CN105543259A - 在表达pdx-1的神经内分泌肿瘤中靶向pdx-1癌基因的新治疗性rna干扰技术 - Google Patents

Abstract

本文描述了一种用于在靶细胞中击倒PDX-I癌基因的表达的，基于双官能shRNA的组合物和方法。本发明还提供了用于将含有shRNA的表达载体递送到过表达PDX-I癌基因的靶组织的方法。

Description

在表达PDX-1的神经内分泌肿瘤中靶向PDX-1癌基因的新治疗性RNA干扰技术

本申请是2010年10月27日申请的PCT国际申请PCT/US2010/054350于2012年7月2日进入中国国家阶段的、申请号为201080060355.X且发明名称为“在表达PDX-1的神经内分泌肿瘤中靶向PDX-1癌基因的新治疗性RNA干扰技术”的发明专利申请的分案申请。

发明技术领域

本发明一般地涉及基因靶向的癌症疗法的领域，并且更具体地涉及为了治疗胰腺神经内分泌肿瘤开发新疗法和药物递送系统。

背景技术

在不限制本发明的范围的情况下，将其背景结合基于shRNA的疗法的设计和递送进行描述，所述基于shRNA的疗法靶向PDX-1癌基因的表达作为胰腺神经内分泌肿瘤的治疗。

胰岛瘤形成总地来说是指发源自胰腺胰岛细胞的疾病，例如胰腺神经内分泌肿瘤(NET)、胰岛瘤和类癌瘤。胰岛细胞肿瘤具有的5年生存率在35-50％[1，2]。胰岛瘤形成影响相对年轻的患者(诊断年龄为50岁)[3，4]。患有胰岛瘤的患者尤其严重地遭受无法控制的低血糖症，对于该低血糖症没有有效的治疗。低血糖症是由高胰岛素血症导致的，并且表现出神经低血糖症的症状例如头痛、眩晕、昏睡、复视、痉挛和交感神经激活[3]。外科手术仍然是最有效的治疗方法(treatmentmodality)，并且没有有效的辅助疗法。当原发肿瘤和转移瘤(metastases)的同时切除可能时，复发率仍然很高。除此之外，采用全身性治疗生存率没有改进[5，6]。因此，需要对治疗NET的新的和有效的治疗方法。

胰腺十二指肠同源框-1(Pancreaticduodenalhomeobox-1)是胰腺器官形成的胚胎转录因子，该转录因子在多数NET中和所有的胰岛细胞胰岛瘤中过表达。转录因子PDX-1基因直接负责调节良性和恶性胰岛瘤中胰岛素分泌[7，10]。其在多种癌症中也被发现，在所述的癌症中其表现为与增殖、分化和迁移关联，在NET发育和胰腺胚胎发生中起主要作用[7，14]。在成年人的胰腺中，90％的β细胞表达PDX-1，其中PDX-1表现为调节胰岛素、葡萄糖激酶和2型葡萄糖转运蛋白(GLUT2)的表达[15-19]。这些基因在急性和慢性高血糖症中对于保持葡萄糖体内稳态(homeostasis)起到决定性的作用。在急性高血糖症中，PDX-1从细胞质中迁移到β细胞的细胞核，并且激活胰岛素基因，这是在提高胰岛素生产和分泌中的第一步[20，21]。

本发明人和其他人显示PDX-1在多种癌症中过表达[22-25]。具体地，本发明人发现PDX-1在80种以上的胰腺癌和胰岛细胞瘤形成中过表达[26]。百分之百的胰岛瘤中也具有PDX-1过表达。本发明人近期证明了PDX-1调节胰腺癌症和胰岛瘤细胞系的增殖和侵袭[27]。本领域技术人员应当认识到如果提供了在癌症中调节PDX-1过表达的组合物和方法，该组合物和方法对本领域有正面价值以及实质性的贡献。同样地，在药物递送领域的熟练技术人员应当认识到，如果提供了绕过非靶向器官并且将治疗剂的递送靶向到过表达PDX-1的靶向器官的递送系统，该递送系统将在医学实践中的临床上是有用的。在授权给Brunicardi的第6716824号美国专利(2004)中提供了一种通过靶向PDX-1来治疗胰腺的腺癌的策略，其牵涉到RIP-tk(大鼠胰岛素启动子-胸苷激酶)构建体的重组核酸，该构建体选择性地靶向分泌胰岛素的细胞如β细胞、PDX-1阳性的人类胰腺导管瘤以及其他的含有特定转录因子的细胞。Brunicardi的发明在治疗胰腺癌中，例如β细胞胰岛瘤中是有用的。

临床前研究证实，RNA干扰技术(RNAi)可以用于使癌症关联的靶沉默[28-38]。体内研究中也显示，对于肿瘤细胞的生长[29，39-42]、转移[43-45]、血管生成[46，47]和化学抗性[48-50]有决定性的组件进行RNAi靶向得到良好的结果。RNAi技术的应用最初采用两种类型的分子；化学合成的双链小干扰RNA(siRNA)或者基于载体的短发夹RNA(shRNA)。尽管siRNA和shRNA可以实现类似的击倒功能(knockdownfunctions)，siRNA和shRNA是在本质上不同的分子。shRNA与天然存在的微小RNA(miRNA)具有相同的生源途径，其被加工并运输到细胞质中，在细胞质中其被加载到RNA干扰沉默复合体(RISC)上[51]。内源mRNA的最初转录物是从细胞核内的基因组DNA合成的，其是具有发夹结构的RNA长链，该RNA长链由一系列的内源RNaseIII酶加工成成熟的21-23个碱基对的双链miRNA。在成熟过程中，至少涉及两种RNaseIII酶复合物；首先，Drosha/DGCR8复合物产生前-miRNA发夹结构，前-miRNA发夹结构在核输出后被掺入到RLC中，在RLC中第二种酶，Dicer将环切割从而产生成熟miRNA[52]，成熟miRNA是加载到RISC上用于RNAi的效应分子[53]。

Argonaute(Ago)蛋白家族一般地与细胞质的RISC相关联。这些蛋白质牵涉到siRNA或者miRNA的加载中，并且也牵涉到转录(靶向到异染色质)和转录后的基因沉默中。加载到Ago-复合的RISC的siRNA或miRNA的引导链(guidestrand)寻找靶向具有序列互补性的mRNA。具有内切核酸活性的Ago-2将mRNA切割，从而引发mRNA的降解[54，55]。可供选择地，靶向的mRNA的3’UTR的部分互补结合通过在处理小体(P-小体)中的螯合(sequestration)实现了对翻译的抑制[56]。在P-小体中观察到了脱腺苷化(deadenylation)导致靶mRNA的不稳定[57，58]。在大量动物模型中，强有力的证据显示RNAi-介导的基因击倒(geneknockdown)是强有力的，特异性的以及耐受良好的。这些发现为将RNAi疗法转化到临床提供了科学依据。当前有至少10种基于RNAi的药物处于早期临床试验[59]，其中的4种是与癌症相关的[60-63]。另外的siRNA也证实在动物模型中是有效的[60，61，64]，并且在非人灵长类动物中是安全的[65]。

第2009/0163431号美国专利申请(Kazhdan等人)公开了用于抑制PDX-1的方法和组合物。在发明的方法和组合物中所包括的抗-PDX-1试剂包括了抗体、适体、反义寡核苷酸、核酶和/或抑制性化合物。本发明中提供了在肿瘤细胞中抑制PDX-1表达的方法，所述的方法包括使肿瘤细胞与有效量的抗-PDX-1试剂接触，所述的抗-PDX-1试剂与编码PDX-1的RNA分子的指定区域高度或完全互补。该试剂特异性地与编码PDX-1的RNA分子杂交，并且抑制肿瘤细胞中PDX-1基因的表达。描述了包含抗-PDX-1siRNA和/或shRNA的组合物。描述了根据本发明的重组表达构建体，所述的重组表达构建体编码抗-PDX-1siRNA或者shRNA。

发明内容

本发明包括PDXbi-shRNA，用于同时诱导其靶的翻译抑制和转录后mRNA降解。与具有相同mRNA靶向特异性的siRNA相比，PDXbi-shRNA构建体达到了更高的效力和延长的活性。本发明人显示，PDX-1击倒诱导细胞凋亡、阻止增殖、并且降低NET癌症细胞的侵袭性，并且改进具有癌异种移植物的SCID小鼠的生存率。本发明人还证实了IV(经静脉内)BIV脂质体PDX-1shRNA的多次治疗导致SCID小鼠中的人PC异种移植物近乎完全消除，并且证实了在小鼠胰岛瘤模型中响应和存活率上的优势。

两层内陷的囊泡(BIV)是递送系统，其中使用了短暂遮盖的靶向脂质体将治疗剂通过与细胞膜融合递送到细胞中。这些经遮盖的隐形脂质体通过避免了胞吞途径，实现了更高的转染效率。Copernicus压缩核酸递送技术是另一种非病毒性的合成的和模块化的平台，其中通过多阳离子将单个的分子或DNA或RNA压缩从而得到非常高转染效率的纳米颗粒。本发明人通过将压缩的含shRNA的DNA纳米颗粒包装在掩蔽的隐形BIV脂质体中，开发了新的癌症治疗方法。

