藻类)，用蒸馏水清洗两次，于0℃条件下用组织破碎机研碎，置入烧杯中，加入pH值6.5、浓度0.005摩尔/升的磷酸盐缓冲液(PBS)，搅拌均匀。于冰浴中1200W超声破碎60分钟，将破碎好的粗液于低温条件下(0℃)静置10小时，然后用至少三层的纱布过滤三次，去除大的细胞组织碎片，滤液置于预冷的高速冷冻离心机中，8000转/分钟0℃下离心60分钟，去掉沉淀，收集上清液；

硫酸铵分级盐析

在上清液中加入固体硫酸铵使之达到30％饱和度，10℃的条件下静置10小时，6000转/分钟0℃下离心60分钟，弃去沉淀。上清液中继续加入固体硫酸铵至80％饱和度，0℃静置10小时，6000转/分钟0℃离心60分钟，弃去上清液，沉淀用少量磷酸盐缓冲液(pH6.5)溶解，在0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5)中充分透析

第一次羟基磷灰石柱层析

将透析后的粗品液加到羟基磷灰石层析柱上，加样量为5毫升，然后以0.005-0.1摩尔/升的线性梯度磷酸盐缓冲液(pH6.5，含0.1摩尔/升氯化钠)洗脱，流速为2.5毫升/分钟，洗脱总体积为1000毫升。用自动部分收集器收集洗脱液。对各管进行光谱测定，将藻红蛋白含量和纯度较高的收集液合并在一起，加入固体硫酸铵至80％饱和度，于0℃条件下保存。

葡聚糖(Sephadex G-150)凝胶柱层析

上述纯化收集的藻红蛋白，加到葡聚糖(Sephadex G-150)凝胶柱上，用0.005摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH值6.5)洗脱，控制流速在5毫升/分钟，收集A₅₆₅/A₂₈₀＞4.0的蛋白溶液部分。

第二次羟基磷灰石柱层析

将数次盐析浓缩后的藻红蛋白合并，以6000转/分钟0℃下离心60分钟，弃去上清液，沉淀用少量磷酸盐缓冲液(pH 6.5)溶解，在0.005摩尔/升磷酸盐缓冲液(pH6.5)中充分透析。将透析后的藻红蛋白加到羟基磷灰石层析柱上，洗脱方法与第一次羟基磷灰石柱层析时相同，洗脱体积为1000毫升，收集A₅₆₅/A₂₈₀＞4.0、A₅₆₅/A₂₈₀＞4.5和A₅₆₅/A₂₈₀＞5.0的部分，制得不同纯度级别的藻红蛋白溶液。

2.藻红蛋白晶体的制备

将A₅₆₅/A₂₈₀＞4.0、4.5或A₅₆₅/A₂₈₀＞5.0的藻红蛋白溶液收集在烧杯中，放入密闭、闭光、恒低温条件(温度控制在10℃)的超净工作上。溶液中加入0.2％(质量/体积，M/V)的氯化镁和4％(质量/体积，M/V)氯化钠。

将pH传感器浸入液面下，通过pH自动调控装置调节液体的pH值始终稳定在pH6.5。

将固体硫酸铵溶解于0.005摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH6.5)中制备成100％饱和度的硫酸铵溶液，并用0.2微米的滤膜过滤除菌。

将饱和硫酸铵溶液缓慢滴加到所盛藻红蛋白溶液中，并轻微搅动，使溶液混合均匀，流速控制在1毫升/6分钟，直到溶液中的藻红蛋白以晶体的形式基本析出完全为止。

将晶体混合溶液放入事先低温(0℃)预冷的真空抽滤器中抽滤，抽除滤液，然后用65％饱和度的硫酸铵溶液洗涤晶体3遍。

将所得到的荧光藻红蛋白晶体溶解于0.005摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH6.5)中，按照以上结晶的方法和步骤，实施重结晶，再结晶，即得最后的晶体产品。

将晶体产品存放于65％饱和度的硫酸铵磷酸盐缓冲液溶液中，加入微量防腐剂(0.1％叠氮化钠(NaN3))，于0℃条件下长期保存。

3.藻红蛋白结构的确定

从条斑紫菜中分离得到的藻红蛋白属于藻胆蛋白的一种，它由α、β、γ三种亚基组成，其分子量分别是17000道尔顿、18000道尔顿和31700道尔顿。条斑紫菜中藻红蛋白主要以稳定的六聚体(αβ)₆γ的形式存在，分子量为229000道尔顿。α亚基含有2个藻红胆素(PEB)，β亚基含有1个藻红胆素(PEB)和0.5个藻尿胆素(PUB)，γ亚基含有2个藻红胆素(PEB)和3个藻尿胆素(PUB)。其发色基团藻红胆素(PEB)的残基与脱辅基蛋白上的半胱氨酸通过硫醚键共价结合，其连接位点在α-84、α140a、β84、β-155和β50、61。

