KR20100046266A - 섬 세포의 기능을 보존하고 아폽토시스를 방지하는 ｅＩＦ-5Ａ1 ｓｉＲＮＡ의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 후속 이식을 위해 공여자로 기관으로부터 분리되는 섬의 생존능, 회복 및 기능을 개선시키는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 섬의 생존능 및 기능을 증가시키기 위한 eIF-5A1 siRNA의 용도에 관한 것이다.

Description

섬 세포의 기능을 보존하고 아폽토시스를 방지하는 ｅＩＦ-5Ａ1 ｓｉＲＮＡ의 용도{Use of eIF-5A1 siRNA to protect islets cells from apoptosis and to preserve their functionality}

본 발명은 섬 세포의 기능을 보존하고 아폽토시스를 방지하는 eIF-5A1 siRNA의 용도에 관한 것이다.

랑게르한스 섬은 췌장 내에서 인슐린을 생성하는 세포를 포함하는 조직이다. 보통 인간은 약 100만개의 섬을 지니고 있고 췌장 내의 총 세포 중 약 2 내지 3%는 섬 세포이다. 췌장은 랑게르한스 섬을 포함하며 이 곳의 베타 세포에서 인슐린을 생성한다. 베타 세포는 혈액 내의 포도당 수준을 모니터링하며 포도당 피크에 대응하여 매우 정교하게 측정된 양의 인슐린을 분비한다. Ⅰ형 및 Ⅱ형 당뇨병은 90 퍼센트 이상의 베타 세포가 손상을 입었을 때 진전된다.

Ⅰ형 당뇨병은 포도당의 항상성에 문제를 야기하며 미국 내에는 2100만 명의 당뇨병 환자중 10%의 환자가 이에 해당된다. Ⅰ형 당뇨병은 췌장 베타 섬 세포의 자가면역 파괴로부터 야기된다. 환자의 생존은 인슐린의 투여를 통해 의존된다. Ⅰ형 당뇨병의 병태 생리는 세포의 면역 시스템과 베타 세포에 존재하는 항원 사이에 상호작용으로 발생한다. 이에 따라 ThI 세포의 활성화와 마크로파지의 활성화를 야기시키며 이에 따라 다른 사이토카인(ILl β, TNFα및 IFNγ)의 분비를 야기시킨다. 이는 일산화질소의 생성을 유발한다. 또한 이러한 일산화질소는 베타 섬 세포의 괴사와 아폽토시스 모두를 촉진한다. 베타 세포를 교환시키는 췌장과 관련된 치료법 또는 섬 이식 등의 방법이 Ⅰ형 당뇨병의 성공적인 치료를 위해 적용되어 왔으나 이는 사체 공여자와 같은 제한된 공급원을 요구할 뿐만 아니라 자가면역 반응에 의한 파괴를 해결해야 하는 문제점이 있다.

연결 매트릭스로부터 섬을 분리 또는 단리시켜 분비조직을 잔존시키는 것은 실험 및 이식을 위해 매우 중요한 것이다. 섬 이식은 유망하고 Ⅰ형 당뇨병 치료를 위한 최소한의 생리학적 외과 시술 절차이다. 췌장 조직 전체 보다 섬을 이식하는 것이 이식의 편이성 면에서 월등히 우수하고 공여자 조직에 관련된 소화 효소 분비 기능을 제외할 수 있는 장점이 있다. 췌장 분비 조직으로부터 섬을 유리시키는 것이 섬 이식의 가장 기초적이고 중요한 단계이다. 섬 분리의 중요한 목적은 섬 이식을 통해 생존 기능을 충분히 제공하는 것이다.

"Edmonton Protocol"은 당뇨병 환자에게 건강한 섬을 이식하는 방법이다. 섬 이식은 Shapiro, Ryan, and Lakey, Clinical Islet Transplantation-State of the Art, Transplantation Proceedings, 33, pp. 3502-3503 (2001); Ryan et al., Clinical Outcomes and Insulin Secretion After Islet Transplantation With the Edmonton Protocol, Diabetes, Vol. 50, April 2001, pp. 710-719; 및 Ryan elal., Continued Insulin Reserve Provides Long-Term Glycemic Control, Diabetes, Vol. 51, July 2002, pp. 2148- 2157에 기술되어 있다. 간세포의 경우에는 세포가 혈액 공급을 증가시키고 인슐린 생성을 시작할 수 있다. Edmonton Protocol은 그 채택된 방법에 따라 7 내지 10개의 단계를 포함하고 있다. 첫 번째 단계는 리버라제와 같은 특이한 효소를 공여자 췌장에 주입시키는 것을 포함한다. 이 효소는 췌장 조직을 분해시키나 섬을 분해하지는 않는다. 이와 같은 분해 단계 이후에 몇 가지 연이은 단계를 통해 췌장 내의 다른 세포로부터 섬을 분리한다. 분리된 섬은 문맥으로 알려진 간의 주요 혈관을 통해 이식된다. 이에 따라 새로운 혈관과 조직을 생성시킨다. 따라서 섬이 간 속에 이식되었을 때 섬을 지지할 수 있는 새로운 혈관이 형성되는 것으로 여겨진다. 세포에서 생성된 인슐린은 근처의 혈관을 통해 흡수되고 인체 내에 분포되어 혈액 내의 포도당 함량을 조절하게 된다.

Edmonton Protocol의 단계는 섬의 생존을 위한 중요한 과정을 창출하는 것이지만 이는 파괴되기 쉽고 그 삼차원 구조의 유지 및 성장과 생존을 위해 많은 양의 산소를 요구한다. 이 과정 동안에 섬은 손상되거나 파괴될 수 있으며 이는 산소 전달에 최적 조건이 이루어지지 않기 때문이다. 또한 이는 공여자의 췌장으로부터 생성되는 건강한 섬의 생존에 영향을 미칠 수 있다. 더욱이 섬 이식은 공여자의 이용가능성에 의해 제한되며 종종 두 개의 췌장이 하나의 환자의 인슐린 분비를 위해 독립적으로 요구되기도 한다.

섬 이식은 또한 스테로이드-유리, 비-당뇨유발성 면역억제 치료를 요구하면서 Ⅰ형 당뇨병 환자의 치료에 사용된다. 그러나 이와 같은 치료는 고지혈증 및 고혈압과 같은 위험성을 증가시키며 장기간의 연구는 섬의 생존이 손상되고 있음을 나타낸다.

인간에 섬 이식을 위한 Edmonton protocol은 단기간으로는 성공적이며 이는 이식 후 1년 후에 80%의 개체가 인슐린 비의존성을 실현할 수 있기 때문이다. 그러나 5년 후에는 오직 약 10 내지 15%로 인슐린 비의존성이 감소된다. 이와 같은 점차적인 손실의 원인은 명확하지 않으나 사이토카인 매개된 염증 반응의 유발로부터 섬이 소실되는 것으로 여겨진다. 그러나 섬 이식은 Ⅰ형 당뇨병 환자를 위한 생존 치료 방법으로 계속 사용되고 있으며 장기적으로는 인슐린 비의존성의 실패를 감안한다 하여도 아직까지는 유효한 치료방법이다. 이는 혈당 의존의 감소, 저혈당의 낮은 발생 및 인슐린 용량의 감소와 같은 중요한 이점이 있기 때문이다.

