KR102413477B1 - Usp21을 표적으로 하는 물질의 스크리닝 방법 - Google Patents

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동국대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 USP21 의존적으로 UCP2 또는 UCP3를 증가시키고, USP21 의존적으로 ACLY 또는 DNA-PKcs를 억제하는 것에 의하여 근육 세포내의 ATP를 고갈하여 체내 저장된 연료를 소모함으로써 골격근의 산화형 근섬유로의 전환; 근육내의 지방을 감소시키면서 근육량의 증가가 필요한 질환; 비만; 과체중 조절; 또는 지방 연소가 필요한 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 물질을 스크리닝하는 방법; 및 상기 물질을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명에 따라 스크리닝된 USP21의 발현 또는 활성을 감소시키는 물질은 근골격계 질환의 예방 및 치료, 운동능력 개선, 비만, 과체중 상태 등의 치료에 활용될 수 있다.

Description

USP21을 표적으로 하는 물질의 스크리닝 방법{Screening method for substance targeting USP21}
본 발명은 유비퀴틴 특이 프로테아제 21(Ubiquitin-specific protease 21: USP21)을 조절하거나 억제하는 약물의 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 골격근의 산화형 근섬유로의 전환; 근육내의 지방을 감소시키면서 근육량의 증가가 필요한 질환; 비만; 과체중 조절; 및 지방 연소가 필요한 질환의 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
소실된 근육은 운동과 사회 활동 증가, 적절한 음식물 섭취 등을 통해 상당 수준까지 회복 가능하지만 근감소증을 치료할 수 있는 약물이나 식품은 아직 알려진 바 없으며, 적절한 영양 섭취와 근력 운동, 유산소 운동, 균형 운동을 병행할 때 근감소증이 경감될 수 있다. 현재 근육량을 늘리는 방법으로는 단백동화 스테로이드제 외에도 인터넷이나 암거래, 혹은 의사의 처방전을 통해 구할 수 있는 근육강화 보충제의 종류는 다양하다. 예를 들어, 일종의 중추신경 흥분제인 에페드린(ephedrine)이나 성장호르몬 에리트로포이에틴 (erythropoietin)이 사용되고 있다. 따라서 이러한 한계점을 극복하기 위하여 전세계적으로 사노피, 노바티스, 머크 등 해외 유명 제약사들이 근감소증 치료약을 개발 중이지만 현재까지 시판을 허가받은 약품은 없으므로, 이러한 한계를 극복할 수 있는 새로운 약물의 개발이 필요하다.
한편, 비만 치료의 목표는 체중감량 뿐만 아니라 전반적인 건강 상태를 개선함으로써 비만으로 인한 2차적인 건강문제 발생을 예방하고 삶의 질을 높이는 것이다. 과체중이나 비만의 치료는 식이요법, 운동요법, 행동교정 등의 생활습관 개선으로 시작한다. 이후에 약물요법이나 수술요법을 시행하는 경우에도 이러한 생활습관 개선을 병행해야 지속적인 체중유지가 가능하다.
세계보건기구(WHO) 기준에 의하면 백인, 흑인, 히스패닉계 인종에서 체질량지수(Body Mass Index, BMI)가 30kg/m2 이상일 때 비만으로 정의된다. BMI가 30kg/m2 이상이거나 BMI가 27kg/m2 이상이면서 비만과 관련된 동반 질환이 있을 때 적극적인 비만치료가 필요하다. 국내에서는 아시아 비만기준인 체질량지수(BMI) 25kg/m2 이상인 경우, 또는 23kg/m2 이상이면서 비만과 관련된 동반 질환이 있는 경우에 적극적인 치료가 필요하다. 여기서 비만과 관련된 동반 질환이란, 체중감량으로 개선되는 것이 입증된 질환으로서 제2형 당뇨병, 고혈압, 이상지질혈증, 심혈관질환, 폐쇄성 수면무호흡증, 골관절염 등이 해당한다.
치료 대상의 환자에게 생활습관을 개선한 후에도 3-6개월 동안 초기체중의 5% 이상 감량되지 않는 경우 약물요법을 고려할 수 있다. 일반적으로 임부, 수유부, 중증 간장애 또는 신장애, 정신과적 질환, 뇌졸중, 심근경색이 있는 경우에는 약물요법이 권장되지 않는다. 미국 FDA에서 비만치료제로 승인된 제제들 중에서 교감신경활성화 약물로 펜타민(phentamine), 펜디메트라진(phendimetrazine), 벤즈페타민(benzphetamine), 및 디에틸프로피온(diethylpropion)이 있으나 이들 약물은 단시간(최대 12주까지)만 사용하도록 승인되었다. 현재 비만치료제로 승인되지 않은 약물은 효과가 불확실하고 안전성 우려가 있으므로 사용하지 않는 것이 원칙이다.
US DEA (United States Drug Enforcement Agency)는 남용과 의존성 위험이 있어 관리가 필요한 물질이나 약물의 목록을 5단계의 스케쥴(schedule)로 구분한다. 스케쥴 I은 연구 목적으로만 제한적으로 사용할 수 있으며, 스케쥴 II는 남용위험이 매우 높아 제한적으로 치료에 사용할 수 있다. 스케쥴 III, IV, V 순으로 남용 가능성이 낮아지나, 스케쥴 V 또한 주의를 요하는 약물이다. 약물요법을 시작한 후 첫 3개월간은 적어도 한달에 한 번씩, 그 이후에는 적어도 3개월마다 체중감량 효과와 이상반응을 모니터링해야 한다. 동반질환이 있는 경우 혈압, 심박수, 혈당을 더 자주 모니터링하여 질환의 상태를 확인한다.
비만과 관련된 동반질환의 치료제를 선택할 때 체중을 증가시킬 가능성이 있는 약물은 가급적 피하고 체중에 영향을 미치지 않거나 감량시킬 수 있는 약물을 선택한다. 예를 들어, 제2형 당뇨병이 동반된 비만환자에게는 체중을 감소시키는 당뇨병 약제인 메트포르민(metformin)을 일차 약제로 투여하고 부가적인 체중감량 효과가 있는 GLP-1 (glucagon-like-peptide-1) 효능제 또는 SGLT-2 (sodium-glucose-linked transporter-2) 억제제를 추가할 수 있다.
장기간 사용할 수 있는 비만치료제로 승인된 제제를 대상으로 수행한 메타분석 결과에서 펜터민-토피라메이트(phentermine-topiramate) 복합제와 리라글루티드(liraglutide)가 가장 체중감량 효과가 큰 것으로 나타났으나, 안전성 측면에서는 이상반응으로 인한 투여중단 위험이 가장 높았다. 오르리스타트 (Orlistat)는 위와 췌장에서 리파제(lipase)의 작용을 억제하여 음식에 포함된 지방이 체내로 흡수되지 않고 체외로 배출되도록 한다. 그러나 오르리스타트는 지용성 비타민의 흡수 감소. 지방변, 복부팽만 및 방귀, 유상배변, 배변실금, 대변절박등의 다양한 부작용을 갖는다. 리라글루티드는 장시간 작용하는 GLP-1 유사체로서 GLP-1 수용체에 작용하여 췌장에서 포도당 의존성 인슐린의 분비를 증가시키고 글루카곤 분비를 감소시킨다. 또한, 위배출을 느리게 하여 음식 섭취를 감소시킨다. 오심, 구토, 설사, 변비, 두통 등의 부작용은 물론 유효성이 낮은 한계를 갖는다. 로카세린(Lorcaserin)은 세로토닌 2c (5HT-2c) 수용체에 선택적으로 작용함으로써 POMC 뉴런을 활성화시켜 포만감이 들게 하고 식욕을 억제하지만, 두통, 구역, 입마름, 어지러움, 피로, 변비 등의 부작용을 보인다.
