CN115361961A - 通过上调人组织蛋白酶抑制素ll-37以抑制胰岛淀粉样蛋白多肽（iapp）自组装来预防或治疗胰腺功能障碍或糖尿病的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种治疗2型糖尿病(T2D)的方法。该方法包括将受试者诊断为患有T2D或糖尿病前期；通过定量成像体内葡萄糖代谢来监测受试者胰腺中至少一个胰岛对葡萄糖刺激的反应；建立至少一个胰岛对葡萄糖刺激的反应的目标范围；并且上调受试者中组织蛋白酶抑制素基因表达，直到监测到的对葡萄糖刺激的反应在目标范围内。

Description

通过上调人组织蛋白酶抑制素LL-37以抑制胰岛淀粉样蛋白 多肽(IAPP)自组装来预防或治疗胰腺功能障碍或糖尿病的 方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年1月28日提交的美国临时申请号62/967,023的权益，该申请具有相同的标题和相同的发明人，并且其通过引用整体并入本文。

序列表

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发明领域

本公开内容一般性涉及用于治疗胰腺疾病(例如2型糖尿病)的方法，并且更具体地涉及用于调节组织蛋白酶抑制素(cathelicidin)基因表达以治疗此类疾病的方法。

发明背景

胰岛淀粉样蛋白多肽(IAPP)的淀粉样蛋白自组装与胰腺β细胞变性和2型糖尿病(T2D)的发病机制有关。37残基的IAPP与胰岛素一起从β细胞分泌，并以其可溶形式作为葡萄糖稳态的神经肽调节剂发挥作用。然而，在T2D条件下，内在无序但高度淀粉样蛋白生成的IAPP自组装成细胞毒性低聚物和淀粉样蛋白原纤维，其介导胰腺炎症和β细胞变性。

发明概述

本概述旨在提供一些实例并且不旨在以任何方式限制本发明的范围。例如，权利要求不要求包括在本概述的实例中的任何特征，除非权利要求明确地列举了这些特征。如在本公开内容的别处描述的各种特征和步骤可以包括在这里概述的实例中，并且这里和别处描述的特征和步骤可以以各种方式组合。

在一个方面，提供了一种预防或治疗2型糖尿病(T2D)的方法。该方法包括：(a)将受试者诊断为患有T2D或糖尿病前期；(b)通过定量成像体内葡萄糖代谢来监测受试者胰腺中至少一个胰岛对葡萄糖刺激的反应；(c)建立至少一个胰岛对葡萄糖刺激反应的目标范围；并且(d)上调受试者中组织蛋白酶抑制素基因表达，直到监测到的对葡萄糖刺激的反应在目标范围内。

在另一方面，提供了一种治疗受试者的2型糖尿病(T2D)的方法。该方法包括：(a)将受试者诊断为患有T2D；并且(b)向受试者施用可上调受试者中组织蛋白酶抑制素基因表达的药学上可接受的组合物。

在另一方面，提供了一种治疗糖尿病前期受试者的方法。该方法包括：(a)将受试者诊断为糖尿病前期或将来可能患有T2D；并且(b)向受试者施用可上调受试者中组织蛋白酶抑制素基因表达的药学上可接受的组合物。

在进一步的方面，提供了一种治疗胰岛淀粉样蛋白多肽(IAPP)在受试者的胰腺中聚集和积累的方法。该方法包括：(a)检测受试者胰腺组织中IAPP聚集体积累的存在；并且(b)向受试者施用药学上可接受的组合物，该组合物上调和/或全身性地上调受试者胰腺组织中组织蛋白酶抑制素基因表达。

在另一方面，提供了一种治疗受试者的方法。该方法包括：(a)监测受试者血液中组织蛋白酶抑制素肽LL-37和受试者胰腺组织中IAPP淀粉样蛋白的水平；并且(b)当检测到条件L/B<k时，其中L是检测到的LL-37的水平，B是检测到的IAPP的水平，并且k是预定阈值，则上调受试者中组织蛋白酶抑制素基因表达。

在又一方面，提供了一种调节体内IAPP淀粉样蛋白原纤维形成的方法。该方法包括：(a)监测受试者胰腺组织中IAPP淀粉样蛋白的水平；并且(b)向受试者施用药物活性组合物，该组合物通过诱导IAPP淀粉样蛋白的生理有效结合配偶体的表达来调节所述胰腺组织中的体内原纤维形成。

在又一方面，提供了一种调节受试者胰腺组织中体内原纤维形成的方法。该方法包括：(a)将IAPP淀粉样蛋白与IAPP淀粉样蛋白的生理有效结合配偶体共孵育，从而获得共孵育肽；(b)由共孵育的多肽产生药物组合物；并且(c)向受试者施用该药物组合物。

在又一方面，提供了一种抑制体内IAPP淀粉样蛋白原纤维在受试者胰腺组织中形成的方法，其中在较小和较大MW种类的IAPP淀粉样蛋白之间存在平衡。该方法包括向受试者施用一种药物组合物，该药物组合物将平衡移向较小种类的IAPP淀粉样蛋白。

在又一方面，提供了一种通过诱导由人CAMP基因编码的LL-37的胰腺和/或全身表达来防止胰腺中IAPP原纤维和斑块形成的方法。

在又一方面，提供了一种治疗受试者的2型糖尿病(T2D)的方法。该方法包括：(a)将受试者诊断为患有T2D；并且(b)向受试者施用包含LL-37的肽模拟物或其一部分的药学上可接受的组合物。

附图简要说明

参考以下附图和数据图表将更充分地理解说明书和权利要求书，这些附图和数据图表被呈现为本发明的示例性实施方案并且不应被解释为对本发明范围的完整记载。

图1-5示例了LL-37对IAPP淀粉样蛋白自组装的影响和细胞损伤作用。因此，图1描绘了单独的IAPP(16.5μM)或与LL-37(1/1)一起的原纤维形成，其通过ThT结合测定(平均值(±SD)，3次测定)；显示单独的LL-37以用于比较(1次测定)。

图2是所示的来自1a的溶液(7天老化)的一系列TEM图像(比例尺，100nm)；LL-37图像中的插图显示LL-37原纤维(少数群体)。

图3是用IAPP及其来自1a的混合物(7天老化)处理后培养的RIN5fm细胞的细胞活力图，其通过MTT还原测定(平均值(±SD)，3次测定(每次n＝3))；还显示了单独的LL-37的影响(1次测定，n＝3)。

图4描绘了LL-37对IAPP细胞毒性的抑制作用的IC50图，其通过用LL-37滴定IAPP(100nM；红色符号)和MTT还原测定(平均值(±SD)，3次滴定测定(每次n＝3))。

图5是单独的IAPP(16.5μM)或与LL-37(1/1)一起在接种fIAPP(10％)后的原纤维形成图，其通过ThT结合测定(平均值(±SD)，3次测定)。

图6-11提供了LL-37-IAPP相互作用的表征。

图6是描绘用荧光光谱滴定法测定app.Kd的图。单独的Fluos-IAPP(5nM)或与所示的不同量的LL-37(pH 7.4)一起的荧光发射光谱。插图，结合曲线(平均值(±SD)，3次滴定测定)。

图7是描述FAM-LL-37与IAPP单体和原纤维结合的图和相关显微照片，其通过DB测定。在硝酸纤维素膜上点上IAPP单体和原纤维(40μg)，并用FAM-LL-37(200nM)进行探测(结果代表4次测定)。

图8是IAPP(5μM)、IAPP-LL-37(1/1；各5μM)和LL-37(5μM)(0小时)(pH 7.4)的Far-UV CD光谱；还显示了LL-37和IAPP的光谱之和。

图9-10是单独的IAPP错误折叠(图9)或与LL-37一起通过far-UV CD光谱的动力学跟踪。显示了IAPP(图9)及其与LL-37(图10)的1/1混合物在不同时间点的光谱(条件如图8所示)。

图11是通过交联(pH 7.4)、NuPAGE和WB(IAPP 30μM；IAPP/LL-37,1/0.1或1/1)表征IAPP-LL-37异源组装体。显示了代表性凝胶(n>5)。

图12-13描绘了与IAPP原纤维(fIAPP)结合的LL-37将它们转化为无接种能力的组装体。

图12是描绘单独的IAPP(16.5μM)或用10％fIAPP或用10％LL-37处理的fIAPP接种后的原纤维形成的图，其通过ThT结合测定(平均值(±SD)，3次测定)。