条斑紫菜藻红蛋白在可见光区的495纳米和565纳米处有特征吸收峰，以565纳米处为最大吸收峰。荧光激发峰为495nm，荧光发射峰为576nm。条斑紫菜藻红蛋白等电点约为4.2。

4.藻红蛋白晶体结构的确定

藻红蛋白晶体的晶胞参数为：a＝b＝189.8埃，c＝60.1埃，α＝β＝γ＝90°。通过分子替代的方法，使用藻蓝蛋白分子作为模型和精确的1.9埃分别率，测定红藻藻红蛋白的结构，虽然晶胞的参数是非常相似的和蛋白内部的螺旋组成几乎相同，但是藻蓝蛋白和藻红蛋白晶体的组装有很大的不同，六棱柱围绕z轴旋转-40度，因此，不同的栏间空白之间联系形成了。由于柱子近似圆柱对称，不同的组装排列能够容纳在一个相似的晶胞内。藻红蛋白晶体的组装有一个显著的特征，发色团和蛋白通过藻红胆素(PEB)K139和相对称的β亚基半胱氨酸残基L159和谷氨酰胺L159连接；蛋白和蛋白之间通过α亚基和β亚基的螺旋G和螺旋H之间的环连接。藻红蛋白晶体的组装使得位于β亚基的B50/61位点的藻尿胆素(PUB)可能靠近位于相对称的α亚基A139位点的藻红胆素(PEB)，这两个发色团重心之间的距离约13.0埃，相互方向基本垂直，有一个短的距离是发色团藻红胆素(PEB)K139和相对称的β亚基藻红胆素(PEB)L158，两个发色团之间最近的距离是3.4埃，这两个发色团的平行排列使得它们重心之间的距离有20.3埃。更多的，有一个短的距离是发色团藻红胆素(PEB)K139和相对称的β亚基藻尿胆素(PUB)L50/61，它们重心之间的距离是16.5埃，相互方向基本垂直，因此，藻红蛋白晶体组装在晶态条件下使得激发子相互作用成为可能。

实施例2

1、藻红蛋白的制备

细胞破碎

称取适量藻红蛋白原料(如紫菜、多管藻等藻类)，用蒸馏水清洗两次，于2℃条件下用组织破碎机研碎，置入烧杯中，加入pH值6.8、浓度0.005摩尔/升的磷酸盐缓冲液(PBS)，搅拌均匀。于冰浴中1200W超声破碎60分钟，将破碎好的粗液于低温条件下(2℃)静置10小时，然后用至少三层的纱布过滤三次，去除大的细胞组织碎片，滤液置于预冷的高速冷冻离心机中，8000转/分钟2℃离心60分钟，去掉沉淀，收集上清液；

硫酸铵分级盐析

在上清液中加入固体硫酸铵使之达到30％饱和度，2℃的条件下静置10小时，6000转/分钟2℃离心60分钟，弃去沉淀。上清液中继续加入固体硫酸铵至80％饱和度，2℃静置10小时，6000转/分钟2℃下离心60分钟，弃去上清液，沉淀用少量磷酸盐缓冲液(pH6.8)溶解，在0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)中充分透析

第一次羟基磷灰石柱层析

将透析后的粗品液加到羟基磷灰石层析柱上，加样量为5毫升，然后在洗脱过程中以0.005-0.05摩尔/升的线性梯度磷酸盐缓冲液(pH6.8，含0.1摩尔/升氯化钠)洗脱，流速为2.0毫升/分钟，洗脱总体积为1000毫升。用自动部分收集器收集洗脱液。对各管进行光谱测定，将藻红蛋白含量和纯度较高的收集液合并在一起，加入固体硫酸铵至80％饱和度，于2℃条件下保存。

葡聚糖(Sephadex G-150)凝胶柱层析

上述纯化收集的藻红蛋白，加到葡聚糖(Sephadex G-150)凝胶柱上，用0.005摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH值6.8)洗脱，控制流速在5毫升/分钟，收集A₅₆₅/A₂₈₀＞4.0的蛋白溶液部分。

第二次羟基磷灰石柱层析

将数次盐析浓缩后的藻红蛋白合并，以6000转/分钟2℃离心60分钟，弃去上清液，沉淀用少量磷酸盐缓冲液(pH 6.8)溶解，在0.005摩尔/升磷酸盐缓冲液(pH6.8)中充分透析。将透析后的藻红蛋白加到羟基磷灰石层析柱上，洗脱方法与第一次羟基磷灰石柱层析时相同，洗脱体积为1000毫升，收集A₅₆₅/A₂₈₀＞4.5和A₅₆₅/A₂₈₀＞5.0的部分，制得不同纯度级别的藻红蛋白溶液。

