CN109655606A - 一种利用3d类器官评价药物肠毒性的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用3D类器官模型评价药物肠毒性的检测方法。在该发明中,首先对C57BL/6小鼠的小肠隐窝进行分选,接种到含有基质胶的培养皿中,培养于Advanced DMEM/F12培养基中,并对3D类器官进行形态观察。其次,用阳性化合物对3D类器官模型进行验证,包括3D类器官形态的变化和IC50检测。最后,利用该模型对新药进行毒理学研究,具体包括药物的IC50检测,3D类器官凋亡情况,药物诱导类器官凋亡的机制。该检测方法具有简便、快速、灵敏度高的优点,可结合3D类器官模型进行药物肠毒性检测,也可进行药物肠毒性机制的研究。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种利用3D类器官模型进行药物肠毒性的评价方法。
背景技术
肠道是人类最重要的消化器官,也是最大的免疫器官。哺乳动物的肠道由小肠、大肠和直肠三段组成。小肠主要进行大量的消化作用,而且几乎所有的消化产物的吸收都是在小肠中进行的。大肠的主要功能是浓缩食物残渣形成粪便,然后由直肠排出体外。肠道不仅是消化器官,还是人体最大的排毒器官。食物和药物经口服后,最先接触的身体屏障就是胃肠道。胃肠道是人体的第一道防线。肠道中不仅有很多转运体,还有很多代谢酶。这些转运体和代谢酶可以通过外排和代谢底物将物质排出体外,起到保护身体的作用。然而,随着饮食结构和精神、社会等生活因素的改变,胃肠道功能障碍性疾病也越来越成为影响现代人生活质量的重要疾病。
目前,口服给药以其安全性较高等优点成为临床上最常见的给药方式。药物进入机体内,一般要经过吸收、分布、代谢和排泄的过程,对于口服药物来说,其在小肠的吸收最为重要,因为这是药物在机体内发挥药效的前提。而小肠绒毛的数量,形态结构和长度很大程度上决定了小肠的消化吸收功能。药物进入小肠后如果引起小肠绒毛形态上的变化,则会影响绒毛的消化吸收面积和单位面积的细胞数,降低小肠的消化吸收功能。研究表明,小肠黏膜具有重要的免疫功能。肠道黏膜因其黏膜上皮结构的完整性与机体的免疫功能密切相关,是机体抵抗病原微生物进入机体的第一道免疫屏障。肠道粘膜表面上皮有许多肠绒毛,形成肠腺或称隐窝,其分泌物排出到绒毛基部之间。绒毛表面的细胞有两类:吸收细胞和杯状细胞。吸收细胞是小肠上皮中最多的一种细胞,具有吸收功能,并起着机械屏障的作用。而杯状细胞是构成肠道机械屏障的结构之一,它能分泌粘液于肠道黏膜的表面起润滑和保护作用,并可通过特异性、非特异性免疫机制参与并调节肠道局部免疫机能。除此之外,小肠上皮还包括分泌各种胃肠道激素的内分泌细胞和能产生抗菌肽的潘氏细胞,对小肠粘膜起着协调增强的作用。
随着医药工业的迅猛发展,新药如雨后春笋般层出不穷,数量日益繁多。在新药研发过程中,药物的临床前安全性评价十分重要。药物安全性评价是指采用大于临床用药剂量,或长于临床用药时间给动物用药,发现并评价药物对动物机体潜在毒性作用,毒性表现以及毒性靶器官等等,然后将其实验结果外推到小剂量相同化合物的大量人群。药物安全性评价实验不仅可以初步了解单次给药和多次给药时产生毒性的剂量范围,为进一步毒性研究或临床设计提供依据,还可以寻找到药物的毒副作用靶器官,判断毒副作用的可逆性,为新药的进一步研究改造、指导临床合理用药提供取舍根据。
细胞毒性药物是指一类可以有效杀伤并抑制细胞增殖的药物。其可以通过口服、吸入或皮肤接触等方式造成泌尿系统、消化系统、肝肾系统等损伤,甚至可以导致畸形。常见的细胞毒性药物有生物碱类、抗生素类、烷化剂类等等。已知具有肠毒性的药物有喜树碱类,如伊立替康,其能够引起肠上皮细胞释放双链DNA,双链DNA由外泌体携带进入微环境的固有免疫细胞,激活AIM2介导的炎症小体反应,进而导致肠道局部炎性损伤。
