CN102124108A - Eif-5a1 sirna保护胰岛细胞免受凋亡和维持它们功能性的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于改善从供体器官分离用于后续移植的胰岛的生存力、恢复和功能性的方法，且更具体的涉及使用eIF-5A1 siRNAs来增强胰岛的生存力和功能性。

Description

EIF-5A1 SIRNA保护胰岛细胞免受凋亡和维持它们功能性的用途
发明背景
胰岛是一种多细胞实体，其包含在胰内产生胰岛素的细胞。正常人具有约一百万个胰岛，它们包含胰中细胞总数的大约2-3％。胰包含胰岛，其包含产生胰岛素的β细胞。β细胞监测血液中的葡萄糖水平，并释放精细测量量的胰岛素以抗衡葡萄糖峰。当这些β细胞中超过90％被破坏时，发生I和II型糖尿病。
1型糖尿病是一种葡萄糖稳态病症，其影响美国2100万糖尿病个体中的约10％。1型糖尿病源自胰岛β细胞的实质上完全的自身免疫破坏，导致个体依赖于胰岛素的施用来维持生命。1型糖尿病的发病机理包括免疫系统细胞与胰岛β细胞上存在的抗原之间复杂的相互作用。这种相互作用引起Th1细胞和巨噬细胞的活化，它们随后释放诱导一氧化氮产生的细胞因子(IL1β，TNFα和IFNγ)以及其他因子，其引发凋亡和坏死性胰岛β细胞死亡。包括胰或胰岛移植的β细胞“替换”策略已经可变地成功用于反转1型糖尿病，但是需要来自有限来源(尸体供体)的组织并仍易受根本的自身免疫过程的损伤。
从结缔基质和残留外分泌组织分开(separation)或分离(isolation)胰岛对于实验室试验和移植目的是有利和有益的。对于I型糖尿病的治疗来说，胰岛移植是最有希望的，并且是生理上侵袭性最低的方法。移植胰岛而不是完整的胰组织具有独特的优势：容易移植，和供体组织胰外分泌功能(包括消化酶的分泌)的清除。从胰外分泌组织释放胰岛是影响胰岛移植的起始和重要步骤。胰岛分离的重要目标是为移植提供足够数目的活的功能性的和有效的胰岛。
“埃德蒙顿方案(Edmonton Protocol)”将健康的胰岛移植到糖尿病患者体内。使用埃德蒙顿方案的胰岛移植在下述文献中叙述：Shapiro，Ryan，and Lakey，Clinical Islet Transplantation-State of the Art，Transplantation Proceedings，33，pp.3502-3503(2001)；Ryan et al.，Clinical Outcomes and Insulin Secretion After Islet Transplantation Withthe Edmonton Protocol，Diabetes，Vol.50，April 2001，pp.710-719；andRyan et al.Continued Insulin Reserve Provides Long-Term GlycemicControl，Diabetes，Vol.51，July 2002，pp.2148-2157。一旦在肝中，所述细胞就发展血液供给并开始产生胰岛素。依赖于所用方法，埃德蒙顿方案可包括7-10个步骤。第一步骤包括向供体胰输送特定的酶(liberase)，其消化所述胰组织，但不消化胰岛。消化步骤接下来的是，从胰其他细胞中分离胰岛的几个连续步骤。所述分离的胰岛被移植到肝的主血管(称为门静脉)中。当被损坏时，肝能够自我再生，构造新的血管和支持组织。因此，当胰岛被移植到肝中时，相信新血管生成以支持胰岛。所述细胞产生的胰岛素通过这些周围血管被吸收到血流中并分布到全身以控制血液中的葡萄糖水平。
总而言之，埃德蒙顿方案的步骤产生一种损害胰岛生存力的有力方法，其中胰岛具有脆弱的三维结构并需要大量的氧以维持生长和生存力。在此方法中，由于氧输送的非最佳条件，胰岛可被损害或破坏，从而影响从给定供体胰回收的健康胰岛的得率。而且，胰岛移植被供体的可获得性严重的限制了；通常，在仅仅一个患者中，要求两个胰以获得胰岛素的独立性。
胰岛移植与无类固醇的非致糖尿病的免疫抑制疗法一起已经被用于治疗I型糖尿病患者。然而，这样的治疗可导致增加的高脂血症和高血压的风险，且长期的研究证明胰岛生存力被损伤。
在人类中胰岛移植的埃德蒙顿方案显示显著的短期成功，80％的个体在移植后1年实现胰岛素独立性。但是，该比例在5年内降低到只有约10-15％。移植功能这种渐进性丢失的原因还不清楚，但可能包括作为进行性细胞因子介导的炎症的结果的胰岛损失。但是，对于1型糖尿病个体来说胰岛移植仍然是可行的治疗选择，尤其当结果显示甚至对于那些未能保持长期胰岛素独立的个体来说，它们仍然保留其他重要的益处，诸如减轻的血糖不稳定性，低血糖症的更低发病率，和降低的胰岛素剂量。