图13是来自3a的溶液的一系列TEM图像：fIAPP接种、LL-37处理的fIAPP接种和用fIAPP(10％)(红点)或LL-37处理的fIAPP(10％)(蓝点)接种的IAPP(均在6小时)；比例尺，100nm。

图14-16示例了介导其与IAPP相互作用的LL-37区域及其有效的淀粉样蛋白抑制剂功能的鉴定。

图14是描绘单独的IAPP(16.5μM)或在LL-37(1-14)或LL-37(15-37)(1/1)存在下的原纤维形成的图，其通过ThT结合测定(平均值(±SD)，3次测定)。

图15是描绘来自4a的溶液(24小时老化)的β细胞损伤作用的图，其通过MTT还原(RIN5fm细胞)测定(平均值(±SD)，3次测定(每次n＝3))。

图16是使用肽微阵列鉴定结合IAPP的LL-37区域。具有由重叠LL-37序列组成的十聚体(粗体)的载玻片与Fluos-IAPP(1μM)一起孵育；通过荧光观察。鉴定出IAPP结合簇在蓝色虚线框中；LL-37“结合核心”，红色字母(结果代表4次测定)。

图17示例了建议的LL-37-IAPP相互作用在胰腺淀粉样蛋白形成、炎症、β细胞变性和T2D发病机制中的保护作用。

图18是显示LL-37对IAPP原纤维形成的抑制作用的剂量依赖性的图：单独的IAPP(16.5μM)或与所示的不同摩尔比的LL-37的原纤维形成，其通过ThT结合测定法测定(平均值(+SD)，3次测定)。

图19-22描绘了scrLL-37对IAPP原纤维形成、细胞损伤作用和构象的影响。

图19描绘了单独的IAPP(16.5μM)或与scrLL-37(IAPP/scrLL-37,1/10)一起的原纤维形成，其通过ThT结合测定法测定(平均值(±SD)，3次测定)。

图20描绘了对IAPP细胞毒性的影响：将来自S2a的溶液(7天老化)加入到RIN5fm细胞中，并通过MTT还原评估细胞损伤(平均值(±SD)，3次测定(每次n＝3))。

图21是单独的IAPP及其与scrLL-37的混合物的来自S2a的溶液(7天老化)的一系列TEM图像；比例尺，100nm)。在混合物的TEM图像的插图中，显示了无定形聚集体，它们被发现为是除了原纤维之外的主要聚集体群体并且最可能对应于scrLL-37(10倍过量)。

图22描绘了通过far-UV CD光谱研究的scrLL-37对IAPP构象的影响：显示了IAPP(5μM)的CD光谱、IAPP与scrLL-37的混合物(1/1；各5μM)和scrLL-37(5μM)(pH 7.4)；为了进行比较，还显示了scrLL-37和IAPP的光谱之和。

图23是通过与戊二醛、NuPAGE和WB与抗LL-37抗体交联的LL-37同源低聚物(包括约15kDa的同源四聚体)的表征：LL-37在3和30μM的浓度孵育(30分钟)，其对应于IAPP/LL-37比率为1/0.1或1/1单独或在IAPP(30μM；凝胶如图2f所示)(pH 7.4)存在下。所示印迹代表3次实验。

图24是一组可用于对胰岛成像的β-淀粉样蛋白成像探针。

图25描绘了合成和研究的IAPP、LL-37、乱序LL-37(scrLL-37)和LL-37片段的一级结构(IAPP具有C端酰胺；LL-37和相关肽具有C端COOH)。通过LALIGN进行IAPP和LL-37序列比对。

详述

本发明的数据和附图，当与本公开内容一起考虑时，根据许多实施方案，提供了治疗2型糖尿病(T2D)的方法。许多这样的实施方案包括监测胰腺中至少一个胰岛对葡萄糖刺激的反应，建立至少一个胰岛对葡萄糖刺激的反应的目标范围；并且上调受试者中组织蛋白酶抑制素基因表达，直到监测到的对葡萄糖刺激的反应在目标范围内。各种实施方案还涉及治疗受试者的方法。许多这样的实施方案包括监测受试者血液中组织蛋白酶抑制素肽LL-37和受试者胰腺组织中IAPP淀粉样蛋白的水平。还有许多实施方案涉及治疗受试者的2型糖尿病(T2D)的方法，包括向受试者施用药学上可接受的组合物，该组合物包含LL-37的肽模拟物或其一部分。

2型糖尿病的特征在于从胰岛β细胞分泌的胰岛素水平不足以补偿胰岛素抵抗。患有胰岛素抵抗的患者是否会发展为明显的糖尿病取决于胰岛β细胞功能障碍。为了跟踪疾病的进展并了解各种风险因素(例如肥胖)如何影响适当的胰岛功能，有必要拥有一种在体内评估胰岛功能的技术。迄今为止，血液胰岛素测量经常用于此目的，但这种测量通常对微小的变化不敏感，并且可能受到其他生理活动的影响。

根据本公开内容的实施方案确立了可以通过使用将固有自发荧光与多光子激发显微术相结合的成像平台来克服前述问题。该平台提供了一种获取高分辨率图像的非侵入性方法，可用于对体内单个胰岛的实时葡萄糖代谢进行定量成像，同时还具有更大成像深度(并且在某些应用中，减少了光漂白并减少了光损伤)的优势。因此，该技术提供了实时重复测量胰岛对葡萄糖刺激的反应的能力，同时还提供了从单组图像同时监测体内胰岛功能、增殖、脉管系统和巨噬细胞浸润的能力。

Sun等人(Sun J,Furio L,Mecheri R,van der Does AM,Lundeberg E,SaveanuL,Chen Y,van Endert P,Agerberth B,Diana J.Pancreaticβ-Cells Limit AutoimmuneDiabetes via an Immunoregulatory Antimicrobial Peptide Expressed under theInfluence of the Gut Microbiota.Immunity.2015Aug 18；43(2):304-17.doi:10.1016/j.immuni.2015.07.013.Epub 2015Aug 4.PMID:26253786，其公开内容通过引用并入)发现由上皮细胞和免疫细胞表达的抗微生物肽(AMP)主要用于防御入侵的微生物。最近，它们的免疫调节功能已在各种情况下得到强调。然而，非免疫细胞表达AMP可能影响外周组织(如胰腺)中自身免疫反应的方式尚不清楚。

已经发现分泌胰岛素的β细胞产生组织蛋白酶抑制素相关的抗微生物肽(CRAMP)并且这种产生在非肥胖糖尿病(NOD)小鼠中是有缺陷的。给糖尿病前期NOD小鼠施用CRAMP诱导胰岛中的调节性免疫细胞，抑制自身免疫性糖尿病的发病率。另外的研究表明，β细胞产生CRAMP是由肠道微生物区系产生的短链脂肪酸控制的。因此，NOD小鼠的肠道微生物区系操作调节胰岛中CRAMP的产生和炎症，这揭示了肠道微生物区系直接塑造了胰腺免疫环境和自身免疫性糖尿病的发展。

胰岛淀粉样蛋白多肽(IAPP)的淀粉样蛋白自组装与胰腺炎症、β细胞变性和2型糖尿病(T2D)的发病机制有关。多功能宿主防御肽(HDP)组织蛋白酶抑制素在炎症中起关键作用。现已发现抗微生物和免疫调节多肽人组织蛋白酶抑制素LL-37以纳摩尔级亲和力结合IAPP，并在体外有效抑制其淀粉样蛋白自组装和相关的胰腺β细胞损伤。此外，已经鉴定了关键的LL-37片段，它们介导其与IAPP的相互作用。上述内容表明LL-37在T2D发病机制中可能具有保护作用，并为设计组合抗微生物、免疫调节和T2D相关抗淀粉样蛋白功能的LL-37衍生肽作为多功能药物的有希望的候选者提供了分子基础。

多功能宿主防御肽(HDP)组织蛋白酶抑制素在炎症过程中起关键作用。这包括促炎和抗炎作用。迄今为止，唯一已知的人组织蛋白酶抑制素是LL-37(图25)。LL-37是一种37残基的多肽，广泛表达于大量免疫和非免疫细胞，包括胰腺的β细胞。LL-37在先天免疫中起着至关重要的作用。它最著名的功能是其广谱抗微生物活性及其强大的免疫调节作用。重要的是，最近发现胰腺β细胞分泌的小鼠LL-37直系同源物组织蛋白酶抑制素相关的抗微生物肽(CRAMP)通过将炎症细胞转化为调节细胞来抑制1型糖尿病(T1D)小鼠模型中的胰腺β细胞炎症。此外，CRAMP/LL-37治疗促进胰岛素和胰高血糖素分泌并增强胰岛功能。因此，LL-37已被认为在T1D中具有保护作用。LL-37的多功能性使其具有很高的生物医学重要性，并且已经报道了许多关于设计具有抗微生物或免疫调节功能的LL-37衍生肽的研究。