서방성(sustained release) 제제인 부프로피온-날트렉손(Bupropion-naltrexone) 복합제는 부프로피온 이 도파민(dopamine)과 노르에피네프린(norepinephrine)의 재흡수를 차단하여 POMC/CART 뉴론을 활성화시켜 식욕을 억제한다. 체중감량 효과는 오르리스타트나 로카세린과 유사하나, 심혈관계 이상반응이 발생할 수 있어 1차 약제로 권고되지 않는다. 부프로피온이 포함되어 있으므로 다른 항우울제와 마찬가지로 자살충동, 비정상적인 행동의 변화를 모니터링해야 한다. 혈압 및 심박수를 모니터링하고 지속적으로 증가할 경우 투여를 중단한다. 그 외에 교감신경 흥분제(sympathomimetic drugs)인 펜터민 펜디메트라진, 디에틸프로피온 등도 유사한 한계점을 보임은 물론 향정신성 의약품으로 사용에 규제가 요구된다.
이상적인 비만치료제는 장기간 투여하는 동안 지속적으로 체중감량 효과가 나타나거나 감량된 체중이 유지되어야 하며, 장기간 안전성이 보장되어야 한다. 그러나 이러한 약물은 현재 존재하지 않는다.
단백질 유비퀴틴화(ubiquitination)는 단백질 안정성과 분자 트래픽킹(molecular trafficking)를 통해 생물학적 기능에 영향을 미치는 가장 일반적인 번역 후 변형(post-translational modifications) 중 하나이다. 유비퀴틴 변형은 E3 리간드와 디유비퀴티나제(deubiquitinases: DUBs)의 반대 작용에 의해 균형을 이룬다. 따라서, DUBs는 표적의 유비퀴틴화 상태와 운명을 미세 조정하는 역할을 한다. DUB 계열의 가장 큰 그룹에 속하는 유비퀴틴 특이적 프로테아제(Ubiquitin-specific protease: USP)는 세포 증식 및 분화와 같은 다양한 생물학적 과정과 연관되어 있어 약물 치료의 표적으로 유망하다. 그러나 연료 저장 및 활용에 영향을 미치는 특정 DUB에 대해서는 아직 완전히 밝혀지지 않고 있다.
골격근은 질량이 크고 연료 소비율이 높기 때문에 전신 에너지 항상성(homeostasis)을 결정하는 중요한 요소이다. 골격근은 전신 열 발생의 최대 40%를 차지한다. 따라서 대부분의 척추 동물에서 열 생성을 위한 주요 기관으로 간주되어 왔다. 떨리는 것 외에도 포유류는 추운 환경에 적응할 때 떨지 않는 가열 메커니즘을 진화시켰다. 열 발생 효과는 근육 기능과 체지방 조성 모두와 관련이 있으므로 대사 장애로부터 보호하는데 기여할 수 있다. 따라서, 특히 근육에서 체온을 조절하는 분자 및 신호 노드의 표적화는 비만을 예방하거나 치료하는 매력적인 접근 방식이다. 그러나, 근육의 열 발생 조절 메커니즘은 제대로 알려져 있지 않다.
본 발명자들은 USP21 발현 억제 또는 활성 감소가 (a) 미토콘드리아 언커플링 단백질 2(mitochondrial uncoupling protein 2: UCP2) 또는 미토콘드리아 언커플링 단백질 3(mitochondrial uncoupling protein 3: UCP3)의 증가, 또는 (b) ATP 시트레이트 리아제 (ATP citrate lyase: ACLY) 또는 DNA 의존성 단백질 키나아제, 촉매 서브 유닛 (DNA-dependent protein kinase, catalytic subunit: DNA-PKcs) 감소와 동시에 (c) p-AMPK (AMPK 인산화) 또는 p-ACC (ACC 인산화)의 지속적인 증가를 수반하며, 이러한 변화는 골격근의 근섬유세포를 비산화형 2형 근섬유에서 산화형 1형 근섬유로 전환시키고 동시에 근육내 지방을 감소시키며 근육량을 증가시키고, 복부지방 등 백색 지방은 감소시킴을 발견하였다.
이에, 본 발명의 하나의 목적은 골격근의 산화형 근섬유로의 전환; 근육내의 지방을 감소시키면서 근육량의 증가가 필요한 질환; 비만; 과체중 조절; 또는 지방 연소가 필요한 질환의 예방 또는 치료 물질로서 USP21의 발현 또는 활성을 감소시키는 후보 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 UPS21 조절 약물 또는 USP21 억제제를 유효성분으로 포함하는, 골격근의 산화형 근섬유로의 전환; 근육내의 지방을 감소시키면서 근육량의 증가가 필요한 질환; 비만; 과체중 조절; 또는 지방 연소가 필요한 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 골격근의 산화형 근섬유로의 전환; 근육내의 지방을 감소시키면서 근육량의 증가가 필요한 질환; 비만; 과체중 조절; 및 지방 연소가 필요한 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환의 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) USP21을 발현하는 세포를 제공하는 단계;
(b) 상기 세포에 USP21의 발현 또는 활성을 억제할 것으로 기대되는 후보 물질을 처리하는 단계;
(c) 상기 후보 물질 처리 후 상기 세포의 배양액 또는 상기 세포의 파쇄물(lysate)에서 USP21 단백질의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및
(d) 비처리 대조군과 비교하여 USP21의 발현 또는 활성을 감소시키는 후보 물질을 골격근의 산화형 근섬유로의 전환; 근육내의 지방을 감소시키면서 근육량의 증가가 필요한 질환; 비만; 과체중 조절; 또는 지방 연소가 필요한 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환의 예방 또는 치료 물질로 선정하는 단계.
본 발명에서는 USP21이 골격근의 연료 소비를 제어하는 분자임을 확인하였다. USP21은 인간과 마우스 골격근 모두에서 높게 발현되었다. 저온 노출은 마우스 골격근에서 USP21 발현을 억제하는 반면, USP21의 손실은 열 발생을 증가시켰다. 본 발명의 연구 결과는 USP21 절제가 미토콘드리아 연료 산화 및 생물 발생(biogenesis), 산화적 인산화 분리, ATP 고갈, 근섬유 유형 전환 및 근육 질량 증가를 촉진하여 열 발생(thermogenesis)을 향상시킨다는 것을 나타낸다. RNA-시퀀싱 (RNA-seq), 프로테오믹스 및 지질학을 활용하여, 본 발명에서는 DNA-PKcs 및 ACLY가 USP21의 기질로서 AMPK의 지속적 활성화를 수반하는 연료 소비증강 현상을 밝혀내었다. 기능적 결과로서 USP21 결핍은 고지방식이(high-fat diet: HFD)로 인한 비만을 감소시켰다. 본 발명은 또한 당뇨병 환자와 HFD를 먹인 동물의 근육에서 USP21 상향 조절을, 운동 또는 추위에 노출된 동물에서는 UPS21 하향 조절을 확인하였고, 이는 연료 저장과 연료 산화의 균형을 맞추는데 USP21의 가변이 조절 역할을 함을 보여준다. 이러한 발견은 미토콘드리아 생물 발생 및 열 생성에서 USP21의 기능에 대한 새로운 역할을 입증하여 비만 치료를 위한 신규 표적을 제공한다.
골격근의 근섬유는 에너지 대사 정도에 따라 대사가 활발한 산화형(oxidative) 근섬유와 그렇지 않은 비산화형(non-oxidative) 근섬유로 분류되며, 이들의 체내 비율에 따라 근육 및 전신 에너지 소모능력이 결정된다. 이러한 골격근은 말초에 공급된 에너지를 가장 많이 소모하는 기관으로 전신 에너지 대사 속도를 조절하는데 중추적인 기관이다.