目前,用于药物毒性评价及安全性评价的模型主要有体内模型和体外模型两种。体内模型主要是动物模型如大鼠、小鼠、斑马鱼等等。药物毒性实验需要大量的实验动物,且需要以高剂量或长期给药使实验动物致残或致死。这些实验手段残忍,不符合实验动物伦理及福利要求,而且整体动物实验耗资巨大,所以急需替代的药物毒性研究方法。体外模型主要是细胞模型,常用的用作药物安全性评价的细胞系主要分为有限细胞系、连续细胞系和干细胞系等3种。这些细胞系都有各自的限制:有限细胞系有的不仅难以获得,变异性大,而且只能进行有限的传代增值;连续细胞系(也叫永生性细胞系)的生物学特征已经变异,如肿瘤细胞系已经丧失了正常的增殖分化调控能力;干细胞虽然可以长时间增殖分化,但是很难维持原位细胞特性所必须的细胞与细胞,细胞与基质之间的相互作用,生长环境与体内微环境差异较大。由于目前使用的药物毒性评价模型有种种缺点,目前急需一种新型的模型来突破这些限制。
2009年,Toshiro Sato等人报道了在体外分离并培养小鼠的小肠隐窝,并将其与基质胶混合后加入细胞培养板中,待基质胶凝固后再加入含有多种生长因子的培养基培养。小肠隐窝中存在的干细胞在适宜的条件下具有分化再生功能,在基质胶中形成一个三维的球状类器官(organoid)结构,因此称之为3D类器官。类器官中不仅有Lgr5类型的干细胞,还包括负责营养吸收的肠上皮细胞、能分泌粘液保护其他成员的杯状细胞、分泌各种胃肠道激素的内分泌细胞、能产生抗菌肽的潘氏细胞等等。这说明肠干细胞不仅能够实现增殖而且能分化形成各种细胞,并且类器官在体外能传代培养2年之久,同时仍保持增殖和分化的能力。相比于传统的2D细胞模型来说,3D类器官是由正常的小肠干细胞分化而来,因此其在生理上与小肠上皮更为相似。并且培养时间较短,节约了时间和成本。
目前,3D类器官已经应用到药物筛选、人类器官发育研究,疾病机制研究和个性化医疗等很多领域,但是利用3D类器官研究药物毒性及安全性评价并没有报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有药物毒性评价模型的缺点,提供一种创新的利用3D类器官模型评价药物的肠毒性的方法。
具体包括:
本发明提出了3D类器官在检测药物的肠毒性中的应用。
本发明提出了一种通过3D类器官检测药物的肠毒性的方法,所述方法具体包括以下步骤:
(1)3D类器官的培养;
(2)3D类器官培养至出芽且形成绒毛状结构后给药;
(3)给药48小时后对3D类器官进行荧光拍照,根据3D类器官的形态破坏的程度和数量来确定药物的肠毒性。
步骤(1)中,本发明中的3D类器官是细胞团中干细胞自行生长分化形成的3D球状结构,其中新形成的隐窝向外突起,内部形成绒毛状的结构。
步骤(1)中,所述3D类器官采用完全培养基进行培养。
即,首先将小肠隐窝分离出来,随后将隐窝与基质胶混合、加入完全培养基,在37℃的CO2培养箱中培养,得到成熟的3D类器官。
其中,所述培养的时间为3-7天;优选地,为3天。
其中,所述完全培养基含基础培养基和生长因子。
其中,所述基础培养基含有以下体积百分比的组分:1%-3%B27、1%-3%N2、0.2%-0.5%N-乙酰、1%-3%谷氨酰胺、1%-3%HEPES、1%-3%双抗、90%-95%AdvancedDMEM/F12。
优选地,所述完全培养基含有体积百分比为99.7%的基础培养基(2%B27、1%N2、0.2%N-乙酰、1%谷氨酰胺、1%HEPES、1%双抗、93.5%Advanced DMEM/F12)和体积百分比为0.3%的生长因子。
其中,所述生长因子包括Responding,m-noggin、m-EGF等。
所述双抗指青霉素/链霉素混合液,在细胞培养中用于避免细胞污染、抑制细菌生长的抗生素。
所述B27是一种无血清补充剂,常用于神经元细胞的培养。
所述N2是一种无血清补充剂,用于补充有生长因子的培养基。
所述Advanced DMEM/F12指一种基础培养基,可以通过减少胎牛血清(FBS)补充来培养哺乳动物细胞。
所述HEPES指一种非离子两性缓冲液,其在pH 7.2-7.4范围内具有较好的缓冲能力。其最大优点是在开放式培养或细胞观察时能维持较恒定的pH值。
步骤(2)中,所述药物为伊立替康、臭椿酮、顺铂等;优选地,为伊立替康、臭椿酮。
步骤(2)中,所述药物采用溶剂进行溶解后,加入3D类器官。
其中,所述溶剂包括DMSO、甲醇、异丙醇等中的一种或几种。
步骤(2)在给药过程中,当所用药物的溶剂为DMSO时,要保证DMSO终浓度不能高于千分之一,以免DMSO毒性影响实验结果。
步骤(3)中,在荧光拍照前,需要向培养基中加入碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)和Hochest 33342,然后在37℃细胞培养箱中避光孵育10分钟,随后进行荧光拍照。