越来越多的证据表明，淀粉样蛋白生成多肽与其他多肽的相互作用是淀粉样蛋白自组装的关键调节子。例如，已发现IAPP的非纤维状的种类与胰岛素或阿尔茨海默病(AD)的淀粉样蛋白β肽(Aβ40(42))的高亲和力相互作用可在体外抑制IAPP淀粉样蛋白生成。此外，最近显示LL-37与Aβ42相互作用，从而在体外抑制Aβ42淀粉样蛋白生成和神经炎症。

本公开内容确定LL-37还与IAPP相互作用。值得注意的是，LL-37和IAPP具有显著的(42％)序列相似性(方案1)。本公开内容进一步确定LL-37以纳摩尔级亲和力结合IAPP，并在体外有效抑制其淀粉样蛋白自组装和相关的胰腺β细胞损伤。此外，鉴定了关键的LL-37片段，它们介导其与IAPP的相互作用。

表1描述了合成和研究的IAPP、LL-37、乱序LL-37(scrLL-37)和LL-37片段的一级结构(IAPP，C端酰胺；LL-37和相关肽，C端COOH)。通过LALIGN进行IAPP和LL-37序列比对。

表1：介导其与IAPP的相互作用的关键LL-37片段

LL-37是否可能干扰IAPP淀粉样蛋白生成和细胞损伤装配体的形成的问题首先通过使用ThT结合测定并结合TEM和细胞活力测定来解决(图1-5)。事实上，LL-37(1/1)有效地抑制了IAPP淀粉样蛋白的自组装(图1)。ThT测定的结果通过TEM得到证实，其显示无定形聚集体是老化的IAPP-LL-37混合物中的主要物质(图2)。有趣的是，除了与先前发现一致的无定形聚集体外，仅在老化的LL-37中也观察到一些原纤维。另外的研究证实了淀粉样蛋白抑制作用的剂量依赖性(图18)。将上述溶液添加到培养的胰腺β细胞(RIN5fm)中并通过3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)还原测定法测定细胞损伤表明LL-37也有效地抑制了细胞毒性IAPP组装体的形成(图3-4)。值得注意的是，多达至少10倍摩尔过量的乱序LL-37(scrLL-37)不能抑制，并且单独的LL-37没有细胞毒性(方案1，图1-3和19)。

为了定量LL-37的抑制活性，用LL-37滴定细胞毒性IAPP，得到17(+1.7)nM的IC50(图4)；因此，LL-37是IAPP细胞毒性自组装的纳摩尔级抑制剂。此外，研究了LL-37是否也可以通过添加接种量的预先形成的IAPP原纤维(fIAPP)干扰IAPP原纤维形成的成核。事实上，在存在LL-37(1/1)的情况下，fIAPP(10％)的接种效应被完全抑制(图5)。

为了表征LL-37-IAPP相互作用，进行了荧光光谱滴定、CD光谱、交联和斑点印迹(DB)。首先，用各种量的LL-37进行N端荧光素标记的IAPP(Fluos-IAPP；5nM)的滴定。它与100倍摩尔过量的LL-37的相互作用导致其荧光发射增加322％(图6)。滴定产生了与高亲和力相互作用一致的88.1(+12)nM的表观(app.)Kd(图6)。由于新鲜制备的5nM Fluos-IAPP溶液主要由单体组成，这些结果表明LL-37以纳摩尔级亲和力结合单体IAPP。为了查明LL-37是否也结合IAPP原纤维，使用N端荧光素标记的LL-37(FAM-LL-37)进行DB。事实上，FAM-LL-37结合IAPP原纤维和单体二者(图7)。

为了确定LL-37对IAPP构象和错误折叠的影响，在各种孵育时间点测量IAPP、LL-37和IAPP-LL-37混合物(1/1)的far-UV CD光谱(图8-10)。IAPP(0h)的光谱在约200nm处表现出强烈的最小值，表明存在大量无序结构(图8)。相比之下，LL-37的光谱在约227nm处表现出强烈的n→π*最小值，在约210nm处表现出较小的n→π*最小值，在约198nm处表现出最大的n→π*最小值。这些特征表明大量的α螺旋和/或β折叠/转角结构。重要的是，混合物的光谱不同于光谱之和，因此证实了两种肽之间的相互作用(图8)。此外，混合物和LL-37的CD光谱彼此非常相似；α螺旋同源或异源低聚物可以解释它们的227和210nm最小值(图8)。事实上，LL-37具有众所周知的自组装成α螺旋低聚物的倾向，而α螺旋介导的同源二聚化可能先于IAPP淀粉样蛋白自组装。值得注意的是，scrLL-37(1/1)不影响IAPP构象(图19)。

IAPP在各种孵育时间点的CD光谱表明构象转变为富含β折叠的组装体，导致原纤维形成和沉淀(24小时)(图9)。相比之下，LL-37-IAPP混合物表现出随时间变化的无规卷曲含量的强烈增加，并且没有发生沉淀(图10)。因此，LL-37-IAPP相互作用导致可溶的、部分无序的异源组装体，从而抑制了IAPP的原纤维形成。

为了进一步表征LL-37-IAPP异源组装体，进行了交联研究。LL-37-IAPP异源组装体与戊二醛交联，通过NuPAGE分离，并通过采用抗IAPP和抗LL-37抗体的蛋白质印迹(WB)分析进行观察。单独的IAPP或LL-37也被交联。IAPP溶液含有低MW低聚物，主要是二到六聚体，而凝胶上部的涂抹表明较高的MW聚集体(图11)。在存在非抑制量(0.1当量)的LL-37时观察到类似的模式。相比之下，在存在抑制性(等摩尔)LL-37量的情况下，在约15kDa处发现了新的在IAPP单独孵育中不存在的显著条带，这表明形成了IAPP-LL-37异源四聚体(图11，左图)。此外，观察到可能对应于细胞毒性IAPP低聚物的低MW低聚IAPP条带的强烈减少(图11，左图)。采用抗LL-37抗体的WB证实了LL-37在IAPP-LL-37混合物的15kDa条带中的存在(图11，右图)。值得注意的是，单独的LL-37也含有一个约15KDa的对应于LL-37同源四聚体的条带(图20)。总之，交联研究将LL-37-IAPP异源四聚体鉴定为主要的异源低聚群体，并表明它们的形成可能是LL-37对IAPP淀粉样蛋白自组装的抑制作用的基础。

由于发现LL-37也与IAPP原纤维(fIAPP)结合，因此研究了这种相互作用是否也可能有助于其淀粉样蛋白抑制剂作用。为了解决这个问题，研究了预先形成的fIAPP与LL-37处理的fIAPP(即fIAPP与LL-37(10倍)孵育24小时)作为IAPP原纤维形成的种子的能力。与强烈加速IAPP原纤维形成的未处理的fIAPP(10％)相比，LL-37处理的fIAPP(10％)不能这样做(图12-13)。TEM揭示了fIAPP和LL-37处理的fIAPP之间的显著形态差异，它们横向相互粘连成大的片状组装体(图13)。因此，LL-37与IAPP原纤维的结合将它们转化为无接种能力的组装体，为其有效的淀粉样蛋白抑制剂功能提供了另外的机制解释。

已发现其中央/C端部分内的特定部分LL-37序列，例如LL-37(17(18)-29)或LL-37(13-32)足以用于抗菌、抗病毒或免疫调节活性，因此被用于药物设计。为了确定LL-37的淀粉样蛋白抑制剂功能是否也存在于特定序列部分内，将其分割为两个片段LL-37(1-14)和LL-37(15-37)，包含其N端和中央/C端螺旋部分。合成了这些肽，并研究了它们对IAPP淀粉样蛋白自组装的相互作用和影响。重要的是，两个片段都不能干扰IAPP淀粉样蛋白自组装和细胞损伤效应(1/1)(图14-15)。此外，荧光滴定显示LL-37(15-37)与全长LL-37一样以高亲和力结合Fluos-IAPP(app.Kd＝31.9(+2.2)nM)；相比之下，发现LL-37(1-14)的结合弱约30倍(app.Kd＝2.54(+0.5)μM)(图21)。因此，虽然中央/C端LL-37部分可能介导其与IAPP的高亲和力相互作用，但它不足以发挥淀粉样蛋白抑制剂的功能；似乎需要中央/C端和N端部分的协同作用。