비만 또는 당뇨병 환자의 근육조직에는 산화형 근섬유가 낮은 비율로 존재한다. 따라서 산화형 근섬유의 비율을 늘릴 수 있다면, 비만은 물론 당뇨를 개선 또는 치료할 수 있다. 또한 비만 상태에서 과잉의 에너지가 유입되어 근육의 대사 항상성이 붕괴되면 인슐린 저항성이 발생하고, 이후 당뇨를 유발하게 된다. 이런 이유로 임상적으로 당뇨 이행과정에서 근육의 인슐린 저항성이 타 조직과 비교하여 가장 이른 시기에 나타난다.
따라서, 본원에 따른 방법에 의해 스크리닝된 물질은 근육조직을 구성하는 근섬유를 산화대사형으로 전환할 수 있어, 비만 및 특히 인슐린 저항성으로 인한 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, USP21의 전사체 또는 단백질의 발현이 억제되거나 또는 USP21 효소활성이 억제되는 경우, USP21의 하위조절자인 ACLY 또는 DNA-PKcs 단백질의 감소 및 이들의 감소와는 역으로 p-AMPK (AMPK 인산화) 또는 p-ACC (ACC 인산화)의 지속적인 증가가 수반될 수 있으며, UCP2 또는 UCP3가 증가할 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 구현예에서, 상기 단계 (C)는 상기 후보 물질 처리 후 상기 세포의 배양액 또는 파쇄물에서 USP21 단백질 대신에 USP21의 하위조절자인 ACLY 또는 DNA-PKcs의 발현 또는 활성을 측정하는 단계이고, 상기 단계 (d)는 비처리 대조군과 비교하여 ACLY 또는 DNA-PKcs의 발현 또는 활성을 감소시키는 후보 물질을 상기 질환의 예방 또는 치료 물질로 선정하는 단계인, 스크리닝 방법일 수 있다.
본 발명에서, 대조군으로 USP21의 하위조절자인 ACLY 또는 DNA-PKcs 유전자가 결손되거나 또는 ACLY 또는 DNA-PKcs 단백질을 발현하지 못하는 세포를 사용하거나; 또는 ACLY 또는 DNA-PKcs를 과발현하는 세포를 사용하는 경우 후보 물질의 효과를 더욱 분명하게 확인가능하다. 이 때, 상기 세포는 in vitro 배지에서 배양될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 단계 (C)는 상기 후보 물질 처리 후 상기 세포의 배양액 또는 파쇄물에서 USP21 단백질 대신에 p-AMPK (AMPK 인산화) 또는 p-ACC (ACC 인산화)를 측정하는 단계이고, 상기 단계 (d)는 비처리 대조군과 비교하여 p-AMPK 또는 p-ACC를 지속적으로 증가시키는 후보 물질을 상기 질환의 예방 또는 치료 물질로 선정하는 단계인, 스크리닝 방법일 수 있다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 상기 단계 (C)는 상기 후보 물질 처리 후 상기 세포의 배양액 또는 파쇄물에서 USP21 단백질 대신에 UCP2 또는 UCP3의 전사체 또는 단백질의 발현 또는 활성을 측정하는 단계이고, 상기 단계 (d)는 비처리 대조군과 비교하여 UCP2 또는 UCP3의 전사체 또는 단백질 증가 및/또는 지방산의 세포내로의 흡수(uptake)를 증가시키는 후보 물질을 상기 질환의 예방 또는 치료 물질로 선정하는 단계인, 스크리닝 방법일 수 있다. 상기 지방산은 예컨대 팔미트산을 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 단계 (c)는 상기 USP21의 발현 또는 활성이 감소한 세포의 배양액 또는 파쇄물을 활용하여 연료(지방산 또는 포도당)의 세포내 흡수나, 혹은 저장된 연료(저장된 중성지방 또는 글리코젠)를 소비하는 민감성을 측정하는 단계이고, 상기 단계 (d)는 비처리 대조군과 비교하여 H+의 언커플링(uncoupling)이 증가한 경우 상기 질환의 예방 또는 치료 물질로 선정하는 단계인, 스크리닝 방법일 수 있다.
본 발명에 따른 스크리닝 방법은 USP21의 발현 또는 활성이 감소한 세포의 배양액 또는 파쇄물에서 ACLY 또는 DNA-PKcs 유비퀴틴(ubiquitination) 변형을 측정하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 처리된 세포에서 상기 USP21 억제에 의한 유비퀴틴 변형이 증가한 경우 상기 질환의 예방 또는 치료 물질로 선정하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 치료 물질은 근육의 유형을 산화형 제1형 근섬유로 전환하고 근육내의 지방을 감소시키면서 근육량을 증강시키는 치료제로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 골격근의 산화형 근섬유로의 전환 또는 근육내의 지방을 감소시키면서 근육량의 증가가 필요한 질환은 예컨대 근육 활성 증강, 골절 등으로 인한 근육소모, 노인성 근육손실, 또는 근소모성 질환을 포함할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용되는 단백질은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 특히 스크리닝에 사용되는 단백질의 제조방법은 유전자 재조합 기술을 이용하는 것이다. 예를 들면 상기 단백질을 코딩하는 상응하는 유전자를 포함하는 플라스미드를 원핵 또는 진핵세포 세포 예를 들면 곤충세포, 포유류 세포에 전달하여 과발현시킨 후 정제하여 사용할 수 있다. 상기 플라스미드는 예를 들면 pET28b(Novagen)과 같은 벡터에 해당 유전자를 클로닝하여 세포주에 전달이입한 후, 발현된 단백질을 정제하여 사용할 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.
또한 스크리닝에 사용되는 단백질을 암호화하는 DNA 또는 RNA 서열을 적당한 숙주 세포에서 발현시켜 그 세포 파쇄물을 만들거나 상기 스크리닝 단백질의 mRNA를 시험관내에서 번역한 후 당업계에 공지된 단백질 분리 방법에 의해 스크리닝 단백질을 정제할 수 있다. 통상, 세포잔여물(cell debris) 등을 제거하기 위해 상기 세포 파쇄물 또는 시험관내 번역한 결과물을 원심분리한 후, 침전, 투석, 각종 컬럼 크로마토그래피 등을 적용한다. 이온교환 크로마토그라피, 겔-퍼미에이션 크로마토그라피, HPLC, 역상-HPLC, 프렙용 SDS-PAGE, 친화성 컬럼 등은 컬럼 크로마토그라피의 예이다. 친화성 컬럼은, 예를 들어, 항-스크리닝 단백질 항체를 이용하여 만들 수 있다.
상기 정제된 단백질은 시험관내에서 이들을 직접 사용하여 후보 물질의 부재 또는 존재하에서 활성 여부를 확인할 수 있다. 후보 물질을 첨가한 후, 일정 시간 후에 UPS21의 발현 또는 억제 정도를 공지의 방법으로 확인할 수 있다. 이러한 방법은 예를 들면, UPS21 단백질의 농도를 측정하여 확인할 수 있다.
또한 본원에 따른 방법에 사용되는 단백질은 검출의 편이를 위해 다양한 표식물질, 예를 들면 단백질 태그, 바이오틴, 형광물질, 아세틸화, 방사선 동위원소와 같은 것으로 공지된 방법 또는 시중의 단백질 표지 키트를 사용하여 표지될 수 있으며, 표지된 물질에 적합한 검출기기를 사용하여 검출될 수 있다.
일 구현예에서, USP21 단백질을 발현하는 세포는 예를 들면 단백질을 발현(Transient 또는 Stable 전달이입 또는 내인성 발현)하는 포유류 세포, 예를 들면 이로 제한하는 것은 아니나 마우스 근육 마이오블라스트 유래의 C2C12, 인간 배아 신장 유래의 HEK293, 일차배양 근섬유(인간, 랫트, 마우스 등), 줄기세포 유래 근세포(인간, 랫트, 마우스 등)을 포함할 수 있다. 이러한 세포들을 세포배양 플레이트에 배양한 후, 여기에 후보 물질을 첨가한 후, 일정 시간 후에 세포로부터, 총 단백질을 추출하여, UPS21 단백질의 발현 또는 활성 정도를 확인할 수 있다. 대조군(후보 물질을 처리하지 않은 경우)과 비교하여, USP21의 발현 또는 활성이 감소된 것을 상기 질환의 예방 또는 치료 물질로 선정할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명에서 USP21을 발현하는 세포로서 근육세포 또는 이를 대체할 수 있는 유효한 세포, 예컨대 섬유모세포(fibroblast)를 사용할 수 있다. 상기 근육세포 또는 섬유모세포는 1차 배양 세포, 확립된 세포, 또는 인간을 제외한 실험동물의 형태로 제공될 수 있다. 상기 확립된 세포는 예컨대 C2C12, NIH 섬유모세포, 또는 그 외 다른 유래의 섬유모세포일 수 있다.