具体地,在荧光拍照前,需要向100μl培养基中加入1μl的10μg/ml的碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)和1μl的10μg/ml的Hochest 33342,然后在37℃细胞培养箱中避光孵育10分钟。
步骤(3)中,若药物有肠毒性,则会使3D类器官中的细胞凋亡,进而使类器官形态破坏,因此,类器官形态破坏的程度和数量可以指示药物的肠毒性强度。
其中,所述“类器官形态破坏的程度”是指类器官3D形态瓦解程度、类器官中细胞凋亡程度等。
给药后类器官形态破坏的程度越大、数量越多,则证明药物的肠毒性越强。
在一个具体实施方式中,3D类器官给药具体时间为培养第三天。将药物(如伊立替康、臭椿酮)用DMSO溶解后加入含多种生长因子的完全培养基中,随后吸出原有培养基(此处“吸出”动作,是将原有的没有加药的完全培养基吸出,将加药的培养基替换进去),加入含有药物的新培养基。在给药48小时后对3D类器官进行荧光拍照。该实验可从3D类器官中的活细胞和死细胞数量的变化来证明该药物的肠毒性,为下一步实验提供依据。
本发明选择第三天给药是因为3D类器官在培养第三天时,大多数3D类器官都“出芽”了,而给药是要在3D类器官形成绒毛状结构以后,若3D类器官“出芽”时间比第三天提前或拖后,那么给药时间可以变动,否则对结果会有影响。
本发明选择在给药后48小时进行荧光拍照是为了和MTS法检测IC50的给药时间相呼应。而且本发明经过多个时间点给药实验,结果表明48小时进行荧光拍照现象最明显。
本发明还提出了3D类器官在检测药物IC50中的应用。
本发明还提出了一种通过3D类器官检测药物IC50的方法,所述方法具体包括以下步骤:
(1)3D类器官的培养;
(2)3D类器官培养至出芽且形成绒毛状结构后给药;
(3)给药48小时后MTS法检测药物IC50。
步骤(1)中,本发明中的3D类器官是细胞团中干细胞自行生长分化形成的3D球状结构,其中新形成的隐窝向外突起,内部形成绒毛状的结构。
步骤(1)中,所述3D类器官采用完全培养基进行培养。
即,首先将小肠隐窝分离出来,随后将隐窝与基质胶混合、加入完全培养基,在37℃的CO2培养箱中培养,得到成熟的3D类器官。
其中,所述培养的时间为3-7天;优选地,为3天。
其中,所述完全培养基为含基础培养基和生长因子。
其中,所述基础培养基含有以下体积百分比的组分:1%-3%B27、1%-3%N2、0.2%-0.5%N-乙酰、1%-3%谷氨酰胺、1%-3%HEPES、1%-3%双抗、90%-95%AdvancedDMEM/F12。
优选地,所述完全培养基含有体积百分比为99.7%的基础培养基(2%B27、1%N2、0.2%N-乙酰、1%谷氨酰胺、1%HEPES、1%双抗、93.5%Advanced DMEM/F12)和体积百分比为0.3%的生长因子。
其中,所述生长因子包括Responding,m-noggin、m-EGF等。
所述双抗指青霉素/链霉素混合液,在细胞培养中用于避免细胞污染、抑制细菌生长的抗生素。
所述B27是一种无血清补充剂,常用于神经元细胞的培养。
所述N2是一种无血清补充剂,用于补充有生长因子的培养基。
所述Advanced DMEM/F12指一种基础培养基,可以通过减少胎牛血清(FBS)补充来培养哺乳动物细胞。
所述HEPES指一种非离子两性缓冲液,其在pH 7.2-7.4范围内具有较好的缓冲能力。其最大优点是在开放式培养或细胞观察时能维持较恒定的pH值。
步骤(2)中,所述药物为伊立替康、臭椿酮、顺铂等;优选地,为伊立替康、臭椿酮。
步骤(2)中,所述药物采用溶剂进行溶解后,加入3D类器官。
其中,所述溶剂包括DMSO、甲醇、异丙醇等中的一种或几种。
步骤(2)在给药过程中,当所用药物的溶剂为DMSO时,要保证DMSO终浓度不能高于千分之一,以免DMSO毒性影响实验结果。
步骤(2)中,在给药48小时后包括向3D类器官的培养基中加入MTS试剂,并在细胞培养箱中避光孵育的步骤。
其中,所述培养基中加入MTS试剂的终浓度优选为1.90mg/ml。
其中,所述细胞培养箱的温度为36℃-37℃;优选地,为37℃。