本发明包括表达载体，所述的表达载体包含启动子和可操作地连接到该启动子的核酸插入物，其中所述的插入物编码一个或多个短发夹RNA(shRNA)，所述的短发夹RNA能够杂交到编码PDX-1转录因子的转录物的区域。shRNA与转录物的结合通过RNA干扰来抑制PDX-1的表达。shRNA可以是双官能性的，其结合了siRNA(切割依赖的)和miRNA(切割非依赖的)两者的基序。在本发明的一个实施方案中，shRNA是PDX-1表达的切割依赖和切割非依赖两者的抑制剂。由shRNA所靶向的mRNA序列不限于PDX-1mRNA转录物的3’非翻译(UTR)区域；在本发明的一个实施方案中，所述的shRNA可以靶向到编码序列。在一个方面，一个或多个shRNA包含选自以下的序列：SEQ.IDNO:3、SEQ.IDNO:4、SEQ.IDNO:5、SEQ.IDNO:6、SEQ.IDNO:7、SEQ.IDNO:8以及它们的组合或修饰。

本发明还提供了用于将shRNA递送到PDX-1mRNA靶的系统。该递送系统包括了治疗剂载体，例如脂质体，所述的载体偶联到包含启动子和可操作地连接到该启动子的核酸插入物的表达载体，其中所述的插入物编码一个或多个短发夹RNA(shRNA)，所述的短发夹RNA能够杂交到编码PDX-1转录因子的转录物的区域。一个或多个shRNA包含选自以下的序列：SEQ.IDNO:3、SEQ.IDNO:4、SEQ.IDNO:5、SEQ.IDNO:6、SEQ.IDNO:7、SEQ.IDNO:8以及它们的组合或修饰。shRNA与转录物的结合通过RNA干扰来抑制PDX-1的表达。shRNA可以是双官能性的，其结合了siRNA(切割依赖的)和miRNA(切割非依赖的)两者的基序。在本发明的一个实施方案中，shRNA是PDX-1表达的切割依赖和切割非依赖两者的抑制剂。由shRNA所靶向的mRNA序列不限于PDX-1mRNA转录物的3’非翻译(UTR)区域；在本发明的一个实施方案中，所述的shRNA可以靶向到编码序列。治疗剂载体可以是压缩的DNA纳米颗粒。在一个实施例中，表达载体的DNA可以通过将其与多阳离子组合来进行压缩。更具体地，该DNA可以通过将其与CK₃₀PEG₁₀k组合来进行压缩，所述的CK₃₀PEG₁₀k是使用肽修饰的10kD聚乙二醇(PEG)，所述的肽包含N-末端的半胱氨酸和30个赖氨酸残基。该治疗剂载体也可以是脂质体，其中DNA可以通过将其与30聚体的赖氨酸缩合的肽组合来进行压缩。在一个实施方案中，所述的脂质体可以是两层内陷的囊泡(BIV)。可以通过用“巧妙的(smart)”受体靶向部分将该脂质体修饰，使其特异性地靶向到靶组织。在一个实例中，所述的靶向部分可以是小分子的二价β-转角模拟物。该脂质体可以进行可逆掩蔽从而绕开非靶的器官。在一个实例中，可逆掩蔽可以通过将该脂质体用小分子量的脂质(约500分子量和更低)涂布来完成，所述的脂质例如正十二烷基-β-D-麦芽吡喃糖苷。在本发明的另一个实施方案中，可以将经压缩的DNA纳米颗粒和脂质体递送系统进行组合。因此，可以将含有shRNA表达载体的压缩DNA纳米可以包裹在脂质体中。这些含有压缩DNA纳米颗粒的脂质体可以是BIV。该脂质体可以用靶向部分进行修饰，并且也可以经可逆掩蔽。

本发明的另一个实施方案是将shRNA递送到表达PDX-1的靶组织的方法，该方法包括以下步骤：(i)制备包含启动子和可操作地连接到该启动子的核酸插入物的表达载体，所述的核酸插入物编码一个或多个shRNA，该shRNA能够杂交到编码PDX-1的mRNA转录物的区域；(ii)将该表达载体与治疗剂载体组合；并且(iii)将治疗上有效量的该表达载体和治疗剂载体的复合物给予需要其的患者。该治疗剂载体可以是压缩的DNA纳米颗粒。在一个实施方案中，表达载体的DNA可以通过将其与多阳离子组合来进行压缩。更具体地，该DNA可以通过将其与CK₃₀PEG₁₀k组合来进行压缩。所述的治疗剂载体也可以是脂质体。在一个实施方案中，所述的脂质体可以是BIV。可以通过用“巧妙的(smart)”受体靶向部分将该脂质体修饰，使其特异性地靶向到靶组织。在一个实例中，所述的靶向部分可以是小分子的二价β-转角模拟物。该脂质体可以进行可逆的掩蔽从而绕开非靶器官。在一个实例中，可逆掩蔽可以通过将该脂质体用小分子量的脂质(约500分子量和更低)涂布来完成，所述的脂质例如正十二烷基-β-D-麦芽吡喃糖苷。在本发明的另一个实施方案中，可以将经压缩的DNA纳米颗粒和脂质体递送系统进行组合。因此，可以将含有shRNA表达载体的压缩DNA纳米颗粒包裹在脂质体中。这些含有压缩DNA纳米颗粒的脂质体可以是BIV。该脂质体可以用靶向部分进行修饰，并且也可以经可逆掩蔽。在一个方面，一个或多个shRNA包含选自以下的序列：SEQ.IDNO:3、SEQ.IDNO:4、SEQ.IDNO:5、SEQ.IDNO:6、SEQ.IDNO:7、SEQ.IDNO:8以及它们的组合或修饰。

本发明还提供了在靶细胞中将PDX-1的表达沉默的方法，该方法包括以下步骤：(i)选择靶细胞；(ii)使用载体转染该靶细胞，所述的载体表达一种或多种shRNA，所述shRNA能够杂交到编码PDX-1的mRNA转录物的区域，其中用载体转染的癌症细胞通过RNA干扰来抑制PDX-1的表达。shRNA可以是双官能性的，其结合了切割依赖和切割非依赖两者的基序。在本发明的一个实施方案中，shRNA是PDX-1表达的切割依赖和切割非依赖两者的抑制剂。由shRNA所靶向的mRNA序列不限于PDX-1mRNA转录物的3’非翻译(UTR)区域；在本发明的一个实施方案中，所述的shRNA可以靶向编码序列。一个或多个shRNA包含选自以下的序列：SEQ.IDNO:3、SEQ.IDNO:4、SEQ.IDNO:5、SEQ.IDNO:6、SEQ.IDNO:7、SEQ.IDNO:8以及它们的组合或修饰。

本发明还包括在癌症患者中抑制肿瘤细胞生长的方法，所述的方法包括以下步骤：(i)确定需要治疗肿瘤的患者；并且(ii)使用载体转染肿瘤细胞，所述的载体表达一个或多个shRNA，所述shRNA能够杂交到编码PDX01的mRNA转录物的区域，其中使用该载体转染的癌症细胞经历细胞凋亡、增殖受阻或者侵袭性降低。shRNA可以是双官能性的，其结合了切割依赖和切割非依赖两者的基序，并且包括选自以下的序列：SEQ.IDNO:3、SEQ.IDNO:4、SEQ.IDNO:5、SEQ.IDNO:6、SEQ.IDNO:7、SEQ.IDNO:8以及它们的组合或修饰。在本发明的一个实施方案中，shRNA是PDX-1表达的切割依赖和切割非依赖两者的抑制剂。由shRNA所靶向的mRNA序列不限于PDX-1mRNA转录物的3’非翻译(UTR)区域；在本发明的一个实施方案中，所述的shRNA可以靶向编码序列。更具体地，所靶向的癌症可以是胰腺神经内分泌肿瘤(NET)。

附图说明

为了更完全地理解本发明的特征和优点，现参考本发明的详述和所附的附图，其中：

图1A和1B显示了bi-shRNA^STMN1载体在体内的生长抑制活性。图1A显示了当将单次瘤内注射bi-shRNA^STMN1脂复合物(lipoplex)(pGBI2)或者混杂的对照脂复合物(pGBI5)或者悬浮溶液(D5W)给予CCL-247肿瘤异种移植物时所观察到的抑制。数值表示平均值±SEM，图1B显示了bi-shRNA^STMN1对SCID小鼠的原发骨肉瘤异种移植物的生长抑制活性。每天给予瘤内注射bi-shRNA^STMN1脂复合物或者对照，进行六次。