2.藻红蛋白晶体的制备

将A₅₆₅/A₂₈₀＞4.0、4.5或A₅₆₅/A₂₈₀＞5.0的藻红蛋白溶液收集在烧杯中，放入密闭、闭光、恒低温条件(温度控制在10℃)的超净工作上。溶液中加入0.2％(质量/体积)的氯化镁和4％(质量/体积)氯化钠。

将pH传感器浸入液面下，通过pH自动调控装置调节液体的pH值始终稳定在pH6.8。

将固体硫酸铵溶解于0.005摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH6.8)中制备成100％饱和度的硫酸铵溶液，并用0.2微米的滤膜过滤除菌。

将饱和硫酸铵溶液缓慢滴加到所盛藻红蛋白溶液中，并轻微搅动，使溶液混合均匀，流速控制在1毫升/6分钟，直到溶液中的藻红蛋白以晶体的形式基本析出完全为止。

将晶体混合溶液放入事先低温(0℃)预冷的真空抽滤器中抽滤，抽除滤液，然后用65％饱和度的硫酸铵溶液洗涤晶体3遍。

将所得到的荧光藻红蛋白晶体溶解于0.005摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH6.8)中，按照以上结晶的方法和步骤，实施重结晶，再结晶，即得最后的晶体产品。

将晶体产品存放于65％饱和度的硫酸铵磷酸盐缓冲液溶液中，加入微量防腐剂(0.1％叠氮化钠(NaN3))，于低温0℃条件下长期保存。

3.藻红蛋白结构的确定

从条斑紫菜中分离得到的藻红蛋白属于藻胆蛋白的一种，它由α、β、γ三种亚基组成，其分子量分别是17000道尔顿、18000道尔顿和31700道尔顿。条斑紫菜中藻红蛋白主要以稳定的六聚体(αβ)₆γ的形式存在，分子量为229000道尔顿。α亚基含有2个藻红胆素(PEB)，β亚基含有1个藻红胆素(PEB)和0.5个藻尿胆素(PUB)，γ亚基含有2个藻红胆素(PEB)和3个藻尿胆素(PUB)。其发色基团藻红胆素(PEB)的残基与脱辅基蛋白上的半胱氨酸通过硫醚键共价结合，其连接位点在α-84、α140a、β84、β-155和β50、61。

条斑紫菜藻红蛋白在可见光区的495纳米和565纳米处有特征吸收峰，以565纳米处为最大吸收峰。荧光激发峰为495nm，荧光发射峰为576nm。条斑紫菜藻红蛋白等电点约为4.2。

4.藻红蛋白晶体结构的确定

藻红蛋白晶体的晶胞参数为：a＝b＝189.8埃，c＝60.1埃，α＝β＝γ＝90°。通过分子替代的方法，使用藻蓝蛋白分子作为模型和精确的1.9埃分别率，测定红藻藻红蛋白的结构，虽然晶胞的参数是非常相似的和蛋白内部的螺旋组成几乎相同，但是藻蓝蛋白和藻红蛋白晶体的组装有很大的不同，六棱柱围绕z轴旋转-40度，因此，不同的栏间空白之间联系形成了。由于柱子近似圆柱对称，不同的组装排列能够容纳在一个相似的晶胞内。藻红蛋白晶体的组装有一个显著的特征，发色团和蛋白通过藻红胆素(PEB)K139和相对称的β亚基半胱氨酸残基L159和谷氨酰胺L159连接；蛋白和蛋白之间通过α亚基和β亚基的螺旋G和螺旋H之间的环连接。藻红蛋白晶体的组装使得位于β亚基的B50/61位点的藻尿胆素(PUB)可能靠近位于相对称的α亚基A139位点的藻红胆素(PEB)，这两个发色团重心之间的距离约13.0埃，相互方向基本垂直，有一个短的距离是发色团藻红胆素(PEB)K139和相对称的β亚基藻红胆素(PEB)L158，两个发色团之间最近的距离是3.4埃，这两个发色团的平行排列使得它们重心之间的距离有20.3埃。更多的，有一个短的距离是发色团藻红胆素(PEB)K139和相对称的β亚基藻尿胆素(PUB)L50/61，它们重心之间的距离是16.5埃，相互方向基本垂直，因此，藻红蛋白晶体组装在晶态条件下使得激发子相互作用成为可能。