其中,所述避光孵育的时间为1-2小时;优选地,为2小时。
本发明所述MTS试剂盒的原理是:MTS被细胞生物还原成一种可溶于组织培养基的水溶性蓝紫色甲臢化合物,甲臢化合物会留存在细胞内,在490-500nm波长下产生吸收峰。MTS是一种光敏感试剂,若暴露在光线下数小时后可能会发生褪色,这种褪色反应可能会导致490nm的背景吸光值轻微升高,因此,本发明选择避光孵育。
在一个具体实施方式中,3D类器官给药时间为培养第三天。在给药48小时后向3D类器官的培养基中加入MTS试剂,并在37℃细胞培养箱中避光孵育2小时。该实验可以确定药物对3D类器官的毒性剂量,实验结果可说明药物肠毒性的强弱。
本发明优选在第三天给药,是因为3D类器官在培养第三天时,大多数类器官都“出芽”了,而给药是要在3D类器官形成绒毛状结构以后,若类器官“出芽”时间比第三天提前或拖后,那么给药时间可以变动,否则对结果会有影响。
本发明选择在给药后48小时进行荧光拍照是为了和MTS法检测IC50的给药时间相呼应。而且本发明经过多个时间点给药实验,结果表明48小时进行荧光拍照现象最明显。
本发明还提出了3D类器官在检测蛋白水平中的应用。
本发明还提出了一种通过3D类器官检测蛋白水平的方法,所述方法具体包括以下步骤:
(1)3D类器官的培养;
(2)3D类器官培养至出芽且形成绒毛状结构后给药;
(3)给药48小时后检测蛋白水平。
步骤(1)中,本发明中的3D类器官是细胞团中干细胞自行生长分化形成的3D球状结构,其中新形成的隐窝向外突起,内部形成绒毛状的结构。
步骤(1)中,所述3D类器官采用完全培养基进行培养。
即,首先将小肠隐窝分离出来,随后将隐窝与基质胶混合、加入完全培养基,在37℃的CO2培养箱中培养,得到成熟的3D类器官。
其中,所述培养的时间为3-7天;优选地,为3天。
其中,所述完全培养基为含基础培养基和生长因子。
其中,所述基础培养基含有以下体积百分比的组分:1%-3%B27、1%-3%N2、0.2%-0.5%N-乙酰、1%-3%谷氨酰胺、1%-3%HEPES、1%-3%双抗、90%-95%AdvancedDMEM/F12。
优选地,所述完全培养基含有体积百分比为99.7%的基础培养基(2%B27、1%N2、0.2%N-乙酰、1%谷氨酰胺、1%HEPES、1%双抗、93.5%Advanced DMEM/F12)和体积百分比为0.3%的生长因子。
其中,所述生长因子包括Responding,m-noggin、m-EGF等。
所述双抗指青霉素/链霉素混合液,在细胞培养中用于避免细胞污染、抑制细菌生长的抗生素。
所述B27是一种无血清补充剂,常用于神经元细胞的培养。
所述N2是一种无血清补充剂,用于补充有生长因子的培养基。
所述Advanced DMEM/F12指一种基础培养基,可以通过减少胎牛血清(FBS)补充来培养哺乳动物细胞。
所述HEPES指一种非离子两性缓冲液,其在pH 7.2-7.4范围内具有较好的缓冲能力。其最大优点是在开放式培养或细胞观察时能维持较恒定的pH值。
步骤(2)中,所述药物为伊立替康、臭椿酮、顺铂等;优选地,为伊立替康、臭椿酮。
步骤(2)中,所述药物采用溶剂进行溶解后,加入3D类器官。
其中,所述溶剂包括DMSO、甲醇、异丙醇等中的一种或几种。
步骤(2)在给药过程中,当所用药物溶剂为DMSO时,要保证DMSO终浓度不能高于千分之一,以免DMSO毒性影响实验结果。
步骤(3)中,所述蛋白指原型caspase-3和剪切caspase-3。
本发明在步骤(3)给药48小时后还包括:加入预冷的PBS、打碎基质胶、收集、静置、离心、加入裂解液等步骤。
其中,加入预冷的PBS的目的为PBS可以使基质胶变为液态便于收集3D类器官。
其中,所述静置具体指将收集到的孔中溶液及基质胶碎片置于冰上静置10分钟。
其中,所述离心的条件为:室温下800rpm离心5min。
其中,所述裂解液为RIPA裂解液、NP-40、TritonX-100等;优选地,为RIPA裂解液。
本发明先选择冰上静置,然后仅进行一次离心,既能避免多次离心对隐窝造成的不良影响,还能将重量大的隐窝沉降至底部,将重量小的碎片留在上清液中,起到分离的作用。
