CN103417987B - miR-148用于制备控制胰岛β细胞的增殖的药物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物和医药领域，公开了miR-148在胰岛β细胞增殖和凋亡中的作用，为糖尿病治疗和制备或筛选治疗2型糖尿病的药物提供了新的靶点，可将miR-148应用于制备或筛选控制胰岛β细胞的增殖的药物、制备或筛选控制胰岛β细胞的凋亡的药物，或者用于制备或筛选治疗2型糖尿病的药物。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和医药领域，具体为一种miRNA的应用。
背景技术
糖尿病是以持续高血糖为基本生化特征的一种慢性全身性代谢系疾病，主要是由于体内胰岛素分泌绝对缺少或由于身体对胰岛素的需求量增多而造成的胰岛素相对不足，或由于胰岛素抵抗，从而导致以糖代谢紊乱为主的糖、蛋白质及脂肪代谢紊乱的一种综合病症。根据发病原因和机制的不同可以将其分为两种类型：1型糖尿病（T1D）和2型糖尿病(T2D)。其中，以胰岛素分泌缺陷或（和）周围组织的胰岛素抵抗为特征的2型糖尿病所占的比例为90–95%。相关统计数据表明，糖尿病目前的患病人数已达2.2亿，其发病数量在全球已经达到了流行性疾病的规模。至2030年，全球糖尿病的发病数量将高达3.6亿。近二十年来，随着我国经济的发展，人们的生活方式发生了显著的改变，糖尿病的患病人数呈急剧增加的趋势，目前我国大约有9000多万糖尿病以及1.5亿糖尿病前期患者。糖尿病已经成为威胁我国居民生命和健康的重要疾病之一，然而目前尚无治愈糖尿病的药物，糖尿病患者的长期护理也使我们面临着巨大的经济挑战，因此，糖尿病是亟待解决的重大公共卫生问题，因而也是科学家们近期的研究热点。2004年，Nature报道了一篇微小RNA(miRNAs)应用上一个重要发现――成功采用miRNA调节了胰岛素的分泌，这为糖尿病的治疗带来新的希望，也将为糖尿病的新药研究带来新的光明和思路。多项重要的研究结果表明，miRNAs在T2D发生发展的各个阶段都起到不容忽视的调控作用，它们不仅影响胰腺的早期分化和发育，更是血糖平衡与能量代谢的重要调控者。糖尿病相关miRNAs的发现为预防，诊断和治疗糖尿病提供了新的靶点，并有望成为治疗和诊断糖尿病的全新医疗手段。
2型糖尿病占糖尿病患病人数的90%-95%，它以胰岛素分泌缺陷并伴随不同程度的胰岛素抵抗为主要特征。流行病学调查显示，2型糖尿病主要高发于发达国家和发展中国家。随着科学研究的进展，糖尿病的治疗手段和策略不断改进，但是糖尿病患者的死亡率仍居高不下，其死亡率可高达非糖尿病患者死亡率的5倍。此外，长期高血糖常引发机体多种器官的损害，主要包括心脏，血管，眼睛，肾脏，神经等，这不仅使患者的生活质量严重下降，这些疾病的治疗还会给整个社会带来沉重的医疗负担，增加了巨大的经济成本。因此，预防、诊断和治疗糖尿病的核心途径和关键靶点成为科学家们迫切需要探索和解决的难题。
2型糖尿病的发病机制不同于1型糖尿病，它有更强的遗传性和环境因素，其基因和环境因素的多样性造成了2型糖尿病个体的异质性的特点。目前，多数研究者认为2型糖尿病发病的主要原因是周围组织对胰岛素的抵抗（主要表现为高胰岛素血症，葡萄糖利用率降低等）和β细胞的功能缺陷。多年来，胰岛素抵抗和β细胞的功能缺陷在2型糖尿病发病过程的重要性一直存在争议，据目前的研究来看，越来越多的研究倾向于后者，认为β细胞功能缺陷是糖尿病发生发展最核心的环节。β细胞功能缺陷主要表现为β细胞数量的减少和胰岛素分泌异常。因此探讨影响β细胞的数量和β细胞的功能的原因以及机制，成为全球糖尿病研究领域的研究焦点。
