CN101703523A - 一种抗肝纤维化有效剂型的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种抗肝纤维化有效剂型的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：(1)鳖甲研粉，过八十目筛，气流粉碎机处理，收集超微粉；(2)将上述超微粉与药学上常规的赋形剂一起制成各种常规剂型；或(2)取鳖甲超微粉进行煎煮，煎煮1.5-5个小时，收集混悬液；将上述混悬液与药学上常规的赋形剂一起制成各种常规剂型；鳖甲经煎煮后，大分子蛋白变性，变性蛋白质易受胃肠道内多种水解酶类的协同催化作用而被消化，转变为简单的小分子肽类物质，符合发挥抗肝纤维化作用的肽段分子量标准及氨基酸序列，与鳖甲中原本存在的少量小分子肽类物质一起，共同发挥抗肝纤维化的作用；从而为药食同源的传统中药鳖甲用于抗肝纤维化临床医疗、中药新药及保健品研发、鳖甲活性物质开发为肽类药物奠定坚实基础和提供科学依据。
Description
技术领域
本发明涉及鳖甲抗肝纤维化有效剂型的制备方法，具体涉及鳖甲微粉与鳖甲水煎液抗肝纤维化有效剂型的制备方法。
背景技术
肝纤维化是各种原因引起的一系列损伤-修复、导致细胞外基质(ECM)合成与降解失衡、合成沉积远远超过降解吸收、以及构成成分比例明显改变的结果，大量ECM沉积于肝小叶内并逐渐形成纤维间隔，严重破坏了肝组织的正常结构和功能，可致肝窦毛细血管化，血流障碍，门脉高压。肝纤维化是各种慢性肝病的共同病理学基础，也是诱发肝硬化肝癌的必经途径。肝纤维化治疗主要包括去除病因与抗纤维化治疗。公认彻底驱除原发病因后，肝纤维化仍可继续进展，机理为活化的肝星状细胞(HSC)通过自分泌或旁分泌再次激活HSC，是故有效的抗纤维化治疗成为控制慢性肝病进展和预防肝硬化肝癌、改善预后不可或缺的重要环节。基因治疗研究取得较大进展，目前存在的主要问题是基因导入的靶向性、表达效率、可调控性及安全性尚未完全解决，真正应用于临床还待时日；目前部分用治肝纤维化的化学药和生物药存在一些毒副反应；许多以鳖甲为君药组方的复方制剂如复方鳖甲软肝片、鳖甲抗纤方、鳖甲煎丸等，抗肝纤维化疗效较好，但价格较昂贵(主要原因是其中天然鳖甲资源有限)，难以满足广大患者尤其是农村和贫困地区的需求，据统计我国约1.3亿人患有肝病，占总人口的10％，针对国情，亟待开发价廉、有效且毒副作用小的抗肝纤维化药物。
鉴于鳖甲“软坚散结”、抗肝纤维化药用的传统剂型至今仍缺乏科学依据，临床应用颇多争议，其单方效用及药效物质基础更有待阐明，查新检索结果表明该诸方面的研究尚未见报道。本发明旨在通过系统的体内、外药理药效学比较研究，明确鳖甲抗肝纤维化的有效剂型、并验证其药效学及物质基础、作用机制，为药食同源的传统中药鳖甲用于抗肝纤维化临床医疗、中药新药及保健品研发、鳖甲活性物质开发为肽类药物奠定坚实基础和提供科学依据。
鳖甲为常用传统中药，源于鳖科动物鳖(Trionyx sinensis Wiegmann)的背甲，具有滋阴潜阳、软坚散结、退热除蒸等功效；主治阴虚发热、劳热骨蒸、虚风内动、癥瘕、久疟疟母等病症。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种抗肝纤维化有效剂型的制备方法。
它通过对中药“软坚散结”、抗肝纤维化代表性药物、复方中的常用“君药”鳖甲之历来存在争议的剂型微粉与水煎液进行系统的体内、外药理药效学对比研究，为鳖甲用于临床治疗肝纤维化疾患用药的传统剂型提供科学依据，阐明其有效剂型、并验证其药效学与物质基础、作用机制，从而为药食同源的传统中药鳖甲用于抗肝纤维化临床医疗、中药新药及保健品研发、鳖甲活性物质开发为肽类药物奠定坚实基础和提供科学依据.
本发明的目的是通过如下技术方案来完成的；一种抗肝纤维化有效剂型的制备方法，它包括下列步骤：
(1)鳖甲研粉，过八十目筛，气流粉碎机处理，收集超微粉；
(2)将上述超微粉与药学上常规的赋形剂一起制成各种常规剂型。
或包括下列步骤：
(1)鳖甲研粉，过八十目筛，气流粉碎机处理，收集超微粉；
(2)取鳖甲超微粉进行煎煮，煎煮1.5-5个小时，收集混悬液；
(3)将上述混悬液与药学上常规的赋形剂一起制成各种常规剂型。
或包括下列步骤：
(1)称取常规研磨的鳖甲粉81---100份，加蒸馏水0.1-5份，超声提取5--30分钟，抽滤，滤渣再加蒸馏水0.1-5份，超声提取5--15分钟，抽滤；合并两次产生的滤液，冷冻干燥后得冻干粉；
(2)用加蒸馏水0.1-5份溶解上述制得的冻干粉，将水溶液装于半透膜(3.500
)内，置0.2-5份蒸馏水中透析1--10小时，温度为2-10℃；同法再透析一次，合并两次膜外透析液，真空冷冻干燥，收集A型冻干粉0.2-10份；
(3)取上述膜内液体，将膜袋置0.2-10份蒸馏水中透析1--6小时，温度为2-10℃；同法透析三次，弃去膜外透析液，将膜内液体真空冷冻干燥，收集B型冻干粉1-20份；
(4)将上述A型冻干粉或B型冻干粉与药学上常规的赋形剂一起制成各种常规剂型。
A型冻干粉为分子量小于6000的物质(鳖甲粗多肽成品)，B型冻干粉为分子量大于6000的物质。
本发明项目通过多学科交叉的研究方法，采用现代科学技术，对鳖甲进行了较系统的抗肝纤维化有效剂型、药效物质基础及其作用机制研究，结果表明，鳖甲抗肝纤维化的药效物质基础为小分子肽类物质、氨基酸；鳖甲水煎液抗肝纤维化的作用明显优于鳖甲微粉，认为鳖甲经煎煮后，对肝星状细胞活化增殖胶原合成起负抑制效应的大分子蛋白变性，变性蛋白质易受胃肠道内多种水解酶类的协同催化作用而被消化，转变为简单的小分子肽类物质，符合发挥抗肝纤维化作用的肽段分子量标准及氨基酸序列，与鳖甲中原本存在的少量小分子肽类物质一起，共同发挥抑制肝星状细胞活化增殖胶原合成、抗肝纤维化的作用。从而为鳖甲用于临床治疗肝纤维化疾患用药的传统剂型提供了实验依据，为鳖甲用于抗肝纤维化临床医疗、中药新药及保健品研发、鳖甲活性物质开发为肽类药物奠定坚实基础和提供科学依据。
具体实施方式
以下通过实例来进一步详细说明本发明。
本发明所述的一种抗肝纤维化有效剂型的制备方法，它可以按照以下三种方法制备；
第一种方法制备鳖甲微粉，包括下列步骤：
(1)鳖甲研粉，过八十目筛，气流粉碎机处理，收集超微粉；
(2)将上述超微粉与药学上可接受的、常规的赋形剂一起制成各种常规剂型。
第二种方法制备鳖甲水煎液，包括下列步骤：
(1)鳖甲研粉，过八十目筛，气流粉碎机处理，收集超微粉；
(2)取鳖甲超微粉进行煎煮，煎煮1.5-5个小时，收集混悬液；
(3)将上述混悬液与药学上可接受的、常规的赋形剂一起制成各种常规剂型。
第三种方法附设制备鳖甲粗提物质(用以药理药效学对比分析研究、药效物质基础研究)，包括下列步骤：
(1)称取常规研磨的鳖甲粉81---100份，加蒸馏水0.1-5份，超声提取5--30分钟，抽滤，滤渣再加蒸馏水0.1-5份，超声提取5--15分钟，抽滤；合并两次产生的滤液，冷冻干燥后得冻干粉；