在一个具体实施方式中,3D类器官给药具体时间为培养第三天。给药48小时后吸出培养基(此处“吸出”动作,是将原有的没有加药的完全培养基吸出,将加药的培养基替换进去),用PBS清洗孔中残留液体,加入新的100μl的PBS,用中枪头打碎基质胶,使含有类器官的基质胶分散在PBS中。将孔中溶液及基质胶碎片收集起来,转移到灭菌的1.5ml的EP管中,置于冰上静置10分钟,使基质胶充分融化成液态。将溶液室温下800rpm离心5min,沉淀即为小肠类器官。向沉淀中加入RIPA裂解液提取蛋白。用BCA试剂盒定量后,用Westernblot检测相关蛋白表达量以探究药物肠毒性的致病机理。
本发明选择第三天给药是因为3D类器官在培养第三天时,大多数类器官都“出芽”了,而给药是要在3D类器官形成绒毛状结构以后,若类器官“出芽”时间比第三天提前或拖后,那么给药时间可以变动,否则对结果会有影响。
本发明选择在给药后48小时进行荧光拍照是为了和MTS法检测IC50的给药时间相呼应。而且本发明经过多个时间点给药实验,结果表明48小时进行荧光拍照现象最明显。
本发明的检测方法灵敏度高,例如用MTS试剂盒检测药物IC50时,采用3D类器官测定的IC50比caco-2细胞要低,即采用3D类器官测定的IC50灵敏度比caco-2细胞要高。
与之前的药物毒性的细胞模型相比,本发明3D类器官模型的优势明显。常用的作为药物安全性评价的细胞系主要分为有限细胞系、连续细胞系和干细胞系等3种。这些细胞系都有各自的限制:有限细胞系不仅难以获得,变异性大,而且只能进行有限的传代增值;连续细胞系(也叫永生性细胞系)的生物学特征已经变异,如肿瘤细胞系已经丧失了正常的增殖分化调控能力;干细胞系虽然可以长时间增殖分化,但是很难维持原位细胞特性所必须的细胞与细胞,细胞与基质之间的相互作用,生长环境与体内微环境差异较大。而3D类器官是由正常的小肠干细胞分化而来,与正常的小肠在生理上更为相似;且3D类器官中有多种细胞,在功能和生长微环境上与正常小肠更为相似;且培养时间短,节约时间和成本。
药物筛选和疾病机制研究的范围十分广泛,其中也包括了药物肠毒性的评价。两者差异是包含与被包含的关系。
本发明的有益效果在于,3D类器官中是由正常的小肠干细胞分化而来,与正常的小肠在生理上更为相似;且3D类器官中有多种细胞,在功能和生长微环境上与正常小肠更为相似;且培养时间短,节约时间和成本。为体外评价药物肠毒性提供了一个新型的模型。
附图说明
图1为3D类器官培养第一天至第五天的形态。可以看出,随着培养时间的延长,类器官的大小和“出芽”数量明显增加。
图2为伊立替康(A)和臭椿酮(B)给药后类器官形态变化情况。箭头所指表示3D类器官球状形态结构被破坏。
图3为臭椿酮给药后加入荧光试剂后的形态变化情况。最左两图即Hochest 33342染色类器官表示活细胞,最右两图即PI染色类器官表示凋亡细胞。
图4为伊立替康(A)和臭椿酮(B)给药48小时后的IC50曲线。纵坐标表示细胞存活率,横坐标表示给药浓度的Log值。
图5为臭椿酮给药后在蛋白水平检测Caspase 3前体和剪切体的表达情况。可以看出,随着给药浓度的升高,Caspase 3剪切体的表达量明显升高。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图,对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等,除以下专门提及的内容之外,均为本领域的普遍知识和公共常识,本发明没有特别限制内容。
实施例1 C57BL/6小鼠隐窝的分选及3D类器官的培养
(1)取6-8周龄C57BL/6小鼠的小肠,从距十二指肠1-2cm的位置开始将小肠分成若干个5-8cm长的片段,去除小肠上的结缔组织,并从中间剪开,用预冷的磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline,PBS)清洗干净,然后将其转入含有适量PBS的50ml离心管中,并置于冰上。
(注:以下所有步骤均在无菌环境中操作,且隐窝须尽可能置于冰上。)
(2)在生物安全柜中,将小肠片段用含有青霉素/链霉素(P/S)的PBS清洗3-4次,再将其转移至50ml离心管中,加入25ml含有2mM EDTA的PBS后,于4℃冰箱消化,10min后将小肠片段转移至新的50ml离心管中,并加入25ml含有2mM EDTA的PBS,于4℃冰箱继续消化15min。