섬 이식 후 첫 번째 날은 이식된 섬이 매우 취약한 기간이다. 최대 60%의 이식된 섬이 이식 후 1일 이내에 비-자가항원-특이성 아폽토시스를 경험하게 된다. 이와 같은 초기 파괴는 섬의 생존을 통한 당뇨병의 치료를 위해 2 내지 3개의 공여자를 요구하는 중요한 요인이다. IL- lβ, TNFα 및 IFNγ와 같은 염증 사이토카인의 국소적 생성이 섬 이식 후 초기 아폽토시스를 매개한다. 따라서 초기 이식 기간에 사이토카인의 생성을 제한하는 전략이 섬 이식에 필요한 공여자의 숫자를 제한할 뿐만 아니라 서의 생존능력을 향상시켜 장기간 그 기능을 유지할 수 있게 하는 것이다. 본 발명은 이러한 전략을 제공하는 것이다.

따라서 본 발명이 해결하려는 과제는 초기 이식 기간에 사이토카인의 생성을 제한하는 전략이 섬 이식에 필요한 공여자의 숫자를 제한할 뿐만 아니라 서의 생존능력을 향상시켜 장기간 그 기능을 유지할 수 있게 하는 것이다. 본 발명은 이러한 전략을 제공하는 것이다.

본 발명은 분리된 섬 세포의 기능을 보존하는 방법을 제공하는 것으로 섬 분리 이전에 섬 세포 공여자에게 eIF-5Al siRNA를 섬 세포에 투여하는 단계를 포함하며 이 때 eIF-5Al siRNA는 섬 세포 내에서 eIF-5Al의 발현을 저해시키고 이에 따라 섬 세포의 아폽토시스를 저해하며 채취된 섬 세포의 기능을 보존하게 된다.

바람직한 실시태양에서 siRNA 목표는 eIF-5Al의 하기 염기 서열; 5'-AAAGGAATGACTTCCAGCTGA-3'; 5'- AAGATCGTCGAGATGTCTACT-3'; 5'-AAGGTCCATCTGGTTGGTATT-3'; 또는 5'- AAGCTGGACTCCTCCTACACA-3'을 지닌다. 또한 또 다른 실시태양에서 siRNA 목표는 eIF-5Al의 하기 염기 서열; 5'-AAAGGAAUGACUUCCAGCTGAdTdT-3'을 지닌다. siRNA는 적당한 수단을 통해 공여자에게 투여되며 바람직한 실시태양에서 siRNA는 복강내 투여를 통해 공여자의 섬 세포에 투여된다.

본 발명의 또 다른 실시태양은 섬 분리 이전에 섬 세포 공여자에게 복강내 투여를 통해 섬 세포 공여자에게 eIF-5Al siRNA를 투여하는 과정을 포함하는 공여자 채취 방법 기간 내에 섬 세포를 아폽토시스로부터 저해하는 방법을 제공하는 것이다. 이 때 eIF-5Al siRNA는 섬 세포 내의 eIF-5Al의 발현을 저해시키고 섬 세포의 아폽토시스를 저해한다.

바람직한 실시태양에서 siRNA 목표는 하기 염기서열을 지닌 elF- 5Al의 일부인; 5'-AAAGGAATGACTTCCAGCTGA-3'; 5'-AAGATCGTCGAGATGTCTACT-3'; 5'- AAGGTCCATCTGGTTGGTATT-3'; 또는 5'-AAGCTGGACTCCTCCTACACA-3' 이다. 또한 siRNA 목표는 하기 염기서열을 지닌 elF-5Al의 일부인; 5'- AAAGGAAUGACUUCCAGCTGAdTdT-3' 이다.

섬 세포 내의 eIF-5Al의 발현을 저해할 수 있는 컨스트럭트라면 어떠한 siRNA 또는 안티센스 컨스트럭트가 사용될 수 있다. siRNA의 투여 경로는 어떠한 방법이든지 가능하다. 예시적인 투여 방법은 공여자 섬 세포의 문맥을 통한 주입을 포함한다. 또한 공여자 섬 세포의 문맥을 통한 유체동력학적 주입과 복강내 주입을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 eIF-5Al siRNA를 포함하는 섬 세포 내의 아폽토시스를 저해하고 섬 세포의 기능을 보존할 수 있는 조성물을 제공하는 것이다. 이 때 siRNA는 eIF-5Al의 발현을 저해하고 이에 따라 섬 세포의 아폽토시스가 저해된다. 바람직한 eIF-5Al siRNAs는 이미 기술하였다.

본 발명의 또 다른 목적은 mRNA 코드화 목표 단백질에 siRNA 컨스트럭트를 접촉시킨 후 베타 세포를 채취하여 베타 세포를 투여하는 방법을 포함하는 섬 베타 세포 내의 목표 단백질의 발현을 저해시키는 방법을 제공하는 것이다. 이 때 siRNA는 베타 섬 세포 내에서 목표 단백질의 발현을 저해한다.

본 발명의 또 다른 목적은 유도될 수 있는 일산화질소 신타제(iNOS) 경로를 통해 일산화질소(NO)의 생성을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다. 이에 따라 eIF-FA의 발현이 감소된다.

본 발명의 또 다른 목적은 iNOS 경로를 통해 일산화질소의 생성을 감소시키기 위하여 eIF5A siRNA를 의약용으로 사용하기 위한 용도를 제공하는 것이다.