본 방법에서 사용되는 단백질의 양, 세포의 종류 및 후보 물질의 양 및 종류 등은 사용하는 구체적인 실험방법 및 후보 물질의 종류에 따라 달라지며, 당업계의 통상의 기술자라면 적절한 양을 선택할 수 있을 것이다. 실험결과 후보 물질과 접촉되지 않은 대조군과 비교하여 후보 물질의 존재하에서 USP21의 발현 또는 활성의 감소를 가져오는 물질을 상기 질환의 예방 또는 치료 물질로 선정한다. 발현 또는 활성의 감소는 대조군과 비교하여 약 99% 이하 감소, 약 95% 이하 감소, 약 90% 감소, 약 85% 감소, 약 80% 감소, 약 75% 감소, 약 70% 감소, 약 65% 이하 감소, 약 60% 이하 감소, 약 55% 감소, 약 50% 이하 감소, 약 45% 이하 감소, 약 40% 이하 감소, 약 30% 이하 감소, 약 20% 이하 감소를 의미하나, 이를 벗어나는 범위를 제외하는 것은 아니다.
본원에서 "후보 물질"은 USP21의 발현 또는 활성을 억제할 것으로 기대되는 물질을 의미하여, 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 핵산 및 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며 이에 한정되는 것은 아니다. 예컨대 후보 물질로서 저분자 화합물 또는 siRNA 등 핵산 기재 물질을 사용할 수 있다. 상기 후보 물질은 2개 이상의 아미노산 잔기, 예컨대 6개, 10개, 12개, 20개 이하 또는 20개 초과 예컨대 50개 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 후보 물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있으며 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 구입 가능하다. 후보 물질은 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, "1-비드 1-화합물" 라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은, DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994 등에 개시되어 있다.
목적에 따라 이러한 화합물은 화합물 라이브러리의 일부를 구성할 수 있으며, 라이브러리를 구성하는 화합물의 숫자도 수십개부터 수백만개까지 다양하다. 이러한 화합물 라이브러리는 펩타이드, 펩토이드 및 기타 환형 또는 선형의 올리고 머성 화합물, 및 주형을 기본으로 하는 저분자 화합물, 예컨대 벤조디아제핀, 하이단토인, 바이아릴, 카보사이클 및 폴리사이클 화합물(예컨대 나프탈렌, 페노티아진, 아크리딘, 스테로이드 등), 카보하이드레이트 및 아미노산 유도체, 디하이드로피리딘, 벤즈하이드릴 및 헤테로사이클(예컨대 트리아진, 인돌, 티아졸리딘 등)을 포함하는 것일 수 있으나, 이는 단지 예시적인 것으로 이로 한정되는 것은 아니다.
본원에서는 특히 이러한 저분자 화합물 중 USP21의 활성을 조절하거나 억제할 수 있는 물질이 포함된다. 또한 공지의 USP21 조절 물질 또는 USP21 억제제가 후보 물질로 사용될 수 있다.
또한 예를 들면 바이올로직스가 스크리닝에 사용될 수 있다. 바이올로직스는 세포 또는 바이오분자를 일컫는 것으로, 바이오분자란, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질 또는 생체내 및 생체외에서 세포 시스템 등을 이용하여 생산된 물질을 일컫는 것이다. 바이오분자를 단독으로 또는 다른 바이오분자 또는 세포와 조합으로 제공될 수 있다. 바이오분자는 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 항체, 또는 기타 혈장에서 발견되는 단백질 또는 생물학적 유기물질을 포함하는 것이다.
따라서 다른 양태에서 본 발명은 USP21 조절 약물 또는 USP21 억제제를 유효성분으로 포함하는, 골격근의 산화형 근섬유로의 전환; 근육내의 지방을 감소시키면서 근육량의 증가가 필요한 질환; 비만; 과체중 조절; 또는 지방 연소가 필요한 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 USP21 조절 약물 또는 USP21 억제제를 유효성분으로 포함하는, USP21 의존적으로 UCP2 또는 UCP3을 증가시키거나 ACLY 또는 DNA-PKcs의 유비퀴틴 변형을 촉진하는 근육의 유형을 산화형 근섬유로 전환하거나 또는 근육량을 증강시킴으로써, 근육 활성 증강, 골절 등으로 인한 근육소모, 노인성 근육손실, 또는 근소모성 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 비만을 수반하는 대사성 질환, 제2형 당뇨병, 고지혈증, 내장지방축적, 당뇨병성 신증, 신경병증, 또는 망막병증을 포함하는 비만과 당뇨에 수반되는 합병증을 예방 또는 치료하기 위한, USP21 조절 약물 또는 USP21 억제제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 USP21 조절 약물 또는 USP21 억제제를 in vitro의 근육세포, 섬유모세포, 또는 인간을 제외한 동물의 근육세포 또는 섬유모세포에 처리하는 단계를 포함하는, UCP2 또는 UCP3을 증가시키거나 ACLY 또는 DNA-PKcs의 유비퀴틴 변형을 촉진하는 근육의 유형을 산화형 근섬유로 전환하거나 또는 근육량을 증강시킴으로써, 근육 활성 증강, 골절 등으로 인한 근육소모, 노인성 근육손실, 또는 근소모성 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
USP21 조절 약물 또는 USP21 억제제는 예를 들면 USP21의 발현 또는 활성을 조절하거나 억제할 수 있는 물질로서, 저분자 화합물, 항체 및 폴리펩타이드를 포함하는 단백질, 또는 RNA와 DNA를 포함하는 핵산분자, 예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 또는 miRNA 또는 이들 임의의 조합을 포함한다.
본원의 치료제는 상기 언급한 억제제 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 또는 유효성분의 용해성 및/또는 흡수성을 유지/증가시키는 화합물을 추가로 함유할 수 있다. 또한 본원의 치료제는 비만 또는 제2형 당뇨병의 치료 또는 예방을 위하여 단독으로, 또는 수술, 약물치료 및 생물학적 반응조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다. 본원의 치료제는 상기 언급한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제형화할 수 있다. 본원의 치료제의 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니며, 공지된 억제제의 투여방법을 적용할 수 있으며, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우 피부에 붙이는 패치형, 코/호흡기를 통해 투여할 수 있으며, 신속한 치료효과를 얻기 위해서는 정맥내 주사에 의한 투여가 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 매우 다양하며, 공지된 USP21 활성 억제제의 투여량을 적용할 수 있다. USP21을 표적으로 하는 siRNA, miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, shRNA 제제 및 폴리펩타이드를 포함한 단백질 제제의 경우 비경구 투여가 선호될 수 있으나 다른 경로 및 수단을 배제하는 것은 아니다. 전형적인 약물의 경우 투약단위체는, 예를 들어 약 0.01 mg 내지 100 mg를 포함하나 상기 범위의 이하 및 이상의 범위를 배제하는 것은 아니다. 일일 투여량은 약 1μg 내지 10g 일 수 있으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.