图2显示了与bi-sh-STMN1和siRNA^STMN1相比，STMN1mRNA靶向切割和细胞生长抑制之间的相关性。bi-shRNA^STMN1(红色)和siRNA^STMN1(黄色)的复合剂量响应曲线与STMN1mRNA切割相关。x轴是从左到右质粒/siRNA浓度的剂量上升。y轴是处理24小时后的细胞存活百分比。各个数据点代表了三个样品的平均值。bi-shRNA^STMN1的浓度范围在1.44×10^-12M到5.63×10^-15M之间变化。siRNA^STMN1的浓度在5×10^-7M到1×10^-10M之间变化。电泳图谱插入物显示了从转染的CCL-247细胞中检测到的5’RACE产物，其指示了切割产物；

图3A和3B显示了双官能shRNA对于过表达的人(图3A)和小鼠(图3B)的PDX1mRNA(SEQ.IDNO.1和2)的作用。将结肠癌CCL-247细胞仅使用PDX-1cDNA表达载体转染或者使用PDX-1cDNA和bi-shRNA表达载体进行共转染。pUMVC3是不带有插入对照的表达载体(SEQ.IDNO:9)。在转染之后24、48、72和96小时，分离总RNA进行qRT-PCR。将PDX-1mRNA水平针对GAPDHmRNA进行归一化。将各个样品的可比较PDX-1mRNA水平针对仅有样品的培养基(没有转染)进行归一化；

图4显示了双官能shRNA对人的PDX-1(SEQ.IDNO:1)的沉默效果。将结肠癌CCL-247细胞仅使用物种特异性的PDX-1cDNA表达载体进行转染，或者使用物种特异性的PDXcDNA和bisRNA表达载体进行共转染。pUMVC3是没有插入物的对照表达载体。在转染之后48、72和96小时，收获细胞，使用对PDX-1和对β-肌动蛋白有特异性的单克隆抗体进行免疫印迹分析；

图5A和5B显示了通过RACE-PCR对人(图5A)和小鼠(图5B)PDX1(SEQ.IDNO1和2)靶向特异地切割的识别；结肠癌CCL-247细胞仅用PDX-1cDNA表达载体转染，或者用PDX-1cDNA和bi-shRNA表达载体进行共转染。pUMVC3是没有插入物对照的表达载体。在转染后24和96小时，分离总RNA用于5’RACE试验，从而检测靶位点的切割产物。在琼脂糖凝胶电泳图上显示RT-PCR扩增的切割产物；

图6A-6C显示了掩蔽剂对CAT报告基因产量的影响。图6A显示了对肺的影响，图6B显示了对心脏的影响以及图6C显示了对肝的影响。在BALB/c小鼠中经静脉注射之后，在肺中(图6A)和在心脏中(图6B)中观察到了降低的非特异性定位以及提高的掩蔽。掩蔽与提高的CAT报告基因定位到希望的靶向位点(肺，图6C)是关联的。

图7A-7C显示了压缩的DNA纳米颗粒的结构和功能。图7A显示了压缩成椭圆体或者棒条体的DNA纳米颗粒的电子显微镜图。标尺等于100nm，图7B显示了将裸露的或者压缩的DNA的脂质体混合物加入到对数期或者生长停止的成神经细胞瘤细胞中。压缩的DNA在有丝分裂后的细胞中将基因表达提高>1000倍，而在对数期细胞中将表达提高6-8倍，并且图7C将压缩后的DNA基因转移到具有结肠癌侧外植块的SCID小鼠中，其经IV或者作为肿瘤内(IT)注射进行给药。IT注射产生高水平的荧光素酶活性，然而IV给药则不产生；

图8显示了在转染后48小时对PDX-1蛋白表达水平降低的序列特异性；结肠癌CCL-247细胞仅使用物种特异性的PDX-cDNA表达载体单独转染，或者使用物种特异性的PDX-cDNA和bisRNA表达载体进行共转染。pUMVC3是没有插入物的对照表达载体。转染后48小时，将细胞收获用于对PDX-1和β-肌动蛋白具有特异性的单克隆抗体进行免疫印迹分析；

图9A和9B显示了在体内使用bi-shRNA-PDX-1脂复合物进行处理之后，SCID小鼠异种移植物模型随时间的血糖水平：β-TC-6细胞胰岛瘤模型(图9A)以及PANC-1胰腺癌模型中(图9B)。将SCID小鼠移植肿瘤细胞2周后使用3轮的50μg的bi-shRNA-PDX-1脂复合物处理。在处理后的长达90天中，以定期的间隔监测处理和未处理的小鼠的空腹血糖水平；

图10A和10B显示了Kaplan-Meier存活率分析：PANC-1胰腺癌模型(图10A)和β-TC-6细胞胰岛瘤模型(图10B)；移植了肿瘤细胞的SCID小鼠使用或者不使用对照载体脂复合物(pUMVC3)，或者使用bi-shRNA-PDX-1脂复合物进行处理(三轮，每轮30μg)。在处理后的长达90天中监测小鼠的存活率；

图11显示了PDX-1在人胰岛瘤肿瘤中和小鼠TC-6胰岛瘤细胞中的过表达；

图12显示了在mPDX-1RNA沉默之后βTC-6细胞周期蛋白的表达；

图13显示了在鼠胰岛瘤SCID模型中，IVL-mPDX-1shRNA处理的小鼠的存活率；

图14是显示了肿瘤体积比较数据的作图；和

图15是用于制备本发明的新型bi-shRNA^PDX-1的质粒构建体。

发明详述

尽管本发明的多个实施方案的制造和使用在下文中进行了详细讨论，应当认识到本发明提供了多个可实施的发明构思，其可以在大量的具体环境下加以体现。在本文中所讨论的具体实施方案仅仅是举例说明用于制造和使用本发明的具体方式，而不限制本发明的范围。

为了便于理解本发明，在下文中定义了多个术语。在本文中定义的术语具有本发明相关领域中的普通技术人员所通常理解的含义。术语如“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”不期待仅指单个的实体，而是包括可以使用具体实例来举例说明的大类。在此的术语用于描述本发明的具体实施方案，但是其使用不限制本发明，除了在权利要求中概括的。

如本文中所使用的，术语“核酸”或者“核酸分子”是指多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)或者核糖核酸(RNA)，寡核苷酸、由聚合酶链式反应(PCR)所产生的片段以及由任意的连接、剪切、内切核酸酶的作用和外切核酸酶的作用所产生的片段。核酸分子可以由天然存在的核苷酸的单体构成(例如DNA和RNA)，或者由天然存在的核苷酸的类似物构成(例如天然存在的核苷酸的α对映体形式)，或者两者的组合。修饰的核苷酸可以在糖部分和/或在嘧啶或者嘌呤碱基部分具有变化。糖的修饰包括，例如，将一个或多个羟基基团替代为卤素、烷基基团、氨基和叠氮基基团，或者糖可以功能化为醚或者酯。此外，可以将整个的糖部分替代为立体上和电性上相似的结构，例如氮杂糖(azasugar)和碳环的糖类似物。碱基部分修饰的实例包括烷基化的嘌呤和嘧啶，酰化的嘌呤或嘧啶或者其他熟知的杂环取代基。核酸单体可以通过磷酸二酯键或者该键的类似物来连接。磷酸二酯键的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、phosphoroanilothioate、phosphoranilidate、磷酰胺酯等等。术语“核酸分子”也包括所谓的“肽核酸”，其包括连接到聚酰胺骨架上的天然存在的或者修饰的核酸碱基。核酸分子可以是单链的或者双链的。

在本文的说明书和权利要求书中所使用的术语“表达载体”包括编码在宿主细胞中表达的基因的核酸分子。一般地，表达载体包括转录启动子、基因和转录终止子。基因表达通常地在启动子的控制下进行，并且该基因据称与该启动子“可操作地连接”。类似地，将调节原件和核心启动子可操作地连接，如果调节元件调节核心启动子的活性。术语“启动子”是指任意的DNA序列，该序列与宿主酵母细胞中的结构基因相关联时，在合适的生长条件下，其与在没有启动子序列的情况下的转录、翻译或者mRNA的稳定性(mRNA更长的半衰期)相比，提高该结构基因的：1)转录；2)翻译或者3)mRNA的稳定性中的一个或多个。

本文中所使用的术语“癌基因”是指允许恶性赘生性细胞(Bradshaw，T.K.:Mutagenesis1，91-97(1986)形成和存活的基因。

如本文中所使用的，术语“受体”是指结合到称作“配体”的生物活性分子的细胞关联蛋白。该相互作用介导了配体对细胞的影响。受体可以是膜结合的、细胞质的或者核的膜；单体的(例如促甲状腺激素受体，β肾上腺素受体)或者多体的(例如PDGF受体、生长激素受体、IL-3受体、GM-CSF受体、G-CSF受体、红细胞生成素受体和IL-6受体)。膜结合的受体表征为包括细胞外的配体结合功能域和通常牵涉到信号转导的细胞内的效应功能域的多功能域结构。在特定的膜结合受体中，所述的细胞外配体结合功能域和细胞内效应功能域位于包含整个功能性受体的分开的多肽上。

术语“杂交”是指任意的方法，通过该方法核酸的链与互补链通过碱基配对结合。

术语“转染”是指将外来的DNA引入到真核细胞中。转染可以通过现有技术中已知的多种方式来完成，所述的方式例如，磷酸钙-DNA共沉降、DEAE-葡聚糖介导的转染、凝聚胺介导的转染、电穿孔、微注射、脂质体融合、脂质转染、原生质体融合、反转录病毒感染和基因枪。