为了更好地表征参与其与IAPP相互作用的LL-37区域，使用10残基的LL-37片段的肽阵列覆盖全LL-37，并在位置上移动一个残基；肽共价附接在载玻片上。与Fluos-IAPP一起孵育揭示了两个由6-8个连续IAPP结合片段组成的簇：第一个在N端序列LL-37(1-15)中，第二个在C端序列LL-37(18-34)(图4c)。每个结合簇内的共同序列部分(即“结合核心”)在N端是LL-37(6-10)或FRKSK，在C端部分内是LL-37(25-27)或KDF(图16)。这些发现与LL-37分割研究一致。此外，他们还鉴定了介导其与IAPP相互作用的片段。

总之，鉴定了LL-37和IAPP之间的高亲和力相互作用，其在体外有效抑制IAPP淀粉样蛋白自组装，并且关键的LL-37片段介导了这种相互作用。这些结果表明，LL-37抑制剂的功能是通过其以下结合方式介导的：(a)与早期前原纤维(prefibrillar)IAPP种类的结合，并将它们隔离成可溶的、非原纤维的异源组装体，以及(b)与IAPP原纤维结合，并将它们转化为无接种能力的组装体。连同其他人的发现，这些结果支持这样的假设，即在胰腺炎症条件下由胰腺β细胞或浸润的中性粒细胞分泌的LL-37与IAPP结合并抑制其淀粉样蛋白自组装和相关的β细胞损伤，从而减缓T2D发病机制(图17)。对LL-37-IAPP相互作用的潜在生理相关性的研究现在具有高度优先级。

因此，应当理解，在主要的抗微生物和免疫调节多肽与T2D的关键淀粉样蛋白多肽之间发现了高亲和力的淀粉样蛋白抑制相互作用。这种相互作用为设计组合抗微生物、免疫调节和T2D相关抗淀粉样蛋白功能的新型分子作为多功能药物的候选者提供了分子基础。

内源性荧光辅因子NAD(P)H是细胞中的主要自发荧光信号。由于NAD(P)+是非荧光的，因此NAD(P)H水平的成像已被用于定量原位氧化还原状态和线粒体功能。在胰岛中，已经建立了一种使用NAD(P)H在体外研究葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)的方法。

本文所述类型的定量NAD(P)H成像可用于直接测量葡萄糖代谢，并且可用于将自体荧光信号与下游葡萄糖刺激事件相关联。当葡萄糖进入胰腺β细胞时，首先通过糖酵解和柠檬酸循环产生NADH。这种现象导致ATP/ADP比率增加，最终以Ca²⁺流入和胰岛素分泌告终。胞质Ca²⁺水平升高之后是线粒体Ca²⁺水平升高，这会活化几种在线粒体中形成NADH的脱氢酶。NAD(P)H和细胞内Ca²⁺之间的这种相互依赖性在本文所述的成像技术的一些实施方案中被作为杠杆用来测量胰腺β细胞功能。与通常允许一次仅监测胰岛功能的单个方面的其他体内成像技术相比，该方法可用于从单组图像同时监测葡萄糖代谢和葡萄糖刺激事件的多个方面。因此，例如，该技术可用于从单组图像中鉴定葡萄糖代谢、胰岛增殖、纤维化、脉管系统和巨噬细胞浸润的变化。这最好通过使用多个组织自发荧光源来实现，这可以使用多光子显微镜同时获得(参见例如Li G,Wu B,Ward MG,Chong AC,Mukherjee S,Chen S,HaoM.Multifunctional in vivo imaging of pancreatic islets during diabetesdevelopment.J Cell Sci.2016 Jul15；129(14):2865-75.doi:10.1242/jcs.190843.Epub2016Jun 6.PMID:27270669；PMCID:PMC4958299，其公开内容通过引用并入)。

该技术允许直接、在体内和实时地对个体人胰岛中葡萄糖代谢进行成像。该技术可用于研究糖尿病发展过程中各个阶段的人胰岛功能，并可与本文所公开的用于诱导CAMP基因表达的方法结合使用，以评估诱导的功效和需要。当然，虽然该技术特别适用于对葡萄糖代谢进行成像，但还需要注意的是，由于人体中的许多组织具有自发荧光特性，因此本文所公开的类型的成像平台可以很容易且适合地用于研究或监测广泛的生物系统。

各种自发荧光信号可用于本文所公开的装置和方法中。这些信号可用作内在生物标志物，以在生理和疾病状态下产生详细的分子信息。细胞NAD(P)H的定量被作为杠杆用来监测氧化还原状态和线粒体功能。可以测量细胞质和线粒体NAD(P)H的变化来解析糖酵解和氧化代谢的时空分配。NADH和NAD(P)H在ATP产生和抗氧化防御中的不同作用可以通过同时测量双光子NAD(P)H和单光子硫辛酰胺脱氢酶自发荧光或通过荧光寿命成像来解析。脂质分配和脂肪酸氧化动力学的建模可以通过适当监测电子转移黄素蛋白自发荧光来实现。最后，基于细胞自发荧光的定量研究可用于区分健康细胞和癌细胞。

在本文所公开的系统和方法的一些实施方案中，成像技术也可利用合适的β-淀粉样蛋白成像探针用于胰岛。例如，此类探针可以靶向胰淀素或与胰岛淀粉样蛋白沉积物相关的其他物质。这些探针可为对Aβ聚集体表现出高结合亲和力的分子，以允许在体内观察Aβ斑块(参见例如，Yoshimura M,Ono M,Watanabe H,Kimura H,Saji H.Feasibility ofamylin imaging in pancreatic islets withβ-amyloid imaging probes.SciRep.2014；4:6155.Published 2014Aug 21.doi:10.1038/srep06155，其公开内容通过引用并入)。可用于此目的的一些特定的、非限制性的探针实例包括图24中所示的探针。

在一些实施方案中，正电子发射断层扫描(PET)可以与淀粉样蛋白成像探针组合使用，用于胰岛淀粉样蛋白沉积物的PET检测。这种探针的一个实例是¹⁸F标记的放射性药物florbetapir，它已在其他地方用于检测大脑中Aβ衍生的淀粉样蛋白沉积物以诊断阿尔茨海默病。在这里，值得注意的是，大脑和胰岛淀粉样蛋白沉积物虽然不同，但也有一些结构相似性(参见例如，Kayed R,Head E,Thompson JL,et al.(2003)Common structure ofsoluble amyloid oligomers implies common mechanism ofpathogenesis.Science.300(5618):486–9，其公开内容通过引用并入)。

各种其他成像技术和平台也可用于本文所述的系统和方法。这些包括但不限于正电子发射断层扫描(PET)和磁共振成像(MRI)。在一些实施方案中，还可以使用利用Ca²⁺探针灌注或荧光报道子的病毒转导的成像技术。

可以根据本文的教导使用各种药物组合物来上调受试者中的组织蛋白酶抑制素基因表达，以诱导IAPP淀粉样蛋白的生理有效结合配偶体的表达，以抑制受试者胰腺组织中体内IAPP淀粉样蛋白原纤维的形成，以将存在于较小和较大MW种类的IAPP淀粉样蛋白之间的平衡移向较小种类的IAPP低聚物和原纤维，或以通过诱导胰腺组织中LL-37产生而将组织中IAPP水平降低到阈值量以下。在一些实施方案中，这些药学上可接受的组合物优选包括至少四种、更优选至少五种、最优选至少六种材料(优选活性材料)的混合物，所述材料选自苯丁酸、蓓沙罗汀、姜黄素、白藜芦醇、视黄醇、胆钙化醇、脂肪酸及其药学上可接受的盐。在其他实施方案中，本文所公开的药学上可接受的组合物优选包含至少四种、更优选至少五种、最优选至少六种材料(优选活性材料)的混合物，所述材料选自苯丁酸、蓓沙罗汀、姜黄素、白藜芦醇、视黄醇、胆钙化醇、二十二碳六烯酸、辛酸、癸酸、月桂酸及其药学上可接受的盐。在其他实施方案中，药物组合物可包含卡介苗(BCG)疫苗。