实施例3

1、藻红蛋白的制备

细胞破碎

称取适量藻红蛋白原料(如紫菜、多管藻等藻类)，用蒸馏水清洗两次，于低温(5℃)条件下用组织破碎机研碎，置入烧杯中，加入pH值7.0、浓度0.005摩尔/升的磷酸盐缓冲液(PBS)，搅拌均匀。于冰浴中1500W超声破碎45分钟，将破碎好的粗液于低温条件下(5℃)静置18小时，然后用至少三层的纱布过滤三次，去除大的细胞组织碎片，滤液置于预冷的高速冷冻离心机中，8000转/分钟4℃离心45分钟，去掉沉淀，收集上清液；

硫酸铵分级盐析

在上清液中加入固体硫酸铵使之达到25％饱和度，5℃的条件下静置18小时，8000转/分钟4℃离心45分钟，弃去沉淀。上清液中继续加入固体硫酸铵至80％饱和度，低温5℃静置18小时，8000转/分钟4℃离心45分钟，弃去上清液，沉淀用少量磷酸盐缓冲液(pH7.0)溶解，在0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)中充分透析

第一次羟基磷灰石柱层析

将透析后的粗品液加到羟基磷灰石层析柱上，加样量为18毫升，然后在洗脱过程中以0.005-0.06摩尔/升的线性梯度磷酸盐缓冲液(pH7.0，含0.15摩尔/升氯化钠)洗脱，流速为0.5毫升/分钟，洗脱总体积为800毫升。用自动部分收集器收集洗脱液。对各管进行光谱测定，将藻红蛋白含量和纯度较高的收集液合并在一起，加入固体硫酸铵至80％饱和度，于5℃低温条件下保存。

葡聚糖(Sephadex G-200)凝胶柱层析

上述纯化收集的藻红蛋白，加到葡聚糖(Sephadex G-200)凝胶柱上，用0.005摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH值7.0)洗脱，控制流速在2.2毫升/分钟，收集A₅₆₅/A₂₈₀＞4.0的蛋白溶液部分。

第二次羟基磷灰石柱层析

将数次盐析浓缩后的藻红蛋白合并，以8000转/分钟4℃离心45分钟，弃去上清液，沉淀用少量磷酸盐缓冲液(pH 7.0)溶解，在0.005摩尔/升磷酸盐缓冲液(pH7.0)中充分透析。将透析后的藻红蛋白加到羟基磷灰石层析柱上，洗脱方法与第一次羟基磷灰石柱层析时相同，洗脱体积为800毫升，收集A₅₆₅/A₂₈₀＞4.0、A₅₆₅/A₂₈₀＞4.5和A₅₆₅/A₂₈₀＞5.0的部分，制得不同纯度级别的藻红蛋白溶液。

2.藻红蛋白晶体的制备

将A₅₆₅/A₂₈₀＞4.0、4.5或A₅₆₅/A₂₈₀＞5.0的藻红蛋白溶液收集在烧杯中，放入密闭、闭光、恒低温条件(温度控制在10℃)的超净工作上。溶液中加入0.2％(质量/体积)的氯化镁和4％(质量/体积)氯化钠。

将pH传感器浸入液面下，通过pH自动调控装置调节液体的pH值始终稳定在pH7.0。

将固体硫酸铵溶解于0.005摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH7.0)中制备成100％饱和度的硫酸铵溶液，并用0.2微米的滤膜过滤除菌。

将饱和硫酸铵溶液缓慢滴加到所盛藻红蛋白溶液中，并轻微搅动，使溶液混合均匀，流速控制在0.5毫升/6分钟，直到溶液中的藻红蛋白以晶体的形式基本析出完全为止。

将晶体混合溶液放入事先低温(5℃)预冷的真空抽滤器中抽滤，抽除滤液，然后用60％饱和度的硫酸铵溶液洗涤晶体4遍。

将所得到的荧光藻红蛋白晶体溶解于0.005摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH7.0)中，按照以上结晶的方法和步骤，实施重结晶，再结晶，即得最后的晶体产品。

将晶体产品存放于60％饱和度的硫酸铵磷酸盐缓冲液溶液中，加入微量防腐剂(0.1％叠氮化钠(NaN3))，于低温(5℃)条件下长期保存。

3.藻红蛋白结构的确定

从条斑紫菜中分离得到的藻红蛋白属于藻胆蛋白的一种，它由α、β、γ三种亚基组成，其分子量分别是17000道尔顿、18000道尔顿和31700道尔顿。条斑紫菜中藻红蛋白主要以稳定的六聚体(αβ)₆γ的形式存在，分子量为229000道尔顿。α亚基含有2个藻红胆素(PEB)，β亚基含有1个藻红胆素(PEB)和0.5个藻尿胆素(PUB)，γ亚基含有2个藻红胆素(PEB)和3个藻尿胆素(PUB)。其发色基团藻红胆素(PEB)的残基与脱辅基蛋白上的半胱氨酸通过硫醚键共价结合，其连接位点在α-84、α140a、β84、β-155和β50、61。