一般情况下，成人的胰腺大约有100万个胰岛，每个胰岛由四种不同类型的内分泌细胞组成，主要包括占比最多、分泌胰岛素的β-细胞（60%-80%），其次是分泌胰高血糖素的α细胞（20%-30%），分泌促生长素抑制素的δ细胞（5%-15%），以及分泌胰多肽的PP细胞。β细胞的数量主要由四种机制调控：包括细胞凋亡（程序性细胞死亡），细胞大小（扩张），复制（已分化β细胞的有丝分裂）和新生（前体细胞的发育成熟）。任何一种调控机制的变化都会直接影响β细胞的数量。这四种调控机制可根据发育的不同阶段或体内代谢的需求发生变化。
正常情况下，成人的胰岛β细胞有0.5%的凋亡率，凋亡细胞的数量可以通过β细胞增生进行补偿，从而机体内胰岛β细胞数量的平衡。肥胖和胰岛素体抗都可以通过细胞增生，细胞变大增加胰岛β细胞的数量。然而，事实上，胰岛素抵抗状态或糖尿病状态下，胰岛β细胞的数量却是明显减少的，研究认为，在小鼠糖尿病模型动物发病的过程中，胰岛β细胞功能的缺陷的主要原因是胰岛β细胞的自我更新和细胞调亡不平衡。然而，胰岛β细胞的功能障碍与凋亡的β细胞数量不成比例。对此，没有人给出一个合理的解释。至2012年，CELL杂志发表的一篇文章，来自美国哥伦比亚大学医学中心的研究人员通过小鼠模型证实了胰岛β细胞并没有凋亡，而是去分化为胰腺前体细胞类型。
因此，保护胰岛β细胞的功能、获得和维持胰岛β细胞数量和功能是治疗糖尿病的根本。2004年研究者发现，GLP-1可以使胰岛β细胞再生增强而凋亡受到抑制，并可以促进胰腺祖细胞向胰岛β细胞分化。GLP-1类似物被称为胰岛β细胞的分化因子（使新生增加）、生长因子（使复制增强）和生存因子（使生存时间延长、凋亡减少）。目前，GLP-1类似物等胰岛β细胞靶向新药已成为研发和应用的中心。随着科学技术的进步，新的生物医学的研究方法和手段层出不穷，然而，目前尚无治愈糖尿病的方法，因此发现治疗糖尿病、改善胰岛β细胞的功能的新靶点，仍然是糖尿病研究领域继续探讨的重大科学问题。
除了胰岛β细胞的数量的减少，胰岛素分泌功能衰退也是引发糖尿病的主要原因，2型糖尿病患者中，胰岛β细胞释放胰岛素原和胰岛素的比例严重失调，其比例是正常人的4-5倍。
在后天的环境因素中，脂毒性和高血糖是引起2型糖尿病胰岛β细胞凋亡以及导致胰岛β细胞的功能障碍的两大关键因素。分离培养2型糖尿病患者的胰岛，是评价2型糖尿病患者胰岛β细胞功能最直接的窗口和工具。有研究人员对2型糖尿病患者的胰岛进行分离培养，期间检测胰岛的存活和分泌功能。结果显示，2型糖尿病患者胰岛β细胞表达胰岛素，糖转运蛋白，葡萄糖激酶等mRNA的水平明显降低，同时与凋亡相关的因子caspase-3和caspase-8的活性明显增加，这些结果也验证了2型糖尿病胰岛β细胞的确存在细胞凋亡增加和细胞的分泌功能缺陷。
因此，保护胰岛β细胞的功能、获得和维持胰岛β细胞数量和功能是治疗糖尿病的根本。发现治疗糖尿病、改善胰岛β细胞的功能的新靶点，仍然是糖尿病研究领域继续探讨的重大科学问题。
近年来，随着微小RNA(microRNA)的发现，其性状和功能研究逐渐受到人们的广泛重视。microRNA是转录后基因表达的调控者，在进化上高度保守，在各种生物的生长发育过程中发挥重要的调控作用。它可以与多个靶基因mRNA3’UTR区互补结合，抑制靶基因mRNA的翻译或（和）促使靶基因mRNA的降解。体内的microRNA可以参与人类的60%编码基因的表达调控，其表达调控具有靶向性和组织多样性的特点。microRNAs参与了体内多项生理和病理过程，影响细胞的增殖，分化，凋亡等。有研究表明，它们在多种疾病的发生发展过程中都起到至关重要的作用，包括各组织肿瘤的发生，心血管疾病，神经系统的疾病，病毒感染，哮喘以及糖尿病等。