这些药物组合物可以使用一种或多种活性成分(并且优选使用多种活性成分，如上所述)，其可以溶解、悬浮或置于各种介质中。这样的介质可以包括例如各种液体、固体或多态介质，例如乳液、凝胶或乳膏。这样的介质可以包括液体介质，其可以是疏水的或者可以包含一种或多种甘油三酯或油。这样的介质可包括但不限于植物油、鱼油、动物脂肪、氢化植物油、部分氢化植物油、合成甘油三酯、改性甘油三酯、分馏甘油三酯及其混合物。在这些药物组合物中使用的甘油三酯可以包括选自以下的油：杏仁油；巴巴苏油；琉璃苣油；黑加仑籽油；黑籽油；油菜籽油；蓖麻油；椰子油；玉米油；棉籽油；月见草油；葡萄籽油；野豆油；芥菜籽油；橄榄油；棕榈油；棕榈仁油；花生油；菜籽油；红花油；芝麻油；鲨鱼肝油；大豆油；葵花籽油；氢化蓖麻油；氢化椰子油；氢化棕榈油；氢化大豆油；氢化植物油；氢化棉籽油和蓖麻油；部分氢化大豆油；豆油；三己酸甘油酯；三辛酸甘油酯；三癸酸甘油酯；十三烷酸甘油酯；三月桂酸甘油酯；三油酸甘油酯；三亚油酸甘油酯；三亚麻酸甘油酯；三辛酸/癸酸甘油酯；三辛酸/癸酸/月桂酸甘油酯；三辛酸/癸酸/亚油酸甘油酯；三辛酸/癸酸/硬脂酸甘油酯；饱和聚乙二醇化甘油酯；亚油酸甘油酯；辛酸/癸酸甘油酯；改性甘油三酯；分馏甘油三酯；及其混合物。特别优选使用椰子油或MCT(中链甘油三酯)油。

各种脂肪酸可用于本文所公开的药物组合物中。这些包括但不限于长链和短链脂肪酸。此类脂肪酸的实例包括但不限于二十二碳六烯酸、辛酸、癸酸、月桂酸、丁酸及其药学上可接受的盐。

可以各种方式施用本文所公开的药物组合物。因此，例如，可以作为口服、经皮、经粘膜、静脉内或注射治疗或通过基于细胞的药物递送系统施用这些组合物。此外，可以单剂量、多剂量或控释方式施用这些组合物。

本文所公开的药物组合物可以制成片剂、液体、凝胶、泡沫、软膏或粉末。在一些实施方案中，可以作为微粒或纳米颗粒施用这些组合物。

各种抗衡离子可用于形成本文所公开的材料的药学上可接受的盐。本领域技术人员将理解，可由各种考虑决定抗衡离子的具体选择。然而，在某些应用中可能优选使用钠盐和盐酸盐。

在本文所公开的系统和方法的一些实施方案中，不是为了上调受试者中组织蛋白酶抑制素基因表达，为了类似目的，LL-37或其片段的拟肽模拟物或拟肽可用于或施用于受试者。这些可能包括修饰肽、结构模拟物(包括肽折叠体)和机械模拟物。

在一些实施方案中，可以使用多个模拟物，它们可以或可以不通过接头部分连接。例如，在一个这样的实施方案中，LL-37结合区的两个模拟物(肽模拟物)可以通过柔性类肽接头例如低聚-N-甲氧基乙基甘氨酸或低聚-Nmeg连接。然而，也可以使用各种其他接头部分，包括但不限于肽、PEG、类肽、7-氨基庚酸(AHA)、烷基接头和含有二硫化物或三唑部分的接头。优选地，肽模拟物包括LL-37的N端序列LL-37(1-15)的第一模拟物和LL-37的C端序列LL-37(18-34)的第二模拟物。更优选地，肽模拟物包括在N端的LL-37(6-10)或LL-37的FRKSK的第一模拟物，以及在LL-37的C端部分内的LL-37(25-27)或KDF区域的第二模拟物。

示例性实施方案

提供以下实施方案以进一步公开和阐明本公开内容。这些实施方案是示例性的，并不意味着限制本公开内容的范围。

肽和肽合成

如前所述，IAPP在Rink树脂上使用Fmoc-固相合成策略合成，用空气氧化并用反相(RP)HPLC纯化。IAPP储液按所述通过将肽溶解在1,1,3,3,3,3-六氟-2-异丙醇(HFIP)(4℃)中并过滤溶液制备；IAPP浓度通过UV光谱测定。合成、纯化N^h-氨基末端荧光素标记的IAPP(Fluos-IAPP)(MALDI-TOF MS：发现为MH+,4261.2；计算为4262.2)，并如前所述进行处理。LL-37购自BACHEM和AnaSpec；其储液是通过将其溶解在HFIP(4℃)中制成的；其浓度由其重量和BCA测定法测定。乱序LL-37(scrLL-37)和N-氨基末端荧光素标记的LL-37(FAM-LL-37)购自Anaspec；值得注意的是，在FAM-LL-37中的荧光素(FAM)部分和LL-37的N端之间包含一个6-氨基己酸间隔基。合成胰高血糖素(斑点印迹分析的对照)来自BACHEM。LL-37部分片段LL-37(1-14)和LL-37(15-37)是在Wang树脂上使用先前建立的Fmoc-SPPS方案手动和通过CS336X肽合成仪(CS Bio)合成的。简而言之，使用标准Fmoc保护的氨基酸(3倍摩尔过量)和作为偶联试剂N,N,N',N'-四甲基-O-(1H-苯并三唑-1-基)六氟磷酸脲(HBTU)或2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸脲(HATU)(3摩尔过量)用于选定的偶联，以及溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的N,N-二异丙基乙胺(DIEA)(4.5倍摩尔过量)进行偶联(两次或3次)。在LL-37(1-14)的情况下，除了其中HATU用于第一次偶联的Lys10、Glu11和Lys12之外，大多数偶联使用HBTU作为偶联剂进行两次；此外，对Phe5、Phe6和Arg7进行了3次偶联，其中前两次偶联使用HATU。在LL-37(15-37)的情况下，大多数偶联第一次使用HATU并且后面两次使用HBTU重复了3次；仅在LL-37(15-19)内对于残基Lys25、Asp26、Pro33和Arg34进行双偶联。通过三氟乙酸/水(95/5,v/v)(3小时)从树脂上裂解两种LL-37片段。按所述，使用Nucleosil 100 C18(250mm x 8mm；粒径，7μm)柱进行它们的RP-HPLC纯化。通过MALDI-TOF MS验证肽纯度(包括商业获得的LL-37、scrLL-37和FAM-LL-37的纯度)。在LL-37(1-14)的情况下：发现为MH+，1638.3(计算为1638.9)；在LL-37(15-37)的情况下，发现为MH+，2873.9(计算为2873.6)。LL-37(1-14)和LL-37(15-37)的储液是在HFIP(4℃)中制成的，它们的浓度由它们的重量测定，并通过BCA测定法确认。

硫磺素T(ThT)结合测定

使用硫磺素T(ThT)结合测定使用先前建立的方案研究了LL-37和其它肽对IAPP原纤维形成动力学的影响。简而言之，将单独的IAPP(16.5μM)及其与LL-37和其他肽的混合物以指定的摩尔比(20℃)(非搅拌条件)在ThT测定缓冲液(50mM磷酸钠水溶液缓冲液，pH7.4，含有100mM NaCl和0.5％HFIP)中孵育。值得注意的是，还包括单独的LL-37的孵育。在指定的时间点，将等分试样与由20μM ThT在0.05M甘氨酸/NaOH(pH 8.5)中组成的ThT溶液混合，并通过使用Multilabel reader VictorX3(Perkin Elmer Life Sciences)在450nm激发时测量486nm处的荧光发射来测定结合。为了研究LL-37对IAPP原纤维形成成核的影响，即用预先形成的IAPP原纤维(fIAPP)(10％)接种后，进行IAPP(16.5μM)及其与LL-37(1/1)的混合物的如上在室温下的孵育。将基于ThT结合和TEM的主要由IAPP原纤维(fIAPP)组成的溶液的等分试样(图18-19)(如上制备的7天老化的IAPP(16.5μM))添加到孵育中，产生最终种子(fIAPP)浓度为1.65μM。包括单独的(未接种的)IAPP(16.5μM)和单独的10％fIAPP的孵育作为对照。在如上所示的时间点测定ThT结合。为了研究LL-37处理的IAPP原纤维(LL-37处理的fIAPP)对IAPP原纤维形成动力学的影响，并与fIAPP的接种效果相比较，主要由fIAPP(16.5μM fIAPP，7天老化；见上文)组成的溶液的等分试样)加到固体LL-37(10倍摩尔过量)中，并将混合物孵育24小时，得到“LL-37处理的fIAPP”(图3b)。值得注意的是，LL-37与fIAPP的结合通过斑点印迹(DB)测定得到证实(图2b和未显示的数据)；此外，还应用DB测定来确认在用于接种测定的fIAPP和LL-37处理的fIAPP的等分试样中存在相同量的fIAPP(数据未显示)。含有fIAPP的溶液的等分试样(以与LL-37处理的等分试样相同的方式处理，但不含LL-37)用于确定fIAPP的接种效果。在ThT测定缓冲液中制备含有单独的(未接种的)IAPP(16.5μM)、用fIAPP(10％)接种的IAPP和用LL-37处理的fIAPP(10％)接种的IAPP的溶液，并通过如上所述的ThT结合测定法测定原纤维形成的动力学。