본 발명은 USP21 발현 또는 활성 감소에 따른 UCP2 또는 UCP3의 증가, 또는 ACLY 또는 DNA-PKcs의 감소와 동시에 p-AMPK (AMPK인산화) 또는 p-ACC (ACC 인산화)의 지속적인 증가를 일으킬 때 비산화형 2형 근섬유에서 산화형 1형 근섬유로 전환되며 근육량이 증가한다는 발견에 근거한 것으로, 근골격계 질환의 예방 및 치료, 운동능력 개선, 비만 또는 과체중 상태 치료에 활용할 수 있다. 이때 골격근의 근섬유세포를 비산화형 근섬유에서 산화형 근섬유로 전환되며 동시에 근육내의 지방이 감소하면서 근육량이 증가하는 활성이 높은 근섬유로 전환될 수 있다. 따라서 위에서 제시한 새롭게 발견한 지표를 표적으로 하여 USP21의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 산화형 골격근으로의 전환을 도모하면서 근육량을 보존 또는 증가시키는데 효과적으로 사용할 수 있다.
도 1은 USP21 하위조절자인 DNA-PKcs와 ACLY의 도출을 나타낸 것이다.
도 2는 USP21 하위조절자인 DNA-PKcs와 ACLY의 프로테오믹스 분석을 나타낸 것이다.
도 3은 USP21 발현에 따른 하위조절자의 유비퀴틴 변형을 분석한 것이다.
도 4는 동물에서의 USP21 과발현에 따른 하위조절자 DNA-PKcs와 ACLY 발현의 변화를 나타낸 것이다.
도 5는 세포에서의 USP21 과발현에 따른 하위조절자 DNA-PKcs와 ACLY 발현의 변화를 나타낸 것이다.
도 6은 USP21 및 하위조절자 DNA-PKcs 또는 ACLY 발현조절에 따른 p-AMPK 활성 변화를 나타낸 것이다.
도 7은 USP21 억제에 따른 UCP2 및 UCP3의 전사체를 분석한 것이다.
도 8은 USP21 억제에 따른 미토콘드리아 생물발생, 지방산 흡수 및 산화를 분석한 것이다.
도 9는 USP21 결핍에 따른 미토콘드리아의 크기와 밀도 증가를 나타낸 것이다.
도 10은 USP21 결핍에 따른 산화형 근섬유로의 전환을 나타낸 것이다.
도 11은 USP21 결핍에 따른 산화형 근섬유로의 전환을 나타낸 것이다.
도 12는 USP21 결핍에 따른 세포 내 미토코드리아에 의한 연료 소비 민감성을 분석한 것이다.
도 13은 USP21 발현에 따른 세포 내 연료 소비 민감성을 분석한 것이다.
도 14는 USP21 결손 마우스의 비만 억제 효과를 연구한 것이다.
도 15는 고지방식이(HFD) 섭취한 USP21 결핍 마우스의 근육 내 지방량을 분석한 것이다.
도 16은 고지방식이(HFD) 섭취한 USP21 결핍 마우스의 근육량을 분석한 것이다.
도 17은 마우스 비만 모델에서 USP21 결핍에 의한 간과 지방 조직 무게 변화를 분석한 것이다.
도 18은 마우스 비만 모델에서 USP21 결핍에 의한 조직별 지방 축적량의 변화를 분석한 것이다.
도 19는 마우스 비만 모델에서 USP21의 발현을 분석한 것이다.
도 20은 마우스 비만 모델에서 USP21 결핍에 의한 혈청 ALT(alanine aminotransferase) 양의 변화를 분석한 것이다.
도 21은 마우스 비만 모델에서의 USP21에 의한 내당능 변화를 평가한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
Figure 112020142327500-pat00001
실험 방법
시험예 1. 세포주 배양
마우스 근육세포주인 C2C12 및 인간 배아 신장세포주 HEK293는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. 모든 세포주는 5% CO2가 공급되는 37℃의 배양기에서 배양하였다. C2C12는 10% 소태아혈청, 100 U/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신을 함유한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) 배지에서 배양한 후 2% 말혈청이 함유된 배지에서 분화시켜 실험에 사용하였다. HEK293 세포주는 10% 소태아혈청, 100 U/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신을 함유한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium에서 배양하였다.
시험예 2. 동물실험, 유전자 변형 동물 제작 및 연구 승인
모든 동물 실험은 서울대학교 동물실험윤리위원회의 심의 통과 후 해당 규정에 따라 시행하였다. 서울대 약학대학 실험동물실의 무균시설(specific pathogen-free)에서 동물을 사육 및 계통 유지하여 실험에 사용하였다. 해당 시설은 12시간 주기로 명암이 바뀌고 55±10%의 습도, 22±2℃의 온도가 유지되었다. 모든 동물실험은 1주 간의 환경 적응 기간을 거친 후 실시되었고, 수컷 C57BL/6 마우스를 사용하였다. 실험에 사용된 유전자 변형 동물로는 USP21tm1a/tm1a (Infrafrontier) 마우스와 Protamine-FLPE 마우스와 Ckmm-Cre (Jackson Laboratory) 마우스가 있다. USP21tm1a/tm1a 마우스는 전신 USP21 결손 마우스 형질을 관찰하기 위한 실험에 사용되었다. USP21 근육특이적 결손 마우스의 형질을 관찰하기 위해 USP21tm1a/tm1a 마우스와 Protamine-FLPE 마우스를 교배하여 대조군 야생형(USP21tm1c/tm1c, littermates)를 얻었고, 이 마우스를 다시 Ckmm-Cre 마우스와 교배하여 근육 특이적 USP21 결손 마우스를 얻었다. 유전자의 형질은 지노타이핑을 통해 결정되었으며 사용된 프라이머 서열은 아래와 같이 표로 정리하였다(표 1). 저온 노출 실험은 4℃에서 실시하였고, 마우스의 직장 온도를 재어 체온을 측정한 후 시료를 얻었다. 절식 실험에서는 마우스를 24시간 동안 절식시킨 후 근육을 적출하였다. 식이유도성 비만 모델에서는 마우스에 총 열량의 60%가 지방으로 구성된 고지방식이(D12492, Research Diets)를 연구결과에 명시된 기간 동안 공급한 후 12시간 절식 후에 시료를 얻었다.
Figure 112020142327500-pat00002
시험예 3. 인체유래물 시료분석 및 연구 승인
정상인 1명 및 당뇨 환자 1명의 근육 조직 슬라이드를 GeneTex로부터 구매하였다. 실험 프로토콜은 헬싱키 선언의 윤리 가이드라인을 준수하였으며 임상시험 심사위원회(IRB) 승인을 획득하였다.
시험예 4. 형질도입 (Transfection)
FuGENE HD 또는 Amaxa Nucleofector(Lonza)를 이용하여 플라스미드 또는 siRNA를 세포 내에 주입하였다. 각 1-3 μg의 USP21, 유비퀴틴(Ubiquitin) 플라스미드와 이에 대한 대조군으로 pCMV를 형질도입하고 최소 12시간 후에 분석하였다. ACLY에 각각 선택적인 siRNA는 100 nM SMARTpool(Dharmacon)과 해당 대조군 siRNA를 사용하여 형질도입 후 48-96 시간 후에 분석하였다. C2C12 세포주는 형질도입 후 분화시켜 분석하였다. HEK293 세포주는 유비퀴틴 플라스미드를 형질도입한 후 6시간 동안 10 μM MG132에 반응시킨 후 분석하였다.
시험예 5. 면역침강법
단백질 G 아가로오스 비드(Millipore)와 4℃에서 30분간 전처리(pre-cleaning)시킨 세포 균질액의 단백질 500 μg 당 표적 단백질에 대한 항체 1 μg 을 4℃에서 12-18시간 반응시켰다. 항원-항체 결합체를 단백질 G 아가로오스 비드와 4℃에서 90분 반응시킨 후 원심분리하여 침전된 비드에 결합한 단백질을 면역화학적 방법으로 관찰하였다. 상기 실험은 과다발현시킨 Flag 표지가 된 USP21과 상호작용하는 단백질 분석 및 검증을 위해, 과다발현시킨 유비퀴틴과 DNA-PKcs 또는 ACLY의 결합을 관찰하기 위해 수행하였다.