现有的研究结果提示，在β细胞发育、增殖以及糖尿病的发生发展等复杂的生理、病理过程中，可能有许多未知的miRNA参与。发现对胰岛β细胞功能具有调节作用的新microRNA，并探讨其在胰岛β细胞增殖，凋亡以及分泌中的作用和机制，仍是我们理解2型糖尿病胰岛β细胞功能缺陷的前提和基础。
发明内容
本发明旨在提供微小RNA mR-148的应用，将其应用于促进胰岛β细胞的增殖或抑制细胞凋亡，或者用于制备或筛选控制胰岛β细胞的增殖的药物，或者用于制备或筛选控制胰岛β细胞的凋亡的药物，或者用于制备或筛选治疗2型糖尿病的药物。
诸多研究已证实，miRNAs在胰岛β细胞的发育和功能上充当着重要的角色。在胰岛β细胞中高丰度表达的miR-375是首个被发现发挥胰岛素分泌调控功能的miRNA，目前，它对胰岛β细胞功能和调控机制的阐述已较为清楚。其他在胰岛β细胞高丰度表达的miRNAs，如miR-124a，let-7,miR-133,miR-126等，对糖尿病或胰岛β细胞的作用也初步被发现和验证。
本发明的测序和验证结果显示miR-148在胰岛细胞中有很高的表达丰度，在人胰岛中测序的拷贝数高于miR-375。有研究发现，miR-148可能通过影响转录抑制因子SOX6和Bhlhe22的表达调控胰岛素的分泌。但是miR-148对胰岛β细胞增殖和凋亡的调控作用均未报道。
用胰岛β细胞系MIN6和小鼠的原代胰岛为工具，探讨了miR-148在胰岛β细胞中的功能。在MIN6细胞系和打散的小鼠胰岛细胞中，利用Lipo2000转染miR-148的抑制剂，并用Real-time PCR验证其抑制效率，结果发现，这种抑制剂可以非常有效的抑制细胞中内源性miR-148的表达，尤其在打散的原代胰岛细胞中，其抑制程度可以达90%以上。说明miRNA的抑制剂利用脂质体非常容易转进细胞中，简化了以往包被病毒感染原代胰岛细胞的程序，也为实验操作和未来的临床应用提供了安全性的前提。
在MIN6细胞增殖实验中，首先对转染miR-148抑制剂（Anti-miR-148）的MIN6细胞进行细胞活力检测，并绘制其生长曲线。结果发现，转染48小时后，两组细胞的生长开始出现显著性差异，miR-148抑制剂组的细胞数量明显低于对照组。初步表明抑制miR-148的表达后，MIN6细胞的增殖活性明显降低，同时，该细胞的生长曲线也说明，48小时至72小时是转染细胞的倍增时期，这为我们后续的细胞干扰实验（EDU和促凋亡诱导剂的添加）提供了合适的选择时机。
EDU实验和Ki67检测是反映细胞周期的不同方法，实验结果显示，在MIN6细胞和打散的小鼠胰岛细胞中，抑制内源性miR-148的表达后，EDU和Ki67的表达都明显降低，从而说明了转染Anti-miR-148使细胞生长减慢可能是通过影响细胞周期实现的。
细胞数量的改变，除了与细胞周期有关外，还可能与细胞的凋亡有关，在胰岛β细胞中，我们对MIN6细胞系进行了AnnexinV/7-AAD流式细胞检测，以及对原代打散的小鼠胰岛细胞进行了TUNEL细胞原位检测，结果都显示，Anti-miR-148可以有效的促进细胞凋亡，反之，miR-148则有抑制细胞凋亡的作用。这一结果与我们的增殖实验结果相吻合。这些也反映了miRNA在不同组织、不同生理/病理过程中调控作用的多样性。
明确了miR-148在胰岛β细胞中的促细胞增殖和抑制细胞凋亡的作用后，我们开始尝试并初步探讨了其作用的机制。诸多研究已经证实，miRNAs发挥作用主要是通过和靶基因3’UTR结合，从而调控mRNA的降解和（或）翻译实现的。那么，寻找miR-148的靶基因是探讨其作用机制的开端。目前文献已报道miR-148的靶基因有TGIF，DNMT1，DNMT3b，MSK1以及ROCK1，PTEN，P27，CDC25B，SOX6和Bhlhe22等，结合生物信息网站预测的miR-148的靶基因(www.targetscan.org)，我们在mRNA水平上初步检测了转染后MIN6细胞和打散的小鼠胰岛细胞中miR-148部分靶基因的表达，结果显示，P27，PTEN和Bim的表达改变较为明显，而文献中报道的ROCK1，CDC25B，SOX6以及Bhlhe22等无明显变化。