通过MTT还原测定评估细胞损伤

使用如先前所述的用于ThT结合测定的肽溶液在大鼠胰岛素瘤细胞系RIN5fm中研究了LL-37和其他肽对β细胞破坏性IAPP组装体形成的影响。简而言之，按所述培养RIN5fm细胞并接种在96孔板中。如“ThT结合测定”中所述，单独的IAPP及其与肽的混合物的溶液在ThT测定缓冲液中老化。在指定的孵育时间点(24小时或7天)，用细胞培养基稀释等分试样并添加到细胞中。在与细胞孵育约20小时(37℃，含有5％CO2的潮湿气氛)后，通过MTT还原测定验证细胞损伤。为了测定LL-37对细胞毒性IAPP聚集体形成的抑制作用的IC50，将24小时老化的单独的IAPP(100nM)及其与不同量LL-37的混合物(根据ThT结合测定制备)加入细胞并通过上述MTT还原测定法测定细胞活力。

透射电子显微镜(TEM)

在指定的时间点，在碳涂层网格上施加10μl等分试样的用于ThT结合和MTT测定的溶液制备TEM样品。使用ddH2O洗涤网格并用2％(w/v)醋酸铀酰水溶液染色。用JEOL1400Plus电子显微镜在120kV下对网格进行检查。

Far-UV CD光谱

使用Jasco 715分光偏振计进行Far-UV CD研究。在室温下在195至250nm以0.1nm的间隔记录光谱，响应时间为1秒。每个光谱是3个光谱的平均值。所有CD研究均在室温下在含有1％HFIP的10mM磷酸钠水溶液(pH 7.4)(CD测定缓冲液)中进行；该测定系统已较早开发并发现适用于单独或在抑制剂存在下错误折叠成β折叠和淀粉样蛋白原纤维的IAPP(5μM)的动力学。简而言之，HFIP中的肽储备是新鲜制备的(4℃)，用透明小容器中指定浓度的测定缓冲液(室温)稀释，轻轻混合后，立即或在指定的孵育时间点测量光谱。对于解决LL-37或scrLL-37与IAPP之间相互作用的研究，在(HFIP)(4℃)中制备肽混合物(1/1)并用透明小容器中指定浓度(各5μM)的测定缓冲液稀释(室温)；如上测量CD光谱。值得注意的是，还平行进行对单独的IAPP和单独的LL-37或scrLL-37(来自相同储液；5μM)的CD研究。在轻轻混合以重新溶解沉淀的聚集体后测量IAPP在24小时(终点)的孵育时间点的CD光谱。总是从肽溶液的CD光谱中减去缓冲液的CD光谱。

荧光光谱滴定

使用JASCO FP-6500荧光分光光度计使用先前描述的实验方案进行荧光光谱滴定研究。简而言之，在492nm激发，并记录在500至600nm的发射光谱。通过用各种量的每种肽滴定合成的Nα-氨基末端荧光素标记的IAPP(5nM)定量IAPP与LL-37及其片段LL-37(1-14)和LL-37(15-37)相互作用的表观(app.)Kd。对于所有实验，都使用了在HFIP中新鲜制备的肽及其荧光标记的类似物的储液。在室温下溶液制备后的2-5分钟内，在含有1％HFIP的10mM磷酸钠缓冲液(pH 7.4)中进行测量。值得注意的是，在这些条件下，新鲜制备的Fluos-IAPP(5nM)溶液主要由单体组成。使用如前所述的1/1结合模型计算app.Kd，并且是三个结合曲线的平均值(±SD)。

交联、NuPAGE和蛋白质印迹分析

使用先前开发的测定系统进行交联研究。简而言之，在含水磷酸钠缓冲液pH 7.4中制备单独的IAPP(30μM)及其与LL-37或scrLL-37以指定摩尔比(IAPP/LL-37为1/1或1/0.1)的混合物的溶液，室温孵育30min；值得注意的是，也进行了单独的LL-37的孵育(浓度与其与IAPP的混合物中的浓度相同)。溶液使用25％戊二醛水溶液(Sigma-Aldrich)交联，10％三氯乙酸水溶液(TCA)用于沉淀交联肽。将沉淀溶解在还原NuPAGE样品缓冲液中，煮沸5分钟，然后在具有MES运行缓冲液(Invitrogen)的4-12％Bis-Tris凝胶中进行NuPAGE电泳。在所有泳道中加载相同体积的每种溶液(相同的IAPP量)。使用XCell II Blot Module印迹系统(Invitrogen)印迹肽。IAPP或LL-37分别使用多克隆兔抗IAPP抗体(Peninsula)或单克隆小鼠抗LL-37抗体(Santa Cruz Biotechnology)与合适的过氧化物酶(POD)偶联二抗(Pierce&Amersham)和Super Signal West Dura Extended Duration Substrate(Pierce)分别组合。值得注意的是，先前的研究为交联测定的特异性提供了证据；此外，在IAPP-scrLL-37(1/1)混合物中未观察到新条带(数据未显示)。

斑点印迹分析

将含有IAPP单体或IAPP原纤维(fIAPP)的溶液(不同量，多达40μg)点样到硝酸纤维素膜上。这些溶液是通过将IAPP溶液(1mg/ml)在ThT测定缓冲液中孵育0小时(“单体”)或24小时(“原纤维”)来制备的；ThT结合和TEM证实了原纤维的存在(未显示)。用TBSn(20mMTris/HCl、150mM NaCl和0.05％Tween-20)洗涤膜，在10℃下用5％牛奶的TBSn溶液封闭过夜，然后再次用TBSn洗涤。然后，将膜与N端荧光素标记的LL-37(来自AnaSpec的FAM-LL-37；参见“肽和肽合成”下的内容)(200nM)在含有1％HFIP的ThT测定缓冲液中在10℃下孵育过夜。用孵育缓冲液和TBSn洗涤后，用LAS-4000mini仪器(Fujifilm)观察结合的FAM-LL-37。值得注意的是，还点样了胰高血糖素原纤维以作为观察到的FAM-LL-37与fIAPP的强结合的特异性的对照(未显示)。通过在10mM HCl(2μg/μl)中孵育胰高血糖素(10天)，然后用10mMNaOH中和来制备胰高血糖素原纤维；ThT结合和TEM证实了原纤维的形成(未显示)。还点样了单独的ThT缓冲液以作为NSB的对照。此外，为了作为原纤维自发荧光的干扰的对照，每次测定都包括已在不含FAM-LL-37单独的缓冲液中孵育的含有点样了fIAPP的膜。一般而言，fIAPP自发荧光占与FAM-LL-37结合的fIAPP中观察到的荧光总量的25％。

使用肽阵列测定LL-37结合位点

使用逐步SPOT合成方案和MultiPep RSi(Intavis)肽合成仪在修饰的纤维素膜支持物上合成由覆盖全长LL-37序列和位置偏移一个残基的LL-37十聚体组成的肽阵列。此后，根据制造商的说明将肽固定在载玻片上，然后使用TBSn中的1％BSA进行封闭步骤4小时(室温)。将带有肽阵列的载玻片与Fluos-IAPP溶液(1μM，在含有1％BSA的TBSn中)在10℃下孵育约12小时，然后用TBSn洗涤。使用LAS-4000mini仪器(Fujifilm)观察结合的Fluos-IAPP。

使用LALIGN进行序列比对

IAPP和LL-37的序列比对使用程序LALIGN(作者：Bill Pearson；https://embnet.vital-it.ch/software/LALIGN_form.html)完成。值得注意的是，该程序以前用于互相比较Aβ和IAPP序列。使用带有3个报告的子比对的全局比对方法；E值阈值设置为10.0，使用的评分矩阵为BLOSUM50，开放空位罚分设置为-12，扩展空位罚分设置为-2(默认值)。LALIGN程序实现了Huang和Miller的算法。