(3)将消化好的小肠片段转移至新的50ml离心管中,分次加入50ml含有P/S的PBS,用力地摇晃20次,收集悬浮液;再次将小肠片段转移至另一个50ml离心管,并分次加入50ml含P/S的PBS,继续用力摇晃20次,收集悬浮液。然后用直径为70μm的细胞过滤网过滤两次收集到的悬浮液,并分别至2个新的50ml离心管中,室温下800rpm离心5min,沉淀即为小肠的隐窝。
(4)弃上清,在每个离心管中分别用1ml的Advanced DMEM/F12培养基重悬沉淀,并合并重悬液,取适量的重悬液计数。
(5)取适当体积的重悬液转移至1.5ml的离心管中,并加入适量的Advanced DMEM/F12培养基再重悬,将离心管置于冰上静置5-10分钟使隐窝自然沉降至管底。
(6)待底部出现沉淀后,用移液枪吸出上清液,将底部剩余液体及沉淀上下颠倒使隐窝密度均匀,并取1μl计数。
(7)取一定量的隐窝重悬液于1.5ml的离心管中,并加入预冷的基质胶(Matrigel)重悬沉淀并计数。(基质胶的特性为:在22-35℃为固态,在4℃为液态。)
(8)接板。将96孔板放入37℃细胞培养箱中预热,然后向每个孔中加入5μl含有隐窝的重悬液,使每个孔中隐窝的数量控制在80-100个。
(9)将接种好的96孔板于细胞培养箱中放置10-15min,使基质胶凝固。然后向每孔中加入100μl培养基,然后每隔一天换一次培养基。(培养基中含有Responding,m-noggin和m-EGF三种生长因子,可诱导小肠细胞的分裂及隐窝的扩增。)
实施例2 3D类器官模型的验证
2.1 3D类器官形态的观察
C57BL/6小鼠的隐窝培养从培养第一天开始至第五天,每日将其放置在带有Olympus DP 71照相系统的Olympus IX 71显微镜下观察并拍照。结果如图1所示。从图1中可以看到隐窝分化而成的类器官结构。类器官中间形成了绒毛状的球状空腔,外周由新形成的隐窝组成。
2.2从类器官的形态的变化证明药物的肠毒性
(1)含药物的培养基的配制。用DMSO配制100mM的伊立替康储备液,并用含有生长因子(Responding,m-noggin、m-EGF)的完全培养基稀释到5μM,10μM,20μM,50μM,100μM。用DMSO配制10μM的臭椿酮储备液,并用含有生长因子(Responding,m-noggin、m-EGF)的完全培养基稀释到0.02μM,0.05μM,0.1μM,0.2μM,0.5μM。
(2)在类器官培养的第三天,将类器官中原有的培养基吸出,然后向培养基中分别加入不同浓度梯度的伊立替康和臭椿酮,每个浓度有三个平行。将给药后的类器官放入37℃细胞培养箱中继续培养。
(3)给药24小时和48小时后,将类器官放置在带有Olympus DP 71照相系统的Olympus IX 71显微镜下观察并拍照。结果如图2A-B。结果显示,随着药物伊立替康和臭椿酮浓度的增加,类器官形态破坏的程度和数量明显增加。
2.3给药后类器官中细胞的死亡和损伤情况
(1)在类器官培养后的第三天,向培养基中加入臭椿酮配成终浓度为0.2μM的完全培养基,用于类器官的培养。
(2)给药48小时后,向100μl培养基中加入1μl的10μg/ml的碘化丙啶(PropidiumIodide,PI)和1μl的10μg/ml的Hochest 33342。在37℃细胞培养箱避光孵育10分钟。
(3)用枪头吸出培养基,并用预冷的PBS清洗类器官中残留的培养基,一共清洗三次。
(4)在孔中重新加入100μl预冷的PBS,并将类器官放置在带有Olympus DP71照相系统的Olympus IX 71显微镜下观察并进行荧光拍照。Hochest 33342是一种蓝色荧光染料,可以通过细胞膜,将细胞核染成蓝色。Hochest 33342的最大激发波长为346nm,最大发射波长为460nm。PI不能透过完整细胞膜,但可以通过破损的细胞膜将双链DNA染成红色。PI的最大激发波长为488nm,最大发射波长为630nm。
结果如图3所示,最左两图即Hochest 33342染色类器官表示活细胞,最右两图即PI染色类器官表示凋亡细胞。从图3中可以看出,在给药臭椿酮0.2μM后,3D类器官中凋亡细胞的数量明显增多,活细胞数量明显减少。在分析单个类器官时也发现,形态破坏的类器官中大多是死亡的细胞。这说明0.2μM的臭椿酮能使3D类器官的形态破坏且使其中的细胞凋亡。