胰岛移植后的第一天对于移植的胰岛来说是特别容易受到损害的时期。高达60％的移植胰岛在移植后第一天经历非自身抗原特异性的凋亡。这种早期损伤是需要使用2到3具尸体供体以确保足够的胰岛存活来逆转糖尿病的主要根本原因。炎性细胞因子IL-1β、TNFα和IFNγ的局部产生与移植胰岛的早期凋亡有关。因此，在移植早期限制细胞因子产生的策略既可以限制获得足够胰岛必需的供体数目，还可以增强胰岛生命力并延长它们长期发挥功能的能力。本发明提供这些策略。
发明概述
本发明提供一种用于在分离后维持收集的胰岛细胞的功能性的方法，包括在胰岛分离前给胰岛细胞供体的胰岛细胞施用eIF-5A1siRNA，其中所述eIF-5A1 siRNA抑制胰岛细胞中eIF-5A1的表达，从而抑制胰岛细胞的凋亡并维持收集的胰岛细胞的功能性。在优选的实施方案中，siRNA以eIF-5A1的下列核苷酸序列作为靶标：5’-AAAGGAATGACTTCCAGCTGA-3’；5’-AAGATCGTCGAGATGTCTACT-3’；5’-AAGGTCCATCTGGTTGGTATT-3’；或5’-AAGCTGGACTCCTCCTACACA-3’。在某些实施方案中，eIF-5A1siRNA  包括核苷酸序列5’-AAAGGAAUGACUUCCAGCTGAdTdT-3’。siRNA可以通过任意可接受的方式施用给供体。在某些实施方案中，通过腹膜内注射给胰岛细胞供体施用siRNA。
本发明的另一实施方案提供一种用于在供体收集过程期间抑制胰岛细胞遭受凋亡的方法，包括在胰岛分离前通过对胰岛细胞供体的腹膜内注射给胰岛细胞供体施用eIF-5A1 siRNA，其中所述eIF-5A1siRNA抑制胰岛细胞中eIF-5A1的表达，从而抑制胰岛细胞的凋亡。
在优选的实施方案中，siRNA以eIF-5A1的下列核苷酸序列作为靶标：5’-AAAGGAATGACTTCCAGCTGA-3’；5’-AAGATCGTCGAGATGTCTACT-3’；5’-AAGGTCCATCTGGTTGGTATT-3’；或5’-AAGCTGGACTCCTCCTACACA-3’。在某些实施方案中，所述eIF-5A1 siRNA  包括核苷酸序列5’-AAAGGAAUGACUUCCAGCTGAdTdT-3’。
可以使用任意siRNA或反义构建体，只要这类构建体抑制胰岛细胞中eIF-5A1的表达。siRNA的施用可以通过任意合适的途径。示例性的施用方法包括通过胰岛细胞供体的门静脉的灌注，通过胰岛细胞供体的门静脉的流体动力灌注和腹膜内施用。
本发明还提供一种包括eIF-5A1 siRNA的用于抑制胰岛细胞凋亡并维持其功能性的组合物，其中所述siRNA抑制eIF-5A1的表达，从而抑制胰岛细胞的凋亡。优选的eIF-5A1 siRNAs是上文讨论到的。
本发明还提供一种抑制胰岛β细胞中靶蛋白表达的方法，包括在β细胞收集前给β细胞供体施用靶向编码靶蛋白的mRNA的siRNA构建体，其中所述siRNA抑制胰岛β细胞中靶蛋白的表达。
本发明还提供一种通过降低eIF-FA的表达减少通过诱导型一氧化氮合酶(iNOS)途径的一氧化氮(NO)产生的方法。
本发明还提供eIF5A siRNA在制备减少通过iNOS途径的一氧化氮产生的药物中的用途。
附图简述
图1提供通过门静脉灌注eIF-5A siRNA后对β-肌动蛋白、mAAT和eIF-5A1进行的RT-PCR结果。该图显示eIF-5A1表达是可测量的，从而并入到胰岛中。
图2显示慢逆行门静脉灌注。为预备结(深色缝合线)准备的胆管(透明的)和门静脉(红)。针在结的下方(箭头标示的方向)进入，穿过结的下方并且向血管释放siRNA，其可以达到胰、脾、肠和三分之一的远端结肠。
图3显示将eIF-5A1 siRNA灌注到胰岛中，引起eIF-5A1表达的降低(所示为eIF-5A1的mRNA水平的降低)。
图4显示与对照和盐水处理的胰岛(此处n＝2每组)相比，用eIF5-5A 1siRNA处理的胰岛细胞凋亡的减少。
图5显示与对照和盐水处理的胰岛(此处n＝3每组)相比，用eIF5-5A1 siRNA处理的胰岛细胞凋亡的减少。
图6提供与eIF5-A2比对的人eIF-5A1的核苷酸序列。
图7提供与eIF5-A2比对的人eIF-5A1的氨基酸序列。
图8提供人eIF-5A1的核苷酸序列与示例性反义寡核苷酸。
图9提供人eIF-5A1的核苷酸序列与示例性反义寡核苷酸。
图10A和B提供人eIF-5A1的核苷酸序列与示例性siRNAs。
图11提供人eIF-5A1的核苷酸序列与示例性siRNAs。
图12是显示siRNA eIF-5A1能够敲低(knock down)(降低)胰岛细胞中表达的实验示意图。