도 1은 eIF-5A siRNA를 간문맥에 주입 후 β-액틴, mAAT 및 eIF-5Al의 발현을 RT-PCR로 측정한 결과이다. 이 도면은 eIF-5Al 발현이 측정되었으며 이는 섬 세포에 통합되어 있다.
도 2는 간문맥 혈류의 퇴화를 나타낸 것이다. 담관(흰색)과 간문맥(붉은색)이 프레파라토리 노트(검은 실선)이다. 바늘이 노트 밑으로 삽입되고 방향은 화살표로 표시됨) 노트 밑에 크로스 방향으로 siRNA가 췌장, 비장, 대장 및 3분의1의 원결장에 도달하는 혈관으로 분비됨을 나타낸다.
도 3은 섬에서 eIF-5Al 발현의 감소를 야기시킨 eIF-5Al siRNA의 관류를 나타낸다(eIF-5Al mRNA 수준의 감소를 나타낸다).
도 4는 생리 식염수 처리된 섬 세포와 대조군에 비해 eIF5-5Al siRNA 처리된 섬 세포의 아폽토시스 감소를 나타낸다.(여기서 그룹 당 n=2이다).
도 5는 생리 식염수 처리된 섬 세포와 대조군에 비해 eIF5-5Al siRNA 처리된 섬 세포의 아폽토시스 감소를 나타낸다.(여기서 그룹 당 n=3이다).
도 6은 eIF5-A2에 대한 인간 eIF-5Al 염기 서열의 배열을 나타낸다.
도 7은 eIF5-A2에 대한 인간 eIF-5Al 아미노산 서열의 배열을 나타낸다.
도 8은 예시적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 지닌 인간 eIF-5Al의 염기서열을 나타낸다.
도 9는 예시적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 지닌 인간 eIF-5Al의 염기서열을 나타낸다.
도 10A 및 10B는 예시적인 siRNAs를 지닌 인간 eIF-5Al의 염기서열을 나타낸다.
도 11은 예시적인 siRNAs를 지닌 인간 eIF-5Al의 염기서열을 나타낸다.
도 12는 siRNA eIF-5Al이 섬 세포의 발현을 넉다운시킬 수 있음을 나타내는 실험의 개요도이다.
도 13A는 50 섬을 위한 인슐린 분비 패턴을 나타낸 것이다. 도 13B는 2.8 내지 11 mM의 포도당 자극에 따른 단일 섬으로부터 [Ca²⁺]_i의 패턴을 나타낸 것이다. 그 페이스를 0, 1, 2로 나타내고 본 도면은 인슐린 분비의 이상성 패턴을 지닌 포토당 자극에 반응하는 정상적인 섬의 기능을 나타낸다. 이는 섬의 세포 내에 칼슘([Ca²⁺]_i)의 변화와 매우 유사하게 변화된다.
도 14는 칼슘 진동 연구 결과를 나타낸 것이다. 이 도면들은 eIF-5Al siRNA로 처리된 섬 세포가 매우 강한 포도당 반응과 진동(oscillation)을 나타냄을 보여준다. 따라서 eIF-5Al 발현은 감소된다. 이는 처리된 세포가 긴 생존뿐 아니라 기능을 유지함을 나타낸다.
도 15는 섬 세포로 처리된 염색 사이토카인의 다른 사진이다. 이 사진은 eIF-5Al siRNA로 처리된 섬 세포가 대조군 또는 생리식염수만으로 처리된 운반체에 비해 더 길게 생존하고 적게 사멸함을 나타낸다.
도 16A 및 16B는 섬 세포 공여자에게 IP 주입으로 투입하였을 때 섬 세포에 siRNA가 도입되는 것을 4개의 서로 다른 이미지 기법으로 나타낸 것이다. 콘포컬 이미지가 분리된 섬을 3D로 재구성하는데 사용되었다. 도 16A는 마우스로부터 분리된 섬에 0.9% 생리식염수를 복강내로 1일 1회 3일간 주입시키고 FITC 오토형광으로 나타낸 것이며 TRITC 채널(도에는 Cy3로 라벨링됨) 최소 형광을 사용하였다. 도 16B는 C57BI/6 마우스에 Cy3 라벨링된 안정한 siRNA를 1일 1회 3일간 복강내로 주입시킨 후 분리된 섬을 Cy3 라벨로 투과시켜 나타낸 것이다.
도 17(A)는 두 개의 서로 다른 siRNA 컨스트럭트(컨스트럭트 A 및 컨스트럭트 B)로 트랜스펙트시킨 βTC3 세포 또는 대조군을 원하는 단백질로 면역블럿팅시킨 결과를 나타내는 것이다. 도 17(B)는 C57BI/6 마우스에 동일한 siRNA를 1일 1회 3일간 복강내로 주입시킨 후 분리된 섬을 분리시킨 후 콜라겐나제 분해를 통해 정제하고 분별 그라디언트 원심분리시켜 분리된 섬을 나타낸 것이다. 섬은 2% SDS에 용해시키고 면역블럿팅을 수행하였다. 도 17(C)는 분리된 섬을 3mM D-포도당 내에서 이미징시키기 전에 30분 동안 Fura2를 로드시켜 분리된 섬을 나타낸 결과이다. 섬은 11 mM D-포도당으로 300초까지 자극시켰다. 도 17(D)는 포도당 자극된 인슐린 분비(GSIS)를 각 처리군으로부터 50 섬을 사용하여 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 18 A∼I는 eIF5A 넉다운 시킨 후 섬 기능 및 생존이 생체 밖에서 증가됨을 나타낸 것이다.
도 19A∼D는 eIF5A-결핍 세포의 부재시 iNOS 단백질의 생성으로 야기되는 사이토카인을 나타낸 것이다.

진핵세포 개시 인자 5A(eIF5A)는 스트레스-유발 유전자의 포스트-전사 조절에 중요한 인자이다. 또한 포유동물 세포에서 사이토카인-매개된 아폽토시스를 증진시키는 것으로 알려졌다. eIF5A는 진핵세포를 통 털어 매우 높게 보존된 작은 산성 단백질이고 이는 폴리아민-유래 아미노산 하이퓨신을 함유하는 유일한 단백질로 알려져 있다. eIF5A는 mRNA 프로세싱, 트래픽킹 및 트랜스레이션에 매우 중요한 역할을 한다. 그러나 이러한 역할은 췌장내 섬에서 염증 케스케이드 내에서는 특정화되지 않았다. 췌장 섬은 포도당 및 지질 독성, 산화 스트레스 및 염증 사이토카인에 매우 취약한 것으로 알려져 있다. 세포 스트레스에 반응하여 섬에 매개되어 있는 인자의 역할을 연구함으로써 본 발명의 발명자들은 소간섭 RNA(siRNA)를 이용하여 특이한 단백질을 생체 내에서 고갈시키는 방법을 개발하였다. 본 연구에서는 본 발명자들이 RNA 간섭을 이용하여 eIF5A 단백질의 고갈에 의한 섬 내에서 eIF5A의 역할을 결정하고자 하였다.

그러나 설치류 섬 내의 RNA 간섭에 의한 중요한 문제는 이들의 상대적으로 낮은 트랜스펙션 효율에 있다. 종전의 연구는 바이러스 매개된 짧은 헤어핀 RNA의 전달을 이용하여 연구된 반면 이 기술은 적당한 바이러스를 배양하는 많은 시간이 소모되고 바이러스의 독성에 의한 문제가 있었다. 따라서 본 발명자들은 안정한 소간섭 RNA(siRNA)의 복강내 주입을 반복함으로써 생체내에서 선택된 단백질의 마우스 섬에서 고갈에 의한 새로운 방법을 발명한 것이다. 이러한 방법은 섬 내에 siRNAs의 현저한 투입을 가능케 한다. 본 기술은 이미 잘 알려진 췌장 전사 인자 Pdxl과 같은 원하는 목표 단백질의 섬 내 고갈을 성공적으로 가능케 한다. 이 방법을 이용하면 본 발명자들은 섬 내의 eIF5A 단백질을 성공적으로 고갈시켰으며 eIF5A가 유발된 일산화질소 신타제(iNOS)를 코드화하는 mRNA의 전사를 증진시킴에 의해 사이토카인-매개된 섬 부작용을 야기시킴을 입증하였다. 이 결과는 eIF5A가 췌장 섬의 안정화에 반드시 필요하거나 iNOS mRNA를 포함하는 mRNA의 서브세트의 핵 유출(아마도 사이토카인-매개된 스트레스 반응에 관여되는 것으로 여겨지는)에 필요함을 제안한다.