实施例3利用3D类器官研究药物的肠毒性剂量
(1)含药物的培养基的配制。配制方式及浓度设置同“实施例2.2”。
(2)在类器官培养第三天时,将细胞板中原有的培养基吸出,加入含有不同浓度伊立替康或臭椿酮的完全培养基,每个浓度设置3个平行组,同时设置3个空白培养基对照孔,将细胞板放入37℃细胞培养箱中继续培养。
(3)在给药48小时后,将细胞板从培养箱中取出,避光加入MTS试剂盒。每孔100μl培养基中悬空加入20μl MTS溶液,加入后轻轻震荡,在避光的37℃细胞培养箱中孵育2小时。
(4)孵育结束后,利用多功能酶标仪(FLUOStar OPTIMA)测定各孔的吸光值(吸收波长为490nm)。
(5)根据各孔吸光值,制作出一条以细胞活性为纵坐标,药物浓度的Log值为横坐标的药物IC50曲线。
实验结果如图4所示,在3D类器官给药48小时后,伊立替康对3D类器官的IC50值为24.76μM,臭椿酮对3D类器官的IC50值为0.25μM。由此说明臭椿酮的肠毒性比伊立替康强。
实施例4利用3D类器官研究药物的肠毒性机理
(1)在类器官培养第三天的时候,吸出原有培养基,分别加入含有0.1μM,0.2μM,0.5μM臭椿酮的培养基,每个浓度设置15个平行组,将96孔板放入37℃细胞培养箱中继续培养48小时。
(2)培养48小时后,吸出原有培养基,用100μl预冷的PBS清洗,每个孔清洗3遍。
(3)冲洗后,每孔加入新的100μl的PBS,用中枪头打碎基质胶,使含有类器官的基质胶分散在PBS中。将加入相同培养基的所有孔中溶液及基质胶碎片收集起来,转移到灭菌的1.5ml的EP管中,置于冰上静置10分钟,使基质胶充分融化成液态。
(4)用大枪头将EP管中液体吹匀,室温下800rpm离心5min,沉淀即为小肠类器官。
(5)弃上清,在每个EP管中加入200μl的含有蛋白酶抑制剂,磷酸酶抑制剂和PMSF的RIPA裂解液,涡旋混匀后在4℃摇床上放置30分钟,并每5分钟涡旋一次。
(6)将裂解好的溶液4℃下12000rpm离心15min,收集上清液即为总蛋白。
(7)用BCA试剂盒对蛋白样品进行定量。
(8)将蛋白提取液和SDS上样缓冲液(loading buffer)以一定比例上样。
(9)将处理好的蛋白样本放入100℃变性5分钟。
(10)配制5%的浓缩胶,10%的分离胶,将玻璃板架好灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶,然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时应当使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。待到浓缩胶凝固后,两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
(11)用水冲洗浓缩胶,然后将其放入电泳槽中。加入足够的电泳液后开始准备上样。用微量进样器贴壁吸取样品,将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。
(12)电泳。电泳时间一般为80~100分钟,电压首先为80V,待蛋白样品至浓缩胶和分离胶的分界处时改至120V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳,进行转膜。
(13)转膜。将滤纸和硝酸纤维素膜用转膜液浸透,将夹子打开使黑的一面保持水平。将不含蛋白样品部分的凝胶切除后,与NC膜和滤纸一同固定于转膜槽中(注意按电极方向固定,且不要产生气泡)电转移时会产热,在槽的一边放一块冰来降温。100V转膜2小时。
(14)转膜完毕后,切下所需条带,立即将蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中,漂洗1-2分钟,以洗去膜上的转膜液。用滤纸吸尽转膜液,将条带放入5%的脱脂奶粉中,室温置于摇床上封闭60分钟。
(15)封闭结束后用洗涤液清洗条带三次,用滤纸吸尽转膜液,加入按一定比例稀释的一抗,置于4℃摇床过夜。