P27、PTEN和Bim均是在胰岛β细胞的发育和功能上起关键作用的基因，其中，P27和PTEN是调控细胞周期非常关键的抑制因子，抑制它们的表达，细胞的增殖增加；而Bim则是bcl-2家族中的促细胞凋亡因子，抑制其表达，则细胞凋亡减少。为了进一步验证mRNA的结果，我们对MIN6细胞和打散的小鼠胰岛细胞转染了Anti-miR-148，转染48小时后收取蛋白，用western-blot方法检测了P27，PTEN和Bim在蛋白水平的表达，结果显示，抑制MIN6细胞和打散的小鼠胰岛细胞表达miR-148后，P27，PTEN和Bim在蛋白水平均有显著的上调。因而推测，Anti-miR-148抑制细胞的增殖可能是通过上调P27和PTEN的表达有关，其促进细胞凋亡的作用可能与Bim的表达水平增加有关。
Luciferase实验是检测报告基因的直接手段，为了观察和检测miR-148是否通过与P27，PTEN和Bim基因的3’UTR相结合，从而调控其表达水平。我们构建了含有P27，PTEN和Bim基因3’UTR的报告质粒，通过与Anti-miR-148或inhibitorcontrol共转染，检测其报告基因荧光素酶的活性。实验结果显示，MIN6细胞经脂质体转染Anti-miR-148后，以上三种报告基因荧光素酶的活性均显著增强，其增强倍数约1.6至2倍。Luciferase的检测结果与P27，PTEN和Bim在mRNA和蛋白水平的检测结果一致，从而验证了Anti-miR-148对胰岛β细胞的增殖抑制和促进凋亡的作用是通过上调P27，PTEN和Bim的表达水平实现的。其中，P27和PTEN作为miR-148的靶基因在其他组织细胞的研究已经体现，而Bim作为miR-148的靶基因则是我们在胰岛β细胞首次发现的。
综上所述，本发明揭示了在人胰岛β细胞中具有高丰度表达的miR-148在β细胞中的增殖与凋亡作用，结果表明miR-148可以促进胰岛β细胞的增殖同时抑制细胞的凋亡，其促增殖和抑制凋亡的作用，为糖尿病治疗和制备或筛选治疗2型糖尿病的药物提供了新的靶点。
附图说明
图1为实施例1中，Anti-miR-148转染MIN6细胞系后的细胞生长曲线。
图2为实施例3中，Anti-miR-148转染原代分离的小鼠胰岛打散细胞后，流式检测分析细胞系Min6抑制miR-148的表达对细胞的凋亡的影响。
图3为实施例5中，QPCR检测细胞系MIN6转染后48小时miR-148的表达。
图4为实施例5中，QPCR检测细胞系MIN6转染后48小时miR-148靶基因的表达。
图5为实施例5中，Western-blot检测细胞系MIN6转染后48小时miR-148靶基因的蛋白表达。
图6为实施例6中，QPCR检测小鼠胰岛打散细胞转染后48小时miR-148的表达。
图7为实施例6中，QPCR检测小鼠胰岛打散细胞转染后48小时miR-148靶基因的表达。
图8为实施例6中，Western-blot检测小鼠原代胰岛打散细胞转染后48小时miR-148靶基因的蛋白表达。
具体实施方式
实施例1
在小鼠胰岛β细胞系MIN6中瞬时转染inhibitor control和Anti-miR-148，并用Real-time PCR验证其抑制效率，结果发现，其抑制剂可以非常有效的抑制细胞中内源性miR-148的表达，抑制程度达80%以上。