본 발명자들은 생체 내에서 siRNA의 주입을 통해 진핵세포 개시 인자 5A(eIF5A)의 사이토카인-매개된 스트레스에 관한 역할을 연구하였다. eIF5A는 다른 시스템 내에서 스트레스 유발 유전자의 전사를 중요하게 조절하는 것으로 알려져 있다. eIF5A에 대해 siRNA를 주입한 마우스에서 50 내지 70%의 eIF5A 단백질 수준의 저하가 분리된 섬에서 관찰되었다. 또한 30 내지 40% 포도당 자극된 인슐린 분비의 증가와 Ca²⁺ 이동이 대조군에 비해 관찰되었다. 분리된 섬이 프로염증 사이토카인(ILl β, TNFα, IFNγ)의 칵테일에 노출되었을 때 상대적으로 증가된 섬 기능이 si-eIF5A로 처리된 동물에 비해 지속되었다. eIF5A 넉다운 시킨 섬 보호는 포도당 반응 또는 인슐린 전사(Slc2a2, Gck, Irsl, Nkx6-1, MafA, Pdxl, NeuroDl 및 Setd7)에 관련된 물질을 발현하는 유전자의 변화를 동반하지 않았다. 도 18C를 보면 유발된 일산화질소 신타제(iNOS)를 코드화하는 mRNA가 사이토카인에 대응하여 대조군 및 si-eIF5A-처리 섬에 비해 40배 이상 상향 조절되어 있음을 알 수 있다(도 19A를 보라). iNOS 단백질 수준은 si-eIF5A-처리된 섬에 비해 3 내지 5배 낮은 수준이었다(도 19B를 보라). 이러한 데이터는 si-eIF5A-처리된 섬의 증가된 기능이 일산화질소 생성을 감소하는 두 번째 기능일 것으로 예측된다. 이는 eIF5A가 iNOS 전사의 대조에 비해 스트레스 시그날에 대항하는 베타 섬 세포 내에서 중요한 역할을 함을 나타내는 증거이다. 이는 또한 eIF5A가 생존력을 보존하기 위한 치료 전략에 유효한 목표일뿐만 아니라 이식 후에 섬 세포의 기능을 작동시키는데도 중요한 역할을 하는 것이다.

본 발명자들은 하이푸신화(hypusination)의 저해를 통해(GC-7 - DHS의 저해제의 투여를 통해) eIF-5A 기능의 봉쇄가 iNOS를 효과적으로 감소시킴을 더욱 나타내었다. 도 19D 참조.

섬으로의 siRNA 혼입이 역행성 문맥 접종을 통한 췌장 관류에 의해 달성될 수 있다는 것은 이미 밝혀진 바 있다. Bradley, et al., Transplantation Proceedings, 37, 233-236, 2005 참조. 간략하게 설명하면, 리포펙트아민(Lipofectamine) 2000으로 패키지되거나 패키지되지 않은 Cy-3 표지된 루시페라제(Luc) siRNA GL2 이중나선이 사용되었고, 꼬리 정맥(생체 내, 마우스 1 마리 당 50 ㎍씩)을 통해 주사하거나 역행성 문맥 접종 (계내(in situ), 마우스 1 마리 당 2 ㎍씩)을 통해 췌장에 직접 주사하였다. 췌장을 꺼내어 계내 전달 후 24시간 동안 또는 생체 내 전달 후 4시간 동안 4℃에서 저장하였고, 섬을 분리하여 16시간 더 배양한 후에 조사하였다. siRNA 분포를 가시화하기 위해 췌장을 인슐린에 대하여 염색하고 형광 현미경하에 조사하였다. 분리된 섬을 형광 현미경하에서 직접 조사하였다. 패키지되지 않은 siRNA는 리포좀-패키지된 siRNA를 사용하여 관찰한 경우와 유사한 정도로 섬에 도달하였고, 이는 소위 생체 내 "네이키드(naked)"-siRNA 전달에 대한 보고와 일치한다(Lewis et al., Nat. Genet. 32:107-108, Epub 2002 Jul 2029, 2002 및 McCaffrey AP, et al., Nature 418:38-39, 2002). 도 1은 섬 세포 내로의 적당한 전달 메커니즘을 제공하는 섬 세포로의 관류를 나타낸다.

따라서 본 발명은 섬 세포에 대한 타겟 단백질을 암호화하는 mRNA에 타겟된 siRNA를 투요하는 단계를 포함하고, 상기 siRNA가 섬 세포 내 타겟 단백질의 발현을 저해함을 특징으로 하는 섬 세포 내 타겟 단백질의 발현 저해 방법을 제공한다. 상기 투여는 어떠한 방법을 통해서도, 바람직하게는 섬 β 세포 분리 전 섬 β 세포 공여자로의 복강내 투여를 통해 이루어진다.

하나의 실험에서 본 발명자들은 공초점 현미경에 의해 측정시 C57BL/6 마우스 내 안정화된 Cy-3-표지 이중-나선 RNA의 3회 매일 복강내 주사가 분리된 섬 내로의 뚜렷한 침투를 나타내었다. 단백질 넉다운에 대한 이러한 기술을 시험하기 위해 Pdx1에 대해 타겟된 안정화된 siRNA가 사용되었다. Pdx1 메시지에 대한 2개의 별개의 siRNA는 섬 내 Pdx1 단백질의 50% 및 90% 넉다운을 유발하였다(면역블럿 분석에 의한 평가시). 도 17A-D 참조.

본 발명은 섬 세포 내로 eIF-5A1 siRNA를 투여하는 단계를 포함하고, 상기 eIF-5A1 siRNA가 섬 세포 내 eIF-5A1의 발현을 저해함을 특징으로 하는 섬 세포 내 eIF-5A1의 발현 저해 방법을 제공한다. 도 16A 및 16B는 IP 주사를 통한 섬 세포 공여자로의 투여가 섬 세포에 대한 적당한 전달 메커니즘을 제공함을 나타낸다. 도 16B는 공초점 현미경에 의해 측정시 C57BL/6 마우스 내 안정화된 Cy-3-표지 이중-나선 RNA의 3회 매일 복강내 주사가 분리된 섬 내로의 뚜렷한 침투를 나타낸다. 도 12B 및 18B는 eIF-5A1 siRNA 처리된 섬 세포가 실제로 eIF-5A1 siRNA를 덜 발현시킴을 나타낸다.

eIF-5A1 발현을 저해함으로서 아폽토시스도 저해된다. 도 4 및 5는 분리 전 eIF-5A1 siRNA로 처리된 섬 세포가 아폽토시스로부터 이들 세포를 저해하는 메커니즘을 제공함을 나타낸다(서브-G1기 내 세포수 감소에 의해 입증된 바와 같이). 따라서 본 발명은 또한 섬 β 세포 공여자 내로 eIF-5A1 siRNA를 투여하는 단계를 포함하고, 상기 eIF-5A1가 섬 세포 내 eIF-5A1 발현을 저해하고 eIF-5A1 발현 저해는 아폽토시스를 저해함을 특징으로 하는 채취된 섬 세포 내 아폽토시스 저해 방법을 제공한다. 바람직하게는 섬 세포는 채취 과정 전 eIF-5A1 siRNA 세포로 처리된다.

본 발명은 섬 분리 전 섬 세포 공여자의 섬 세포 내로 eIF-5A1 eIF-5A1를 투여하는 단계를 포함하고, 이는 섬 세포 내 eIF-5A1의 발현 저해 또는 감소를 유발하고, 결국 섬 세포 내 아폽토시스를 저해할 뿐만 아니라 그의 기능을 보존함을 특징으로 하는 분리 후 채취된 섬 세포의 기능 보존 방법을 제공한다. 섬 세포의 기능 보존은 섬 세포가 채취 과정 동안 생존할 뿐만 아니라 채취 과정 후 그의 기능을 유지함(세포 기능이 더 길게 유지되거나 eIF-5A1 siRNA 처리되지 않은 섬 세포보다 우수한 포도당 반응을 유지함)(즉 포도당에 반응하여 인슐린 분비)을 의미한다.