시험예 6. 세포 분획법
전세포 추출액(whole cell lysate)을 단백질 분석에 사용하였다. 인산염 완충식염수로 세척한 세포에 용해완충용액[10 mM Tris-HCl, pH7.1, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glycerol, 0.5% Triton X-100, 0.5% Nonident P-40, 1 mM 디티오트레이톨(dithiothreitol) 및 0.5 mM 페닐메틸술포닐 플루오리드(phenylmethylsulfonyl fluoride: PMSF)]을 처리하여 4℃에서 1시간 동안 반응시켜 용해한 뒤 10,000 g로 10분간 원심분리한 상층액을 전세포 추출액으로 사용하였다.
시험예 7. 면역화학적 분석 (western blot)
세포 추출액, 동물 조직 추출액, 면역침강물에서 얻은 동일한 양의 단백질을 도데실황산소듐-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동법(SDS-PAGE)으로 분리하였다. 크기에 따라 분리된 단백질은 190 mA, 70분 동안 나이트로셀룰로오스 막(GE healthcare) 또는 0.45 μm PVDF 막에 전이시켰다. 1시간 동안 5% 탈지유 용액에 반응시킨 후 각 단백질 특이적 항체에 반응시켰다(표 2). 이후 2차 항체로 HRP-conjugated IgG(Zymed Laboratories)를 1시간 반응시키고 ECL chemiluminescence system (GE Healthcare)를 사용하여 발색하였다.
Figure 112020142327500-pat00003
시험예 8. LC-MS 분석
USP21과 상호작용하는 단백질의 분석을 위한 LC-MS/MS: HEK293 세포주에 USP21 또는 이에 대한 대조군을 형질도입하고 24시간이 지난 후에 전세포추출물을 확보하였다. 전세포추출물을 사용하여 면역침강법을 수행하였고, 얻어진 단백질은 도데실황산소듐-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동법(SDS-PAGE)으로 분리하였다. 이후 reverse phase (low pH) 액상 크로마토그래피를 통해 분리시킨 후 이온화시켜 질량분석을 수행하였다. 결과는 Sorcerer 2 (Sage-N Research)와 Scaffold 4 Q+S (Proteome Software Inc.)를 사용하여 생성 및 분석되었다.
시험예 9. 조직학적 검사
1) 투과전자현미경 분석: 가자미근(Soleus muscles)을 적출한 즉시 Karnovsky 고정액에 고정하였다. 이후 1% 사산화 오스뮴(osmium tetraoxide)을 함유한 0.1 M 카코딜산소듐 용액에 후고정하고 0.5% 아세트산우라닐로 염색하였다. 하루가 지난 후 에탄올과 프로필렌옥사이드로 탈수한 뒤 Spurr 수지 안에서 중합하였다. 조직 박절과 관찰은 JEM-1010 (JEOL) 기기를 이용하여 서울대학교 농생명과학공동기기원에서 수행하였다.
2) 숙신산탈수소효소(SDH) 염색: 순간동결시킨 근육조직 절편을 0.6 mM 니트로테트라졸리움 (nitrotetrazolium: Sigma-Aldrich)과 50 mM 숙신산소듐이 함유된 0.2 M 인산소듐용액에 반응한 후 덮개유리를 덮어 밀봉하였다.
3) 형광면역염색: 순간동결시킨 앞정강근 조직 절편을 1차 항체인 MyHC2a와 MyHC2b (DSHB)에 반응시킨 뒤 2차 항체인 알렉사플로오르 488-염소 항 생쥐 IgG1 (AlexaFluor 488-Goat anti Mouse IgG1: ThermoFisher)와 알렉사플로오르 594-염소 항 생쥐 IgM (AlexaFluor 594-Goat anti Mouse IgM: Jackson Immunoresearch)로 반응시켜 형광표지한 후 덮개유리를 덮어 밀봉하였다. 조직 형광은 레이저 스캐닝 공초점 현미경(Leica TCS8, Leica Microsystems)을 이용하여 관찰하였다.
4) Oil Red O 염색: Oil Red O 키트(ScyTek)를 이용하여 순간동결 근육조직 절편의 지방을 염색하였다.
시험예 10. 전기천공을 매개한 생체 유전자 전달
마우스를 마취한 후 두 앞정강근(tibialis anterior muscles)에 히알루로니다아제(hyaluronidase)를 40 μg 주입하였다. 3시간 후 USP21 (Origene)을 발현하는 플라스미드 50 μg을 한쪽 앞정강근에 주입하고 반대쪽 앞정강근에는 같은 양의 대조군을 주입하였다. 그 직후 ECM830 전기천공기(Harvard Apparatus)를 이용하여 8회 전기 펄스(50 ms, 1 Hz, 100 V)를 전달하였다. 7일 후에 근육을 적출하여 분석하였다.
시험예 11. 세포호흡 측정
C2C12 세포주의 산소 소모 속도를 제조사의 방법에 따라 XFp Extracellular Flux Analyzer (Seahorse Bioscience)로 측정하였다. 실험 30분 전에 세포를 1 mM 소디움 피루베이트 25 mM, 글루코오스, 4 mM 글루타민이 포함된 비완충용액에 배양하였다. 순차적으로 XFp cell Mito stress Test kit (Seahorse Bioscience)을 활용하여 올리고마이신(1 μM), FCCP (2 μM), 로테논/antimycin A (0.5 μM)을 처리한 후 3분마다 3분간 측정한 산소량의 감소 기울기를 Fixed Delta법으로 측정하였다.
시험예 12. RNA 분리, cDNA 합성 및 실시간 RT-PCR
cDNA는 트리졸 (TRIzol: Invitrogen)을 사용하여 세포 및 조직에서 추출한 RNA와 d(T)16 프라이머 및 AMV 역전사효소를 사용하여 mRNA를 변환하여 얻었다. 확보된 cDNA는 각 유전자에 대한 프라이머와 SYBR 녹색 염료(Takara)를 사용하여 제조사의 안내에 따라 StepOne Real-Time PCR (Applied Biosystems) 기기로 정량하였다. RNA를 선택적으로 증폭하고 정량하기 위해 설계한 각각의 프라이머 서열은 아래의 표에 명시되어 있다(표 3).
Figure 112020142327500-pat00004
시험예 13. 조직학적 검사
1) 면역 조직화학적 염색: 근육조직 검체를 4% 중성 완충된 포름알데히드에 고정하여 제작한 파라핀 포매 조직을 10 μm 두께로 박절하여 슬라이드에 표본을 부착하였고, USP21 항체(표 2)를 반응시켜 염색하였다.
2) 헤마톡실린(Haematoxylin) 및 에오신(Eosin) 염색: 간, 지방, 갈색지방 검체를 10% 포르말린에 고정하여 제작한 파라핀 포매 조직을 4 μm 두께로 박절하여 염색하였다.
시험예 14. 당부하 검사 및 인슐린 내성 검사
1) 당부하 검사: 마우스를 16시간 절식시킨 후 꼬리에 면도칼로 작은 상처를 내어 얻은 혈액을 취해 공복혈당을 측정하였다 (Accu-check glucometer, Roche). 이후 포도당(2 g/kg)을 경구투여하고 15, 30, 60, 90분째에 각각 혈당을 측정하였다. 근육 특이적 USP21 결손 마우스 검사에 1.5 g/kg의 포도당을 투여하였다.
2) 인슐린 내성 검사: 고지방식이를 섭취한 마우스를 4시간 절식시킨 후 공복혈당을 잰 후 인슐린(Humalog)을 복강 내 주사하고 30, 60, 90분째에 혈당을 측정하였다. 고지방식이를 섭취한 마우스와 일반 식이를 섭취한 마우스에 각각 1.5 U/kg, 1 U/kg의 인슐린을 투여하였다.