(2)用加蒸馏水0.1-5份溶解上述制得的冻干粉，将水溶液装于半透膜(3.500)内，置0.2-5份蒸馏水中透析1--10小时，温度为2-10℃；同法再透析一次，合并两次膜外透析液，真空冷冻干燥，收集A型冻干粉0.2-10份；
(3)取上述膜内液体，将膜袋置0.2-10份蒸馏水中透析1--6小时，温度为2-10℃；同法透析三次，弃去膜外透析液，将膜内液体真空冷冻干燥，收集B型冻干粉1-20份；
(4)将上述A型冻干粉或B型冻干粉与药学上可接受的、常规的赋形剂一起制成各种常规剂型。
A型冻干粉为分子量小于6000的物质(鳖甲粗多肽成品)，B型冻干粉为分子量大于6000的物质。
本发明对鳖甲抗肝纤维化的传统剂型进行了系统的体内、外药理药效学对比研究，结果表明，鳖甲水煎液抗肝纤维化作用显著，而鳖甲微粉无此作用，联系课题组同期研究得出的鳖甲抗肝纤维化的药效物质基础为小分子肽类物质的结论，从而明确了鳖甲抗肝纤维化的有效剂型与药效物质基础、作用机制。详见下述试验。
实施试验例1：本发明的“体外实验：鳖甲微粉与鳖甲水煎液药物血清(附设鳖甲粗提物质组分)对离体HSC-T6细胞增殖的影响”
1.材料与方法
动物：健康雄性SD大鼠12只，体重200g±20g，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心。饲养温度23℃左右，相对湿度60.0％±10.0％。
细胞系：肝星状细胞系HSC-T6购自上海中医药大学肝病研究所，为SV40转染的Sprague-Dauley大鼠星状细胞，其表现型为活化的HSC，表达高水平的I型胶原、TIMP-lmRNA等。
主要试剂：细胞培养试剂：羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、胰蛋白酶(trypsin)、L-谷氨酰胺等(美国Sigma公司)，DMEM培养基(高糖、低糖)(美国GIBCO公司)，小牛血清(fetal calf serum，FCS)(武汉亚法生物技术公司)，青霉素、链霉素(华北制药股份公司)，碳酸氢钠(湖北化工厂)，二氧化碳(CO2)(武汉无机盐厂)。细胞增殖检测用试剂：二甲基亚砜(DMSO)、噻唑蓝(MTT)(Sigma公司)。
主要仪器设备：电热恒温水浴锅(H.H.S11-2型，上海医疗器械五厂)，水浴恒温振荡器(SHZ-B，上海跃进医疗器械厂)，倒置显微镜(IMT-2B型，日本Olymplus公司)，高速台式离心机(L110，上海)，CO2培养箱(18201R，美国Shel-Lab公司)，塑料培养板(24孔，96孔，丹麦Nunc公司)，塑料培养皿(100mm，丹麦Nunc公司)，超净工作台(GHO2-2型，天津市医药净化设备厂)，高压消毒锅(Autoclave SM52，美国Yamatoscientific公司)，分析天平(TG328A型，湘仪天平仪器厂)，-80℃低温冰箱(ULT FREEZER725型，Forma Solentific)，紫外分光光度计(753BI型，上海光学仪器厂)，多功能酶标仪(352型，芬兰Labsystem公司)。
试剂配制：DMEM液：1L的DMEM高糖及低糖培养基干粉各一包，并称取2.38gHEPES、2.0g NaHCO3溶于2L三蒸水中，调pH为7.2，0.22μm滤膜抽滤除菌，分装置4℃备用，用前加入10％FCS，1％L-谷氨酰胺，100μ/ml青霉素，即为完全培养基。MTT的配制：称取MTT10mg，37℃温浴中溶解于2ml 0.01mol/L PBS，PH7.4，即为5mg/ml的MTT溶液，0.22μm过滤除菌，置棕色小瓶中，4℃冰箱保存。
鳖甲粗提样品的制备：(1)称取鳖甲粉100g，加蒸馏水200ml，超声提取二十分钟，抽滤，滤渣再加蒸馏水100ml，超声提取十分钟，抽滤；合并两次滤液，冷冻干燥，得冻干粉；
(2)用加蒸馏水200ml溶解上述制得的冻干粉，将水溶液装于半透膜(3.500)内(截留分子量6000)，置100ml蒸馏水中透析五小时(4℃，5min摇一次)；同法再透析一次，合并两次膜外透析液，真空冷冻干燥，收集A型0.4g冻干粉。
(3)取膜内液体，将膜袋置500ml蒸馏水中透析三小时(4℃，磁力搅拌)；同法透析三次，弃去膜外透析液，将膜内液体真空冷冻干燥，收集B型3.2g冻干粉。
A型冻干粉为分子量小于6000的物质(鳖甲粗多肽成品)，B型冻干粉为分子量大于6000的物质。
鳖甲微粉与鳖甲水煎液药物血清的制备：实验用大鼠随机分成三组，每组4只。鳖甲研粉，过80目筛，JGM-T50型气流粉碎机处理，收集超微粉。取鳖甲超微粉及其煎煮混悬液(煎煮1.5h)分别按成人10倍剂量(即生药含量27.0g·kg-1·d-1)配成药液(1.35g/ml)，以及生理盐水，分别给大鼠灌胃，2ml，2/d×3。第3天给药后1h，无菌无热源污染条件下心脏采血，分离血清，56℃灭活30min，分装冻存。
HSC-T6的培养及传代：HSC-T6培养于37℃、5％CO2的含10％胎牛血清、100μ/ml青霉素、100mg/ml链霉素、1％L-谷氨酰胺的DMEM(低糖与高糖比例为1∶1)培养液中，在倒置显微镜下观察细胞长到亚单层或细胞密度约80％～90％时，是HSC-T6传代的标志，吸弃培养基，加入0.25％胰蛋白酶4～5ml，以浸没细胞为宜，37℃消化5～7min，待细胞回缩，瓶壁有少量细胞脱落，即用含10％小牛血清培养基终止，收集细胞悬液于50ml消毒离心管中，1700rpm，4℃离心7min，弃上清，加入含10％小牛血清的DMEM用吸管反复吹打、分散细胞，取10μl细胞悬液光镜下计数，完全培养基调整细胞浓度，以1×105/ml传代。
实验分组及药物处理：待细胞长满培养板底后，换用5％FCS的DMEM培养基，培养24h后分别加入不同浓度的鳖甲粗提物质(以含5％FCS的DMEM培养基倍比稀释成14.0000mg/ml、7.0000mg/ml、3.5000mg/ml、1.7500mg/ml、0.8750mg/ml、0.4375mg/ml、0.2188mg/ml、0.1094mg/ml，0.45μm滤膜过滤)以及不同浓度鳖甲微粉与鳖甲水煎液药物血清(分设2.5％、5％、10％、15％、20％五个浓度)，4孔重复，设空白对照组(含5％FCS的DMEM培养基)以及相应浓度生理盐水对照血清组。
MTT比色法测定HSC-T6增殖：传代HSC-T6细胞按1×105的密度接种于96孔培养板，每孔加100μl，细胞贴壁长满孔底12h后，换含5％FCS的DMEM培养基，培养12h，加入鳖甲粗提物质(以含5％FCS的DMEM培养液倍比稀释，0.45μm滤膜过滤)和鳖甲微粉与鳖甲水煎液药物血清共同培养48h、72h，每一浓度设4复孔，另设空白对照组及生理盐水血清组，去培养基(翻板)，每孔加20μlMTT溶液，PH7.2PBS，浓度为5mg/ml，过滤除菌，置棕色小瓶中，4℃冰箱保存.孵育4h，每孔加入二甲基亚砜(DMSD)100μl，在微型混合器上振荡2min，10min后于酶标仪上测定OD490值.存活率＝(药物组OD值/对照组OD值)×100％.抑制率＝(1-药物组OD值/对照组OD值)×100％.