하나의 실험에서 섬 기능 및 전체 건강 상의 eIF-5A1 넉다운의 결과를 조사하기 위해 C57BL/6 수컷 마우스가 운반체(0.9% 식염수)[그룹 I], 대조군 siRNA(16.6 mg/kg)[그룹 Ⅱ] 또는 eIF-5Al siRNA(16.6 mg /kg)[그룹 Ⅲ]의 복강내(IP) 주사가 제공되었다. 할당된 처리 주입은 섬 채취 전(0일) 3일간 매일(-3, -2, -1일) 투여되었다. 분리된 섬은 콜라게나제 처리에 의해 정제되고 시험 착수 전 16-18시간 동안 정치되었다. 채취 후 1일에 기능 기준을 수립한 후 제1형 당뇨병에대응하는 췌장 섬 조건을 모방하기 위해 섬의 절반이 사이토카인 칵테일(5 ng/mL ILlβ, lO ng/mL TNF-α, lOO ng/mL INF-γ)에 노출되었다.

섬의 각각의 그룹 유래의 단백질 용해질은 단백질 넉다운에 대해 웨스턴 블럿에 의해 분석되었다. 도 12B는 그룹 Ⅲ 처리된 마우스 섬 내 eIF-5A1의 상대 넉다운을 나타내고, 도 12C에서 정량화되었다. 이들 데이터는 섬 내 eIF-5A1의 발현 넉다운을 생성하는 IP 주입 효능을 나타낸다.

채취된 섬의 기능 보존 증거는 칼슘 진동에 의해 입증된다. 본 발명자들은 세포내 칼슘이 자극 및 스트레스의 지표임을 측정하였다. 인간 및 설치류 모두의 경우 도 13A에 나타난 바와 같이 정상적으로 기능하는 섬은 인슐린 분비의 이상성 패턴으로 포도당 자극에 반응한다. 첫 번째 근접으로서 이들 이상성 분비 패턴은 두 번째 편평기로 저하되는 첫 번째 최고기로 구성되는 섬 세포 내 칼슘([Ca²⁺]_i) 변화와 밀접하게 유사하다(도 13B). [Ca²⁺]_i의 측정은 340 및 380 nm 자극으로부터 발광된 광의 비율로 기록되었으나 섬 기능의 추가적인 특징을 탐지하는데 더 큰 감도를 제공한다. [Ca²⁺]_i는 베타-세포 자극-분비 커플링의 "공통(consensus) 모델"에 의해 기재된 과정을 개략적으로 반영하는 3개의 상으로 구성된(도 13 참조) 포도당에 반응한다. 소포체가 [Ca²⁺]_i을 동원하고 격리시키면 베타-세포 내로의 포도당 운송에 따라 [Ca²⁺]_i 내 초기 급강하가 발생한다(0기). 이후 포도당은 당분해를 통해 대사되고 ATP 생성을 유발하는 삼카르복실산(TAC) 회로 내에서 더욱 대사된다. ATP/ADP의 충분한 증가가 K_ATP-이온 채널에 근접하여 발생하게 되면 첫 번째 기 인슐린 분비와 관련된 L-형태 칼슘 채널의 개방으로 인해 [Ca²⁺]_i의 급격한 증가가 발생한다. 이러한 초기 최고기 후 [Ca²⁺]_i는 진동에 의해 종종 중단되는 편평상태로 하락한다. 편평상태 높이는 포도당 농도 및 두 번째 기 인슐린 분비 비율과 직접적으로 관련된다. 전체적으로 이러한 영상-기반 [Ca²⁺]_i 측정은 개체 섬의 수치에서 역동적 인슐린 분비의 우수한 첫 번째 근사치가 된다.

많은 인자는 포도당 자극에 반응하는 정상 [Ca²⁺]_i에 악영향을 미칠 수 있다. 포도당 대사, 미토콘드리아 및 ATP 생성, 소포체(ER), 이온 채널 기능의 분열 및 무수한 다른 문제점은 포도당 자극과 관련된 칼슘 처리의 동력학에 영향을 미칠 수 있다. [Ca²⁺]_i의 변화를 자주 모니터함으로서 활성 양상의 결함은 정적 인슐린 분비의 표준 측정보다 더욱 관찰되기 용이하다. 예를 들어 낮은 포도당 내 증가된 기본 [Ca²⁺]_i 및 포도당 자극 동안 [Ca²⁺]_i의 0기 급강하의 소실은 ER-스텔스 또는 이온-채널 기능장애를 표시할 수 있다. 이러한 결함은 정적 또는 동력학 인슐린 분비를 측정함으로서 용이하게 검출될 수 없으나 본원에 기재된 영상 기술은 이들 의문을 설명하는데 이용될 수 있다.

사이토카인의 존재 및 부재 하에 칼슘 진동 및 포도당 자극된 인슐린 분비 연구시 eIF-5A1 siRNA(16.6 mg/kg) 처리된 섬[그룹 Ⅲ(eIF-5A1 넉다운 섬)]은 더욱 큰 포도당에 대한 반응 및 확장된 기능 유지(확장돤 생존을 의미)를 나타내었다. 도 14 참조. 이에 따라 이들 섬은 더 높은 인슐린 생성을 나타낼 것으로 예측된다(데이터는 미결정됨). 생존/사멸 정량적 염색 후 촬영된 영상으로부터의 예비 데이터는 섬 세포 수명을 연장시키는 eIF-5A1 넉다운의 개념을 지지한다(도 15). 사멸된 섬 세포의 세포핵 내로의 EtHD-1의 삽입의 결과인 적색 섬 수를 칼세인(calcein)-AM을 형광 칼세인으로 활성적으로 분열시키는 녹색 섬 수와 비교함으로서 섬 생존능의 정량적 영상이 확인된다(도 15).

또한 본 발명은 증가된 일산화질소와 관련된 염증 질환과 관련된 세포 내 아폽토시스를 저해하는 방법을 제공한다. 예를 들어 류마티스 관절염과 같은 염증 질환은 유도성 일산화질소 합성효소(iNOS) 경로의 활성화로 인한 일산화질소(NO)의 증가된 생성과 관련된다. 동물 모델 연구는 관절염의 경중도가 NOS 저해제의 투여에 의해 감소될 수 있기 때문에 NO가 관절 염증 발병 및 조직 손상에 원인임을 제안한 바 있다. 윤활 섬유아세포, 내피세포 및 연골세포를 포함한 관절 내 존재하는 여러 세포 형태는 시험관 내에서 NO를 생성하기 위해 염증-유발성 사이토카인에 의해 유도될 수 있다. 더욱이 국소화 연구는 RA 환자로부터 수득된 관절 조직 내 윤활막 세포, 연골세포 및 혈관 내 iNOS 발현의 상향-조절이 존재함을 나타내었다. 윤활막층 및 연골로의 iNOS 발현의 국소화는 아폽토시스가 RA, 특히 윤활막층 및 연골에서 증가됨을 나타낸 다른 연구의 견지에서 흥미롭다. 종전 연구자들이 시험관 내에서 Fas 항원 발현이 RA 윤활막세포 내에서 증가되고 Fas 항체가 윤활막세포의 아폽토시스성 사멸을 자극시킬 수 있음을 나타낸 바 있으나 류마티스 관절 내 아폽토시스에 원인이 되는 메커니즘은 규명되지 않았다. 다른 연구자들은 높은 수치의 NO가 시험관 내에서 많은 세포의 아폽토시스를 자극시키기 때문에 iNOS 경로의 활성화가 류마토이드 관절 내 아폽토시스 자극에 관련됨을 조사하였고 NO가 RA의 아폽토시스 매개제로 작용함을 결론 내렸다. R. J. van't Hof et al., Rheumatology 200, 39:1004-1008 참조.