如本文中所使用的，术语“脂质体”是指由脂双层构成的，包围了内部的含水空间的封闭结构。本文中所使用的术语“多阳离子”表示在同一个分子中具有多个阳离子部分的材料，例如季铵基团，并且包括游离的碱以及其药学上可接受的盐。

本发明包括开发用于对其靶的同时诱导翻译抑制和转录后mRNA降解的PDXbi-shRNA。与具有相同mRNA靶向特异性的siRNA相比，原型构建体达到了更高的效力和延长的活性。本发明人显示，PDX-1击倒诱导细胞凋亡，停止增殖并且诱导NET癌细胞的侵袭性，并且改进具有癌异种移植物的SCID小鼠的存活率。本发明人还证明了IV(静脉)BIV脂质体PDX-1shRNA多次治疗使得SCID小鼠中的人PC异种移植物近乎完全被消除，以及证实了在鼠的胰岛瘤模型中在响应和存活率上的优势。

bi-shRNA：本发明人首创了第三个独立的RNAi平台，其称作双官能性的shRNA。从概念上来说，RNAi可以通过加载了shRNA的RISC实现从而促进切割依赖的或者切割非依赖的mRNA击倒。我们已经显示了两种构型shRNA的伴随表达(因此其命名为双官能性的shRNA)，从而达到与siRNA相比，以更快的沉默发生(尽管mRNA和蛋白质有失误率)的更为有效的靶向基因击倒，及更大的耐久性。该双官能性的shRNA表达单元的碱基设计包括两个茎环shRNA结构；其中一个茎环由用于切割依赖的RISC加载的完全匹配的过客(passenger)和引导链组成，并且第二个茎环具有错配的过客链(在第9-12位)，其用于切割非依赖的RISC加载。该双官能的设计出于两个原因是更为有效的；第一，该双官能促进了引导链加载到不同的RISC类型上，从而促进mRNA靶向；第二，针对同一靶向mRNA的切割依赖和切割非依赖的RISC的存在通过降解和翻译抑制/隔绝过程促进沉默。强有力的基因击倒效应子通过在单个的polII启动子控制下的多重shRNA，实现了空间上和时间上的控制。本发明人所设计的该平台模拟天然的过程。他人的多个研究和文献支持本发明人的方法[66-70]。

通过使用miR30-骨架，本发明人产生了针对微管重构癌蛋白stathmin(STMN1，癌蛋白18，prosolin，p19，op18)的新型双官能(bi-shRNA)。对于相同的靶位点，与siRNA相比，Bi-shRNA^STMN1证实具有更有效的沉默活性。STMN1决定性地牵涉到有丝分裂纺锤体的形成中[71，72]。本发明的bi-shRNA^STMN1构建体证实是安全的，有效的靶击倒，并且对于同一靶而言，和siRNA相比时在肿瘤细胞杀灭中具有显著的剂量优势。除此之外，bi-shRNA^STMN1脂复合物在体内显示出显著的肿瘤生长控制和存活率的优势(图1A和1B)。本发明人使用可以区分匹配的和错配的过客链的RT-PCR方法[73]证实了成熟分子和效应分子两者(具有完全匹配链的dsRNA和具有特定错配的dsRNA)的细胞内转录和加工。大多数的癌症细胞具有高的Drosha和Dicer表达。关于在癌症细胞中内源性Dicer水平仍然有争议[74]。尽管如此，多数的研究中表明，sh或者bi-shRNAi击倒在具有甚至低水平的Dicer表达的肿瘤细胞中是高度有效的[75]。本发明人证实了对应于bi-shRNA^STMN1的成熟miRNA/siRNA组分的预测的匹配及错配shRNA的表达，如所反对的那样，仅在对照的由siRNA^STMN1处理的细胞中有完全匹配的过客链[76]。为了进一步地支持bi-shRNASTMN1的机制，在本发明中关于5’RACE方法的研究中的发现证实了STMN-1的切割产物的存在，所述的切割产物具有对应于bi-shRNA^STMN1的siRNA组分的靶向切割位点的预期序列(匹配的)。观察到了STMN1表达肿瘤细胞的有效抑制(93％)，反映了bi-shRNA^STMN1的切割依赖性和非依赖性介导的已知。除此之外，与bi-shRNA^STMN1(GBI-2)相比，在击倒之后所观察到的STMN1mRNA的动力学与预测的机制是一致的，所述的击倒使用分别的组分切割依赖的(GBI-1)和切割非依赖的(GBI-3)载体。

证实了bi-shRNA^STMN1载体的效应机制和功能效力之后，本发明人进一步探索了在体外的抗癌活性，并且成功地证明了在几种癌症细胞系中有效的细胞杀灭。尽管靶向到同样的序列，bi-shRNA^STMN1与siRNA^STMN1相比达到了5log下的IC₅₀更低的摩尔浓度(图2)。

胰岛瘤是胰岛细胞肿瘤中最常见的类型。恶性胰岛瘤引起高胰岛素血症并且导致无法控制的低血糖症。如前文众所讨论的，胰腺十二指肠同源框-1(PDX-1)属于含同源结构域的转录因子家族，并且在胰腺的器官形成中起到主要的作用。PDX-1通过调节胰岛素、葡萄糖激酶和2型葡萄糖转运蛋白的转录来维持β细胞的功能。PDX-1在导致高胰岛素血症的胰岛瘤中过表达。还发现了PDX-1一般在胰腺肿瘤中过表达。从确诊开始转移性胰腺癌具有4-6个月的生存时间。

在小鼠胰岛瘤模型中shRNA击倒的PDX-1：为了证实PDX-1在胰岛瘤中的表达，Dr.Brunicardi的实验室开发了针对PDX1的强力抗体。本发明人使用此抗体证实了PDX-1在鼠的胰岛瘤中过表达水平与在人的胰岛瘤相似(图11)。本发明人构建了鼠的(mu)shRNA来测试鼠模型中的击倒效果。然而，研究是有限的，因为随着胰岛瘤尺寸的增大，无法控制的高血糖症使得这些小鼠的寿命为2-3个月。在最初的研究中，将βTC-6细胞使用mu-shPDX-1shRNA在体外处理，并且执行MTS检测来评估细胞活力。与空载体相比，mu-shPDX-1处理的细胞在多个时间点上的细胞增殖具有本质上的下降。本发明人还证明了，PDX-1的击倒导致了几种细胞周期相关蛋白的击倒和通过蛋白质印迹技术证明的击倒的情况下，DNA合成在多个时间点显著地降低了(图12)。

PDX-1表达的沉默代表了抑制肿瘤生长的有吸引力的方式。本发明人设计了双官能的sh-RNA来将PDX-1的基因表达沉默。将抗人PDX-1(SEQ.IDNO:1)或者小鼠PDX-1(SEQ.IDNO:2)的基于MiR30的双官能shRNA框克隆到pUMVC3载体中。图15显示了用于制备该新型bi-shRNA^PDX-1的质粒构建体。将靶向小鼠或者人PDX-1的双官能shRNA与表达小鼠或人PDX-1的表达载体共同电穿孔进入人结肠癌细胞系中。采用RACE-PCR来检测人和小鼠PDX1的mRNA的潜在切割产物。采用RT-QPCR和免疫印迹来检测人PDX-1或小鼠PDX-1的表达击倒。