24孔板细胞和8孔板的爬片细胞后瞬时转染空白载体inhibitor control和Anti-miR-148，转染后48小时，更换一半新鲜培养液，同时按照1：1000的比例加入10mM EDU，掺入细胞DNA，4个小时后固定细胞，爬片细胞做EDU-Alexa647染色，24孔板细胞进行流式分析。结果显示，与对照组相比较，Anti-miR-148组EDU阳性细胞的比例明显减少，同时流式分析的结果也显示抑制miR-148的表达后EDU染色阳性细胞的比例由35%降至27%左右。
用ki67染色检测，免疫荧光化学结果显示，与对照组相比较，Anti-miR-148组ki67阳性细胞的比例也明显降低；同样，流式分析结果也显示抑制miR-148的表达后细胞Ki67阳性细胞的比例由56%下降至45%左右。
两组细胞EDU和ki67阳性细胞的比例经统计分析后均有显著差异（P<0.05）。同时，细胞瞬时转染后24小时，48小时，72小时和96小时分别用NF CellProliferation Assay Kit（Invitrogen）检测细胞活力，并绘制转染后细胞的生长曲线。方法：用酶标仪上设定激发波长485nm和发射波长530nm，并用测荧光的通道读取各孔的荧光值，进行统计分析，结果如图1。
结果显示，实验组抑制β细胞系MIN6表达miR-148后，与对照组相比较，其各时间点的活细胞数目均有不同程度的减少，尤其72小时和96小时的细胞数目差异更明显，两组活细胞数目相差15%左右，经统计分析后显示，两组细胞数目的差异有显著性差异（P<0.05，P<0.01）。
以上结果都说明抑制β细胞系MIN6内源性miR-148的表达，可以导致细胞的增殖显著减少；miR-148的抑制剂（Anti-miR-148）可以有效抑制胰岛β细胞系MIN6的增殖。
实施例2
分离的小鼠原代胰岛培养过夜后消化打散，瞬时转染inhibitor control和Anti-miR-148，转染48小时后固定细胞核染色，荧光显微镜下观察细胞的转染效率，约90%左右。并用Real-time PCR验证其抑制效率，结果发现，其抑制剂可以非常有效的抑制细胞中内源性miR-148的表达，抑制程度达90%以上。
转染后48小时，固定透化后免疫荧光化学显结果显示，两组细胞均有少量细胞核表达的Ki67阳性细胞，经荧光显微镜下拍照，阳性细胞记数后统计分析，显示ki67阳性细胞占insulin阳性细胞的比例由9‰降为4‰左右；
转染后48小时，打散的小鼠原代胰岛细胞基本已贴壁，更换新鲜培养液，同时加入10mM EDU(1:1000)，掺入细胞DNA，24小时后固定细胞，做EDU-Alexa647染色，经荧光显微镜下拍照，阳性细胞记数后统计分析EDU阳性细胞的比例，结果显示EDU阳性细胞占insulin阳性细胞的比例由5.9‰下降至2.95‰左右；经统计学分析，inhibitor control组和Anti-miR-148的Ki67阳性细胞和EDU阳性细胞在insulin阳性细胞的比例差异均具有显著差异（P<0.05），表明用Anti-miR-148抑制小鼠原代胰岛β细胞中miR-148的表达，对细胞的增殖有明显的抑制作用。
实施例3
细胞系MIN6瞬时转染对照空白载体和Anti-miR-148，转染后48小时按照1：1000的比例加入蛋白激酶C抑制剂星型包菌素staurosprine以诱导细胞凋亡，作用24小时后收细胞进行Annexin-FITC/7-AAD染色，然后流式检测分析，结果如图2。
结果显示，与对照组相比较，Anti-MiR-148组细胞早期凋亡细胞（Annexin-FITC阳性/7-AAD阴性细胞）的比例明显增加，存活细胞（Annexin-FITC/7-AAD均阴性细胞）的比例显著减少，死亡细胞或晚期凋亡细胞（Annexin-FITC/7-AAD均阳性细胞）的比例无明显改变。
因此，Anti-miR-148可以促进胰岛β细胞系MIN6的凋亡，同时表明抑制胰岛β细胞系MIN6中miR-148的表达后存活细胞的减少的途径是通过细胞凋亡实现的。