统计学方法：数据以X±S表示，进行方差分析和组间q检验，P＜0.05为差异具有显著性意义。
2.试验结果
传代培养的大鼠肝星状细胞系HSC-T6与鳖甲粗提物质(分子量大于和小于6000的物质)以及鳖甲微粉与鳖甲水煎液药物血清分别共同培养48h、72h后，采用MTT比色法测定各浓度组HSC增殖情况，见表1、2。结果显示：鳖甲分子量小于6000物质组MTTOD值低于空白对照组(培养72h结果)和分子量大于6000物质组(培养48h、72h结果)，中位值差异均非常显著，P＜0.01-0.001。与空白对照组相比，中位抑制率(培养48h、72h结果)，分子量大于6000物质组分别为-119.76％、-58.91％；培养72h结果，分子量小于6000物质组在各实验浓度均产生抑制效应(抑制率5.89％～68.74％)，中位抑制率51.67％。
鳖甲水煎液药物血清组MTTOD值低于相应浓度生理盐水对照血清组和鳖甲微粉药物血清组，中位值差异均非常显著，P＜0.001。与相应浓度生理盐水对照血清组相比，中位抑制率(培养48h、72h结果)，鳖甲微粉药物血清组分别为1.36％、-23.21％，鳖甲水煎液药物血清组分别为51.43％、48.76％。
实施试验例2：本发明的“体外实验：鳖甲提取物分子量小于6000的肽类物质对TGF-β1刺激的LX-1细胞活化及胶原合成的影响
γ-干忧素(IFN-γ)是目前已知的作用最强的抗肝纤维化细胞因子。以往的体外及动物实验均证实IFN-γ可有效地改善日本血吸虫、四氯化碳、二甲基亚硝胺等引起的肝纤维化。本实验通过Western blot法检测鳖甲粗多肽成品(分子量＜6000)、IFN-γ等各作用组、对照组对TGF-β1刺激的LX-1细胞I、III型胶原和α-平滑肌肌动球蛋白(α-SMA)表达的影响，探讨鳖甲中多肽类成分抗肝纤维化的活性和作用机制。
1.材料与方法
细胞系：人肝星状细胞系LX-1由美国Mount Sinai医学院肝病科Friedman SL教授惠赠。
主要试剂：IFN-γ、TGF-β1(美国R&D公司)，DMEM培养基、胎牛血清(美国Hyclone公司)，β-肌动蛋白(β-actin)多克隆抗体、羊抗III型胶原多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，小鼠抗α-SMA和I型胶原单克隆抗体(美国Sigma Aldrich公司)，IgG-HRP羊抗兔、兔抗羊和抗小鼠第二抗体(美国Santa Cruz公司)，SDS-PAGE蛋白电泳及转膜试剂，Western-blot试剂，PVDF膜，ECL显色剂，Re-blot洗膜试剂。
LX-1细胞的培养：按文献的方法培养LX-1细胞系，于37℃、饱和湿度、体积分数5％CO2条件下，含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基中培养。
膜透析法提取分离鳖甲分子量小于6000的肽类物质的制备方法同“发明内容”项下“第三种方法”之“(1)、(2)”。
药物处理、Western-blot法检测：将LX-1按1×106接种于10cm的培养皿，待细胞贴壁，加入含不同浓度药物的培养基(2％FCS-DMEM，培养时间48h)预处理2h后，加入800pg/ml重组TGF-β1，37℃、5％CO2培养72h。加200μl/dish的细胞裂解液，用机械法收集细胞，冰浴30min，10000rpm离心10min，收集上清液用BCA protein assay试剂盒进行总蛋白定量。取40ug蛋白加上样缓冲液煮沸10min变性，进行10％SDS-PAGE电泳后，电转移至醋酸纤维素膜，5％脱脂奶粉室温封闭2h，加入相应的一抗(Santa Cruz)分别以封闭液适当稀释，将PVDF膜浸泡其中，摇床缓慢4℃反应过夜；洗膜4次每次10min，加辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶2000，Santa Cruz)，室温反应2h；洗膜5次后ECL化学发光显色、曝光，胶片作激光密度扫描，结果以I型胶原、III型胶原、α-SMA与对应的β-肌动蛋白(Actin)的密度积分比值来表示蛋白的相对表达量。实验以Actin为内参照，作空白对照、TGF-β1刺激对照和hIFN-γ对照。
统计学方法：同“实施试验例1”项下“1.”。
2.试验结果
Western blot法检测鳖甲粗多肽成品对TGF-β1刺激的LX-1细胞活化及胶原合成影响的试验结果显示：TGF-β1刺激组LX-1细胞Col I、Col III、α-SMA表达显著高于空白对照组(P＜0.01)；LX-1细胞IFN-γ及鳖甲粗多肽成品10、5、1mg/ml作用组三种蛋白表达显著低于TGF-β1刺激对照组(P＜0.01)；鳖甲粗多肽成品10、5mg/ml组三种蛋白表达显著低于IFN-γ作用组(P＜0.05)；鳖甲粗多肽成品10mg/ml组三种蛋白表达显著低于空白对照组(P＜0.05)；鳖甲粗多肽抑制TGF-β1刺激的LX-1细胞Col I、Col III、α-SMA蛋白表达在实验浓度范围呈现量效依赖关系。
采用Western blot法，以目前抗肝纤维化作用最强的药物IFN-γ作为对照，检测鳖甲提取物中分子量小于6000的肽类物质对TGF-β1刺激的LX-1细胞I、III型胶原和α-SMA蛋白表达的影响。试验结果表明，鳖甲提取物分子量小于6000的肽类物质能有效抑制肝星状细胞激活及胶原合成，从而阻抑肝纤维化的发展，其抑制效果呈现量效关系，高中剂量的抑制效果明显优于对照药物IFN-γ，从而进一步确定了鳖甲提取物分子量小于6000的肽类化合物为其抗肝纤维化的有效物质部位。
“实施试验例1、2”讨论
肝纤维化是各种原因引起的一系列损伤-修复、导致ECM合成与降解失衡、合成沉积远远超过降解吸收、以及构成成分比例明显改变的结果，大量ECM沉积于肝小叶内并逐渐形成纤维间隔，严重破坏了肝组织的正常结构和功能，可致肝窦毛细血管化，血流障碍，门脉高压。在肝纤维化形成发展过程中，HSC激活的启动维持、增殖及大量合成ECM是中心环节。HSC在各种损肝因子持续刺激下转化为具有增生性、纤维原性及可收缩性的肌成纤维样细胞(MFB)，表达α-SMA(HSC活化的标志，其表达面积、强度与HSC激活程度及肝纤维化程度正相关)和多种细胞因子及其受体，并大量合成以I、III型胶原为主的多种ECM；且HSC还通过合成和分泌基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPS)、抑制基质金属蛋白酶(MMPS)活性从而抑制ECM的降解。大量研究表明，许多因子参与了HSC的激活，而其中TGF-β1为最强刺激因子，通过激活HSC以及刺激肝窦内皮细胞、Kupffer细胞等使ECM过度形成与沉积，刺激HSC等细胞合成分泌血小板衍生生长因子(PDGF)等细胞因子并增强PDGFR等细胞因子受体表达进而促进PDGF等对HSC的增殖作用，活化Smad、MAPK信号系统诱导胶原表达，抑制MMPS而促进TIMPS合成分泌以阻碍胶原降解，从而促进肝纤维化形成发展。