이와 같이 본 발명은 eIF-5A 발현을 저해하고 따라서 iNOS 경로를 통해 일산화질소 생성을 저해시키거나 감소시켜 세포 내 아폽토시스를 저해함으로서 RA와 관련된 세포(윤활 및 연골 세포와 같은) 내 아폽토시스를 저해하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 eIF-5A에 대해 지시된 siRNA를 세포 또는 숙주 내로 투여함으로서 세포 또는 숙주 내 NO 생성을 저해하는 방법을 제공한다. 상기 siRNA는 eIF-5A의 발현을 감소시키고 결국 iNOS 경로의 활성화를 저해함으로서 NO의 생성을 감소시킨다.

또한 본 발명은 iNOS 경로를 통해 일산화질소의 생성을 감소시키는 약물의 제조시 eIF-5A siRNA의 용도를 제공한다.

eIF-5A1의 발현을 저해하는 어떠한 eIF-5A1 siRNA도 사용된다. 또한 "저해"라는 용어는 대조군 세포 즉 eIF-5A1 siRNA로 처리되지 않은 세포에서 발생하는 수치와 비교시 감소됨을 의미한다. 하나의 예시적인 특히 바람직한 eIF-5A1 siRNA는 하기 서열을 포함한다: 5'-AAAGGAAUGACUUCCAGCTGAdTdT-3'. 동시 출원 중인 2005년 11월 28일 출원된 출원번호 11/293,391호(그 전체가 참고문헌으로 본원에 포함된)는 다른 세포 형태에서 eIF-5A1의 발현을 저해시키는데 사용되고 아폽토시스를 저해시키는 것으로 나타난 추가 예시적인 eIF-5A1 siRNA 및 다른 안티센스 컨스트럭트를 제공한다. 당업자는 eIF-5A1 서열을 제공하는 경우 또다른 eIF-5A1 siRNA를 고안할 수 있고 부적당한 실험 없이 발현을 저해할 수 있는 siRNA 능력에 대해 용이하게 시험할 수 있다. 도 6-11은 eIF-5A1, 예시적 eIF-5A1 siRNA 및 안티센스 컨스트럭트의 서열을 제공한다. 본 발명의 또다른 실시태양에서 eIF-5A1의 안티센스 컨스트럭트는 eIF-5A1의 발현을 저해하고 따라서 섬 세포의 아폽토시스를 저해할 뿐만 아니라 그의 기능을 유지시키거나 보존시키는데 이용된다.

바람직한 실시태양에서 eIF-5A1 siRNA은 하기 eIF-5A1 뉴클레오타이드 서열을 타겟한다(도 10 참조): 5'-AAGATCGTCGAGATGTCTACT-3'; 5'-AAGGTCCATCTGGTTGGTATT-3'; 및 5'-AAGCTGGACTCCTCCTACACA-3'. 특히 바람직한 실시태양에서 siRNA는 하기 eIF-5A1 서열을 타겟한다: 5'-AAAGGAATGACTTCCAGCTGA-3'.

또한 본 발명은 공여자 채취 과정 동안 섬 세포가 아폽토시스를 진행시키는 것을 방지하는 방법을 제공한다. 상기 논의된 바와 같이 많은 섬 세포는 채취시 아폽토시스를 진행시킨다. 본 발명자들은 채취 전 섬 세포로 eIF-5A1 siRNA를 제공하는 것은 아폽토시스에 대해 보호 이익을 제공함을 나타내었다. eIF-5A1 siRNA는 섬 분리 전 섬 세포 공여자의 섬 세포에 투여된다. 공여자( 및 따라서 섬 세포)는 인간 섬 세포를 포함한 어떠한 동물도 된다. 어떠한 투여 방법도 이용된다. 예를 들어 siRNA는 섬 세포 공여자의 문맥을 통한 관류에 의해 또는 섬 세포 공여자의 문맥을 통한 유체동력학적 관류를 통해 투여된다. 실시예 1 참조. 또다른 투여 형태는 복강내 투여를 포함한다. 실시예 2 및 실시예 3-5 참조.

문맥을 통한 관류는 담관의 캐뉼라 삽입과 유사하나 바늘은 반대 방식으로 찌른다. 간을 수축시키고 내장 기관을 마우스 좌측으로 이동시켜 문맥이 노출된다. 그 주위에 담관을 포함하는 예비 결절이 생성된다. 혈관을 천공시킨 후에 뭉툭한 바늘을 췌장 방향으로 밀어 넣고 그 주위에서 결절을 조인다. 마우스 모델에서는 1 mL의 식염수 또는 siRNA(5 ㎍)가 서서히 방출되고, 바늘이 제거되고 바늘 뒤에서 결절이 밀봉되어 유체가 유출되는 것이 방지된다. 이 시점에서 마우스는 뒤집히고 췌장 분해를 위해 담관에 접근한다. 췌장은 siRNA로 더 오래 유지된다. 대안으로 이는 채취되어 콜라게나제로 더 오래 차게 유지될 수 있다. 규칙적인 섬 분리 방법이 수행되고 섬(50개)은 16시간 동안 인큐베이트된다.

또한 본 발명은 siRNA가 eIF-5A1의 발현을 저해하여 섬 세포의 아폽토시스를 저해하고 기능을 유지시킴을 특징으로 하는 eIF-5A1 siRNA를 포함한 섬 세포 내 아폽토시스를 저해하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 상기 논의된 바와 같이 또다른 또는 추가적 eIF-5A1 siRNA를 포함한다. 바람직한 siRNA는 뉴클레오티드 서열 5'-AAAGGAAUGACUUCCAGCTGAdTdT-3'을 포함한다.