实施例4
分离的小鼠原代胰岛培养过夜，胰岛修复后状态良好，用0.05%的胰酶消化胰岛后将其打散为单细胞，接种在8孔板中，同时瞬时转染空白对照载体和Anti-miR-148，转染后48小时后按照1：1000的比例加入蛋白激酶C抑制剂星型包菌素staurosprine以诱导细胞凋亡，诱导4小时后，收细胞样本固定透化做TNUEL染色，经荧光显微镜下观察拍照，记数后统计分析TUNEL阳性细胞比例，结果显示，与对照组相比较，实验组TUNEL阳性细胞占胰岛素阳性细胞的比例由8%上升至14%左右。
经统计学分析，对照组和Anti-miR-148组TUNEL阳性细胞比例差异具有显著差异（P<0.05），表明Anti-miR-148可增加小鼠原代胰岛β细胞的凋亡。
实施例5
在小鼠胰岛β细胞系MIN6中瞬时转染空白对照载体（inhibitor control）和Anti-miR-148，48小时后分别收取总RNA，并提取细胞蛋白用QPCR的方法，检测miR-148和以及相关靶基因的表达水平。用western blot方法检测P27,Pten和Bim的蛋白水平，结果如图3-5。
结果显示用Anti-MiR-148可以显著降低小鼠胰岛β细胞系MIN6中内源性miR-148的表达，可使其下调80%以上（图2）。QPCR的结果显示，MiR-148被抑制后，其相关基因的表达有所变化，其中以bim、p27、pten三个基因上调明显（图4）。
同样，用western-blot方法检测靶基因在蛋白水平的表达情况，结果也显示，在miR-148被抑制后，其靶基因bim、p27、pten在MIN6细胞系中的表达均明显上调（图5）。
实施例6
分离的小鼠原代胰岛培养过夜，胰酶消化打散后瞬时转染空白对照载体inhibitor control和Anti-miR-148，48小时后分别收取总RNA，并提取细胞蛋白。用QPCR的方法，检测miR-148和以及相关靶基因的表达水平，用western blot方法检测P27,PTEN和BIM的蛋白水平。结果如图6-8。
结果显示用Anti-miR-148可以强烈抑制小鼠胰岛β细胞系MIN6中内源性miR-148的表达，可使其下调至几乎消失的状态（图6）。靶基因QPCR的结果显示，miR-148被抑制后，其相关基因的表达也有所变化，同样以bim，p27，pten三个基因上调尤为明显（图7）。
同样，在蛋白水平结果显示，miR-148被抑制后，其靶基因P27，Pten，Bim在小鼠原代胰岛打散细胞中，表达也明显上调（图8）。
实施例7
用胰岛β细胞系MIN6做报告基因检测，显示miR-148可结合bim,pten和P27基因的3’UTR区域。
用带pten，P27和bim基因3’UTR的报告质粒瞬时转染MIN6细胞系，同时转染inhibitor control和Anti-miR-148，48小时后收取细胞样本检测各报告基因荧光素酶的活性。结果显示，与对照组相比较，Anti-miR-148组pten，P27和bim报告基因荧光素酶活性活性显著增强，其均值分别是对照组的1.64，1.58和2倍。
经统计学分析，Anti-miR-148组和inhibitor control荧光素酶的活性差异有显著的统计学意义，从而表明miR-148可能结合于pten、P27和bim基因3’UTR区域，调控其基因的表达。
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1.mir-148在制备促进胰岛β细胞的增殖的药物中的应用。
2.mir-148在制备抑制胰岛β细胞的凋亡的药物中的应用。
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