鳖甲为鳖科动物鳖Trionyx sinensis Wiegmann的背甲。鳖甲含有动物胶(以骨胶原为主)、多糖、角质、蛋白、碘质、维生素D及铁、铜、锌、镁、磷等10余种微量元素，蛋白含量为50％以上，组成蛋白质、多肽的氨基酸有17种，其中以脯氨酸和甘氨酸为主。
本发明实施试验结果显示，鳖甲小分子提取物(粗多肽成品，分子量＜6000)及鳖甲水煎液药物血清具有显著的抑制HSC活化、增殖及胶原合成的作用。表明鳖甲活性物质通过阻断TGF-β1在HSC内的Smad、MAPK信号转导，阻止HSC向MFB转化，使I、III型胶原等基因表达明显下调，减少胶原合成分泌与促进胶原降解，达到抗肝纤维化目的。鳖甲微粉药物血清无抗纤维化作用(可排除鳖甲多糖发挥抗纤维化作用的可能性，因其系由β-葡萄糖借β-1，4糖苷键组成的高分子多糖类纤维素，分子量通常在几十万至上百万，不溶于水等一些普通溶剂，人体消化液不含水解β-1，4糖苷键的纤维素酶，所以不被消化利用)。而鳖甲大分子提取物(鳖甲蛋白为主，分子量＞6000)对HSC活化、增殖则起负抑制效应；给大鼠注射白蛋白或血清是免疫损伤性肝纤维化造模常用方法，其机理与III型变态反应有关；作为异种抗原的白蛋白或血清进入大鼠体内后，刺激其产生相应抗体，当抗原再次进入机体后，抗原抗体结合形成免疫复合物激活补体；由于抗原的反复长期刺激，过量的循环免疫复合物来不及被清除，沉积于肝小叶间微血管壁内外，使肝小叶周围出现广泛的进行性的慢性炎症病变，导致肝细胞变性坏死、成纤维细胞增殖和胶原纤维病理性增生，形成肝纤维化及至肝硬化。临床上鳖甲研粉生用治疗肝纤维化，效果不佳，认为未经煎煮的鳖甲因其蛋白分子量大，而人体胃肠道消化功能所限，以致蛋白质虽经一定程度分解吸收，但仍未能达到与符合抗肝纤维化的肽段分子量标准及氨基酸序列，因而难以显效；而鳖甲经煎煮后，起负抑制效应的大分子蛋白变性，变性蛋白质易受胃肠道内多种水解酶类的协同催化作用而被消化，转变为简单的小分子肽类物质，符合发挥抗肝纤维化作用的肽段分子量标准及氨基酸序列，与鳖甲中原本存在的少量小分子肽类物质一起，共同发挥抑制肝星状细胞活化增殖胶原合成、抗肝纤维化的作用。
本发明实施试验为鳖甲用于临床治疗肝纤维化疾患用药的传统剂型提供了科学依据，明确了鳖甲抗肝纤维化的有效剂型，并验证了其药效物质基础为小分子肽类物质，从而为鳖甲用于抗肝纤维化临床医疗、中药新药及保健品研发、鳖甲活性物质开发为肽类药物奠定坚实基础和提供科学依据。
实施试验例3：本发明的“体内实验：鳖甲微粉与鳖甲水煎液抗大鼠肝纤维化的药理药效学比较研究”
1.实验材料
1.1实验动物：雄性SD大鼠110只，体重200g±20g，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心。
1.2实验试剂：
主要试剂：一抗I、III、IV型胶原(Col I、Col III、Col IV)、层粘蛋白(LN)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)、基质金属蛋白酶-13(MMP-13)、基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)多克隆抗体(博士德公司产品，编号：BA0325、BA0326、BA2174、BA1761、BA0290、BA0519、BA2204、BA0575)，α-平滑肌肌动球蛋白(α-SMA)、核因子-κB(NF-κB)p65单克隆抗体分别为博士德公司、Santa Cruz公司产品(克隆号：C-20)；α-SMA和NF-κB p65-抗为鼠抗，其余为兔抗；α-SMA、NF-κB p65、MMP-13、TIMP-1的工作滴度为1∶70，其余为1∶50。
主要试剂配方：苏木素液：苏木素2.5g，硫酸铝钾50g，氧化汞1.25g，无水乙醇25ml，冰醋酸25ml，加双蒸水500ml。伊红染液：醇溶性伊红2g，95％酒精500ml。天狼猩红染液：天狼猩红0.25g，饱和苦味酸500ml。1％盐酸酒精：盐酸1ml，75％酒精99ml。抗原修复液：0.38g柠檬酸，2.4g柠檬酸三钠，加双蒸水1000ml。PBS液：KCl 0.20g，KH2PO40.2g，NaCl 8.00g，Na2HPO4·7H2O 1.56g，加双蒸水1000ml，调至PH 7.4。四氯化碳(CCl4)分析纯购自武汉亚法生物技术有限公司，以食用色拉油配制成40％溶液。
1.3实验仪器：切片机(德国Leca公司)，OLYMPUS CHK型生物显微镜，LeicaDLMB(MP60)显微照相系统，63-5型电热恒温培养箱，格兰氏微波炉，HPIAS-1000型高清晰度彩色病理图文报告分析系统，JOEL 100×100CXII型透射电镜，日立7170型自动生化分析仪，550nm、412nm的分光光度计，可调式恒温水浴锅，台式离心机，可调式移液器，酶标仪等。
1.4供试药物制备：将鳖甲微粉加适量水煎煮1.5h得混悬液。
2.实验方法
2.1动物实验和分组：将110只大鼠随机分为6组：正常对照组10只，CCl4模型对照组、鳖甲水煎液预防组和治疗组、鳖甲微粉预防组和治疗组各20只。除正常对照组外，均给予40％CCl4 0.30ml/100g体重背部皮下注射，2/周，共12周；正常对照组给予等量等渗盐水背部皮下注射。每周末处死造模而未用药物处理的大鼠5只观察肝组织病理改变。实验第4周末，中等度肝纤维化形成(纤维隔形成并互相连接，深入小叶内，小叶结构保留或紊乱，但无肝硬化)。药物预防组于造模同期分别给以鳖甲微粉煎煮混悬液(煎煮1.5h)、鳖甲微粉混悬液2.7g生药/100g体重灌胃，1/日；药物治疗组于造模第5周开始给以上述药液灌胃。正常对照组与模型对照组给予生理盐水1ml/100g体重灌胃，1/日。实验12周末，各组随机取10只大鼠，2％戊巴比妥那麻醉后，心脏采血，分离血清备检；冰等渗盐水原位洗涤肝脏，分别用中性10％甲醛、2.5％戊二醛固定及-70℃冻存备检。
2.2病理检查：肝组织标本用中性10％甲醛固定，石蜡包埋，4um连续切片，常规作HE染色、天狼红染色，观察组织学变化，将肝纤维化分为0-4期；按2002中华肝脏学会肝纤维化组《肝纤维化诊断与疗效评估共识》进行肝纤维化组织学半定量计分系统(SSS)标准计分；肝胶原含量测定参考Jimenez等报道的测试方法，计算方法如下：胶原μg/切片(cm2)＝(A540nm-7.78％A630nm)×1000/37。
2.3免疫组化：肝组织石蜡切片，脱蜡至水，3％H2O2(30min)阻断内源性过氧化物酶，PBS液洗3次，抗原修复液(0.38g柠檬酸，2.4g柠檬酸三钠，加双蒸水1000ml)中微波修复，封闭非特异性抗原。加一抗，湿盒内置37℃孵育2小时，加二抗PicTureTM(Zymed公司)，37℃孵育1小时，PBS液洗3次，DAB(Zymed公司)显色10分钟，流水终止反应，苏木素复染，封片。每次实验均设PBS空白对照和正常血清取代一抗的阴性对照，观察各蛋白的表达，蛋白表达的定量结果用HIPAS-1000型高清晰度彩色病理图文报告分析系统在低倍镜下(100×)计算阳性面积百分比(％)。MMP-13表达的定量结果在高倍镜下(400×)计数阳性细胞数。
2.4肝组织氧化指标：超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒购自南京建成生物工程研究所.