人胰腺和十二指肠同源框1(PDX1)的mRNA(SEQ.IDNO:1)：

GGGTGGCGCCGGGAGTGGGAACGCCACACAGTGCCAAATCCCCGGCTCCAGCTCCCGACTCCCGGCTCCCGGCTCCCGGCTCCCGGTGCCCAATCCCGGGCCGCAGCC GAGGCAGGAGCTGCTCCTGGCTGAGGGGCTTCAACCACTCGCCGAGGAGGAGCAGAGGGCCTAGGAGGACCCCGGGCGTGGACCACCCGCCCTGGCAGTTGAATGGGGCGGCAATTGCGGGGCCCACCTTAGACCGAAGGGGAAAACCCGCTCTCTCAGGCGCATGTGCCAGTTGGGGCCCCGCGGGTAGATGCCGGCAGGCCTTCCGGAAGAAAAAGAGCCATTGGTTTTTGTAGTATTGGGGCCCTCTTTTAGTGATACTGGATTGGCGTTGTTTGTGGCTGTTGCGCACATCCCTGCCCTCCTACAGCACTCCACCTTGGGACCTGTTTAGAGAAGCCGGCTCTTCAAAGACAATGGAAACTGTACCATACACATTGGAAGGCTCCCTAACACACACAGCGGGGAAGCTGGGCCGAGTACCTTAATCTGCCATAAAGCCATTCTTACTCGGGCGACCCCTTTAAGTTTAGAAATAATTGAAAGGAAATGTTTGAGTTTTCAAAGATCCCGTGAAATTGATGCCAGTGGAATACAGTGAGTCCTCCTCTTCCTCCTCCTCCTCTTCCCCCTCCCCTTCCTCCTCCTCCTCTTCTTTTCCCTCCTCTTCCTCTTCCTCCTGCTCTCCTTTCCTCCCCCTCCTCTTTTCCCTCCTCTTCCTCTTCCTCCTGCTCTCCTTTCCTCCCCCTCCTCTTTCTCCTCCTCCTCCTCTTCTTCCCCCTCCTCTCCCTCCTCCTCTTCTTCCCCCTCCTCTCCCTCCTCCTCTTCTTCTCCCTCCTCTTCCTCTTCCTCCTCTTCCACGTGCTCTCCTTTCCTCCCCCTCCTCTTGCTCCCCTTCTTCCCCGTCCTCTTCCTCCTCCTCCTCTTCTTCTCCCTCCTCTTCCTCCTCCTCTTTCTTCCTGACCTCTTTCTTTCTCCTCCTCCTCCTTCTACCTCCCCTTCTCATCCCTCCTCTTCCTCTTCTCTAGCTGCACACTTCACTACTGCACATCTTATAACTTGCACCCCTTTCTTCTGAGGAAGAGAACATCTTGCAAGGCAGGGCGAGCAGCGGCAGGGCTGGCTTAGGAGCAGTGCAAGAGTCCCTGTGCTCCAGTTCCACACTGCTGGCAGGGAAGGCAAGGGGGGACGGGCCTGGATCTGGGGGTGAGGGAGAAAGATGGACCCCTGGGTGACCACTAAACCAAAGATATTCGGAACTTTCTATTTAGGATGTGGACGTAATTCCTGTTCCGAGGTAGAGGCTGTGCTGAAGACAAGCACAGTGGCCTGGTGCGCCTTGGAAACCAACAACTATTCACGAGCCAGTATGACCTTCACATCTTTAGAAATTATGAAAACGTATGTGATTGGAGGGTTTGGAAAACCAGTTATCTTATTTAACATTTTAAAAATTACCTAACTGTGCATCCCAGGTCTGTCTTCTTTTCAAGGTCTGGGCCTTGTGCTCGGGTTATGTTTGTGGGAAATGCTTAATAAATACTGATAATATGGGAAGAGATGAAAACTGATTCTCCTCACTTTGTTTCAAACCTTTCTGGCAGTGGGATGATTCGAATTCACTTTTAAAATTAAATTAGCGTGTTTTGTTTTG

在前文所表示的序列中，编码区域以粗斜体表示，以及第一和第二靶位点分别为下划线和粗体表示。

小鼠胰腺和十二指肠同源框1(PDX1)的mRNA(SEQ.IDNO：2)：

GTCAAAGCGATCTGGGGTGGCGTAGAGAGTCCGCGAGCCACCCAGCGCCTAAGGCCTGGCTTGTAGCTCCGACCCGGGGCTGCTGGCCCCCAAGTGCCGGCTGCCACC GGACAGCAGTCTGAGGGTGAGCGGGTCTGGGACCCAGAGTGTGGACGTGGGAGCGGGCAGCTGGATAAGGGAACTTAACCTAGGCGTCGCACAAGAAGAAAATTCTTGAGGGCACGAGAGCCAGTTGGGTATAGCCGGAGAGATGCTGGCAGACTTCTGGAAAAACAGCCCTGAGCTTCTGAAAACTTTGAGGCTGCTTCTGATGCCAAGCGAATGGCCAGATCTGCCTCTAGGACTCTTTCCTGGGACCAATTTAGACAACCTGGGCTCCAAACTGAGGACAATAAAAAGGGTACAAACTTGAGCGTTCCAATACGGACCAGC

在前文中所表示的序列中，编码区域以粗斜体表示，而靶位点为下划线表示的。

图3A和3B显示了双官能shRNA分别对于强制过表达的人和小鼠的PDX的影响。双官能shRNA对于人PDX-1的沉默影响在转染之后24小时观察到，并且持续了至少96小时(图4)。最大的沉默效果，人PDX-1的80％被击倒是在转染后72小时达到的。此外，靶向小鼠PDX-1(与人的序列具有68％的同源性)的双官能shRNA不影响人PDX-1的表达(图8)。类似地，小鼠PDX-1的表达在转染之后24小时沉默并且该沉默效应持续了至少96小时(图4)。在转染之后48小时观察到最大的沉默效果，95％的小鼠PDX-1表达。此外，靶向人PDX-1(与小鼠序列有79％的同源性)的双官能shRNA也没有改变小鼠PDX-1的表达(图8)。

图5A和5B中分别观察到通过RACE-PCR所识别的人和小鼠的PDX-1mRNA切割产物。图5A和5B显示了人PDX1mRNA和小鼠的PDX1mRNA两者都如预测的那样，精确地在靶向区域中心切割。除此之外，靶向人PDX-1的双官能shRNA没有引起小鼠的PDX-1mRNA的切割，反之亦然。

在前文中所表示的研究中证明了靶向到人或小鼠PDX1的双官能shRNA的效力和物种特异性。Bi-shRNA^hPDX1将人PDX1表达击倒，并且表现为对于小鼠的PDX1表达没有沉默效果。类似地，Bi-shRNA^mPDX1将小鼠PDX1表达击倒，并且表现为对于人的PDX1表达没有沉默效果。

脂质体递送系统：本发明人在前文中验证过的脂质体递送系统涉及1，2-二油酰基-3-三甲基-丙铵盐(DOTAP)和胆固醇[77]。该制剂与DNA组合，形成将核酸包裹在双层内陷囊泡(脂质体BIV)中的复合物。为了改进RNA、DNA和RNAi质粒的递送，发明人之一优化了该BIV递送系统的一些特征。脂质体BIV是融合性的，从而绕开了胞吞介导的DNA细胞进入，所述的胞吞介导的DNA细胞进入可以导致核酸的降解[78]以及TLR介导的脱靶效应。该脂质体递送系统已经由本发明人和其他人成功地用于临床试验中[79-83]。在过去十年中累积的研究表明，优化的递送囊泡需要是隐形(常规地通过PEG化来实现)的纳米颗粒，该纳米颗粒具有≤10mV的zeta电势用于有效进行血管内的运输[84-86]，从而使得对于负电性的血清蛋白质如血清白蛋白的非特异性结合最小化(调理作用)[87]。将靶向部分如抗体和其单链衍生物(ScFv)、糖类化合物或者肽掺入可以进一步提高向靶细胞中的转基因定位。

本发明人在不使用PEG下得到了将复合物在体内靶向递送，从而避免了过度的循环半衰期延长[86，88-90]。尽管PEG化在DNA或者siRNA寡聚核苷酸的递送中对于改进膜的渗透性是相关的，本发明人和其他人指出，该方法导致BIV脂质体结构有位阻，导致了无效的DNA包裹和降低的基因表达。除此之外，PEG化的复合物主要地通过内吞途径进入细胞，导致了大部分的核酸在溶酶体中降解。尽管PEG提供在循环中特别长的半衰期，其为患者带来了问题，例如阿霉素(doxil)，其是包裹了细胞毒性药剂阿霉素(doxorubicin)的PEG化脂质体形成[90-92]。试图将配体加入到阿霉素中从而向特异性细胞表面受体(例如HER2/neu)递送没有提高肿瘤特异性的递送[93]。

基于这一原因，本发明的BIV使用DOTAP和合成胆固醇制备，其使用了专有手册中的挤出方法来进行[94]。除此之外，该递送使用可逆掩蔽技术来优化。可逆掩蔽使用不带电荷的小分子量的脂质(约500的分子量和更低，例如为正十二烷基-β-D-麦芽吡喃糖苷)，从而该脂质松散地结合BIV复合物的表面，从而临时地遮蔽正电性的BIV复合物从而绕开非靶向的器官。这些小的脂质在血流中通过剪切力去除。当其到达靶细胞时，电荷重新暴露(最佳地～45mV)从而便于进入。图6A显示了在BALB/c小鼠中，使用BIV包裹了CAT的质粒经静脉转染肺的优化，以及图6B显示了在BALB/c小鼠中，使用BIV包裹的CAT来包裹的质粒经静脉转染心脏的优化。当可逆掩蔽的复合物在全身循环时，尽管zeta电势分析仪上测得电荷为4.8mV，其转染很少。这些复合物当掩蔽可逆地从BIV复合物上解离时恢复到其天然的电荷状态(45.5mV)，从而促进通过膜融合的细胞进入，以及促进肝脏的肝细胞中高水平的转基因(CAT)表达(图6C)。转基因的表达提高了100倍以上，并且该水平与使用“一般的”BIV复合物在肺中产生的CAT水平相称。使用可逆掩蔽，在其他任何器官中未观察到CAT的产生。