图13A显示在2.8到11mM葡萄糖刺激后50个胰岛的胰岛素分泌模式，图13B显示在2.8到11mM葡萄糖刺激后来自单个胰岛的[Ca2+]I模式。相是0，1，2。该图显示具有胰岛素分泌二相性模式的对葡萄糖刺激的正常功能性胰岛应答，其非常类似于胰岛胞内钙([Ca2+]i)的相似变化。
图14提供钙振荡研究的结果。这些图显示用eIF-5A1 siRNA处理的胰岛细胞(因此具有降低的eIF-5A1表达)显示显著更强的葡萄糖应答和整体的振荡。这表明这些处理的细胞不仅存活更长，而且保留了功能性。
图15显示染色的细胞因子处理胰岛细胞的不同照片。所述照片显示用eIF-5A1 siRNA处理的胰岛细胞比用对照或赋形剂(只用盐水)处理的胰岛细胞具有更多活的和更少死的细胞。
图16A和16B通过4种不同的成像技术显示，当通过IP注射给胰岛细胞供体施用时siRNA进入胰岛细胞。使用共焦成像来产生分离胰岛的3D重建。图16A显示从小鼠(给其腹膜内施用0.9％盐水，每天一次共三天)分离的胰岛显示特征性FITC自身荧光，但在TRITC通道(在图中标记的Cy3)中荧光最弱。图16B显示，从C57BI/6小鼠(给其腹膜内施用Cy3-标记的稳定化的siRNA，每天一次共三天)分离的胰岛显示Cy3标记的穿透。
图17(A)显示用两种不同的siRNA构建体(构建体A和B)或对照转染βTC3细胞并进行针对所示蛋白的免疫印迹的结果。图17(B)显示用相同的siRNAs腹膜内注射C57B1/6小鼠(每天一次共三天)，然后通过胶原酶消化和差异梯度离心分离并纯化胰岛的结果。胰岛用2％SDS裂解，然后进行免疫印迹。图17(C)显示在3mM D-葡萄糖中成像前用Fura2加载分离的胰岛30分钟的结果。胰岛用11mM D-葡萄糖刺激约300秒，通过荧光显微镜检查连续监测Fura2比例。图17(D)显示利用每个治疗组的50个胰岛进行葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)的结果。
图18A-I显示eIF5A的敲低(knockdown)临时提供(improvise)胰岛离体(ex-vivo)功能和存活。
图19A-D显示在eIF5A-缺陷型细胞中没有细胞因子诱导的iNOS蛋白产生。
发明详述
真核起始因子5A(eIF5A)看起来是应激诱导型基因的转录后调节中的一个重要因子，其在哺乳动物细胞中促进细胞因子介导的凋亡。eIF5A是一种小的酸性蛋白，在整个真核生物中都高度保守，是已知的包含独特多胺来源的氨基酸羟丁赖氨酸(hypusine)的唯一蛋白。eIF5A被认为在mRNA加工、运输和翻译中起作用。但是，其在胰岛炎性级联中的作用(如果有的话)之前还没有被表征过。胰岛对葡萄糖和脂质毒性、氧化应激和炎性细胞因子非常敏感。为了研究参与介导胰岛应答细胞应激的因子的作用，本发明人开发了一种利用小干扰RNAs(siRNAs)体内减少(deplete)胰岛的特定蛋白的方案。在一个研究中，本发明人通过使用RNA干扰减少胰岛中的eIF5A蛋白来设法确定eIF5A在胰岛中的作用。
但是，在主要啮齿动物胰岛中RNA干扰研究的一个主要挑战是它们相对较差的转染效率。而先前的工作已经证明病毒介导的短发夹RNAs输送的应用，该技术耗费大量时间产生合适的病毒，并易遭受病毒毒性。本发明人发现一种通过重复腹膜内注射稳定化的小干扰RNAs(siRNAs)以在体内减少小鼠胰岛中所选蛋白的新方案。该方案导致siRNA在胰岛内的显著穿透。该技术可以成功用于减少胰岛中任意需要的/靶蛋白诸如充分表征的胰转录因子Pdx1。利用该技术，本发明人还成功地减少胰岛中的eIF5A蛋白，证明eIF5A通过促进编码诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的mRNA的翻译而有助于细胞因子介导的胰岛功能障碍。该数据表明一种模型，其中在胰岛中eIF5A是mRNAs亚组(可能是涉及细胞因子介导的应激应答的那些)(包括iNOSmRNA)的稳定化和/或核输出必需的。
本发明人使用体内siRNA注射来研究真核起始因子5A(eIF5A)在细胞因子介导的应激中的作用。eIF5A已经在其他系统中被表征为应激诱导型基因的翻译中的重要调节因子。当给小鼠注射针对eIF5A的siRNA时，在分离的胰岛中观察到eIF5A蛋白水平的50-70％降低。伴随这种降低，与对照处理相比，观察到葡萄糖刺激的胰岛素分泌和Ca2+动员的30-40％增加。当分离的胰岛被暴露于促炎细胞因子(IL1β，TNFα，IFNγ)的鸡尾酒混合物时，在用si-eIF5A处理的动物中仍然维持相对增强的胰岛功能。eIF5A敲低后的胰岛保护不伴随有基因表达的改变，所述基因的产物涉及葡萄糖应答性或胰岛素转录(Slc2a2，Gck，Irs1，Nkx6-1，MafA，Pdx1，NeuroD1和Setd7)。参见图18C。重要地是，尽管响应细胞因子时在对照和si-eIF5A处理的胰岛中编码诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的mRNA均上调至超过40倍(参见图19A)，但在si-eIF5A处理的胰岛中iNOS蛋白水平要低至1/3-1/5(参见图19B)。这些数据表明用si-eIF5A处理的胰岛中增强的功能可能是减少的一氧化氮产生后继发的。这提供证据证明，eIF5A通过控制iNOS翻译在针对应激信号的胰岛β细胞应答中起着重要作用，这样的话，eIF5A可以作为目标在于收集和移植后维持胰岛细胞的生存力以及能力的治疗策略的活靶标。