肝组织SOD、GSH-Px酶活力检测：将10％的肝匀浆，用生理盐水稀释成0.25％的浓度，严格按SOD、GSH-Px测定试剂盒提供的方法操作，双蒸水调零，分别于550nm波长下比色、412nm处测各管光密度值(OD值)，计算公式分别为：
肝组织MDA检测：将10％的肝匀浆，离心10分钟，取上清，严格按MDA测定试剂盒提供的方法操作，双蒸水调零，532nm处测各管吸光度值，计算公式为：
2.5血清肝功能、血脂、透明质酸指标：自动生化分析仪检测肝功能及血脂；放免法检测血清透明质酸，试剂盒购自上海海军医学研究所，方法严格按试剂盒操作程序进行。
2.6透射电镜检查：将新鲜肝组织切成1mm3小块，用2.5％戊二醛固定24小时，经梯度酒精脱水至100％丙酮30分钟，用90％丙酮/包埋剂(1∶1)包埋过夜后，用纯包埋剂包埋5小时，低粘度spurr包埋剂60℃过夜，在Ultracut E型切片机下切成的超薄切片经醋酸铀和硝酸铅染色，在JOEL 100×100CXII型透射电镜下观察结果。
2.7统计方法：实验数据以x±s表示，进行方差分析和组间q检验，计数资料采用Ridit检验，P＜0.05为差异具有显著性意义。
3.实验结果
3.1大鼠一般情况、肝脏标本外观
一般情况：正常组大鼠生长良好，体重自然增加，被毛光滑润泽致密，二便如常。鳖甲微粉预防组和治疗组与模型组无显著差异，精神萎糜，喜睡少动，或易怒好斗，胡须下垂，被毛枯萎秽黯，食欲下降，体重增加减少，甚至较前下降，尿色黄，可有腹泻，可有腹水出现。鳖甲水煎液预防组和治疗组一般情况介于两者之间，近似正常组。
肝脏标本外观：正常组大鼠肝脏红褐色，表面光滑，边缘锐利，质地柔软。鳖甲微粉预防组和治疗组与模型组无显著差异，肝脏缩小，颜色较苍灰，表面呈颗粒结节状，油腻，边缘钝，质地硬韧。鳖甲水煎液预防组和治疗组肝脏外观介于两者之间，近似正常组，肝表面未见明显颗粒结节。
3.2病理检查结果
鳖甲微粉预防组和治疗组与模型组无显著差异，大鼠肝组织HE、天狼红染色可见大量肝细胞脂肪变性存在，正常肝小叶结构遭到破坏；汇管区和小叶间有大量粗大增生的胶原纤维，组织切片中有大量假小叶形成；与正常组相比，纤维化分期、SSS计分显著增高(P＜0.01)。与模型组及鳖甲微粉组相比，鳖甲水煎液预防组和治疗组大鼠肝细胞脂肪变性程度减弱，汇管区扩张，有纤维隔，但多数尚未连接；纤维化分期、SSS计分显著降低(P＜0.01)。
3.3免疫组化结果
正常组肝脏MMP-13不表达，α-SMA、Col I、Col III、Col IV、LN、TGF-β1、NF κB p65、PDGF-BB、TIMP-1低水平表达，TGF-β1表达部位局限于肝细胞浆，PDGF-BB、TIMP-1表达部位局限于肝窦，其余各蛋白表达部位局限于汇管区和肝窦。鳖甲微粉预防组和治疗组与模型组无显著差异，上述各蛋白表达较正常组显著增强(P＜0.05-0.01)，TGF-β1主要表达在变性的肝细胞浆；NFκB p65主要表达在肝细胞浆，肝窦旁细胞、血管内皮细胞、胆管上皮细胞和肌成纤维细胞也有表达；PDGF-BB、TIMP-1主要表达在肝细胞浆，肝窦旁细胞和肌成纤维细胞也有表达；MMP-13主要表达在肌成纤维细胞，肝窦旁细胞少量表达；α-SMA、Col I、Col III、Col IV、LN主要表达在纤维间隔、肝窦壁、血管内皮细胞和胆管上皮细胞，肝细胞浆少量表达。鳖甲水煎液预防组和治疗组表达特点同模型组及鳖甲微粉组，但MMP-13阳性细胞表达数量呈不同程度减少，其余各蛋白表达面积和强度显著减少和减弱(P＜0.05-0.01)。
3.4肝组织氧化指标
鳖甲微粉预防组和治疗组与模型组无显著差异，与正常组相比，SOD、GSH-Px显著下降(P＜0.05-0.01)，MDA显著上升(P＜0.01)；与模型组及鳖甲微粉组相比，鳖甲水煎液预防组和治疗组SOD、GSH-Px显著上升(P＜0.01)，MDA显著下降(P＜0.05-0.01)。
3.5血清肝功能、血脂、透明质酸指标
鳖甲微粉预防组和治疗组与模型组无显著差异，与正常组相比，血清总胆红素(TBIL)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(AKP)、r-谷氨酰转肽酶(r-GT)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、透明质酸(HA)显著上升，白蛋白(ALB)下降(P＜0.05-0.01)。与模型组及鳖甲微粉组相比，鳖甲水煎液预防组和治疗组TBIL、ALT、AST、AKP、r-GT、TC、TG、HA显著下降(P＜0.05-0.01)。
3.6透射电镜检查结果
鳖甲微粉预防组和治疗组与模型组无明显差异，肝细胞内可见大小不等脂滴，大时可挤压整个胞浆；线粒体肿胀，部分外膜破裂和嵴断裂；粗面内质网脱颗粒，严重时线粒体、内质网和溶酶体等细胞器均溶解消失；肝窦区肝星状细胞增生，胶原产生增加；Disse间隙消失，肝窦内皮细胞下基底膜形成。与模型组及鳖甲微粉组相比，鳖甲水煎液预防组和治疗组肝细胞内脂滴较小、少，上述病变较轻微。
实施试验例4：本发明的“体内实验：鳖甲水煎液对两种肝纤维化大鼠模型的实验研究”
1.材料与方法
1.1动物
雄性SD大鼠330只，体重200g±20g，购自浙江省医科院实验动物中心。
1.2实验用药物
鳖甲微粉煎煮混悬液(煎煮1.5h)。注射用重组人γ-干扰素，上海克隆生物高技术有限公司产品[(98)卫药准字(沪克隆)S-01号]，批号：970521，100万IU/支，临用前以1ml注射用水溶解。扶正化瘀胶囊，上海中医药大学肝病研究所研制，上海现代中医药技术发展有限公司出品，批号：国药准字Z20020073、Z20020074，0.5g/粒。
1.3大鼠分组及实验步骤
1.3.1四氯化碳(CCl4)大鼠肝纤维化模型组
四氯化碳(CCl4)分析纯购自武汉亚法生物技术有限公司，以食用色拉油配制成40％溶液.