我们的BIV递送系统独特地有效的一个原因是因为，复合物通过与细胞膜融合，使治疗剂递送进入细胞，并且避免了胞吞途径。脂质体进入的两个主要进入机制是通过胞吞，或者直接和细胞膜融合。本发明人发现，包裹在BIV复合物中的核酸在体外和在体内都通过直接的融合进入细胞，并且在比较研究中证实了BIV在很大程度上避免了内体的摄取，所述的比较研究将聚乙烯胺(PEI)用于小鼠肺泡巨噬细胞中。已知PEI快速地以及积极地摄取到内体中，这一点通过以下证明，≥95％的罗丹明标记的寡核苷酸在转染后2-3小时内定位[95-97]。

使用修饰的BIV进行癌症靶向的递送：最近，Bartlett和Davis指出了由肿瘤靶向的纳米颗粒(NP)进行全身性递送的siRNA与未经修饰的NP相比在抑制皮下皮下肿瘤的生长中显著地更为有效[98]。靶向递送未显著地影响药物动力学或者生物分布，但是表现出通过提高的细胞摄取改进转基因表达[95-97]，所述的药物动力学或者生物分布在很大程度上仍然是EPR(提高的渗透性和潴留)的结果[95]。

确实，在开发用于治疗用途的BIV中，关键的“缺失的一块”是识别出可以放置到BIV复合物的表面从而将其导向到靶细胞的此种无免疫原性配体。尽管使用多聚化在脂质体表面的小肽来完成这一目标是可能的，其可以在重复的注射之后产生免疫应答。包括抗体、抗体片段、蛋白质、不完全蛋白等的其他更大的配体与使用小肽相比，在脂质体的表面上用于靶向递送时远远更为难以控制。因此本发明的复合物是独特的，其独特在于其不仅穿透包括肿瘤脉管系统内皮孔和实体瘤的间质压力梯度的紧密疾病[99]，还直接地靶向到肿瘤细胞。因此，本发明的治疗方法不限于完全依赖于EPR效应的递送，还在于直接靶向肿瘤[100-102]。

设计为选择性地结合蛋白质的小分子可以用于本发明。重要的是，所制备的小分子是“两价的”从而其尤其地适合于结合细胞表面受体，并且该小分子类似于在蛋白质-配体相互作用中的热点处所发现的二级结构基序。Burgess小组成功地设计了对细胞表面受体有亲和性的两价β-转角模拟物[103-105]。该策略由本发明人采用，从而产生具有烃尾部的两价分子，并且我们从这些采用的小分子制备了功能化的BIV复合物。开发并运行了有效的高通量技术来筛选文库。

压缩的DNA纳米颗粒：有丝分裂后细胞中安全和有效的DNA递送：Copernicus核酸递送技术是非病毒的合成性和模块式平台，其中将单个分子的DNA或者siRNA使用多阳离子压缩，形成具有可能的最小体积的纳米颗粒[106]。优化用于体内递送的多阳离子是10kDa的聚乙二醇(PEG)，所述聚乙二醇(PEG)由含有N-末端半胱氨酸和30个赖氨酸残基的肽修饰(CK30PEG10k)。这些复合物的形状部分地依赖于当DNA压缩时赖氨酸的对离子[107]。棒状纳米颗粒的最小横截面直径是8-11nm，与有效负载质粒的大小无关，而当为椭圆体时对于通常的表达载体的最小直径是20-22nm(图7A)[107]。重要的是，这些DNA纳米颗粒能够稳健地(robustly)转染培养物中不分裂的细胞。压缩DNA的脂质体混合物与裸露DNA的脂质体混合物相比，将基因表达的水平提高1000倍以上(图7B)。在体内给药之后，压缩的DNA稳健地转染肺[108]、脑[109，110]和眼睛[111，112]中的有丝分裂后细胞。在这些系统的每一个中，压缩DNA转染有丝分裂后细胞的卓越能力看起来是由于这些纳米颗小的尺寸，所述的纳米颗粒可以穿过25nm的核膜孔[106]。

这些DNA纳米颗粒的一种摄取机制是基于与细胞表面核仁蛋白(26nmK_D)的结合，随后通过非降解的途径由细胞质运输到细胞核中，在细胞核中纳米颗粒拆开释放生物活性的DNA[113]。已经证实了长期的体内表达在基因转移后持续长达1年。这些纳米颗粒具有良性的毒性特征，并且不刺激toll样的受体，从而避免了有毒的细胞因子响应，即使当压缩的DNA具有上百个CpG小岛并且与脂质体混合时，没有观察到毒性效应[114，115]。已经将DNA纳米颗粒给药到囊胞性纤维化试验的人，得到了令人鼓舞的结果，而没有归于纳米颗粒的不良事件，并且证实了大多数患者具有CFTR蛋白质的生物活性[116]。

在本发明人和Copernicus(Cleveland，OH)的初期合作研究中，将压缩的DNA通过尾静脉或者肿瘤内(IT)注射给予到具有结肠癌移植物的SCID小鼠中(图7C)。尽管IV注射未产生基因转移，在IT给药之后有显著高水平的基因转移，这表明这些DNA纳米颗粒在局部递送之后具有转染肿瘤的高活性。

新型的递送系统：由于希望全身性基因转移到原发肿瘤和转移的位点，可以通过将纳米颗粒封装来便于压缩DNA的肿瘤递送，所述的纳米颗粒由通过在专用的BIV脂质体中将其与30聚体的赖氨酸缩合肽组合来压缩的DNA构成。压缩的DNA与掩蔽的隐形脂质体的新型结合代表了新型的癌症基因治疗方法。

如在前文中所看到的，在胰腺癌细胞系PANC-1中通过RNA干扰来使PDX-1表达沉默在体外抑制了细胞增殖，并且在体内抑制了肿瘤生长及提高了肿瘤细胞的细胞凋亡。基于这一策略，本发明人开发了一种用于治疗胰岛瘤、胰腺癌和神经内分泌肿瘤的临床应用的双官能shRNA(bi-shRNA-PDX-1)。除此之外，本发明人使用胰岛瘤/SCID模型和使用PANC-1/SCID胰腺肿瘤模型证实了在体外的效力和在体内的效力。

通过免疫印迹和qRT-PCR分析评估了在PDX-1阴性的人类癌症细胞系(HCT116)中PDX-1的表达在体外的抑制效力，所述的PDX-1阴性的人类癌症细胞系由PDX-1和bi-shRNA表达载体共转染(图3A、3B、4和8)。通过腹膜内注射(IP)来产生动物模型，对于体内的胰岛瘤模型注射1×10⁶β-TC-6细胞，或者对于PC模型注射1×10⁵PANC-1细胞。在接种两周之后，将各个模型的小鼠随机地分成两个组，其中一个组经尾部静脉注射给予含有35μg对照载体(无shRNA插入物的质粒)的脂复合物(DOTAP:胆固醇脂质体质粒复合物)，第二个组经尾部静脉注射给予含有35μg小鼠特异性bi-mshRMA(对于胰岛瘤模型)或者人特异性的bi-hsh-PDX-1(对于PC模型)的脂复合物。每两周进行两次重复递送，总共进行三次注射。定期地监测血胰岛素和血糖水平。在第三次注射后的2周、10周和18周，将各组的6只小鼠处死用于评价其病理学和肿瘤。

将HCT116人癌症细胞使用1:1比例的质粒进行电穿孔。利用qRT-PCR将PDX-1mRNA与使用△△Ct方法进行定量的对比(图3A和3B)。将mRNA水平与空载体对照比较，从而得到在表1中总结的％表达。转染后24、48和72小时分析PDX-1mRNA。

表1：转染后72小时监测的PDX-1mRNA表达的降低

人和小鼠特异性的bi-shRNA-PDX-1显示出在体外PDX-1mRNA表达的有效性和物种特异性的击倒。

在首先的两轮处理的各轮之后的七天时，第45天和第90天，测定禁食小鼠的血糖水平。在小鼠胰岛瘤模型中，使用mbi-shRNA-PDX-1处理使小鼠有效地免受β-TC-6细胞诱导的高血糖(图9A)，而hbi-shRNA-PDX-1对胰腺癌模型的血糖水平没有影响(图9B)。在β-TC-6的胰岛瘤模型中，所有未处理的小鼠在第90天的测量之前死亡。PANC-1胰腺癌模型的结果显示在图9B中。

Kaplan-Meier存活率分析进一步证明了PANC-1(图10A)和β-TC-6(图10B)胰岛瘤模型中bi-shRNA-PDX-1处理的好处。对于胰岛瘤而言，对处理组中的10只小鼠(各只使用30μgmbi-shRNA-PDX-1脂复合物处理三轮)和对照组中的10只小鼠(各只使用30μg含有pUMVC3载体而没有bi-shRNA插入物的脂复合物处理三轮)监测存活率。存活率监测96天的时间。对于PC模型，5只接种了PANC-1的小鼠未经处理，10只小鼠各只使用30μg含有pUMVC3载体而没有bi-shRNA插入物的脂复合物处理三轮，以及15只小鼠各只使用30μghbi-shRNA-PDX-1脂复合物处理三轮。将来自各组的5只小鼠在第60天和第90天处死用于比较肿瘤体积。处理之后60天，100％的未经处理小鼠发展出肿瘤，所述的肿瘤具有1330.75mm³的平均尺寸，而仅50％的经处理的小鼠具有可见的肿瘤，该可见的肿瘤具有50.5mm³的平均尺寸。在处理后90天，37.5％的经处理小鼠没有可见的肿瘤，并且剩余的小鼠具有36.7mm³的平均尺寸。肿瘤体积比较研究的结果表示于表2中，并且显示在图14中。