本发明人进一步证明，通过羟丁赖氨酸化作用(hypusination)的抑制(通过施用GC-7-一种DHS的抑制剂)对eIF-5A功能的阻断有效降低iNOS水平。参见图19D。
先前已经证明通过逆行门静脉接种的胰灌注可以实现将siRNA并入胰岛。参见Bradley，et al.，Transplantation Proceedings，37，233-236，2005。简单来说，使用与Lipofectamine 2000一起包裹的或未包裹的Cy-3标记的萤光素酶(Luc)siRNA GL2双链，通过尾静脉(体内，50μg每只小鼠)注射或通过逆行门静脉接种(原位，2μg每只小鼠)直接注射入胰。在原位输送后获得胰并在4℃保存24小时或体内输送后获得胰并在4℃保存4小时，分离胰岛，在检查前再培养16小时。为了显示siRNA分布，针对胰岛素对胰染色，并在荧光显微镜下检查。在荧光显微镜下直接检查分离的胰岛。观察到未包裹的siRNA以与使用脂质体包裹的siRNA类似的程度达到胰岛，与所谓的体内“裸”siRNA输送的报道吻合。Lewis et al.，Nat.Genet.32：107-108，Epub 2002 Jul2029，2002和McCaffrey AP，et al.，Nature 418：38-39，2002)。图1显示对胰岛细胞的灌注提供针对胰岛细胞的合适输送机制。
因此，本发明提供一种抑制胰岛细胞中靶蛋白表达的方法，包括给胰岛细胞施用针对编码靶蛋白的mRNA的siRNA，其中siRNA抑制胰岛细胞中靶蛋白的表达。施用可以通过任意方式，优选的在胰岛β细胞分离前通过给胰岛β细胞供体的腹膜内施用。
在一个实验中，本发明人证明给C57BL/6小鼠进行三个一天一次的腹膜内注射稳定化的Cy3标记的双链RNAs显示显著的穿透入分离的胰岛，这通过共焦显微镜术确定。为了验证用于蛋白敲低的这种技术，使用针对Pdx1的稳定化的siRNAs。两种不同的针对Pdx1信息的siRNAs导致胰岛中Pdx1蛋白的50％和90％敲低(通过免疫印迹分析法评价)。参见图17A-D。
本发明提供一种抑制胰岛细胞中eIF-5A1表达的方法，包括给胰岛细胞施用eIF-5A1 siRNA，其中eIF-5A1 siRNA抑制胰岛细胞中eIF-5A1的表达。图16A和16B显示通过IP注射对胰岛细胞供体的施用还提供一种针对胰岛细胞的合适输送机制。图16B显示给C57BL/6小鼠进行三个一天一次的腹膜内注射稳定化的Cy3标记的双链RNAs显示显著的穿透入分离的胰岛，这通过共焦显微镜术确定。图12B和18B显示用eIF-5A1 siRNA处理的胰岛细胞实际上表达更少的eIF-5A1siRNA。
通过抑制eIF-5A1表达，凋亡也被抑制。图4和5显示，在分离前用eIF-5A1 siRNA处理胰岛细胞提供一种抑制这些细胞遭受凋亡的机制(如通过sub-G1期细胞数目的减少来表明的)。因此，本发明还提供一种在收集的胰岛细胞中抑制凋亡的方法，包括给胰岛β细胞供体施用eIF-5A1 siRNA，其中eIF-5A1 siRNA抑制胰岛细胞中eIF-5A1的表达，并且其中eIF-5A1表达的抑制抑制凋亡。优选的在收集步骤前用eIF-5A1 siRNA细胞处理胰岛细胞。
本发明还提供一种用于在分离后维持收集的胰岛细胞的功能性的方法，包括在胰岛分离前给胰岛细胞供体的胰岛细胞施用eIF-5A1siRNA，其导致胰岛细胞中eIF-5A1表达的抑制或降低，进而抑制胰岛细胞的凋亡并维持它们的功能性。维持胰岛细胞的功能性表示，胰岛细胞在收集过程期间不仅存活，而且在收集过程后维持它们的功能(与未经eIF-5A1 siRNA处理的胰岛细胞相比，细胞的功能性维持更长时间和/或它们维持更好的葡萄糖应答)(即响应葡萄糖而释放胰岛素)。
在一个实验中，为了研究eIF-5A1敲低对胰岛功能和总体健康状况的影响，对C57BL/6雄性小鼠给予腹膜内(IP)注射：赋形剂(0.9％盐水)[组I]，对照siRNA(16.6mg/kg)[组II]或eIF-5A1 siRNA(16.6mg/kg)[组III]。在胰岛收集前(第0天)每天施用指定治疗的注射，共3天(-3，-2，-1天)。分离的胰岛通过胶原酶处理纯化，并在试验开始前静置16-18小时。在收集后第1天确定功能的基线后，将一半胰岛暴露于细胞因子鸡尾酒混合物(5ng/mL IL1β，10ng/mL TNF-α，100ng/mLINF-γ)以模拟1型糖尿病中胰岛遭遇的条件。实验设计示意图和胰岛分配在图12A中描述。