本发明的上述描述是说明性的，而不是限制性的。因此应当理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可以对上述实施方案进行各种添加、替换和修改。因此，本发明的范围应参照所附权利要求书来解释。

序列表

<110> 斯坦福大学托管董事会

<120> 通过上调人组织蛋白酶抑制素LL-37以抑制胰岛淀粉样蛋白多肽（IAPP）自组装来预防或治疗胰腺功能障碍或糖尿病的方法

<130> S31-07148.PCT

<150> 62/967,023

<151> 2020-01-28

<160> 35

<170> PatentIn version 3.5

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 19

Lys Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val

1 5 10

<210> 20

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<400> 20

Ile Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln

1 5 10

<210> 21

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<400> 21

Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg

1 5 10

<210> 22

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<400> 22

Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile

1 5 10

<210> 23

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<400> 23

Glu Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys

1 5 10

<210> 24

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<400> 24

Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp

1 5 10

<210> 25

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<400> 25

Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe

1 5 10

<210> 26

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<400> 26

Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu

1 5 10

<210> 27

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<400> 27

Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg

1 5 10

<210> 28

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<400> 28

Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn

1 5 10

<210> 29

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<400> 29

Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu

1 5 10

<210> 30

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<400> 30

Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val

1 5 10

<210> 31

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<400> 31

Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro

1 5 10

<210> 32

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<400> 32

Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg

1 5 10

<210> 33

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<400> 33

Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr

1 5 10

<210> 34

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<400> 34

Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Glu

1 5 10

<210> 35

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<400> 35

Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Glu Ser

1 5 10

Claims (87)

1.一种治疗2型糖尿病(T2D)的方法，该方法包括：

将受试者诊断为患有T2D或糖尿病前期；

通过定量成像体内葡萄糖代谢来监测受试者胰腺中至少一个胰岛对葡萄糖刺激的反应；

建立至少一个胰岛对葡萄糖刺激的反应的目标范围；并且

上调受试者中组织蛋白酶抑制素基因表达，直到监测到的对葡萄糖刺激的反应在目标范围内。

2.根据权利要求1所述的方法，其中监测对葡萄糖刺激的反应包括实时测定至少一个胰岛对葡萄糖刺激的反应。

3.根据权利要求1所述的方法，其中监测对葡萄糖刺激的反应包括定量成像来自体内单个胰岛的实时葡萄糖代谢。

4.根据权利要求1所述的方法，其中监测对葡萄糖刺激的反应包括利用固有的自发荧光与多光子激发显微镜相结合。

5.根据权利要求1所述的方法，其中监测对葡萄糖刺激的反应包括定量成像体内葡萄糖代谢以重复测量至少一个胰岛对葡萄糖刺激的反应。

6.根据权利要求1所述的方法，其中监测对葡萄糖刺激的反应还包括监测选自胰岛功能、增殖、脉管系统和巨噬细胞浸润的至少一个参数。

7.根据权利要求1所述的方法，其中定量成像葡萄糖代谢包括NAD(P)H成像。

8.根据权利要求7所述的方法，其中监测对葡萄糖刺激的反应包括直接测量葡萄糖代谢。

9.根据权利要求8所述的方法，该方法进一步包括：

将自体荧光信号与下游葡萄糖刺激事件相关联。

10.根据权利要求7所述的方法，其中NAD(P)H成像使用NAD(P)H和细胞内Ca²⁺之间的相互依赖性来测量胰腺β细胞功能。

11.根据权利要求7所述的方法，该方法进一步包括：

通过定量细胞NAD(P)H来监测氧化还原状态和线粒体功能。

12.根据权利要求7所述的方法，该方法进一步包括：

测量细胞质和线粒体NAD(P)H变化以解析糖酵解和氧化代谢的时空分配。

13.根据权利要求1所述的方法，其中定量成像体内葡萄糖代谢包括使用β-淀粉样蛋白成像探针。

14.根据权利要求13所述的方法，其中β-淀粉样蛋白成像探针靶向胰淀素。

15.根据权利要求13所述的方法，其中β-淀粉样蛋白成像探针靶向至少一种与胰岛淀粉样蛋白沉积物相关的物质。

16.根据权利要求13所述的方法，其中β-淀粉样蛋白成像探针表现出对Aβ聚集体的结合亲和力。

17.根据权利要求13所述的方法，其中β-淀粉样蛋白成像探针选自IPBF、PQ-6、FPYBF-1、IMPY和AV-45。

18.根据权利要求17所述的方法，其中β-淀粉样蛋白成像探针为[¹²⁵I]IPBF。

19.根据权利要求1所述的方法，其中监测至少一个胰岛对葡萄糖刺激的反应包括组合使用正电子发射断层扫描(PET)与淀粉样蛋白成像探针。

20.根据权利要求19所述的方法，其中淀粉样蛋白成像探针是¹⁸F标记的放射性药物。

21.根据权利要求20所述的方法，其中淀粉样蛋白成像探针是florbetapir。

22.根据权利要求1所述的方法，该方法包括：

将受试者诊断为患有T2D。

23.根据权利要求1所述的方法，该方法包括：

将受试者诊断为糖尿病前期。

24.根据权利要求1所述的方法，该方法包括：

通过上调受试者中组织蛋白酶抑制素基因表达来预防T2D。

25.根据权利要求1所述的方法，其中基于选自空腹血浆葡萄糖(FPG)测试、口服葡萄糖耐量测试(OGTT)和随机血浆葡萄糖测试的测试将受试者诊断为糖尿病前期。

26.根据权利要求1所述的方法，其中上调受试者中组织蛋白酶抑制素基因表达包括向受试者施用上调组织蛋白酶抑制素基因表达的药学上可接受的组合物。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述药学上可接受的组合物包括至少四种材料的混合物，所述材料选自苯丁酸、蓓沙罗汀、姜黄素、白藜芦醇、视黄醇、β-胡萝卜素、胆钙化醇、脂肪酸及其药学上可接受的盐。

28.根据权利要求27所述的方法，其中施用来上调受试者中CAMP基因表达的所述混合物包括至少四种材料，所述材料选自苯丁酸、蓓沙罗汀、姜黄素、白藜芦醇、视黄醇、β-胡萝卜素、胆钙化醇、二十二碳六烯酸、辛酸、癸酸、月桂酸及其药学上可接受的盐。

29.根据权利要求27所述的方法，其中所述混合物包括至少三种材料，所述材料选自苯丁酸、蓓沙罗汀、姜黄素、白藜芦醇、视黄醇、β-胡萝卜素、胆钙化醇及其药学上可接受的盐。

30.根据权利要求27所述的方法，其中所述混合物包括至少五种材料，所述材料选自苯丁酸、蓓沙罗汀、姜黄素、白藜芦醇、视黄醇、β-胡萝卜素、胆钙化醇、脂肪酸及其药学上可接受的盐。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述混合物包括至少四种材料，所述材料选自苯丁酸、蓓沙罗汀、姜黄素、白藜芦醇、视黄醇、β-胡萝卜素、胆钙化醇及其药学上可接受的盐。

32.根据权利要求27所述的方法，其中所述混合物包括至少五种材料，所述材料选自苯丁酸、蓓沙罗汀、姜黄素、白藜芦醇、视黄醇、β-胡萝卜素、胆钙化醇、二十二碳六烯酸、辛酸、癸酸、月桂酸及其药学上可接受的盐。

33.根据权利要求27所述的方法，其中所述混合物包括至少六种材料，所述材料选自苯丁酸、蓓沙罗汀、姜黄素、白藜芦醇、视黄醇、β-胡萝卜素、胆钙化醇、脂肪酸及其药学上可接受的盐。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述混合物包括至少五种材料，所述材料选自苯丁酸、蓓沙罗汀、姜黄素、白藜芦醇、视黄醇、β-胡萝卜素、胆钙化醇及其药学上可接受的盐。

35.根据权利要求27所述的方法，其中所述混合物包括至少六种材料，所述材料选自苯丁酸、蓓沙罗汀、姜黄素、白藜芦醇、视黄醇、β-胡萝卜素、胆钙化醇、二十二碳六烯酸、辛酸、癸酸、月桂酸及其药学上可接受的盐。

36.根据权利要求27所述的方法，其中所述药学上可接受的组合物包括苯丁酸、姜黄素、蓓沙罗汀、胆钙化醇、白藜芦醇和二十二碳六烯酸。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述药学上可接受的组合物包含椰子油或液体MCT(中链甘油三酯)油。