条斑紫菜藻红蛋白在可见光区的495纳米和565纳米处有特征吸收峰，以565纳米处为最大吸收峰。荧光激发峰为495nm，荧光发射峰为576nm。条斑紫菜藻红蛋白等电点约为4.2。

4.藻红蛋白晶体结构的确定

藻红蛋白晶体的晶胞参数为：a＝b＝189.8埃，c＝60.1埃，α＝β＝γ＝90°。通过分子替代的方法，使用藻蓝蛋白分子作为模型和精确的1.9埃分别率，测定红藻藻红蛋白的结构，虽然晶胞的参数是非常相似的和蛋白内部的螺旋组成几乎相同，但是藻蓝蛋白和藻红蛋白晶体的组装有很大的不同，六棱柱围绕z轴旋转-40度，因此，不同的栏间空白之间联系形成了。由于柱子近似圆柱对称，不同的组装排列能够容纳在一个相似的晶胞内。藻红蛋白晶体的组装有一个显著的特征，发色团和蛋白通过藻红胆素(PEB)K139和相对称的β亚基半胱氨酸残基L159和谷氨酰胺L159连接；蛋白和蛋白之间通过α亚基和β亚基的螺旋G和螺旋H之间的环连接。藻红蛋白晶体的组装使得位于β亚基的B50/61位点的藻尿胆素(PUB)可能靠近位于相对称的α亚基A139位点的藻红胆素(PEB)，这两个发色团重心之间的距离约13.0埃，相互方向基本垂直，有一个短的距离是发色团藻红胆素(PEB)K139和相对称的β亚基藻红胆素(PEB)L158，两个发色团之间最近的距离是3.4埃，这两个发色团的平行排列使得它们重心之间的距离有20.3埃。更多的，有一个短的距离是发色团藻红胆素(PEB)K139和相对称的β亚基藻尿胆素(PUB)L50/61，它们重心之间的距离是16.5埃，相互方向基本垂直，因此，藻红蛋白晶体组装在晶态条件下使得激发子相互作用成为可能。

实施例4

1、藻红蛋白的制备

细胞破碎

称取适量藻红蛋白原料(如紫菜、多管藻等藻类)，用蒸馏水清洗两次，于0℃条件下用组织破碎机研碎，置入烧杯中，加入pH值7.2、浓度0.005摩尔/升的磷酸盐缓冲液(PBS)，搅拌均匀。于冰浴(0℃)中1800W超声破碎60分钟，将破碎好的粗液于低温条件下(10℃)静置10小时，然后用至少三层的纱布过滤三次，去除大的细胞组织碎片，滤液置于预冷的高速冷冻离心机中，10000转/分钟7℃离心30分钟，去掉沉淀，收集上清液；

硫酸铵分级盐析

在上清液中加入固体硫酸铵使之达到30％饱和度，10℃的条件下静置10小时，10000转/分钟7℃离心30分钟，弃去沉淀。上清液中继续加入固体硫酸铵至80％饱和度，低温(10℃)静置24小时，10000转/分钟7℃下离心30分钟，弃去上清液，沉淀用少量磷酸盐缓冲液(pH7.2)溶解，在0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)中充分透析。

第一次羟基磷灰石柱层析

将透析后的粗品液加到羟基磷灰石层析柱上，加样量为30毫升，然后在洗脱过程中以0.005-0.08摩尔/升的线性梯度磷酸盐缓冲液(pH7.2，含0.15摩尔/升氯化钠)洗脱，流速为1.0毫升/分钟，洗脱总体积为600毫升。用自动部分收集器收集洗脱液。对各管进行光谱测定，将藻红蛋白含量和纯度较高的收集液合并在一起，加入固体硫酸铵至80％饱和度，于低温(10℃)条件下保存。

葡聚糖(Sephadex G-200)凝胶柱层析

上述纯化收集的藻红蛋白，加到葡聚糖(Sephadex G-200)凝胶柱上，用0.005摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH值7.2)洗脱，控制流速在0.5毫升/分钟，收集A₅₆₅/A₂₈₀＞4.0的蛋白溶液部分。

第二次羟基磷灰石柱层析

将数次盐析浓缩后的藻红蛋白合并，以10000转/分钟7℃离心30分钟，弃去上清液，沉淀用少量磷酸盐缓冲液(pH 7.2溶解，在0.005摩尔/升磷酸盐缓冲液(pH7.2)中充分透析。将透析后的藻红蛋白加到羟基磷灰石层析柱上，洗脱方法与第一次羟基磷灰石柱层析时相同，洗脱体积为600毫升，收集A₅₆₅/A₂₈₀＞4.0、A₅₆₅/A₂₈₀＞4.5和A₅₆₅/A₂₈₀＞5.0的部分，制得不同纯度级别的藻红蛋白溶液。