通过Western印迹分析每组胰岛的蛋白裂解物中的蛋白敲低。图12B显示组III处理小鼠的胰岛中eIF-5A1的相对敲低，这在图12C中进行定量。这些数据显示IP注射导致胰岛中eIF-5A1表达敲低的功效。
通过钙振荡分析法表明了收集的胰岛中功能性得到维持的证据。本发明人已经确定胞内钙是刺激和应激的指示物。对于人和啮齿动物来说，功能正常的胰岛以胰岛素分泌的两相模式响应葡萄糖刺激，如图13A所示。作为一级近似(first approximation)，这种两相分泌模式与胰岛胞内钙([Ca2+]i)的类似变化非常相似，其还由落入第二相平台的第一相峰组成(图13B)。但是，报道的作为340和380nm刺激的发射光比例的[Ca2+]i测量值提供检测胰岛功能其他特征的更高敏感性。对葡萄糖的[Ca2+]i应答由三相组成(参见图13)，其大致反映了由β细胞刺激-分泌偶联的“共有模型(Consensus Model)”描述的过程。当内质网动员和捕获[Ca2+]i(相0)时，[Ca2+]i的初始降低发生在葡萄糖转运入β细胞之后。葡萄糖然后通过糖酵解代谢，并在三羧酸(TCA)循环中进一步代谢，其导致ATP的产生。当ATP/ADP的足够增加开始关闭KATP-离子通道时，发生[Ca2+]i的急剧上升，这归因于与第一相胰岛素分泌有关的L型钙离子通道的开放。在该初始第一相峰后，[Ca2+]i降至经常被[Ca2+]i振荡打断的平台。平台高度与葡萄糖浓度和第二相胰岛素分泌的比例直接相关。总的说来，这种基于成像的[Ca2+]i测量值因此是单个胰岛水平上动力学胰岛素分泌的良好一级近似值。
许多因子可以对针对葡萄糖刺激的正常[Ca2+]i应答产生负面影响。葡萄糖代谢、线粒体和ATP产生、内质网(ER)、离子通道功能的破坏和无数其他问题都可能影响与葡萄糖刺激有关的钙处理动力学。相对于通过静态胰岛素分泌的标准检测法，通过经常监测[Ca2+]i的变化更有可能观察到在这些活性方面的缺陷。例如，低葡萄糖情况下增加的基础[Ca2+]i和葡萄糖刺激期间[Ca2+]i相0降低的损失可能表明ER-应激或可能的离子-通道功能障碍。这类缺陷不可能通过测量静态或动力学胰岛素分泌轻易检测，但可以使用本文描述的成像技术解决这些问题。
在细胞因子存在和缺失的条件下，在钙振荡和葡萄糖刺激的胰岛素分泌研究中，用eIF-5A1 siRNA(16.6mg/kg)处理的胰岛[组III(eIF-5A1敲低胰岛)]显示对葡萄糖的更高应答和延长的功能性维持(提示延长的存活)。参见图14。因此，还预期这些胰岛显示胰岛素的更高产生(数据待决)。在活/死染色后采集的成像初步数据定性支持以下观点：eIF-5A1敲低延长胰岛细胞的生命(图15)。通过比较红色胰岛(EtHD-1插入死胰岛细胞细胞核的结果)的数目相对绿色胰岛(主动将钙黄绿素-AM裂解为荧光钙黄绿素)的数目，可以确定胰岛生存力的定性成像(图15)。
本发明进一步提供一种抑制涉及炎性疾病的细胞凋亡的方法，其中所述疾病与一氧化氮产生的增加有关。例如，炎性疾病诸如类风湿性关节炎(RA)与一氧化氮(NO)的产生增加有关，这归因于诱导型一氧化氮合酶(iNOS)途径的活化。动物模型中的研究表明，NO在关节炎症和组织损伤的发病机理中起着原因作用，因为通过施用NOS抑制剂可以减轻关节炎的严重性。关节内存在的数种细胞类型，包括滑液成纤维细胞、内皮细胞和软骨细胞，可以通过促炎性细胞因子诱导来在体外产生NO。此外，定位研究显示获自RA患者的关节组织中滑液衬里细胞、软骨细胞和血管存在iNOS表达的上调。鉴于其他研究(显示凋亡在RA中增加，尤其是在滑液衬里层和软骨中)，将iNOS表达定位于滑液衬里层和软骨是令人感兴趣的。导致类风湿性关节中凋亡的机制仍然不清楚，尽管先前的工作显示Fas抗原的表达在RA滑膜细胞中增加，并且Fas抗体可以在体外刺激滑膜细胞的凋亡死亡。其他人已经研究了以下假设，iNOS途径的活化还参与刺激类风湿性关节中的凋亡，因为已知高水平的NO在体外刺激许多细胞类型的凋亡，并总结出NO作为RA中凋亡的介导物。参见R.J.van′t Hof et al.，Rheumatology 200，39：1004-1008。
这样的话，本发明提供一种在与RA有关的细胞(诸如滑液和软骨细胞)中抑制凋亡的方法，通过抑制eIF5A的表达从而抑制或减少通过iNOS途径的一氧化氮产生来抑制细胞的凋亡。