실시예

실시예 1: 문맥 관류

eIF-5A를 발현하는 마우스 섬

분리된 마우스 섬에서 전체 RNA가 추출되고 β-액틴 및 eIF-5A1에 대해 RT-PCR이 수행되었다(도 1). 휴지기의 비자극 섬은 양성 수치의 eIF-5A1-mRNA를 나타내었다.

eIF5A1-siRNA 전달 후에 감소된 eIF-5A1-mRNA 수치

마우스는 1 ml의 siRNA(CT(대조군) 서열 또는 eIF-5A1, 5 ㎍) 또는 식염수가 그룹 당 n= 2로 저속의 역행성 문맥 관류로 도입되었다(도 2). 췌관의 콜라게나제 관주에 의해 췌장이 분해되고 Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102:12153-12158 Epub 12005 Aug. 12110, 2005에 기재된 바와 같이 섬이 분리되었다. 섬(마우스 당 50개)은 16시간 동안 인큐베이트되었다. 이후 전체 RNA가 추출되고 β-액틴 및 eIF-5A1에 대한 RT-PCR이 수행되었다(도 3). eIF-5A1/β-액틴에 대한 mRNA의 비율은 5.24(CT-siRNA) 및 3.01(eIF-5A1-siRNA)이었다. 도 3은 eIF-5A1의 mRNA 수치가 siRNA로 처리된 세포에서 감소됨을 나타낸다. 본 실험은 n = 3 마리 마우스로 반복되었고, 섬은 3반복으로 RNA 추출에 대해 인큐베이트되었다; 결과는 초기 관찰 결과와 일치하였다.

eIF5A1-siRNA의 전달 후 감소된 eIF-5A1-mRNA 수치 및 섬 아폽토시스 비율: 문맥 유체역학적 관류

마우스는 1 ml의 siRNA(CT 또는 eIF-5A1, 5 ㎍) 또는 식염수가 그룹 당 n = 2로 유체역학적 역행성 문맥 관류로 도입되었고, 이 과정은 5초 이내에 완료하였다. 췌관의 콜라게나제 관주에 의해 췌장이 분해되고 섬이 분리되었다. 섬은 16시간 동안 인큐베이트된 후 분류되었다: 하나의 그룹은 아폽토시스를 평가를 위해 요오드화프로피듐으로 염색되었고(마우스 당 50개 섬), 또다른 그룹은 RT-PCR로 처리되었다(마우스 당 25개 섬). eIF-5A1/β-액틴에 대한 mRNA 수치는 eIF-5A1-siRNA군보다 CT-siRNA군에서 마찬가지로 더 높았다. 아폽토시스 비율은 28.1%까지 감소하였다(도 4). 본 실험은 n = 3으로 반복되었고, 아폽토시스 비율은 다시 감소하였다(도 5).

비오틴화-siRNA로의 섬 관류

비오틴화-siRNA(50 ㎍)는 상기 기재된 바와 같 섬 내로 관류되었다(저속 관류, n = 1). 췌장은 염색을 위해 포르말린으로 고정되었다.

siRNA

siRNA 분자는 미국 콜로라도주 라파예트 소재의 다르마콘(Dharmacon)에서 합성되었다. eIF-5A1 및 대조군 siRNA의 서열은 각각 하기와 같다: 5' CGGAAUGACUUCCAGCUGAdTdT 3' 및 5' AGUCGACCUUCAGUAAGGCdTdT 3'.

RT-PCR

Qiagen RNeasy 키트를 이용하여 전체 RNA가 세포에서 추출되었다. eIF-5A1 프라이머: 전방 5'-GAC AGT GGG GAG GTA CGA GA-3'; 역방 5'-GGG GTG AGG AAA ACC AAA AT-3'.

요오드화프로피듐(PI) 아폽토시스 염색

섬의 단일 세포 현탁액은 약한 트립신처리로 달성되었다. 세포는 PBS로 세척되고, PBS 내 0.3％ 사포닌, 1 mM EDTA, Rnase, 1% 아지드, 1% FCS 및 50 ㎍/ml PI를 함유한 사포닌-PI 혼합물을 첨가하였다. 세포는 FACS에 의한 sub-G1 집단에 대한 분석 전에 완전하게 교반되고 암실에서 6시간 동안 4℃에서 인큐베이트되었다.

실시예 2: 복강내 주사

항체 및 siRNA

eIF-5A1에 대한 마우스 단일클론 항체가 생성되었다. 항-액틴 단일클론 항체(클론 C4, #69100)는 MP Biomedicals에서 구입하였다. Li-Cor사의 웨스턴 블럿시 적외선 근방형광단 표지된 2차 항체가 사용되었다(IRDye 800 및 IRDye 700). eIF-5A1에 특이적인 siRNA는 하기 eIF-5A1 서열로 지시되었다: 5'-AAAGGAATGACTTCCAGCTGA-3'. 반면에 대조군 siRNA는 서열 5'-AAAGTCGACCTTCAGTAAGGA-3'으로 전사되었고 어떠한 알려진 단백질의 넉다운도 유도하지 않은 것으로 종전 나타났다. 그 전체가 참고문헌으로 본원에 포함된 동시 출원 중인 미국 특허출원 번호 11/725,470 및 PCT/US07/64424 참조.

siRNA의 마우스의 IP(복강내) 주사

12마리의 8- 내지 10-주령 C573L/6 수컷 마우스는 Charles River에서 구입하였다. 수컷 마우스는 암컷 발정 주기를 동반한 대사 변동을 방지하여 선택되었다. 마우스는 3가지 처리군 중 하나에 무작위로 할당되었다: 그룹 Ⅰ - 운반체 처리(0.9% 식염수), 그룹 Ⅱ - 대조군 siRNA 처리, 그룹 Ⅲ - eIF-5A1 siRNA 처리. 각각의 마우스는 섬 채취(0일) 전 16.6 mg/kg 또는 유사한 부피(그룹 Ⅰ의 경우)의 IP 주사가 주사되었다.

섬 분리 및 사이토카인 처리

C57BL/6 마우스로부터 섬 분리는 표준 분리 기술 및 동물사용관리위원회(IACUC)에 의해 승인된 프로토콜을 이용하여 수행되었다. 췌장은 콜라게나제 분해까지 4.2 mM 중탄산나트륨 및 1% BSA(Invitrogen) 보충된 HBSS 내에 보관되었다. 정제는 차별적 원심분리에 의해 수행되었다. 전체 섬은 10% FBS 및 5% 페니실린/스트렙토마이신 보충된 페놀레드-부재 DMEM 용액 내에 유지되었다. 배양액은 5.5 mM 포도당 내에서 37℃ + 5% CO₂에서 인큐베이트되었다. 정제된 섬은 대사 시험(칼슘 진동) 전 16-18시간 동안 회복되었다.

사이토카인 처리는 생리적으로 관련된 사이토카인(5 ng/mL ILlβ, lO ng/mL TNT-α, 100 ng/mL INF-γ)의 처방된 칵테일을 이용하여 1일째에 대사 시험 종료시 섬 절반에 적용되었다. 사이토카인 처리된 섬은 추가 시험 전 24시간 동안 정치되었고 단백질 분석이 착수되었다(2일 및 3일).

면역블럿 분석

10 ㎍의 섬 세포 추출물(200 mM DTT 및 Benzonase 함유 Laemmli 완충액 내에 준비된)은 4-20% SDS-폴리아크릴아미드 겔(Invitrogen) 상에서 전기영동에 의해 분석된 후 항-eIF-5A1 마우스 단일클론 1차 항체(1:15000 희석)를 이용하여 면역블럿 분석되었다. 면역블럿은 영상화되고 Odyssey 시스템(Li-Cor Biosciencs)의 적외선 근방 기술로 정량화되었다.