在IV输注通过BIV脂质体递送的shRNA^PDX-1(L-mu-shRNA^PDX-1)之后，在SCID小鼠中存活率也提高了，并且该存活率表现为与L-mu-shRNA^PDX-1的注射次数相关(图13)。脂复合物(即，在体内研究中所使用的脂质-质粒复合物)以前缀“L”来表示，从而将其与只有载体相区分。下降的胰岛素和提高的葡萄糖水平对应于胰岛瘤生长抑制的L-mu-shRNA^PDX-1处理结果。在使用L-mu-shPDX-1处理之后，动物肿瘤的响应与通过流式细胞法检测的胰岛瘤细胞中PDX-1的抑制，与细胞周期蛋白(细胞周期蛋白E、cdk4、cdk2)的抑制以及与细胞周期蛋白依赖的激酶抑制剂(p27)的上调是相关的。还证实了细胞凋亡。本发明人进一步证实了在PDX-1表达的人胰腺癌鼠异种移植物模型对于IV输注shRNA^PDX-1脂复合物有与剂量相关的存活率优点。

表2：肿瘤体积比较研究

样品	％肿瘤率	平均肿瘤体积14 -->
			90天未经处理	100％	1330.75mm3
90天对照经处理	100％	1199.5mm3
			90天经处理	50％	50.5mm3
120天经处理	62.5％	36.7mm3

新型的bi-shRNA^PDX-1：为了实施双官能的shRNA策略，本发明人构建并且验证了鼠的(mu)-bi-shRNA^PDX-1。mu-bi-shRNA^PDX-1由两个具有miR-30a骨架的茎环结构所构成。第一茎环结构具有完全互补的引导链和过客链，而第二茎环结构在过客链的第10和11位置具有两处碱基对错配。mu-bi-shRNA^PDX-1靶向小鼠PDX-1mRNA(NM_008814)的#723-#741的核苷酸。

将mu-bi-shRNA^PDX-1表达单元与寡核苷酸的组合装配在一起。将在5’和3’端分别具有SalI和NotI位点的装配的表达单元插入到pUMVC3的SalI和NotI位点。插入序列通过两个方向上的测序来确认，所述的测序使用位于插入物侧面的引物。使用了开发用于检测微小RNA的茎环RT-PCR方法来检测经mu-bi-shRNA^PDX-1转染的细胞中的成熟shRNA。本发明人还使用5’RACE试验检测靶向位点切割，验证了mu-bi-shRNA^PDX-1的活性。

本发明的bi-shRNA质粒的插入序列在此下文中表示：

pGBI-20：人bi-shRNA-PDX1(SEQ.IDNO：3)：

TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCAGTTCCTATTCAACAAGTATAGTGAAGCCACAGATGTATACTTGTTGAATAGGAACTGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCAGTTCCTATCTAACAAGTATAGTGAAGCCACAGATGTATACTTGTTGAATAGGAACTGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC

SEQ.IDNO：3中下划线部分(包含了从25到43的核酸残基)代表了主要靶向位点。

pGBI-21：人bi-shRNA-PDX1(SEQ.IDNO：4)：

TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCAGTTCCTATTCAACAAGTATAGTGAAGCCACAGATGTATACTTGTTGAATAGGAACTGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC

pGBI-22：人bi-shRNA-PDX-1(SEQ.IDNO：5)：

TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCCAGTTATTTACAAACAGGTTAGTGAAGCCACAGATGTAACCTGTTTGTAAATAACTGGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCCAGTTATTTCTAAACAGGTTAGTGAAGCCACAGATGTAACCTGTTTGTAAATAACTGGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC

pGBI-23：人bi-shRNA-PDX-1(SEQ.IDNO：6)：

TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCCAGTTATTTACAAACAGGTTAGTGAAGCCACAGATGTAACCTGTTTGTAAATAACTGGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC

pGBI-24：小鼠bi-shRNA-PDX-1(SEQ.IDNO：7)：

TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCGGAAGATAAGAAACGTAGTTAGTGAAGCCACAGATGTAACTACGTTTCTTATCTTCCGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCAGCTCACTACATTACTCAGCTGTTGAAGTGAGCGCCGGAAGATAAACAACATAGTTAGTGAAGCCACAGATGTAACTACGTTTCTTATCTTCCGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC

SEQ.IDNO：4中下划线的部分(包含了从25到43的核酸残基)代表了主要靶向位点。

pGBI-25：小鼠bi-shRNA-PDX1(SEQ.IDNO：8)：

TCGACTGCTGTTGAAGTGAGCGCCGGAAGATAAGAAACGTAGTTAGTGAAGCCACAGATGTAACTACGTTTCTTATCTTCCGTTGCCTACTGCCTCGGAAGCTTAATAAAGGATCTTTTATTTTCATTGGC

本发明的新型bi-shRNA疗法的构建代表了本领域状态的方法，其可以降低用于通过转录后基因击倒得到有效的治疗结果所需要的有效的全身剂量。存在着有效的和临床上可实现的递送方式来快速转换用于全身性靶向表达PDX-1过表达的肿瘤。

预期的是，本说明书中所讨论的任何实施方案可以通过关于本发明的任何方法、试剂盒、试剂或组合物来实施，反之亦然。此外，本发明的组合物可以用于实现本发明的方法。

要理解的是，本文所述的具体实施方案是通过举例说明的方式来显示而不是为了限制本发明。本发明的主要特征可以在不脱离本发明范围的情况下用于各种实施方案中。本领域技术人员将认识到，或者能够仅仅利用常规的实验确定本文所述具体步骤的许多等同物。这样的等同物被认为是在本发明的范围内，且被权利要求所涵盖。

本说明书中提到的所有出版物和专利申请表明了本发明所涉及领域的技术人员的水平。所有的出版物和专利申请均引入本文作为参考，其引入的程度如同各个独立的出版物或专利申请具体并独立地被指明引入作为参考。

词语“一个(a)”或“一种(an)”当与权利要求和/或说明书中的术语“包含(comprising)”结合使用时，可以指“一种”，但其也与“一种或多种”、“至少一种”和“一种或多于一种”的意思相一致。在权利要求中所使用的术语“或者”是指“和/或”，除非明确指明仅仅是指替代物，或替代物为相互排斥的，尽管公开内容支持仅仅指替代物及“和/或”的定义。在整个本申请中，术语“大约”用来说明这样的值，其包括用来测定所述值的装置和方法的误差的固有变化，或者研究受试者之间存在的变化。

如在本说明书和权利要求中所使用的，词语“包含(comprising)”(以及任何形式的“包含”，如“包含(comprise)和包含(comprises)”)，“具有(having)”(以及任何形式的“具有”，如“具有(have)”和“具有(has)”)，“包括(including)”(以及任何形式的“包括”，如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(以及任何形式的“含有”，如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包括的或开放式的，且不排除额外的，未述及的元素或方法步骤。

本文所使用的术语“或它们的组合”是指在该术语之前所列举项目的全部排列和组合。例如，“A、B、C或它们的组合”意在包括A、B、C、AB、AC、BC或ABC中的至少一种，并且如果在特定的上下文中顺序是重要的，那么还包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续这个例子，明显包括的是包含一种或多种项目或术语的重复的组合，如BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等等。本领域技术人员将理解的是，通常对任何组合中的项目或术语的数目没有限制，除非从上下文中另外是明显的。

如本文所使用的，近似的词语如但不限于“约”、“基本的”或者“基本上”指这样的情况，当这样修饰时理解为不必是绝对的或者完美的，而应认为是足以接近本领域技术人员从而保证指定所述情作为当前的情况。说明书可以变化的程度取决于进行多大的变化之后，仍然使得本领域技术人员认为修饰的特征仍然具有所需的性质和未修饰的特征所具有的能力。总地来说，与前面讨论的主题一致地，本文通过近似的词语如“约”修饰的数值可以从所宣称的数值变化至少±1、2、3、4、5、6、7、10、12或者15％。

根据本发明的公开内容，在不过度的实验下可以制备和实施本文所公开和要求保护的全部组合物和/或方法。尽管以优选的实施方案的形式描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员来说明显的是，在不脱离本发明的构思、精神和范围的情况下，可以改变本文所述的组合物和/或方法以及方法的步骤或方法的步骤的顺序。对本领域技术人员而言明显的所有这样相似的取代和修饰被认为是在所附的权利要求所限定的本发明的精神、范围和构思内。

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Claims (47)

1.一种表达载体，其包括：

启动子；和

可操作地连接到该启动子的核酸插入物，其中所述插入物编码一个或多个短发夹RNA(shRNA)，所述短发夹RNA能够杂交到mRNA转录物的区域，所述mRNA转录物编码PDX-1癌基因并且通过RNA干扰来抑制PDX-1癌基因的表达。