本发明进一步提供一种抑制细胞或宿主中NO产生的方法，通过给细胞或宿主施用针对eIF-5A的siRNA。siRNA减少eIF-5A的表达，进而通过抑制iNOS途径的活化来减少NO的产生。
本发明还提供eIF5A siRNA在制备减少通过iNOS途径的一氧化氮产生的药物中的用途。
可以使用任意抑制eIF-5A1表达的eIF-5A1 siRNA。术语“抑制”还表示与对照细胞(即未用eIF-5A1 siRNA处理的那些细胞)中存在的水平相比的降低。一种示例性和尤其优选的eIF-5A1 siRNA包括序列：5’-AAAGGAAUGACUUCCAGCTGAdTdT-3’。2005年11月28日提交的共同待决申请11/293,391(其在此完整通过援引引入)提供其他示例性的eIF-5A1 siRNAs和其他反义构建体，它们已经被用于在其他细胞类型中抑制eIF-5A1的表达，也被证明抑制凋亡。根据eIF-5A1序列本领域技术人员可以设计其他eIF-5A1 siRNAs，无需过度实验就可以轻易检测siRNAs抑制表达的能力。图6-11提供eIF-5A1，示例性eIF-5A1siRNAs和反义构建体的序列。在本发明的另一实施方案中，eIF-5A1的反义构建体可以用于抑制eIF-5A1的表达，从而抑制胰岛细胞的凋亡以及保持或维持它们的功能性。
在优选的实施方案中，eIF-5A1siRNA以eIF-5A1的下列核苷酸序列作为靶标(参见图10)：5’-AAAGGAATGACTTCCAGCTGA-3’；5’-AAGATCGTCGAGATGTCTACT-3’；5’-AAGGTCCATCTGGTTGGTATT-3’；和5’-AAGCTGGACTCCTCCTACACA-3’。在特别优选的实施方案中，siRNA以eIF-5A1的下列序列作为靶标：5’-AAAGGAATGACTTCCAGCTGA-3’。
本发明还提供一种在供体收集过程期间抑制胰岛细胞遭受凋亡的方法。正如上文的讨论，许多胰岛细胞在收集时经历凋亡。本发明人证明在收集前给胰岛细胞施用eIF-5A1 siRNA提供抗凋亡的保护性益处。在胰岛分离前给胰岛细胞供体的胰岛细胞施用eIF-5A1 siRNA。供体(以及由此胰岛细胞)可以是任意动物，包括人胰岛细胞。可以使用任意施用方法。例如，可以通过胰岛细胞供体门静脉的灌注或通过胰岛细胞供体门静脉的流体动力灌注施用siRNA。参见实施例1。另一施用形式包括腹膜内施用。参见实施例2和实施例3-5。
通过门静脉的灌注类似于胆管的插管，但针指向相反路径。所述门静脉由于肝的收缩和脏器至小鼠左侧的转移而暴露。预备结在其周围制成并且包括胆管。在穿刺血管后，钝的针朝向胰前进，且结在其周围变紧。在小鼠模型中，1ml盐水或siRNA(5μg)被缓慢释放，所述针被移开，并且所述结在针后闭合以防止流体流出。在该点使小鼠转身，并且使胆管可接近以进行胰消化。所述胰可与siRNA保持更长时间。可选的，它可以被转移但与胶原酶一起冷存更久。遵循常规胰岛分离法，并且所述胰岛(50)可被温育16小时。
本发明还提供一种包括eIF-5A1 siRNA的抑制胰岛细胞凋亡的组合物，其中siRNA抑制eIF-5A1的表达，从而抑制胰岛细胞的凋亡并维持其功能性。所述组合物可以包括其他或另外如上所述的eIF-5A1siRNAs。优选的siRNA包括核苷酸序列5’-AAAGGAAUGACUUCCAGCTGAdTdT-3’。
实施例
实施例1：门静脉灌注
小鼠胰岛表达eIF-5A。从分离的小鼠胰岛提取总RNA，针对β-肌动蛋白和eIF-5A1进行RT-PCR(图1)。静止的未刺激胰岛显示eIF-5A1-mRNA的阳性水平。
在eIF5A1-siRNA输送：门静脉缓慢灌注后eIF5A1-mRNA水平降低。通过缓慢逆行门静脉灌注给小鼠导入1ml siRNA(CT(对照)序列或eIF-5A1，5μg)或盐水，每组n＝2(图2)。通过胰管的胶原酶冲洗消化胰，并分离胰岛，如Lewi等人所述，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，102：12153-12158 Epub 12005 Aug.12110，2005。温育胰岛(每只小鼠50个)16小时。然后提取总RNA，针对β-肌动蛋白和eIF-5A1进行RT-PCR(图3)。eIF-5A1/β-肌动蛋白的mRNA比例为5.24(CT-siRNA)和3.01(eIF-5A1-siRNA)。图3显示在用siRNA处理的那些细胞中eIF-5A1的mRNA水平降低。用n＝3只小鼠重复本实验，且对于RNA提取物一式三份温育胰岛；结果与初始观察一致。
