CN107823212A - 红景天甙在防治糖尿病性血管损伤中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了红景天甙在防治糖尿病性血管损伤中的应用,其中红景天甙的分子式为C14H20O7。本发明通过实验证实红景天甙能够提高糖诱导的平滑肌细胞凋亡抑制模型细胞的凋亡率,提高平滑肌细胞中促凋亡相关蛋白表达和miR‑195‑3p的表达水平,降低抗凋亡相关蛋白的表达等指标,本发明首次公开了红景天甙对于miR‑195‑3p的调节作用,因此红景天甙能够用于防治糖尿病性血管损伤,且在防治由高血糖诱导的动脉管壁异常增厚作用中发现新机制。

Description

红景天甙在防治糖尿病性血管损伤中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及红景天甙在防治糖尿病性血管损伤中的应用。
背景技术
最新资料显示,我国已成为世界上糖尿病患者最多的国家,世界上糖尿病患者人数也在逐年增加,并预计2030年患者人数将曾至3.66亿,目前诊断病例中90%为2型糖尿病。这些数据表明2型糖尿病在世界范围内造成了巨大威胁。它是以慢性高血糖为特征的代谢紊乱,长期不治或治疗不当可能会导致糖尿病慢性并发症(Diabetes mellitus chroniccomplication,DCC),包括:糖尿病血管损伤、糖尿病神经病等,这些慢性并发症也是糖尿病致死致残的重要原因。所以,如何有效防治糖尿病并发症,改善糖尿病人的生存质量,是目前需要解决的重大问题。
血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)的增殖和迁移是动脉粥样硬化斑块形成、高血压等糖尿病血管并发症的共同病理特征。当血管受损或疾病状况下,VSMC重新获得增殖、迁移及合成大量细胞外基质的能力,VSMC增殖和凋亡的平衡被打破,通常为增殖增多和凋亡抑制,导致血管壁增厚、管腔狭窄、血管顺应性降低及血管重构。因此,VSMC是动脉粥样硬化预防和治疗的重要靶点。如果可以改变其凋亡抑制,寻找药物发挥作用的新机制,改善其血管平滑肌的异常积累,对改善糖尿病性血管损伤的进程和治疗技术的发展具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供红景天甙在防治糖尿病性血管损伤中的应用。
本发明是通过以下技术方案来实现:
本发明公开了红景天甙在制备防治糖尿病性血管损伤的药物和/或保健品中的应用,红景天甙的分子式为C14H20O7,结构如下式:
优选地,所述的药物和/或保健品为防治高血糖引起的动脉管壁增厚的药物和/或保健品。
优选地,所述的药物和/或保健品为促进平滑肌细胞凋亡的药物和/或保健品。
优选地,所述的药物和/或保健品为促进动脉血管中膜平滑肌细胞凋亡的药物和/或保健品。
优选地,所述的药物和/或保健品为促进平滑肌细胞中促凋亡蛋白表达和/或抑制平滑肌细胞中抗凋亡蛋白表达的药物和/或保健品。
优选地,所述的促凋亡蛋白为促凋亡家族蛋白Bax,抗凋亡蛋白为抗凋亡家族蛋白Bcl-2。
优选地,所述的药物和/或保健品为促进平滑肌细胞凋亡过程中的终末剪切酶Cleaved Caspase-3表达的药物和/或保健品。
优选地,所述的药物和/或保健品为促进平滑肌细胞中microRNA表达的药物和/或保健品。
进一步优选地,所述的microRNA为能够调节平滑肌细胞凋亡的microRNA。
与现有技术相比,本发明具有以下有益的技术效果:
本发明公开了红景天甙在防治糖尿病性血管损伤药物作用新机制的应用,红景天甙是从红景天中提取的一种活性单体,红景天甙的分子式为C14H20O7。本发明首次提出红景天甙能够用于防治糖尿病性血管损伤,具有良好的临床应用前景,因而能够制备防治糖尿病性血管损伤的药物和/或保健品。
进一步地,通过实验证明了红景天甙对高糖条件下动脉血管平滑肌细胞凋亡抑制有明显的改善作用,本发明提供的红景天甙能够提高高糖诱导的平滑肌细胞凋亡抑制模型平滑肌细胞凋亡率和促凋亡蛋白表达量,降低抗凋亡蛋白表达量,提高miR-195-3p的表达水平等指标,因此红景天甙能够用于防治糖尿病性血管损伤,尤其是能够用于防治由高血糖诱导的动脉管壁异常增厚。
进一步地,通过实验证明本发明提供的红景天甙能够通过上调miR-195-3p和促凋亡家族蛋白Bax的表达,并能够抑制Bcl-2的表达,因此该防治糖尿病性血管损伤的机制为能够通过促进miR-195-3p和促凋亡蛋白的表达同时抑制抗凋亡蛋白的表达而促进平滑肌细胞发生凋亡,且随着红景天甙浓度的增加,平滑肌细胞发生凋亡的数目逐渐增多,实现防治糖尿病性血管损伤的作用。
附图说明
图1为通过Hoechst+PI染色法检测红景天甙对平滑肌细胞凋亡能力的影响结果图;