2.藻红蛋白晶体的制备

将A₅₆₅/A₂₈₀＞4.0、4.5或A₅₆₅/A₂₈₀＞5.0的藻红蛋白溶液收集在烧杯中，放入密闭、闭光、恒低温条件(温度控制在10℃)的超净工作上。溶液中加入0.2％(质量/体积)的氯化镁和4％(质量/体积)氯化钠。

将pH传感器浸入液面下，通过pH自动调控装置调节液体的pH值始终稳定在pH7.2。

将固体硫酸铵溶解于0.005摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH7.2)中制备成100％饱和度的硫酸铵溶液，并用0.2微米的滤膜过滤除菌。

将饱和硫酸铵溶液缓慢滴加到所盛藻红蛋白溶液中，并轻微搅动，使溶液混合均匀，流速控制在0.1毫升/6分钟，直到溶液中的藻红蛋白以晶体的形式基本析出完全为止。

将晶体混合溶液放入事先低温(5℃)预冷的真空抽滤器中抽滤，抽除滤液，然后用50～60％饱和度的硫酸铵溶液洗涤晶体5遍。

将所得到的荧光藻红蛋白晶体溶解于0.005摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH7.2)中，按照以上结晶的方法和步骤，实施重结晶，再结晶，即得最后的晶体产品。

将晶体产品存放于65％饱和度的硫酸铵磷酸盐缓冲液溶液中，加入微量防腐剂(0.1％叠氮化钠(NaN3))，于低温(4℃)条件下长期保存。

3.藻红蛋白结构的确定

从条斑紫菜中分离得到的藻红蛋白属于藻胆蛋白的一种，它由α、β、γ三种亚基组成，其分子量分别是17000道尔顿、18000道尔顿和31700道尔顿。条斑紫菜中藻红蛋白主要以稳定的六聚体(αβ)₆γ的形式存在，分子量为229000道尔顿。α亚基含有2个藻红胆素(PEB)，β亚基含有1个藻红胆素(PEB)和0.5个藻尿胆素(PUB)，γ亚基含有2个藻红胆素(PEB)和3个藻尿胆素(PUB)。其发色基团藻红胆素(PEB)的残基与脱辅基蛋白上的半胱氨酸通过硫醚键共价结合，其连接位点在α-84、α140a、β84、β-155和β50、61。

条斑紫菜藻红蛋白在可见光区的495纳米和565纳米处有特征吸收峰，以565纳米处为最大吸收峰。荧光激发峰为495nm，荧光发射峰为576nm。条斑紫菜藻红蛋白等电点约为4.2。

4.藻红蛋白晶体结构的确定

藻红蛋白晶体的晶胞参数为：a＝b＝189.8埃，c＝60.1埃，α＝β＝γ＝90°。通过分子替代的方法，使用藻蓝蛋白分子作为模型和精确的1.9埃分别率，测定红藻藻红蛋白的结构，虽然晶胞的参数是非常相似的和蛋白内部的螺旋组成几乎相同，但是藻蓝蛋白和藻红蛋白晶体的组装有很大的不同，六棱柱围绕z轴旋转-40度，因此，不同的栏间空白之间联系形成了。由于柱子近似圆柱对称，不同的组装排列能够容纳在一个相似的晶胞内。藻红蛋白晶体的组装有一个显著的特征，发色团和蛋白通过藻红胆素(PEB)K139和相对称的β亚基半胱氨酸残基L159和谷氨酰胺L159连接；蛋白和蛋白之间通过α亚基和β亚基的螺旋G和螺旋H之间的环连接。藻红蛋白晶体的组装使得位于β亚基的B50/61位点的藻尿胆素(PUB)可能靠近位于相对称的α亚基A139位点的藻红胆素(PEB)，这两个发色团重心之间的距离约13.0埃，相互方向基本垂直，有一个短的距离是发色团藻红胆素(PEB)K139和相对称的β亚基藻红胆素(PEB)L158，两个发色团之间最近的距离是3.4埃，这两个发色团的平行排列使得它们重心之间的距离有20.3埃。更多的，有一个短的距离是发色团藻红胆素(PEB)K139和相对称的β亚基藻尿胆素(PUB)L50/61，它们重心之间的距离是16.5埃，相互方向基本垂直，因此，藻红蛋白晶体组装在晶态条件下使得激发子相互作用成为可能。

实施例5

1、藻红蛋白的制备

细胞破碎

称取适量藻红蛋白原料(如紫菜、多管藻等藻类)，用蒸馏水清洗两次，于4℃条件下用组织破碎机研碎，置入烧杯中，加入pH值7.4、浓度0.005摩尔/升的磷酸盐缓冲液(PBS)，搅拌均匀。于冰浴中1800W超声破碎60分钟，将破碎好的粗液于低温条件下(4℃)静置10小时，然后用至少三层的纱布过滤三次，去除大的细胞组织碎片，滤液置于预冷的高速冷冻离心机中，10000转/分钟10℃离心30分钟，去掉沉淀，收集上清液；