칼슘 진동 분석

췌장 섬은 콜라게나제-분해된 8- 내지 10-주령 C57BL6 마우스 췌장(상기 기재된 바와 같이)으로부터 손으로 채취되었다. 섬은 Fura-2 저 포도당(3 mM) 용액 내에서 20분간 처리된 후 온도-제어된 플로우 챔버(flow chamber) 내에 놓였다. 저 포도당 용액(Fura 없는)은 섬 위로 흘러 기본 칼슘 측정을 수립하였다(5분). 칼슘 측정은 IP Lab 4.0 소프트웨어(BD Biosciences)를 이용하여 수득되었고 340 내지 380 nm로부터 방출된 광의 비율로 기록되었다. 기본 칼슘 수치가 수립된 후 고 포도당(11 mM) 용액이 챔버를 통해 흘러 섬의 세포성 칼슘 반응을 유도하였다. 칼슘 반응은 관찰 20-분 기간에 걸처 5-초 간격으로 모니터되었다. 섬은 시험 종결시 5% 표백제로 처리된다.

실시예 3: 시험관 내 및 생체 내 Pdx-1에 대한 siRNA의 적용

βTC3 세포는 2개의 상이한 Pdx-1 siRNA 컨스트럭트(컨스트럭트 A 및 B) 또는 대조군으로로 트랜스펙트되고 단백질 Pdx-1, GAPDH 및 β-액틴에 대해 면역블럿팅되었다. 도 17A 참조. C57B1/6 마우스는 동일한 siRNA으로 3일간 1일 1회 복강내 주사되었고, 섬이 분리되고 콜라게나제 분해 및 차별적 증감 원심분리를 통해 정제되었다. 섬은 2% SDS 내에 용해되고 면역블럿팅되었다. 도 17B 참조. 분리된 섬은 3 mM D-포도당 내에서의 영상화 전 Fura2로 30분간 로드되었다. 섬은 11 mM D-포도당로 ∼300초에 자극되었고, Fura2 비율은 형광 현미경에 의해 지속적으로 모니터되었다. 도 17C 참조. 포도당 자극된 인슐린 분비(GSIS)는 각각의 처리군 유래의 50개 섬을 이용하여 수행되었다. 도 17D 참조.

실시예 4: 생체 외 섬 기능 및 생존을 개선시키는 eIF-5A 넉다운

본 실험은 eIF5A에 대한 siRNA의 생체 내 투여가 생체 외 섬 기능을 개선시킴을 나타낸다. 도 18A는 실험 디자인의 개략도를 제공한다. 섬은 처리-후 분리되고 추출물은 면역블럿 분석되었다. 도 18B 참조. 분리된 섬은 포도당 감지 및 인슐린 전사에 필수적인 유전자의 RT-PCR 분석되었다; 유전자 전사는 사이토카인 처리에 의해 저해되었으나(IFNg, ILIb, TNFa로의 4시간 인큐베이션) 그룹 간에 어떠한 차이도 관찰되지 않았다. 도 18C 참조. 분리 24시간(도 18D 참조) 및 48시간(도 18F 참조) 후 si-eIF5A-처리 섬은 분리 24시간(도 18D 참조) 및 48시간(도 18F 참조) 후 대조군과 비교시 개선된 포도당 자극된 칼슘 반응(GSCa)을 나타낸다. si-eIF5A-처리 섬은 분리 24시간(도 18E 참조) 및 48시간(도 18G 참조) 후 사이토카인 존재 하에 증가된 GSCa를 입증한다. GSIS에 의한 평가시 eIF5A 처리 마우스로부터 분리된 섬은 4시간 사이토카인 인큐베이션의 부재(도 18H 참조) 및 존재(도 18H 참조)시 대조군과 비교시 개선된 포도당 자극된 인슐린 분비("GSIS") 나타내었다.

실시예 5: 사이토카인-유도 INOS 생성을 제거시키는 eIF-5A 넉다운

사이토카인 유도된 iNOS 단백질 생성은 eIF5A-결함 세포에서는 부재하였다. 사이토카인으로 처리된 섬은 iNOS mRNA에 대해 RT-PCR 수행되었다; 모든 처리군은 사이토카인 노출시 iNOS mRNA의 현격한 상향조적을 나타내었다. 도 19A 참조. 사이토카인-처리 섬은 면역블럿 분석되었다. 특히 대조군 섬에서 사이토카인 노출시 iNOS 단백질이 유도되었으나 si-eIF5A-처리 섬에서는 그렇지 않았다. 도 19B 참조. INS-1(832/13) β 세포는 사이토카인 칵테일로 4시간 동안 처리되고 면역블럿팅되었다; 세포는 유사한 iNOS 단백질 증가를 나타낸다. 도 19C 참조. INS-1 세포는 데옥시하이푸신 신타제의 저해제인 다양한 농도의 GC-7로 밤새 처리된 후 사이토카인 존재시 4시간 동안 인큐베이트되었다. INS-1 세포는 iNOS 생성 및 GC-7의 역상관관계를 나타내고, 이는 활성 eIF5A 생성의 저해가 iNOS 번역을 방지시킴을 나타낸다.

참고문헌

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Claims (7)

1. 섬 분리 전 섬 세포 공여자의 섬 세포에 eIF-5A1 siRNA를 투여하는 단계를 포함하고, 상기 eIF-5A1 siRNA는 섬 세포 내 eIF-5A1의 발현을 저해하여 섬 세포 내 아폽토시스를 저해하고 채취된 섬 세포의 기능을 보존함을 특징으로 하는 채취된 섬 세포의 기능 보존 방법
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 eIF-5A1 siRNA는 하기 eIF-5A1 뉴클레오타이드 서열을 타겟함을 특징으로 하는 방법: 5'-AAAGGAATGACTTCCAGCTGA-3'; 5'-AAGATCGTCGAGATGTCTACT-3'; 5'-AAGGTCCATCTGGTTGGTATT-3'; 또는 5'-AAGCTGGACTCCTCCTACACA-3'
   
3. 제 1항에 있어서, 상기 eIF-5A1 siRNA는 뉴클레오타이드 서열 5'-A AAGGAAUGACUUCCAGCTGAdTdT-3'을 포함함을 특징으로 하는 방법
   
4. 제 1항에 있어서, 상기 siRNA는 섬 세포 공여자 내로 복강내 주사에 의해 투여됨을 특징으로 하는 방법
   
5. 섬 분리 전 섬 세포 공여자 내로 복강내 주사를 통해 섬 세포 공여자 내로 eIF-5A1 siRNA를 투여하는 단계를 포함하고, 상기 eIF-5A1 siRNA는 섬 세포 내 eIF-5A1 발현을 저해하여 섬 세포의 아폽토시스를 저해함을 특징으로 하는 공여자 채취 과정 동안 섬 세포가 아폽토시스를 진행시키는 것을 저해하는 방법
   
6. 제 5항에 있어서, 상기 eIF-5A1 siRNA는 하기 eIF-5A1 뉴클레오타이드 서열을 타겟함을 특징으로 하는 방법: 5'-AAAGGAATGACTTCCAGCTGA-3'; 5'-AAGATCGTCGAGATGTCTACT-3'; 5'-AAGGTCCATCTGGTTGGTATT-3'; 또는 5'-AAGCTGGACTCCTCCTACACA-3'
   
7. 제 5항에 있어서, 상기 eIF-5A1 siRNA는 뉴클레오타이드 서열 5'- AAAGGAAUGACUUCCAGCTGAdTdT-3'을 포함함을 특징으로 하는 방법
   

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