其中,(a)为Hoechst+PI染色法检测红景天甙对大鼠胸主动脉平滑肌细胞系A7r5细胞凋亡的结果;(b)为0uM、10uM、100uM、250uM、500uM的红景天甙对大鼠胸主动脉平滑肌细胞系A7r5细胞凋亡影响的剂量曲线结果;(c)为100uM的红景天甙对大鼠胸主动脉平滑肌细胞系A7r5细胞凋亡影响的时间曲线结果;
图2为红景天甙对miR-195-3p表达水平调控结果图;
其中,(a)为高糖与低糖处理以及高糖加红景天甙处理后miR-195-3p在平滑肌细胞差异表达的结果图;(b)为单纯转染miR-195-3p后平滑肌细胞miR-195-3p表达结果图;(c)为单纯转染miR-195-3p后平滑肌细胞凋亡率结果图;(d)为转染mir-193-3p后与红景天甙共同作用时平滑肌细胞miR-195-3p表达结果图;(e)为转染mir-193-3p后与红景天甙共同作用时平滑肌细胞凋亡率结果图;
图3为Western blot法检测转染miR-195-3p mimic、inhibitor后和红景天甙对平滑肌细胞内凋亡相关蛋白表达水平的影响结果图;
其中,(a)为凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的Western blot蛋白表达图;(b)为凋亡相关蛋白Caspase-3和Cleaved Caspase-3的Western blot蛋白表达图;(c)、(d)、(e)分别为(a)、(b)的统计图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明,所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明提供了一种红景天甙作用新的机制,即红景天甙在防治糖尿病性血管损伤中的新机制,其所述的糖尿病性血管损伤为高血糖诱导的动脉管壁异常增厚,具体分子式为C14H20O7,分子量为C14H20O7,分子式结构为:
本发明所述的红景天甙为市场采购获得,购自西格玛奥德里奇贸易有限公司(Sigma-Aldrich)识别码为CAS:10338-51-9。
本发明通过进一步的研究,检测了该红景天甙对高糖诱导的平滑肌细胞凋亡抑制有明显的改善作用,并进一步发现其可以调节miR-195-3p的表达,且miR-195-3p对平滑肌细胞凋亡有调节作用。其中,miR-195-3p序列为“ccaatatt ggctgtgctg ctcca”,来源于Pubmed数据库。
下面对本发明提供的红景天甙防治糖尿病性血管损伤作用和促进平滑肌细胞凋亡及其对平滑肌细胞内miR-195-3p表达的调节作用具体试验和结果进行详细说明。
1、红景天甙对高糖诱导的平滑肌细胞凋亡抑制的影响
实验方法:采用Hoechst+PI染色法检测红景天甙对高糖条件下平滑肌细胞凋亡能力的影响。所选细胞系为:大鼠胸主动脉平滑肌细胞系A7r5,细胞接种于含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中,置于体积分数为5%的CO2,温度为37℃的培养箱中常规培养。
取对数生长期的平滑肌细胞,以15000个/孔接种于24孔板培养过夜。待细胞贴壁后,将红景天甙以不同浓度(0、10、100、250、500μmol/L)加入孔中,在培养不同时间(0、12、24、36、48、72h)后,加入Hoechst和PI染色液,浓度为10uL/mL,培养箱中孵育25分钟,用无菌PBS冲洗3次,每次5分钟,荧光显微镜下拍摄,计算凋亡率。
凋亡率计算公式为:(凋亡细胞数)/(细胞总数)×100%。
结果如图1所示,(a)为Hoechst+PI染色法检测红景天甙对大鼠胸主动脉平滑肌细胞系A7r5细胞凋亡的结果、(b)为0μM、10μM、100μM、250μM、500μM的红景天甙对大鼠胸主动脉平滑肌细胞系A7r5细胞凋亡影响的剂量曲线结果、(c)为100μM的红景天甙对大鼠胸主动脉平滑肌细胞系A7r5细胞凋亡影响的时间曲线结果。从图中可以看出,红景天甙浓度100μM处促凋亡作用最显著,处理时间在24h时作用效果最显著。
2、红景天甙对平滑肌细胞中miR-195-3p表达水平的调控作用
取对数生长期的平滑肌细胞接种于6孔板中,分别设置低糖对照组、低糖加甘露醇组、高糖处理组、高糖加红景天甙(100μM)处理组,培养24h后提取细胞RNA,运用实时定量PCR仪检测每组细胞中miR-195-3p的表达倍数变化。设置转染组,高糖条件下在细胞生长至70%-90%密度时进行转染miR-195-3p mimic和inhibitor处理,8h后更换高糖培养基继续培养48h,并设置红景天甙处理组,即转染8h后更换含红景天甙(100μM)的高糖培养基继续培养48h,提取细胞RNA,运用实时定量PCR仪检测每组细胞中miR-195-3p的表达倍数变化,同样处理后采用Hoechst+PI染色法计算各组平滑肌细胞凋亡率。