190只大鼠随机分为10组：正常对照组10只，CCl4模型对照组、鳖甲水煎液高、低剂量预防组和治疗组、扶正化瘀胶囊预防组和治疗组、IFN-γ预防组和治疗组各20只。除正常对照组外，均给予40％CCl4 0.30ml/100g体重背部皮下注射，2/周，共12周；正常对照组给予等量等渗盐水背部皮下注射。每周末处死造模而未用药物处理的大鼠5只观察肝组织病理改变。实验第4周末，中等度肝纤维化形成(纤维隔形成并互相连接，深入小叶内，小叶结构保留或紊乱，但无肝硬化)。药物预防组于造模同期分别给以鳖甲微粉煎煮混悬液(煎煮1.5h)1.8g生药/100g体重灌胃、1/日(低剂量组)、2/日(高剂量组)，扶正化瘀胶囊(内置药粉用生理盐水溶解)0.046g生药/100g体重灌胃、1/日，IFN-γ2.5万IU/100g体重肌肉注射，1/日；药物治疗组于造模第5周开始每日给以上述剂量药物。正常对照组与模型对照组给予生理盐水1ml/100g体重灌胃，1/日。实验12周末，各组随机取10只大鼠，2％戊巴比妥那麻醉后，心脏采血，分离血清备检；冰等渗盐水原位洗涤肝脏，分别用中性10％甲醛、2.5％戊二醛固定及-70℃冻存备检。
1.3.2二甲基亚硝胺(DMN)大鼠肝纤维化模型组
二甲基亚硝胺(DMN)分析纯购自天津市化学试剂研究所。
150只大鼠随机分为8组：正常对照组10只，DMN模型对照组、鳖甲水煎液预防组和治疗组、扶正化瘀胶囊预防组和治疗组、IFN-γ预防组和治疗组各20只。除正常对照组外，均给予1％DMN10mg/kg体重腹腔内注射，共13次，实验第1周连续用药3日，1/日；后5周每周连续用药2日，1/日，共6周，每周末处死造模而未用药物处理的大鼠5只观察肝组织病理改变，直至中度肝纤维化形成。实验第4周末，中度肝纤维化模型建成。药物处理：预防组于造模同期直至实验结束，鳖甲按1.3.1高剂量组每日剂量给药，扶正化瘀胶囊、IFN-γ组每日给药剂量同1.3.1；治疗组于造模第5周开始给药4周，实验共8周。实验结束标本采集同1.3.1。
1.4检测指标
1.4.1病理检查
肝组织标本用10％福尔马林液固定24h取材，常规石蜡切片，切片厚度5um，HE染色、天狼红染色，光镜观察。试剂天狼红(DIRECT RED 80)购自SIGMA公司。参照2002年中华肝脏病学会肝纤维化学组制定的《肝纤维化诊断与疗效评估供识》，将肝纤维化程度分为0-4期(HE切片观察)，按肝纤维化组织学半定量计分系统(SSS)标准计分(天狼红切片观察)。
1.4.2免疫组化
肝组织标本用10％福尔马林液固定24h取材，常规石蜡切片，切片厚度5um，免疫组化染色采用POWERVISION二步法，光镜观察。
一抗Col I、Col IV、LN、TIMP-1、Smad 2/3、Smad 7抗体购自博士德公司(BA0325、BA2170、BA1399、BA1761、BA0575、BA1395)，TGF-β1、NF-κB、Bax、Bcl-2抗体购自Santa Cruz公司(lot.A031、lot.C2008、lot.F1008、)，Col III、α-SMA、PDGF-BB抗体购自ABCAM公司(AB-59436、Lot.150745、AB-21234)，α-SMA和NF-κB一抗为鼠抗，其余为兔抗。POWERVISION试剂购自北京中杉金桥公司。步骤：切片脱蜡至水，3％H2O2(10min)阻断内源性过氧化物酶，PBS洗5min×3，Col I、Col IV、Smad 7组滴加0.1％胰酶，Col III组滴加0.4％胃蛋白酶，湿盒内37℃30min，作抗原暴露；LN、α-SMA、TGF-β1、PDGF-BB、TIMP-1、NF-κB、Bax、Bcl-2、Smad 2/3组入0.01M柠檬酸缓冲液(PH6.0)煮沸20min，自然冷却20min作抗原修复。PBS洗5min×3，加一抗(1∶100)，湿盒内4℃过夜，PBS洗5min×3，加POWERVISION试剂，室温30min，PBS洗5min×3，DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片。
每次实验均设PBS空白对照和正常血清取代一抗的阴性对照，观察各蛋白的表达，蛋白表达的定量结果采用LEICA QWIN图像分析系统，每张切片在100倍镜下取5个视野，计算阳性面积百分比(％)；TGF-β1、PDGF-BB、TIMP-1、Bax、Bcl-2表达的定量结果，每张切片在400倍视野下，计数阳性细胞数。
1.4.3肝组织氧化指标、羟脯氨酸
超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、羟脯氨酸(Hyp)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
肝组织SOD、GSH-Px酶活力检测：将10％的肝匀浆，用生理盐水稀释成0.25％的浓度，严格按SOD、GSH-Px测定试剂盒提供的方法操作，双蒸水调零，分别于550nm波长下比色、412nm处测各管光密度值(OD值)，计算公式分别为：
肝组织MDA检测：将10％的肝匀浆，离心10分钟，取上清，严格按MDA测定试剂盒提供的方法操作，双蒸水调零，532nm处测各管吸光度值，计算公式为：
肝组织HYP测定(样本碱水解法)：严格按HYP测定试剂盒提供的方法操作，将10％的肝匀浆，离心10分钟，取上清，550nm处，1cm光径，双蒸水调零，测各管吸光度值，计算公式为：
1.4.4血清肝功能、血脂、透明质酸指标
自动生化分析仪检测肝功能及血脂；放免法检测血清透明质酸，试剂盒购自上海海军医学研究所，方法严格按试剂盒操作程序进行。
1.4.5统计方法
实验数据以x±s表示，进行方差分析和组间q检验，计数资料采用Ridit检验，P＜0.05为差异具有显著性意义。
2.结果
2.1病理检查结果
HE染色，正常组大鼠肝组织结构清晰，肝细胞无脂肪变性等病变，汇管区未见纤维组织增生及炎症细胞浸润；天狼红染色，正常组仅在汇管区及中央静脉见少量纤维组织。
CCl4模型对照组大鼠肝组织HE、天狼红染色可见肝细胞重度脂肪变性，正常肝小叶结构遭到破坏；汇管区、中央静脉和小叶间有大量粗大增生的胶原纤维，并有淋巴细胞浸润，组织切片中有大量大小不等的假小叶形成；DMN模型对照组大鼠肝组织小叶结构不清，肝细胞索排列紊乱，肝细胞轻度水肿及脂肪变性，间质有淋巴细胞浸润，汇管区及肝细胞间有纤维组织增生，部分区域呈网状分布.模型对照组肝纤维化分期、SSS计分较正常组显著增高(P＜0.01).与相应模型对照组相比，各药物处理组上述病变有不同程度减轻，肝小叶结构趋向正常，纤维间隔明显变薄，纤维化分期、SSS计分显著降低(P＜0.05-0.01).药物处理组间比较，肝纤维化分期：CCl4模型组中，鳖甲治疗组高剂量预防组较之扶正化瘀胶囊、γ-干扰素相应处理组显著降低(P＜0.05)；DMN模型组中，鳖甲预防、治疗组较之γ-干扰素相应处理组显著降低(P＜0.05)。SSS计分：CCl4模型组中，鳖甲预防组较之相应剂量治疗组，鳖甲预防、治疗组较之扶正化瘀胶囊相应处理组，鳖甲治疗组较之γ-干扰素治疗组显著降低，P＜0.05-0.01。
2.2免疫组化结果
Col I、Col III、Col IV、α-SMA、Smad 7，阳性物质定位于纤维组织内，部分肝细胞胞浆也有阳性表达；正常鼠肝仅在汇管区及中央静脉壁见少量Col I、Col III、ColIV、α-SMA阳性纤维，模型对照组在假小叶周围及汇管区见大量阳性纤维、部分区域肝细胞间也可见阳性纤维、部分肝细胞也有阳性表达。LN、Smad 2/3，阳性物质定位于肝窦内衬细胞及炎性细胞胞浆内。TGF-β1、PDGF-BB、TIMP-1，阳性物质主要定位于肝细胞胞浆内。