硫酸铵分级盐析

在上清液中加入固体硫酸铵使之达到30％饱和度，10℃的条件下静置10小时，10000转/分钟10℃下离心30分钟，弃去沉淀。上清液中继续加入固体硫酸铵至80％饱和度，低温(10℃)静置24小时，10000转/分钟10℃下离心30分钟，弃去上清液，沉淀用少量磷酸盐缓冲液(pH7.4)溶解，在0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)中充分透析

第一次羟基磷灰石柱层析

将透析后的粗品液加到羟基磷灰石层析柱上，加样量为30毫升，然后在洗脱过程中以0.005-0.050摩尔/升的线性梯度磷酸盐缓冲液(pH7.4，含0.15摩尔/升氯化钠)洗脱，流速为1.8毫升/分钟，洗脱总体积为600毫升。用自动部分收集器收集洗脱液。对各管进行光谱测定，将藻红蛋白含量和纯度较高的收集液合并在一起，加入固体硫酸铵至80％饱和度，于低温(5℃)条件下保存。

葡聚糖(Sephadex G-200)凝胶柱层析

上述纯化收集的藻红蛋白，加到葡聚糖(Sephadex G-200)凝胶柱上，用0.005摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH值7.4)洗脱，控制流速在0.5毫升/分钟，收集A₅₆₅/A₂₈₀＞4.0的蛋白溶液部分。

第二次羟基磷灰石柱层析

将数次盐析浓缩后的藻红蛋白合并，以10000转/分钟2℃下离心30分钟，弃去上清液，沉淀用少量磷酸盐缓冲液(pH 7.0)溶解，在0.005摩尔/升磷酸盐缓冲液(pH7.4)中充分透析。将透析后的藻红蛋白加到羟基磷灰石层析柱上，洗脱方法与第一次羟基磷灰石柱层析时相同，洗脱体积为600毫升，收集A₅₆₅/A₂₈₀＞4.0、A₅₆₅/A₂₈₀＞4.5和A₅₆₅/A₂₈₀＞5.0的部分，制得不同纯度级别的藻红蛋白溶液。

2.藻红蛋白晶体的制备

将A₅₆₅/A₂₈₀＞4.0、4.5或A₅₆₅/A₂₈₀＞5.0的藻红蛋白溶液收集在烧杯中，放入密闭、闭光、恒低温条件(温度控制在10℃)的超净工作上。溶液中加入0.2％(质量/体积)的氯化镁和4％(质量/体积)氯化钠。

将pH传感器浸入液面下，通过pH自动调控装置调节液体的pH值始终稳定在pH7.4。

将固体硫酸铵溶解于0.005摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH7.4)中制备成100％饱和度的硫酸铵溶液，并用0.2微米的滤膜过滤除菌。

将饱和硫酸铵溶液缓慢滴加到所盛藻红蛋白溶液中，并轻微搅动，使溶液混合均匀，流速控制在0.1毫升/6分钟，直到溶液中的藻红蛋白以晶体的形式基本析出完全为止。

将晶体混合溶液放入事先低温(7℃)预冷的真空抽滤器中抽滤，抽除滤液，然后用50～60％饱和度的硫酸铵溶液洗涤晶体5遍。

将所得到的荧光藻红蛋白晶体溶解于0.005摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH7.4)中，按照以上结晶的方法和步骤，实施重结晶，再结晶，即得最后的晶体产品。

将晶体产品存放于65％饱和度的硫酸铵磷酸盐缓冲液溶液中，加入微量防腐剂(0.1％叠氮化钠(NaN3))，于低温(5℃)条件下长期保存。

3.藻红蛋白结构的确定

从条斑紫菜中分离得到的藻红蛋白属于藻胆蛋白的一种，它由α、β、γ三种亚基组成，其分子量分别是17000道尔顿、18000道尔顿和31700道尔顿。条斑紫菜中藻红蛋白主要以稳定的六聚体(αβ)₆γ的形式存在，分子量为229000道尔顿。α亚基含有2个藻红胆素(PEB)，β亚基含有1个藻红胆素(PEB)和0.5个藻尿胆素(PUB)，γ亚基含有2个藻红胆素(PEB)和3个藻尿胆素(PUB)。其发色基团藻红胆素(PEB)的残基与脱辅基蛋白上的半胱氨酸通过硫醚键共价结合，其连接位点在α-84、α140a、β84、β-155和β50、61。