结果如图2所示,其中(a)为高糖与低糖处理以及高糖加红景天甙处理后miR-195-3p在平滑肌细胞差异表达的结果图、(b)为单纯转染miR-195-3p后平滑肌细胞miR-195-3p表达结果图、(c)为单纯转染miR-195-3p后平滑肌细胞凋亡率结果图、(d)为转染mir-193-3p后与红景天甙共同作用时平滑肌细胞miR-195-3p表达结果图、(e)为转染mir-193-3p后与红景天甙共同作用时平滑肌细胞凋亡率结果图。从图中可以看出,红景天甙处理后平滑肌细胞中miR-195-3p表达水平升高;分别转染miR-195-3p的mimic和inhibitor后平滑肌细胞miR-195-3p的表达量分别升高和降低,并且伴随细胞凋亡率分别升高和降低;转染miR-195-3p inhibitor后能降低红景天甙处理组平滑肌细胞中miR-195-3p的表达量且降低细胞凋亡率,说明红景天甙对平滑肌细胞中miR-195-3p具有调节作用,并且可以通过miR-195-3p通路来调节平滑肌细胞凋亡。
3、Western blot法检测转染miR-195-3p mimic和inhibitor后与红景天甙共同作用于平滑肌细胞内凋亡相关蛋白的表达
采用经典蛋白免疫印迹方法检测红景天甙对平滑肌细胞内凋亡相关信号通路的影响。取对数生长期的平滑肌细胞接种于6孔板中,高糖条件下在细胞生长至70%-90%密度时进行转染miR-195-3p mimic和inhibitor处理,8h后更换高糖培养基继续培养48h,并设置红景天甙处理组,转染8h后更换含红景天甙(100uM)的高糖培养基继续培养48h后,充分裂解细胞制作蛋白样品进行蛋白质免疫印迹实验。分别检测平滑肌细胞中内参蛋白GAPDH,凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2以及Caspase-3、Cleaved Caspase-3的表达情况。
结果如图3所示,图中(a)为凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的Western blot蛋白表达图,(b)为凋亡相关蛋白Caspase-3和Cleaved Caspase-3的Western blot蛋白表达图。(c)、(d)、(e)分别为(a)、(b)的统计图。从图中可以看出,红景天甙可以引起促凋亡蛋白Bax以及Cleaved Caspase-3的表达水平升高;抗凋亡蛋白Bcl-2以及Caspase-3表达水平的降低。以上结果提示红景天甙可以通过miR-195-3p通路促进促凋亡蛋白表达同时抑制抑凋亡蛋白的表达而引起平滑肌细胞发生凋亡。
综上所述,本发明通过上述实验证实,红景天甙能够有效改善由高糖引起的平滑肌细胞凋亡抑制,且可通过miR-195-3p通路调节平滑肌细胞凋亡,说明红景天甙具有效防治糖尿病性血管损伤的作用。

Claims (10)

1.红景天甙在制备防治糖尿病性血管损伤的药物和/或保健品中的应用,其特征在于,红景天甙的分子式为C14H20O7,结构如下式:
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的药物和/或保健品为防治高血糖引起的动脉管壁增厚的药物和/或保健品。
3.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的药物和/或保健品为促进平滑肌细胞凋亡的药物和/或保健品。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述的药物和/或保健品为促进动脉血管中膜平滑肌细胞凋亡的药物和/或保健品。
5.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述的药物和/或保健品为促进平滑肌细胞中促凋亡蛋白表达和/或抑制平滑肌细胞中抗凋亡蛋白表达的药物和/或保健品。
6.如权利要求5所述的应用,其特征在于,所述的促凋亡蛋白为促凋亡家族蛋白Bax,抗凋亡蛋白为抗凋亡家族蛋白Bcl-2。
7.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述的药物和/或保健品为促进平滑肌细胞凋亡过程中的终末剪切酶Cleaved Caspase-3表达的药物和/或保健品。
8.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述的药物和/或保健品为促进平滑肌细胞中microRNA表达的药物和/或保健品。
9.如权利要求8所述的应用,其特征在于,所述的microRNA为能够调节平滑肌细胞凋亡的microRNA。
10.如权利要求8或9所述的应用,其特征在于,microRNA为miR-195-3p。
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