正常组肝脏α-SMA、天狼红胶原染色、Col I、Col III、Col IV、LN、TGF-β1、PDGF-BB低水平表达，TIMP-1未见表达；模型对照组上述各蛋白表达较正常组显著增强(P＜0.01)；各药物处理组上述蛋白表达面积和强度较相应模型对照组显著减少和减弱(P＜0.05-0.01)。药物处理组间比较，天狼红胶原染色表达：CCl4模型组中，鳖甲预防、治疗组较之扶正化瘀胶囊、γ-干扰素相应处理组，鳖甲高剂量预防、治疗组较之低剂量相应处理组，显著减少和减弱，P＜0.05-0.01；DMN模型组中，鳖甲治疗组较之γ-干扰素治疗组显著减少和减弱(P＜0.05)。Col I表达：CCl4模型组中，鳖甲高剂量预防组较之低剂量组、扶正化瘀胶囊、γ-干扰素预防组，鳖甲高剂量治疗组较之γ-干扰素治疗组，显著减少和减弱，P＜0.05；DMN模型组中，鳖甲预防组较之治疗组、扶正化瘀胶囊预防组，显著减少和减弱，P＜0.05。Col III表达：CCl4模型组中，鳖甲预防组较γ-干扰素预防组、鳖甲高剂量治疗组较γ-干扰素治疗组，显著减少和减弱，P＜0.05。LN表达：CCl4模型组中，鳖甲高剂量预防组较之高剂量治疗组显著减少和减弱，P＜0.05。α-SMA表达：CCl4模型组中，鳖甲高剂量预防组较之扶正化瘀胶囊、γ-干扰素预防组，鳖甲治疗组较之γ-干扰素治疗组，显著减少和减弱，P＜0.05-0.01；DMN模型组中，鳖甲预防组较之治疗组，鳖甲治疗组较之扶正化瘀胶囊、γ-干扰素治疗组，显著减少和减弱，P＜0.05。TGF-β1表达：CCl4模型组中，鳖甲高剂量预防组较之高剂量治疗组、低剂量预防组、扶正化瘀胶囊、γ-干扰素预防组，鳖甲高剂量治疗组较之扶正化瘀胶囊、γ-干扰素治疗组，显著减少和减弱，P＜0.05-0.01。TGF-β1下游信号通道蛋白Smad表达：正常肝组织内有一定量Smad 7表达而Smad 3较少；模型对照组较正常组Smad 3表达显著增强(P＜0.01)；各药物处理组较相应模型对照组Smad 3表达显著减少和减弱(P＜0.05)；CCl4模型组中，鳖甲治疗组Smad 3表达较之扶正化瘀胶囊、γ-干扰素治疗组显著减少和减弱(P＜0.05)；CCl4模型组中，扶正化瘀胶囊治疗组较之模型对照组Smad 7表达显著增强，P＜0.05。TIMP-1表达：CCl4模型组中，鳖甲高剂量预防组较之低剂量组，鳖甲低剂量预防组较之治疗组，鳖甲高剂量治疗组较之低剂量组、扶正化瘀胶囊、γ-干扰素治疗组，显著减少和减弱，P＜0.05-0.01；DMN模型组中，鳖甲预防组较之治疗组、扶正化瘀胶囊、γ-干扰素预防组，鳖甲治疗组较之γ-干扰素治疗组，显著减少和减弱，P＜0.05.Bax表达：正常组未见表达；模型组主要表达在肝细胞浆，其次在纤维间隔、肝窦和中央静脉，模型组较正常组表达显著增强(P＜0.01)；Bcl-2表达：正常组在肝细胞浆、肝窦和中央静脉低水平表达，模型组主要表达在纤维间隔、汇管区，其次在肝细胞浆、肝窦和中央静脉，模型组较正常组显著增强(P＜0.01)；各药物处理组较相应模型对照组显著减少和减弱(P＜0.05-0.01)；CCl4模型组中，鳖甲高剂量预防组较之高剂量治疗组、低剂量预防组、扶正化瘀胶囊、γ-干扰素预防组，鳖甲治疗组较之扶正化瘀胶囊、γ-干扰素治疗组，显著减少和减弱，P＜0.05-0.01；Bax/Bcl-2比值：CCl4模型组中，鳖甲高剂量预防组较之高剂量治疗组、低剂量预防组、扶正化瘀胶囊、γ-干扰素预防组，鳖甲治疗组较之扶正化瘀胶囊、γ-干扰素治疗组，显著增高，P＜0.05-0.01。
2.3肝组织氧化指标、羟脯氨酸检测结果
模型组较之正常组，GSH-Px显著下降，MDA、Hyp显著上升，P＜0.01。各药物处理组较之相应模型对照组，SOD、GSH-Px显著上升，MDA、Hyp显著下降，P＜0.05-0.01。CCl4模型组中，鳖甲高剂量预防组，较之高剂量治疗组GSH-Px显著上升，较之鳖甲低剂量预防组、扶正化瘀胶囊预防组Hyp显著下降，P＜0.05-0.01；鳖甲低剂量预防组较之低剂量治疗组GSH-Px显著上升，P＜0.05；鳖甲高剂量治疗组较之扶正化瘀胶囊治疗组MDA显著下降，鳖甲治疗组较之扶正化瘀胶囊、γ-干扰素治疗组，Hyp显著下降，P＜0.05。DMN模型组中，鳖甲预防组较之治疗组、扶正化瘀胶囊预防组，GSH-Px显著上升，P＜0.01；鳖甲治疗组较之扶正化瘀胶囊治疗组SOD、GSH-Px显著上升，较之γ-干扰素治疗组GSH-Px显著上升，P＜0.05。
2.4血清肝功能、血脂、透明质酸指标
模型组较之正常组TBIL、ALT、AST、AKP、r-GT、TBA、HA显著上升，CCl4模型对照组TC、TG及DMN模型对照组TC较之正常组显著上升，P＜0.05-0.01。各药物处理组较之相应模型对照组，TBIL、ALT、AST、AKP、r-GT、TBA、HA显著下降，P＜0.05-0.01；CCl4模型组中，鳖甲、γ-干扰素处理组较之模型对照组TC显著下降，鳖甲预防组及扶正化瘀胶囊、γ-干扰素处理组较之模型对照组TG显著下降，P＜0.05；DMN模型组中，鳖甲预防组、γ-干扰素处理组较之模型对照组TC显著下降，P＜0.05。药物处理组间比较，CCl4模型组中，鳖甲高剂量预防组，较之高剂量治疗组TBIL、AKP、r-GT、TBA显著下降，较之低剂量预防组TBIL、ALT、AST、r-GT、TBA、HA显著下降，较之扶正化瘀胶囊预防组TBIL、ALT、r-GT、TBA显著下降，较之γ-干扰素预防组TBIL、ALT、AST、r-GT、TBA显著下降，P＜0.05-0.01；鳖甲低剂量预防组，较之低剂量治疗组TBIL、ALT、AKP、r-GT、TBA显著下降，较之扶正化瘀胶囊、γ-干扰素预防组TBA显著下降，P＜0.05-0.01；鳖甲高剂量治疗组，较之低剂量治疗组ALT、r-GT、TBA、HA显著下降，较之扶正化瘀胶囊治疗组r-GT、TBA、HA显著下降，较之γ-干扰素治疗组ALT、AST、r-GT、TBA显著下降，P＜0.05-0.01；鳖甲低剂量治疗组，较之扶正化瘀胶囊治疗组TBA显著下降，较之γ-干扰素治疗组AST、TBA显著下降，P＜0.05-0.01。DMN模型组中，鳖甲预防组，较之治疗组AST、AKP、r-GT、HA显著下降，较之扶正化瘀胶囊预防组TBIL显著下降，较之γ-干扰素预防组TBIL、ALT、AST显著下降，P＜0.05-0.01；鳖甲治疗组，较之扶正化瘀胶囊治疗组TBIL、ALT、r-GT显著下降，较之γ-干扰素治疗组TBIL、ALT显著下降，P＜0.05-0.01。
“实施试验例3、4”讨论
在肝纤维化形成发展过程中，肝星状细胞(HSC)的“持续性”活化、增殖及大量合成细胞外基质(ECM)是中心环节。α-平滑肌肌动球蛋白(α-SMA)是活化HSC的特异性标志，且其表达强度与HSC激活程度、肝纤维化程度明显正相关。HSC的激活过程，是多种细胞因子旁分泌和自分泌协同作用的结果，其中起关键作用的因子是转化生长因子-β1(TGF-β1)和血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)。TGF-β1被认为是最重要的促肝纤维化因子，TGF-β1及其II型受体(TGF-β1RII)、以及TGF-β1信号通道蛋白Smad在肝纤维化形成进展中起着重要作用；肝内TGF-β1与TGF-β1RII结合后，继而活化TGF-β1RI，活性TGF-β1RI的激酶区直接使Smad 2、3自动磷酸化，与共同介质型Smad 4形成异源寡聚体复合物，该复合物随即转移到细胞核，介导TGF-β1的生物学效应；TGF-β1诱发肝纤维化的机制主要包括：活化HSC，并刺激肝窦内皮细胞、Kupffer细胞以及肝细胞等合成ECM，刺激HSC等细胞合成分泌PDGF-BB等细胞因子并增强PDGFR等细胞因子受体表达进而促进PDGF-BB等对HSC的增殖作用，同时，TGF-β1抑制MMPS而促进TIMPS合成分泌以阻碍胶原降解，抑制肝细胞再生和诱导肝细胞凋亡，影响肝功能；而抑制型Smad 6、7是细胞中TGF-β1RI型受体拮抗蛋白，能牢固地与TGF-β1RI型受体结合，使之无法将Smad 2、3磷酸化而阻断信号转导过程。PDGF-BB作为最强有丝分裂原，有显著的促进HSC活化、分裂、增殖、合成胶原等作用；上调TIMPS而抑制MMPS活性，减少ECM降解。TGF-β1与PDGF-BB都以正反馈方式作用于HSC活化通路的信号传导，形成级联放大效应，导致HSC的不断激活和肝纤维化的发生发展。