2.权利要求1所述的表达载体，其中所述shRNA结合一个或多个siRNA(切割依赖的)和miRNA(切割非依赖的)基序。

3.权利要求1所述的表达载体，其中所述shRNA是PDX-1癌基因表达的切割依赖和切割非依赖两者的抑制剂。

4.权利要求1所述的表达载体，其中所述shRNA进一步限定为双官能的shRNA。

5.权利要求1所述的表达载体，其中所述一个或多个shRNA包含选自以下的序列：SEQ.IDNO:3、SEQ.IDNO:4、SEQ.IDNO:5、SEQ.IDNO:6、SEQ.IDNO:7、SEQ.IDNO:8以及它们的组合或修饰。

6.权利要求1所述的表达载体，其中所述靶向的区域是PDX-1癌基因转录物的3’UTR区域序列。

7.一种治疗性递送系统，其包括：

治疗剂载体；和

表达载体，所述表达载体包括启动子和可操作地连接到该启动子的核酸插入物，所述插入物编码一个或多个短发夹RNA(shRNA)，所述短发夹RNA杂交到mRNA转录物的区域，所述mRNA转录物编码PDX-1癌基因并且通过RNA干扰来抑制PDX-1癌基因的表达。

8.权利要求7所述的递送系统，其中所述治疗剂载体是压缩的DNA纳米颗粒。

9.权利要求8所述的递送系统，其中所述DNA纳米颗粒用一种或多种多阳离子进行压缩。

10.权利要求8所述的递送系统，其中所述一种或多种多阳离子是10kDA的聚乙二醇(PEG)-取代的半胱氨酸-赖氨酸3聚体肽(CK₃₀PEG10k)。

11.权利要求8所述的递送系统，其中所述压缩的纳米颗粒进一步地包裹在脂质体中。

12.权利要求11所述的递送系统，其中所述脂质体是两层内陷的囊泡(BIV)。

13.权利要求11所述的递送系统，其中所述脂质体是可逆掩蔽的脂质体。

14.权利要求11所述的递送系统，其中所述脂质体使用一种或多种“巧妙的(smart)”受体靶向部分修饰。

15.权利要求14所述的递送系统，其中所述一种或多种“巧妙的”受体靶向部分是小分子二价β-转角模拟物。

16.权利要求7所述的递送系统，其中所述治疗剂载体是脂质体。

17.权利要求16所述的递送系统，其中所述的脂质体是使用一种或多种“巧妙的”受体靶向部分修饰的两层内陷的囊泡(BIV)，其中所述脂质体是可逆掩蔽的脂质体。

18.权利要求17所述的递送系统，其中所述“巧妙的”受体靶向部分是小分子二价β-转角模拟物。

19.权利要求7所述的递送系统，其中所述一个或多个shRNA包含选自以下的序列：SEQ.IDNO:3、SEQ.IDNO:4、SEQ.IDNO:5、SEQ.IDNO:6、SEQ.IDNO:7、SEQ.IDNO:8以及它们的组合或修饰。

20.一种用于将一个或多个shRNA递送到表达PDX-1癌基因的靶组织的方法，该方法包括以下步骤：

制备表达载体，所述表达载体包含启动子和可操作地连接到该启动子的核酸插入物，所述插入物编码一个或多个shRNA，所述的shRNA杂交到编码PDX-1癌基因的mRNA转录物的区域，并且该shRNA通过RNA干扰来抑制PDX-1癌基因的表达；

将该表达载体与治疗剂载体组合，其中所述的治疗剂载体是由一种或多种“巧妙的”受体靶向部分所修饰的脂质体；以及

将治疗有效量的该表达载体和治疗剂载体复合物给予需要其的患者。

21.权利要求20所述的方法，其中所述治疗剂载体是压缩的DNA纳米颗粒。

22.权利要求21所述的方法，其中所述DNA纳米颗粒是用一种或多种多阳离子压缩的，其中所述的一种或多种多阳离子包括10kDA的聚乙二醇(PEG)-取代的半胱氨酸-赖氨酸3聚体肽(CK₃₀PEG10k)或者30聚体赖氨酸缩合肽。

23.权利要求21所述的方法，其中所述压缩的DNA纳米颗粒进一步地包裹在脂质体中，其中所述的脂质体是两层内陷的囊泡(BIV)，并且使用一种或多种“巧妙的”受体靶向部分修饰。

24.权利要求23所述的方法，其中所述一种或多种“巧妙的”受体靶向部分是小分子二价β-转角模拟物。

25.权利要求23所述的方法，其中所述脂质体是可逆掩蔽的脂质体。

26.权利要求20所述的方法，其中所述脂质体是两层内陷的囊泡(BIV)。

27.权利要求20所述的方法，其中所述脂质体是可逆掩蔽的脂质体。

28.权利要求20所述的方法，其中所述一种或多种“巧妙的”受体靶向部分是小分子二价β-转角模拟物。

29.权利要求20所述的方法，其中所述一个或多个shRNA包含选自以下的序列：SEQ.IDNO:3、SEQ.IDNO:4、SEQ.IDNO:5、SEQ.IDNO:6、SEQ.IDNO:7、SEQ.IDNO:8以及它们的组合或修饰。

30.一种用于在一种或多种靶细胞中沉默PDX-1癌基因的表达的方法，该方法包括以下步骤：

选择所述一种或多种靶细胞；并且

用载体转染所述靶细胞，所述载体表达一个或多个短发夹RNA(shRNA)，所述的短发夹RNA能杂交到编码PDX-1癌基因的mRNA转录物的区域，其中使用载体转染所述一种或多种靶细胞通过RNA干扰来抑制PDX-1癌基因的表达。

31.权利要求30所述的方法，其中所述shRNA结合了siRNA(切割依赖的)和miRNA(切割非依赖的)基序。

32.权利要求30所述的方法，其中所述shRNA是PDX-1癌基因表达的切割依赖和切割非依赖两者的抑制剂。

33.权利要求30所述的方法，其中所述shRNA进一步限定为双官能的shRNA。

34.权利要求30所述的方法，其中所述靶向的区域是PDX-1癌基因转录物的3’UTR区域序列。

35.权利要求30所述的方法，其中所述一个或多个shRNA包含选自以下的序列：SEQ.IDNO:3、SEQ.IDNO:4、SEQ.IDNO:5、SEQ.IDNO:6、SEQ.IDNO:7、SEQ.IDNO:8以及它们的组合或修饰。

36.一种在人受试者中抑制肿瘤细胞生长、治疗胰岛瘤形成疾病或者两者的方法，该方法包括以下步骤：

确定需要抑制肿瘤细胞生长、治疗胰岛瘤形成疾病或者两者的人受试者；并且

向该人受试者给予足以抑制肿瘤细胞生长、治疗胰岛瘤形成疾病或者两者的量的治疗剂载体复合物中的表达载体，其中所述表达载体表达一个或多个双官能短发夹RNA(shRNA)，所述的短发夹RNA能杂交到编码PDX-1癌基因的mRNA转录物的区域，其中所述的杂交导致细胞凋亡、增殖受阻或者肿瘤细胞的侵袭性降低。

37.权利要求36所述的方法，其中所述胰岛瘤形成疾病包括胰腺神经内分泌肿瘤(NET)、胰岛瘤和类癌瘤。

38.权利要求36所述的方法，其中所述双官能shRNA结合了siRNA(切割依赖的)和miRNA(切割非依赖的)基序。

39.权利要求36所述的方法，其中所述双官能shRNA是PDX-1表达的切割依赖和切割非依赖两者的抑制剂。

40.权利要求36所述的方法，其中所述一个或多个shRNA包含选自以下的序列：SEQ.IDNO:3、SEQ.IDNO:4、SEQ.IDNO:5、SEQ.IDNO:6、SEQ.IDNO:7、SEQ.IDNO:8以及它们的组合或修饰。

41.权利要求36所述的方法，其中所述靶向的区域是PDX-1转录物的3’UTR区域序列。

42.权利要求36所述的方法，其中所述胰岛瘤形成疾病是胰腺神经内分泌肿瘤(NET)。

43.权利要求36所述的方法，其中所述治疗剂载体是压缩的DNA纳米颗粒或者可逆掩蔽的脂质体，所述脂质体用一种或多种“巧妙的”受体靶向部分修饰。

44.权利要求43所述的方法，其中所述DNA纳米颗粒是用一种或多种多阳离子压缩的，其中所述一种或多种多阳离子是10kDA的聚乙二醇(PEG)-取代的半胱氨酸-赖氨酸3聚体肽(CK₃₀PEG10k)或者30聚体赖氨酸缩合肽。

45.权利要求43所述的方法，其中所述可逆掩蔽的脂质体是两层内陷的囊泡(BIV)。

46.权利要求43所述的方法，其中所述一种或多种“巧妙的”受体靶向部分是小分子二价β-转角模拟物。

47.权利要求43所述的方法，其中所述压缩的DNA纳米颗粒进一步地包裹在脂质体中。