条斑紫菜藻红蛋白在可见光区的495纳米和565纳米处有特征吸收峰，以565纳米处为最大吸收峰。荧光激发峰为495nm，荧光发射峰为576nm。条斑紫菜藻红蛋白等电点约为4.2。

4.藻红蛋白晶体结构的确定

藻红蛋白晶体的晶胞参数为：a＝b＝189.8埃，c＝60.1埃，α＝β＝γ＝90°。通过分子替代的方法，使用藻蓝蛋白分子作为模型和精确的1.9埃分别率，测定红藻藻红蛋白的结构，虽然晶胞的参数是非常相似的和蛋白内部的螺旋组成几乎相同，但是藻蓝蛋白和藻红蛋白晶体的组装有很大的不同，六棱柱围绕z轴旋转-40度，因此，不同的栏间空白之间联系形成了。由于柱子近似圆柱对称，不同的组装排列能够容纳在一个相似的晶胞内。藻红蛋白晶体的组装有一个显著的特征，发色团和蛋白通过藻红胆素(PEB)K139和相对称的β亚基半胱氨酸残基L159和谷氨酰胺L159连接；蛋白和蛋白之间通过α亚基和β亚基的螺旋G和螺旋H之间的环连接。藻红蛋白晶体的组装使得位于β亚基的B50/61位点的藻尿胆素(PUB)可能靠近位于相对称的α亚基A139位点的藻红胆素(PEB)，这两个发色团重心之间的距离约13.0埃，相互方向基本垂直，有一个短的距离是发色团藻红胆素(PEB)K139和相对称的β亚基藻红胆素(PEB)L158，两个发色团之间最近的距离是3.4埃，这两个发色团的平行排列使得它们重心之间的距离有20.3埃。更多的，有一个短的距离是发色团藻红胆素(PEB)K139和相对称的β亚基藻尿胆素(PUB)L50/61，它们重心之间的距离是16.5埃，相互方向基本垂直，因此，藻红蛋白晶体组装在晶态条件下使得激发子相互作用成为可能。

Claims (6)

1.一种藻红蛋白溶液的制备方法，其特征在于，将藻细胞破碎后，通过过滤和高速冷冻离心分离，去除沉淀，收集上清，分级盐析后收集藻红蛋白沉淀，沉淀溶解于磷酸盐缓冲液后依次经过羟基磷灰石、葡聚糖凝胶Sephadex G-150或Sephadex G-200、羟基磷灰石柱层析，羟基磷灰石柱层析时使用浓度范围为0.005-0.1摩尔/升的线性梯度磷酸盐缓冲液洗脱，控制流速在0.5-2.5毫升/分钟，最后收集A₅₆₅/A₂₈₀＞4.0、A₅₆₅/A₂₈₀＞4.5、A₅₆₅/A₂₈₀＞5.0一种或多种不同纯度要求的藻红蛋白溶液，制成不同纯度级别的藻红蛋白溶液。

2.根据权利要求1所述的藻红蛋白溶液的制备方法，其特征在于，所述藻红蛋白溶液在羟基磷灰石柱层析过程中使用浓度范围为0.005-0.05摩尔/升的线性梯度磷酸盐缓冲液洗脱。

3.根据权利要求1所述的藻红蛋白溶液的制备方法，其特征在于，所述藻红蛋白溶液在羟基磷灰石柱层析过程中使用线性梯度磷酸盐缓冲液洗脱，洗脱流速控制在1.0-2.0毫升/分钟。

4.一种藻红蛋白晶体的制备方法，其特征在于，将一定纯度的藻红蛋白放在闭光封闭的环境中，加入0.2％质量/体积的氯化镁和4％质量/体积的氯化钠，调节pH值使其在晶体的成长过程中始终稳定在pH6.5～7.4的范围内，线性梯度地加入硫酸铵并轻微搅动，使其转变成粗晶体，通过重结晶，再结晶，即得最后的晶体产品。

5.根据权利要求4所述的藻红蛋白晶体的制备方法，其特征在于，所述的在晶体的成长过程中始终稳定在pH6.8～7.2的范围内。

6.一种藻红蛋白晶体，分子结构为通过硫醚键连接的载体蛋白与发色团---开链线性延展的四吡咯化合物，脱辅蛋白单体由α、β、γ三种亚基组成，在适宜波长激发下能发射强烈荧光，特征吸收峰为560～570nm，荧光激发峰为480～500nm，荧光发射峰为575～580nm，其特征在于所述的藻红蛋白为晶体结构，所述的藻红蛋白晶体的组装为发色团和蛋白通过藻红胆素K139和相对称的β亚基半胱氨酸残基L159和谷氨酰胺L159连接；蛋白和蛋白之间通过α亚基和β亚基的螺旋G和螺旋H之间的环连接；所述的藻红蛋白晶体的晶胞参数为：

α＝β＝γ＝90°。

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