肝纤维化发生的中心环节为肝星状细胞的广泛激活，肝纤维化逆转机理之一为活化的肝星状细胞(肌成纤维细胞，MFB)凋亡加强。Bcl-2是抗凋亡蛋白，主要通过防止线粒体内释放出凋亡因子(AIF、Cytochrome C、pro-caspase-2、-3、-9等)来发挥抗凋亡作用，是阻遏细胞凋亡的核心分子；Bax为促凋亡蛋白，主要通过与Bcl-2形成异二聚体，以使Bcl-2灭活，由此决定具有活性的Bcl-2分子数，实现对细胞凋亡的调节。实验发现Bax、Bcl-2在模型组表达均显著高于正常组，Bax表达增强提示肝细胞凋亡有所增强。Bcl-2在纤维间隔区表达高于其他区域符合应激情况下Bcl-2表达加强有助于促进肝细胞存活、再生的观点。有研究报道，γ-干扰素对整个肝组织和纤维间隔中的Bax、Bcl-2的作用不同，能抑制整个肝组织Bax、Bcl-2的表达但对Bax/Bcl-2比值(此比值被认为是一重要的凋亡消长决定因素)无明显作用，能显著抑制纤维间隔(其中的细胞主要为MFB)的Bcl-2表达但对Bax表达无明显影响由此Bax/Bcl-2比值有上升趋势，从而促进MFB凋亡，推测γ-干扰素对肝中不同细胞的凋亡起不同的作用。本实验结果显示出药物处理组类似的对MFB凋亡的调节效应。
核因子-κB p65(NF-κB p65)是真核细胞基因转录中重要的调控因子，经有毒物质氧化应激产物诱导激活后，通过调节靶基因表达，刺激细胞因子释放而促进HSC活化，并抑制HSC凋亡。
肝脏ECM的代谢主要由MMPS及其抑制因子TIMPS调节，MMPS促进ECM降解，而TIMPS通过抑制MMPS从而阻止ECM的降解。多项研究表明，MMPS在肝纤维化形成过程中变化复杂，与病程、检测方法、酶原、活化与结合状态等因素有关；研究发现，增加胶原酶的数量不是影响ECM降解的最主要因素，提高胶原酶活性可能对ECM的降解更有意义。TIMP1是最重要的基质金属蛋白酶组织抑制因子，它可与活化的MMP-9，MMP-1及MMP-13等以1∶1的比例形成复合物，使后者活性下降，造成ECM主要成分I、III型胶原降解减少、沉积增加，促进肝纤维化的发展.
肝纤维化形成的自由基机制还认为，单纯肝细胞损伤不足以诱导肝纤维化，氧化应激和脂质过氧化是诸多病因引起肝损伤向肝纤维化发展的中间必经环节。脂质过氧化反应的一系列醛类产物如丙二醛(MDA)等不仅可活化Kupffer细胞、释放多种细胞因子继而激活HSC，还可直接刺激HSC活化增殖，转化为肌成纤维样细胞并大量合成胶原。实验证实，HSC胞内氧化物含量与HSC活化水平正相关，而抗氧化剂如过氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等则能抑制HSC的活化、增殖和胶原的沉积。
抑制HSC活化和促进MFB凋亡、减少胶原合成和促进胶原降解是逆转肝纤维化的关键，保护肝细胞结构和功能、抗氧化应激等为防治肝纤维化重要环节。
本发明实施试验，采用抗肝纤维化研究的常用模型，CCl4、DMN分别诱导大鼠肝纤维化，旨在从不同视角了解鳖甲对不同原因引起肝纤维化的预防治疗作用(在观察肝纤维化模型的形成过程中，于染毒后每周各解剖5只大鼠观察肝组织病理改变，结果发现CCl4组大鼠在肝纤维化形成前，肝脏病变以脂肪变性为主，而DMN组大鼠则以出血、坏死为主要病理改变)。研究结果显示，与模型对照组相比，鳖甲水煎液处理组能显著改善肝纤维化大鼠肝组织病理，抑制α-SMA、Col I、Col III、Col IV、LN等表达，降低Hyp及血清HA；下调TGF-β1、PDGF-BB，并作用于TGF-β1下游信号通道蛋白，抑制Smad 3等因子表达，提升肝内Smad 7，从而作用于TGF-β1的正、负反馈环路，在各阶段阻断TGF-β1发挥病理作用；通过抑制TIMP-1蛋白表达，有利于改善胶原酶活性，促进ECM降解；显著抑制主要定位于纤维间隔的Bcl-2的表达，对Bax的表达无明显影响，Bax/Bcl-2的比值升高，推测可能是促进MFB凋亡的作用机制之一；通过抑制NF-κB含量和活性及其所调控的细胞因子释放，间接抑制HSC的活化和增殖，促进活化HSC的凋亡；同时具有保护肝细胞、改善肝功能、抗氧化应激等作用，显著降低肝组织MDA水平，提高SOD、GSH-Px活性，对于CCl4、DMN两种肝纤维化大鼠模型均具有明显的预防和治疗综合效应，作用相当或优于公认有效的抗肝纤维化药物γ-干扰素、扶正化瘀胶囊，预防组及高剂量组效果尤佳。研究结果同时表明，鳖甲微粉药液无抗大鼠肝纤维化药理药效学作用。从而进一步为历来存在争议的鳖甲临床用药的传统剂型提供了科学依据，验证了其有效剂型——鳖甲水煎液抗肝纤维化的药理作用，结合课题组同期研究证实的鳖甲抗肝纤维化的药效物质基础为小分子肽类物质，认为鳖甲经煎煮后，对肝星状细胞活化增殖胶原合成起负抑制效应的大分子蛋白变性，变性蛋白质易受胃肠道内多种水解酶类的协同催化作用而被消化，转变为简单的小分子肽类物质，符合发挥抗肝纤维化作用的肽段分子量标准及氨基酸序列，与鳖甲中原本存在的少量小分子肽类物质一起，共同发挥抑制肝星状细胞活化增殖胶原合成、抗肝纤维化的作用。从而为药食同源的传统中药鳖甲用于抗肝纤维化临床医疗、中药新药及保健品研发、鳖甲活性物质开发为肽类药物奠定坚实基础和提供科学依据。
Claims (2)
1.一种抗肝纤维化有效剂型的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：
(1)鳖甲研粉，过八十目筛，气流粉碎机处理，收集超微粉；
(2)将上述超微粉与药学上常规的赋形剂一起制成各种常规剂型；或(2)取鳖甲超微粉进行煎煮，煎煮1.5-5个小时，收集混悬液；将上述混悬液与药学上常规的赋形剂一起制成各种常规剂型。
2.一种抗肝纤维化有效剂型的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：
(1)称取常规研磨的鳖甲粉81---100份，加蒸馏水0.1-5份，超声提取5--30分钟，抽滤，滤渣再加蒸馏水0.1-5份，超声提取5--15分钟，抽滤；合并两次产生的滤液，冷冻干燥后得冻干粉；
(2)用加蒸馏水0.1-5份溶解上述制得的冻干粉，将水溶液装于
半透膜内，置0.2-5份蒸馏水中透析1--10小时，温度为2-10℃；同法再透析一次，合并两次膜外透析液，真空冷冻干燥，收集A型冻干粉0.2-10份；
(3)取上述膜内液体，将膜袋置0.2-10份蒸馏水中透析1--6小时，温度为2-10℃；同法透析三次，弃去膜外透析液，将膜内液体真空冷冻干燥，收集B型冻干粉1-20份；
(4)将上述A型冻干粉或B型冻干粉与药学上常规的赋形剂一起制成各种常规剂型。
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|---|---|---|---|---|
| CN110082520A (zh) * | 2019-05-05 | 2019-08-02 | 南京烁朴生物科技有限公司 | 一种检测植物赤霉素的免疫荧光方法 |
| CN111701020A (zh) * | 2020-06-08 | 2020-09-25 | 南通大学 | 一种治疗pdgf诱导的肝纤维化的分子靶点 |
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2009
- 2009-12-08 CN CN200910154791A patent/CN101703523A/zh active Pending
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