시험예 15. 통계분석
면역화학적 분석으로 시각화한 단백질 띠 영역을 ImageJ (NIH) 또는 Photoshop CC 19.1.6 프로그램(Adobe)으로 정량하였다. 데이터는 산술평균±표준오차로 표기하였다. Two-tailed Student's t tests 또는 one-way analysis of variance tests (ANOVA)로 그룹간 유의성을 평가하여 P<0.05 또는 P<0.01을 기준으로 하였다. Pearson 또는 Spearman의 상관분석방법에 따라 상관계수 r을 구하고 통계적 유의성을 계산하였다. 엑셀 (Microsoft), Sigma Plot 10.0 (Systat Software) 또는 SPSS 25 (IBM) 프로그램을 사용하여 통계적 유의성을 계산하였다.
실험 결과
실시예 1. USP21이 새로운 기질로서 DNA-PKcs 및 ACLY와 상호 작용
본 발명에서는 프로테오믹 접근법을 사용하여 USP21 기질을 확인하고자 하였다. USP21 면역 침전, 겔내 소화 및 단백질 분석은 플래그 태그가 지정된 USP21을 과발현하는 HEK293 세포에서 총 95개의 결합 파트너를 확인하였다(도 1(b)). 5개 이상의 스펙트럼 카운트(도 1(a))를 가지며 2배 이상 풍부하게 증가한 상위 18개의 차동 결합 단백질 중에서 AMPK와 관련하여 가장 높은 스펙트럼 카운트를 갖는 단백질인 DNA-PKcs로 초점을 좁혔다. ACLY는 지질 동화 작용의 역할 때문에 또다른 표적으로 선택되었다. GO 생물학적 과정 용어 분석에서 본 발명자들은 세포 대사 과정에 관여하는 결합 파트너가 풍부하고, 또한 DNA-PKcs와 ACLY가 USP21 및 서로 연결될 수 있음을 발견하였다 (도 2). USP21과 DNA-PKcs 또는 ACLY 간의 연결은 이전에 설명되지 않았기 때문에 USP21이 대사 처리를 위한 기질로 DNA-PKcs 및 ACLY를 사용할 수 있다는 가설을 세웠다.
잠재적인 표적과 USP21의 진정한 상호 작용을 평가하기 위해, 면역 침전 및 면역 블로팅 분석(immunoblotting assay)을 수행하였고 USP21이 실제로 DNA-PKcs 및 ACLY와 결합한다는 것을 밝혀내었다(도 3(a)). USP21은 DUB이기 때문에 본 발명에서는 밴드 강도의 감쇠를 통해 확인된 DNA-PKcs 및 ACLY의 유비퀴틴화 상태에 대한 USP21 과발현 효과를 확인하였다(도 3(b)). 그런 다음 마우스 골격근을 사용하여 추가적으로 전기 천공(electroporation) 실험을 수행하여 확인된 기질에 대한 USP21의 효과를 확인하고 USP21의 강제 발현이 DNA-PKcs 및 ACLY 수준을 증가시켜 USP21의 단백질 안정화 능력을 지원함을 확인하였다(도 4). 이와 같은 결과를 C2C12 근관세포(myotube)에서 추가로 확인하였다(도 5). DNA-PKcs 또는 ACLY의 siRNA 매개 침묵은 USP21 과발현에 의한 AMPK의 억제를 막았다(도 6). 이러한 결과는 USP21이 AMPK 매개 이화 작용(catabolism)의 조절을 위한 기질로 DNA-PKcs 및 ACLY를 사용함을 보여준다.
실시예 2. 미토콘드리아 활동을 대표하는 유전자 발현의 변화
미토콘드리아 활동을 대표하는 유전자 발현의 변화를 조사하였다. 미토콘드리아 언커플링 단백질 (mitochondrial uncoupling proteins: UCPs) 중에서 골격근에서 열 발생과 지방산 (FA) 산화에 참여하는 UCP2 및 UCP3의 전사체(transcript) 수준은 야생형(wild-type: WT) 대조군과 비교하여 6시간 냉 스트레스를 받은 USP21-KO 마우스(USP21 knockout mice)에서 유의하게 상승하였다(도 7). 일관되게 USP21-KO 마우스에서 미토콘드리아 생물 발생(biogensis)과 지방산(FA) 산화 및 흡수를 담당하는 유전자의 발현 수준이 상승하였다(도 8).
실시예 3. USP21의 근육 절제에 의한 미토콘드리아 기능 자극
USP21 조절을 통해 유도된 열 발생 변화를 감안할 때, 본 발명에서는 USP21-KO 마우스 및 근육 특이 USP21 녹아웃 마우스(USP21-MKO 마우스: muscle-specific USP21 knockout (MKO) mice)가 미토콘드리아 생물 발생 및 근섬유 유형 전환에 미치는 영향을 평가하였다. 전자 현미경 분석은 USP21-KO 마우스와 USP21-MKO 마우스의 골격근에서 더 큰 크기와 고밀도의 근섬유간 및 근막하(intermyofibrillar and subsarcolemmal) 미토콘드리아를 보여주었다(도 9). 숙신산 탈수소효소 (Succinate dehydrogenase: SDH) 활성 분석은 USP21이 결핍된 동물에서 미토콘드리아 산화의 상당한 증가를 확인하였다 (도 10(a)). 앞정강근(tibialis anterior)에서 USP21의 전기 천공(electroporation) 매개 강제 발현은 SDH 활성의 증가를 방지하였다(도 10(b)).
더욱이, IIb 형 당분해 섬유의 상호 감소와 함께 II2a형 산화 섬유의 미오신 중쇄 이소 형의 수의 증가는 유전자 결실의 결과로서 근섬유 유형이 보다 산화적인 표현형으로 전환되는 것을 보여주었다(도 11). 이에 상응하여, 미토콘드리아 생물 발생, 지방산(FA) 흡수 및 이용을 나타내는 단백질을 암호화하는 유전자의 전사 수준은 KO 동물에서 더 높았으며 전체 지방산(FA) 산화의 증가를 나타내었다(도 12(a)).
미토콘드리아에 대한 USP21 제거의 진정한 조절 효과를 확인하기 위해 생체 내 유전자 전달 기술을 사용하여 USP21-MKO 마우스의 근육에서 USP21 과발현의 효과를 연구하였다. 미토콘드리아 활성과 분리에 관련된 유전자의 유도도 완전히 억제되었다 (도 12(b)). 이러한 결과는 USP21 결핍이 미토콘드리아 생물 생성, 산화 능력, 산화 표현형으로의 근섬유 유형 전환 및 지질 연료 연소를 촉진한다는 가설을 뒷받침한다.
또한, USP21의 강제 발현은 C2C12 근관세포에서 미토콘드리아 최대 산소 소비율(oxygen consumption rate: OCR)과 결합되지 않은 OCR을 지속적으로 낮추어 산화적 인산화의 분리에서 USP21의 조절 역할을 지지하였다(도 13).
실시예 4. USP21의 제거는 연료 소비 증가를 통해 항 비만 효과를 발휘
USP21 절제가 근육, 섬유 유형 전환 및 체열 생성에서 미토콘드리아 생물 발생에 미치는 영향을 확인한 후 USP21-KO가 비만에 유익한 효과를 미치는지 여부를 확인하고자 하였다. 흥미롭게도, USP21-KO 마우스는 야생형(W)에 비해 HFD로 인한 체중(BW) 증가에 저항하였다. 대조적으로, 정상 식단 (normal diet: ND)을 먹인 USP21-KO 마우스에서는 차이가 관찰되지 않았다. 추가로 USP21-MKO 마우스를 사용하고 HFD 공급으로 인한 체중(BW) 증가에 대한 USP21 절제의 억제 효과를 확인하였다(도 14). HFD로 유도된 근세포 내 지질 방울의 축적도 KO 동물에서 더 낮았다 (도 15). USP21-MKO 마우스는 지방 축적의 감소와 함께 앞정강근(tibialis anterior) 근육 질량의 증가를 보여주었다(도 16). 이러한 결과는 USP21의 절제가 근육과 지방 조직에서 지방 이화를 촉진하여 체중 증가를 억제시킨다는 결론을 뒷받침한다.