38.根据权利要求27所述的方法，其中所述混合物溶解在疏水液体介质中。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述疏水液体介质是油。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述油是椰子油。

41.根据权利要求27所述的方法，其中药学上可接受的组合物包含卡介苗(BCG)疫苗。

42.根据权利要求1所述的方法，其中受试者是人受试者。

43.根据权利要求1所述的方法，其中上调受试者中组织蛋白酶抑制素基因表达是全身发生的。

44.根据权利要求1所述的方法，其中上调受试者中组织蛋白酶抑制素基因表达包括向受试者施用卡介苗(BCG)疫苗。

45.一种治疗受试者的方法，该方法包括：

监测受试者血液中组织蛋白酶抑制素肽LL-37和受试者胰腺组织中IAPP淀粉样蛋白的水平；并且

当检测到条件L/B<k时，其中L是检测到的LL-37的水平，B是检测到的IAPP的水平，并且k是预定阈值，则上调受试者中组织蛋白酶抑制素基因表达。

46.根据权利要求45所述的方法，其中上调受试者胰腺组织中组织蛋白酶抑制素基因表达包括向受试者施用药学上可接受的组合物，其中所述药学上可接受的组合物包括至少四种材料的混合物，所述材料选自苯丁酸、蓓沙罗汀、姜黄素、白藜芦醇、视黄醇、β-胡萝卜素、胆钙化醇、脂肪酸及其药学上可接受的盐。

47.根据权利要求45所述的方法，其中所述混合物包括至少四种材料，所述材料选自苯丁酸、蓓沙罗汀、姜黄素、白藜芦醇、视黄醇、β-胡萝卜素、胆钙化醇、二十二碳六烯酸、辛酸、癸酸、月桂酸及其药学上可接受的盐。

48.根据权利要求46所述的方法，其中所述混合物包括至少三种材料，所述材料选自苯丁酸、蓓沙罗汀、姜黄素、白藜芦醇、视黄醇、β-胡萝卜素、胆钙化醇及其药学上可接受的盐。

49.根据权利要求46所述的方法，其中所述混合物包括至少五种材料，所述材料选自苯丁酸、蓓沙罗汀、姜黄素、白藜芦醇、视黄醇、β-胡萝卜素、胆钙化醇、脂肪酸及其药学上可接受的盐。

50.根据权利要求49所述的方法，其中所述混合物包括至少四种材料，所述材料选自苯丁酸、蓓沙罗汀、姜黄素、白藜芦醇、视黄醇、β-胡萝卜素、胆钙化醇及其药学上可接受的盐。

51.根据权利要求46所述的方法，其中所述混合物包括至少五种材料，所述材料选自苯丁酸、蓓沙罗汀、姜黄素、白藜芦醇、视黄醇、β-胡萝卜素、胆钙化醇、二十二碳六烯酸、辛酸、癸酸、月桂酸及其药学上可接受的盐。

52.根据权利要求46所述的方法，其中所述混合物包括至少六种材料，所述材料选自苯丁酸、蓓沙罗汀、姜黄素、白藜芦醇、视黄醇、β-胡萝卜素、胆钙化醇、脂肪酸及其药学上可接受的盐。

53.根据权利要求52所述的方法，其中所述混合物包括至少五种材料，所述材料选自苯丁酸、蓓沙罗汀、姜黄素、白藜芦醇、视黄醇、β-胡萝卜素、胆钙化醇及其药学上可接受的盐。

54.根据权利要求46所述的方法，其中所述混合物包括至少六种材料，所述材料选自苯丁酸、蓓沙罗汀、姜黄素、白藜芦醇、视黄醇、β-胡萝卜素、胆钙化醇、二十二碳六烯酸、辛酸、癸酸、月桂酸及其药学上可接受的盐。

55.根据权利要求46所述的方法，其中所述药学上可接受的组合物包括苯丁酸、姜黄素、蓓沙罗汀、胆钙化醇、白藜芦醇或β-胡萝卜素和二十二碳六烯酸。

56.根据权利要求55所述的方法，其中所述药学上可接受的组合物包含椰子油或液体MCT(中链甘油三酯)油。

57.根据权利要求46所述的方法，其中所述混合物溶解在疏水液体介质中。

58.根据权利要求57所述的方法，其中所述疏水液体介质是油。

59.根据权利要求58所述的方法，其中所述油是椰子油。

60.根据权利要求45所述的方法，其中上调受试者胰腺组织中组织蛋白酶抑制素基因表达包括向受试者施用药学上可接受的组合物，其中所述药学上可接受的组合物包含卡介苗(BCG)疫苗。

61.根据权利要求45所述的方法，其中监测受试者胰腺组织中IAPP淀粉样蛋白包括测定胰腺组织中至少一个胰岛对葡萄糖刺激的反应。

62.根据权利要求45所述的方法，其中监测受试者胰腺组织中IAPP淀粉样蛋白包括定量成像来自体内单个胰岛的实时葡萄糖代谢。

63.根据权利要求45所述的方法，其中监测受试者胰腺组织中IAPP淀粉样蛋白包括利用固有的自发荧光与多光子激发显微镜相结合。

64.根据权利要求45所述的方法，其中监测受试者胰腺组织中IAPP淀粉样蛋白包括定量成像体内葡萄糖代谢以重复测量至少一个胰岛对葡萄糖刺激的反应。

65.根据权利要求45所述的方法，该方法进一步包括监测选自胰岛功能、增殖、脉管系统和巨噬细胞浸润的至少一个参数。

66.根据权利要求45所述的方法，其中监测受试者胰腺组织中IAPP淀粉样蛋白包括通过使用NAD(P)H成像定量成像葡萄糖代谢。

67.根据权利要求66所述的方法，该方法进一步包括直接测量葡萄糖代谢。

68.根据权利要求67所述的方法，该方法进一步包括：

将自体荧光信号与下游葡萄糖刺激事件相关联。

69.根据权利要求66所述的方法，其中NAD(P)H成像使用NAD(P)H和细胞内Ca²⁺之间的相互依赖性来测量胰腺β细胞功能。

70.根据权利要求66所述的方法，该方法进一步包括：

通过定量细胞NAD(P)H来监测氧化还原状态和线粒体功能。

71.根据权利要求66所述的方法，该方法进一步包括：

测量细胞质和线粒体NAD(P)H变化以解析糖酵解和氧化代谢的时空分配。

72.根据权利要求45所述的方法，其中监测受试者胰腺组织中IAPP淀粉样蛋白包括使用β-淀粉样蛋白成像探针。

73.根据权利要求72所述的方法，其中β-淀粉样蛋白成像探针靶向胰淀素。

74.根据权利要求72所述的方法，其中β-淀粉样蛋白成像探针靶向至少一种与胰岛淀粉样蛋白沉积物相关的物质。

75.根据权利要求72所述的方法，其中β-淀粉样蛋白成像探针表现出对Aβ聚集体的结合亲和力。

76.根据权利要求72所述的方法，其中β-淀粉样蛋白成像探针选自IPBF、PQ-6、FPYBF-1、IMPY和AV-45。

77.根据权利要求76所述的方法，其中β-淀粉样蛋白成像探针为[¹²⁵I]IPBF。

78.根据权利要求45所述的方法，其中监测受试者胰腺组织中IAPP淀粉样蛋白包括组合使用正电子发射断层扫描(PET)与淀粉样蛋白成像探针。

79.根据权利要求78所述的方法，其中淀粉样蛋白成像探针是¹⁸F标记的放射性药物。

80.根据权利要求78所述的方法，其中淀粉样蛋白成像探针是florbetapir。

81.一种治疗受试者的2型糖尿病(T2D)的方法，该方法包括：

将受试者诊断为患有T2D；并且

向受试者施用包含LL-37的肽模拟物或其一部分的药学上可接受的组合物。

82.根据权利要求81所述的方法，其中肽模拟物包括通过连接部分连接的第一片段和第二片段。

83.根据权利要求82所述的方法，其中第一片段是LL-37的N端序列LL-37(1-15)的模拟物。

84.根据权利要求82所述的方法，其中第一片段是LL-37在N端的LL-37(6-10)或FRKSK的模拟物。

85.根据权利要求82所述的方法，其中第二片段是LL-37的C端序列LL-37(18-34)的模拟物。

86.根据权利要求82所述的方法，其中第二片段是LL-37的C端部分内的LL-37(25-27)或KDF区域的模拟物。

87.根据权利要求82所述的方法，其中连接部分选自低聚-N-甲氧基乙基甘氨酸和低聚-Nmeg。

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