在eIF5A-siRNA输送：门静脉流体动力灌注后，eIF-5A1-mRNA水平降低，并且胰岛凋亡率降低。通过流体动力逆行门静脉灌注给小鼠导入1ml siRNA(CT或eIF-5A1，5μg)或盐水，每组n＝2，其在5秒内完成。通过胰管的胶原酶冲洗消化胰，并分离胰岛。温育胰岛16小时然后将其分割；一组为评价凋亡用碘化丙啶染色(每只小鼠50个胰岛)，另一组被处理用于RT-PCR(每只小鼠25个胰岛)。CT-siRNA组中eIF-5A1/β-肌动蛋白的mRNA水平再次高于eIF-5A1-siRNA组。凋亡率降低28.1％(图4)。重复本实验，n＝3，凋亡率再次降低(图5)。
利用生物素化siRNA的胰岛灌注。如上所述(缓慢灌注，n＝1)将生物素化的siRNA(50μg)灌注入胰岛。用福尔马林固定胰进行染色。
siRNA。siRNA分子由Dharmacon，Lafayette，CO合成。eIF-5A1和对照siRNA的序列分别是：5′CGGAAUGACUUCCAGCUGAdTdT 3′和5′AGUCGACCUUCAGUAAGGCdTdT 3′。
RT-PCR。利用Qiagen RNeasy试剂盒从细胞提取总RNA。eIF-5A1引物：正向5′-GAC AGT GGG GAG GTA CGA GA-3′；反向5′-GGG GTG AGG AAAACCAAAAT-3′。
碘化丙啶(PI)凋亡染色。胰岛的单细胞悬液通过温和胰酶消化获得。细胞用PBS清洗，然后添加溶于PBS的包含0.3％皂苷、EDTA 1mM、Rnase、1％叠氮化物、1％FCS和50μg/ml PI的皂苷-PI混合物。在用FACS分析sub-GI群体前细胞被彻底涡旋，并在4℃黑暗条件下温育6小时。
实施例2：腹膜内注射
抗体和siRNA：产生抗eIF-5A1的小鼠单克隆抗体。抗肌动蛋白单克隆抗体(克隆C4，#69100)购自MP Biomedicals。在Western印迹中，使用来自Li-Cor的近红外荧光团标记二抗(IRDye 800和IRDye 700)。对eIF-5A1特异的siRNA针对eIF-5A1的下列序列：5’-AAAGGAATGACTTCCAGCTGA-3’。而对照siRNA是转录的序列5’-AAAGTCGACCTTCAGTAAGGA-3’，之前已经证明其不诱导任意已知蛋白的敲低。参见共同待决的申请U.S.11/725,470和PCT/US07/64424，它们完整通过援引在此引入。
siRNA对小鼠的IP(腹膜内)注射：12只8-到10-周龄C57BL/6雄性小鼠购自Charles River。选择雄性小鼠以避免伴随雌性动情周期的代谢变化。小鼠被随机分配到3个治疗组之一：组I-赋形剂治疗(0.9％盐水)，组II-对照siRNA治疗，组III-eIF-5A1 siRNA治疗。每只小鼠接受挑选的治疗，通过IP注射16.6mg/kg或类似的体积(就组I来说)。在胰岛收集(第0天)前，每天注射小鼠(大约11:00a.m.)，共3天(第-3，-2，-1天)。
胰岛分离和细胞因子处理：按照标准分离技术和研究机构的动物管理和使用委员会(IACUC)批准的方案进行C57BL/6小鼠的胰岛分离。将胰保存于添加4.2mM碳酸氢钠和1％BSA(Invitrogen)的HBSS中直至胶原酶消化。通过差速离心进行纯化。将完整的胰岛保存于添加10％FBS和5％氨羧丁青霉素/链霉素的无酚红DMEM溶液中。将培养物在37℃+5％CO2条件下于5.5mM葡萄糖中温育。在代谢试验(钙振荡)前回收纯化的胰岛16-18小时。
利用生理上相关细胞因子的指定鸡尾酒混合物(5ng/mL IL 1β，10ng/mL TNT-α，100ng/mL INF-γ)在第1天代谢试验结束时对一半的胰岛进行细胞因子处理。在进一步的试验和蛋白质分析开始(第2天和第3天)前将细胞因子处理的胰岛静置24小时。
免疫印迹分析：在4-20％SDS-聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)上通过电泳分辨10μg胰岛细胞提取物(在包含200mM DTT和Benzonase的Laemmli缓冲液中制备)，然后使用抗eIF-5A1小鼠单克隆一抗(按照1∶15000稀释度)进行免疫印迹分析。利用Odyssey系统(Li-CorBiosciences)的近红外技术对免疫印迹进行成像和定量。
钙振荡分析：从胶原酶消化的8-到10-周龄C57BL6小鼠胰中手选胰岛(如上所述)。在Fura-2低葡萄糖(3mM)溶液中处理胰岛20分钟，然后将其置于温控流动室中。低葡萄糖溶液(不含Fura)流过胰岛以确定基础钙测量值(5分钟)。利用IP Lab 4.0软件(BD Biosciences)获得钙的测量值，报告为从340到380nm的发射光比例。在确定基础钙水平后，将高葡萄糖(11mM)溶液流过所述室(15分钟)以诱导胰岛的细胞钙应答。在20分钟的观察期间每隔5秒监测钙应答。在试验结束时将胰岛在5％漂白溶液中处理。
实施例3：在体外和体内应用针对Pdx-1的siRNA