(16)回收一抗。加入Western洗涤液,在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后,再加入洗涤液,洗涤5-10分钟。共洗涤3次。
(17)用滤纸吸干转膜液,立即加入稀释好的二抗,室温避光在摇床上缓慢摇动孵育一小时。
(18)回收二抗。加入Western洗涤液,在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后,再加入洗涤液,洗涤5-10分钟。共洗涤3次。
(19)显影,将条带膜放置在ODYSSEY CLX双色红外激光成像系统中曝光拍照,显示所需条带。
实验结果如图5所示,研究表明,所有的动物细胞在凋亡诱导因子的刺激下都有相似的凋亡途径。而caspase蛋白酶在这一过程中发挥了重要作用,其中caspase-3作为非常重要的效应蛋白在体内最初是以无活性的酶原形式存在的。当收到信号刺激是会发生切割变成有活性的效应蛋白。本发明检测的对照组和给药臭椿酮200nM后的类器官中均有活性的caspase3和原型caspase3的蛋白量。结果表明给药后的类器官中有活性的caspas3的量较对照组有显著性的升高。这说明臭椿酮是通过影响caspase3的活化来影响细胞凋亡的。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下,本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中,并且以所附的权利要求书为保护范围。
Claims (10)
1.一种通过3D类器官检测药物的肠毒性的方法,其特征在于,所述方法具体包括以下步骤:
(1)3D类器官的培养;
(2)3D类器官培养至出芽且形成绒毛状结构后给药;
(3)给药48小时后对3D类器官进行荧光拍照,根据3D类器官的形态破坏的程度和数量来确定药物的肠毒性。
2.一种通过3D类器官检测药物IC50的方法,其特征在于,所述方法具体包括以下步骤:
(1)3D类器官的培养;
(2)3D类器官培养至出芽且形成绒毛状结构后给药;
(3)给药48小时后MTS法检测药物IC50。
3.一种通过3D类器官检测蛋白水平的方法,其特征在于,所述方法具体包括以下步骤:
(1)3D类器官的培养;
(2)3D类器官培养至出芽且形成绒毛状结构后给药;
(3)给药48小时后检测蛋白水平。
4.如权利要求1-3之任一项所述的方法,其特征在于,步骤(1)中,采用完全培养基对3D类器官进行培养,所述完全培养基含基础培养基和生长因子。
5.如权利要求4所述的方法,其特征在于,所述基础培养基含有以下体积百分比的组分:1%-3%B27、1%-3%N2、0.2%-0.5%N-乙酰、1%-3%谷氨酰胺、1%-3%HEPES、1%-3%双抗、90%-95%Advanced DMEM/F12;所述生长因子包括Responding,m-noggin、m-EGF中的一种或多种。
6.如权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤(2)中,在给药48小时后包括向3D类器官的培养基中加入MTS试剂,并在细胞培养箱中避光孵育的步骤。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述培养基中加入MTS试剂的终浓度为1.90mg/ml;和/或,所述细胞培养箱的温度为36℃-37℃;和/或,所述避光孵育的时间为1-2小时。
8.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)给药48小时后还包括:加入PBS、打碎基质胶、收集、静置、离心、加入裂解液步骤。
9.如权利要求8所述的方法,其特征在于,所述静置具体指将收集到的孔中溶液及基质胶碎片置于冰上静置10分钟;和/或,所述离心的条件为:室温下800rpm离心5min;和/或,所述裂解液为RIPA裂解液、NP-40、TritonX-100。
10.如权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤(3)中,所述蛋白指原型caspase-3和剪切caspase-3。
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