βTC3细胞用两种不同的Pdx-1siRNA构建体(构建体A和B)或对照转染，并针对蛋白Pdx-1、GAPDH和β-肌动蛋白进行免疫印迹。参见图17A。每天一次给C57B 1/6小鼠腹膜内注射相同的siRNAs共3天，分离胰岛并通过胶原酶消化和差异梯度离心进行纯化。胰岛在2％SDS中裂解并进行免疫印迹。参见图17B。在3mM D-葡萄糖中成像前用Fura2加载分离的胰岛30分钟。胰岛用11mM D-葡萄糖刺激约300秒，通过荧光显微镜检查连续监测Fura2比例。参见图17C。利用来自每个治疗组的50个胰岛进行葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)。参见图17D。
实施例4：eIF-5A的敲低提高胰岛离体(ex vivo)功能和存活
该实施例显示针对eIF5A的siRNA的体内施用提高胰岛离体功能。图18A提供实验设计的示意图。处理后分离胰岛，将提取物进行免疫印迹分析。参见图18B。对分离的胰岛进行RT-PCR分析对葡萄糖传感(sensing)和胰岛素转录重要的基因；尽管基因转录被细胞因子处理(与IFNg，IL1b，TNFa温育4小时)抑制，但在各组间没有观察到差异。参见图18C。与分离后第24小时(参见图18D)和48小时(参见图18F)的对照相比，分离后第24小时(参见图18D)和48小时(参见图18F)用si-eIF5A处理的胰岛显示提高的葡萄糖刺激钙应答(GSCa)。在分离后存在细胞因子24小时(参见图18E)和48小时(参见图18G)的条件下，用si-eIF5A处理的胰岛显示增强的GSCa。通过GSIS评价，与4小时细胞因子温育不存在(参见图18H)和存在(参见图18H)条件下的对照相比，从eIF5A处理小鼠分离的胰岛显示提高的葡萄糖刺激胰岛素分泌(″GSIS″)。
实施例5：eIF-5A的敲低终止细胞因子诱导的INOS产生
eIF5A-缺陷型细胞中没有细胞因子诱导的iNOS蛋白产生。对用细胞因子处理的胰岛进行RT-PCR以分析iNOS mRNA；在细胞因子暴露时所有处理组显示显著的iNOS mRNA上调。参见图19A。将细胞因子处理的胰岛进行免疫印迹分析。值得注意的是，在对照胰岛而不是si-eIF5A处理的胰岛中当细胞因子暴露时诱导iNOS蛋白。参见图19B。INS-1(832/13)β细胞用细胞因子鸡尾酒混合物处理4小时，并进行免疫印迹；细胞显示iNOS蛋白的类似增加。参见图19C。用不同浓度的GC-7(一种脱氧羟丁赖氨酸合酶的抑制剂)处理INS-1细胞过夜，然后在细胞因子存在的条件下温育4小时。INS-1细胞显示iNOS产生与GC-7浓度的负相关，表明活性eIF5A产生的抑制预防iNOS翻译。参见图19D。
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Claims (7)

1.一种用于在分离后维持收集的胰岛细胞的功能性的方法，包括在胰岛分离前给胰岛细胞供体的胰岛细胞施用eIF-5A1siRNA，其中所述eIF-5A1siRNA抑制胰岛细胞中eIF-5A1的表达，从而抑制胰岛细胞的凋亡并维持收集的胰岛细胞的功能性。
2.权利要求1的方法，其中所述eIF-5A1siRNA以eIF-5A1的下列核苷酸序列作为靶标：5’-AAAGGAATGACTTCCAGCTGA-3’；5’-AAGATCGTCGAGATGTCTACT-3’；5’-AAGGTCCATCTGGTTGGTATT-3’；或5’-AAGCTGGACTCCTCCTACACA-3’。
3.权利要求1的方法，其中所述eIF-5A1siRNA包括核苷酸序列5’-AAAGGAAUGACUUCCAGCTGAdTdT-3’。
4.权利要求1的方法，其中通过腹膜内注射给胰岛细胞供体施用所述siRNA。
5.一种用于在供体收集过程期间抑制胰岛细胞遭受凋亡的方法，包括在胰岛分离前通过对胰岛细胞供体的腹膜内注射给胰岛细胞供体施用eIF-5A1siRNA，其中所述eIF-5A1siRNA抑制所述胰岛细胞中eIF-5A1的表达，从而抑制所述胰岛细胞的凋亡。
6.权利要求5的方法，其中所述eIF-5A1siRNA以eIF-5A1的下列核苷酸序列作为靶标：5’-AAAGGAATGACTTCCAGCTGA-3’；5’-AAGATCGTCGAGATGTCTACT-3’；5’-AAGGTCCATCTGGTTGGTATT-3’；或5’-AAGCTGGACTCCTCCTACACA-3’。
7.权利要求5的方法，其中所述eIF-5A5siRNA包括核苷酸序列5’-AAAGGAAUGACUUCCAGCTGAdTdT-3’。
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