실시예 5. USP21 절제는 HFD 공급으로부터 다른 장기를 보호
HFD를 먹인 마우스에서 다른 장기의 대사 표현형의 변화를 추가로 조사하였다. 11주 동안 HFD를 먹인 USP21-KO 마우스 및 USP21-MKO 마우스는 야생형(WT) 또는 한배 새끼(litter)에 비해 간 중량 및 백색 지방 조직(white adipose tissue: WAT)이 유의하게 약화되었다(도 17). ND상의 USP21-KO 마우스 및 USP21-MKO 마우스는 대조군 동물과 비교하여 차이를 나타내지 않았다. 일관되게, 혈청 알라닌 트랜스 아미나제 수치의 변화와 조직 병리학적 분석에 의해 입증된 바와 같이, HFD를 먹인 USP21-KO 마우스 및 USP21-MKO 마우스에서 간 손상 및 지방증(steatosis)이 감소하였다 (도 18).
또한, WAT와 갈색 지방 조직(brown adipose tissue: BAT)의 지방 축적과 지방 비대는 HFD를 먹인 USP21-KO 마우스에서도 약화되었다. 유사하게, 지방 조직에 대한 USP21 절제의 억제 효과는 USP21 MKO 마우스에서 두드러졌다(도 18). 이러한 결과는 근육의 USP21 결핍이 간, WAT 및 BAT를 포함한 다른 대사 기관의 지방 축적 감소에 기여한다는 개념을 뒷받침한다.
실시예 6. USP21의 결핍은 HFD로 인한 고혈당증을 완화
골격근의 대사 기능 장애는 전신 포도당 대사를 완화하고 고혈당증을 유발한다. 근육의 USP21 발현수준과 포도당 항상성 간의 연관성을 보다 잘 이해하기 위해 제2형 당뇨병 환자의 근육에서 USP21 발현을 평가하였다. 면역화학적 분석에서 USP21 발현수준은 비 당뇨 대조군보다 당뇨병 환자에서 더 높았다(도 19). 더욱이 USP21의 근육 특이적 KO는 9주 동안 HFD 섭식을 통해 유발된 고혈당증을 현저히 약화시켰다(도 20). 또한 포도당 내성 검사 (GTT)와 인슐린 내성 검사 (ITT)를 사용한 평가에서도 이들 동물에서 혈당 수치를 감소시켰다(도 21).
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 시험예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (13)

  1. 하기 단계를 포함하는, 골격근의 산화형 근섬유로의 전환이 필요한 질환; 근육내의 지방을 감소시키면서 근육량의 증가가 필요한 질환; 비만; 과체중; 및 지방 연소가 필요한 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환의 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법:
    (a) 유비퀴틴 특이 프로테아제 21(Ubiquitin-specific protease 21: USP21)을 발현하는 세포를 제공하는 단계;
    (b) 상기 세포에 USP21의 발현 또는 활성을 억제할 것으로 기대되는 후보 물질을 처리하는 단계;
    (c) 상기 후보 물질 처리 후 상기 세포의 배양액 또는 파쇄물(lysate)에서 USP21 단백질의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및
    (d) 비처리 대조군과 비교하여 USP21의 발현 또는 활성을 감소시키는 후보 물질을 골격근의 산화형 근섬유로의 전환이 필요한 질환; 근육내의 지방을 감소시키면서 근육량의 증가가 필요한 질환; 비만; 과체중; 및 지방 연소가 필요한 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환의 예방 또는 치료 물질로 선정하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (C)는 상기 후보 물질 처리 후 상기 세포의 배양액 또는 파쇄물에서 USP21 단백질에 추가하여 USP21의 하위조절자인 ATP 시트레이트 리아제(ATP citrate lyase: ACLY) 또는 DNA 의존성 단백질 키나아제, 촉매 서브 유닛 (DNA-dependent protein kinase, catalytic subunit: DNA-PKcs)의 발현 또는 활성을 측정하는 단계이고,
    상기 단계 (d)는 비처리 대조군과 비교하여 USP21과 함께 ACLY 또는 DNA-PKcs의 발현 또는 활성을 감소시키는 후보 물질을 상기 질환의 예방 또는 치료 물질로 선정하는 단계인, 스크리닝 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (c)는 상기 후보 물질 처리 후 상기 세포의 배양액 또는 파쇄물에서 USP21 단백질의 발현 또는 활성 측정에 추가하여 p-AMPK (AMPK 인산화) 또는 p-ACC (ACC 인산화)를 측정하는 단계이고,
    상기 단계 (d)는 비처리 대조군과 비교하여 USP21의 발현 또는 활성을 감소시키면서 p-AMPK 또는 p-ACC를 지속적으로 증가시키는 후보 물질을 상기 질환의 예방 또는 치료 물질로 선정하는 단계인, 스크리닝 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (c)는 상기 후보 물질 처리 후 상기 세포의 배양액 또는 파쇄물에서 USP21 단백질에 추가하여 미토콘드리아 언커플링 단백질 2(mitochondrial uncoupling protein 2: UCP2) 또는 미토콘드리아 언커플링 단백질 3(mitochondrial uncoupling protein 3: UCP3)의 전사체 또는 단백질의 발현 또는 활성을 측정하는 단계이고,
    상기 단계 (d)는 비처리 대조군과 비교하여 USP21의 발현 또는 활성을 감소시키면서 UCP2 또는 UCP3의 전사체 또는 단백질의 발현 또는 활성을 증가시키는 후보 물질을 상기 질환의 예방 또는 치료 물질로 선정하는 단계인, 스크리닝 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (c)는, USP21 단백질의 발현 또는 활성 측정에 추가하여, 상기 USP21의 발현 또는 활성이 감소한 세포의 배양액 또는 파쇄물을 활용하여 지방산 또는 포도당의 세포내 흡수(uptake)나 혹은 저장된 중성지방 또는 글리코젠을 소비하는 민감성을 측정하는 단계이고,
    상기 단계 (d)는 비처리 대조군과 비교하여 USP21의 발현 또는 활성을 감소시키면서, 지방산 또는 포도당의 세포내로의 흡수를 증가시키거나 또는 저장된 중성지방 또는 글리코젠의 소비를 증가시키는 후보 물질을 상기 질환의 예방 또는 치료 물질로 선정하는 단계인, 스크리닝 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 상기 USP21의 발현 또는 활성이 감소한 세포의 배양액 또는 파쇄물에서 ACLY 또는 DNA-PKcs의 유비퀴틴(ubiquitination) 변형을 측정하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 처리된 세포에서 상기 USP21 억제에 의한 유비퀴틴 변형이 증가한 경우 상기 질환의 예방 또는 치료 물질로 선정하는 단계를 포함하는, 스크리닝 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 USP21을 발현하는 세포는 근육세포 또는 섬유모세포(fibroblast)인, 스크리닝 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 근육세포 또는 섬유모세포는 1차 배양 세포, 확립된 세포, 또는 인간을 제외한 실험동물의 형태로 제공되는 것인, 스크리닝 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 확립된 세포는 C2C12 또는 NIH 섬유모세포인, 스크리닝 방법.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 치료 물질은 근육의 유형을 산화형 제1형 근섬유로 전환하고 근육내의 지방을 감소시키면서 근육량을 증강시키는 치료제로 사용되는 것인, 스크리닝 방법.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    골격근의 산화형 근섬유로의 전환이 필요한 질환 또는 근육내의 지방을 감소시키면서 근육량의 증가가 필요한 질환이 근육 활성 증강이 필요한 질환, 골절로 인한 근육소모, 노인성 근육손실, 또는 근소모성 질환인, 스크리닝 방법.
  12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 후보물질은 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 핵산 및 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 스크리닝 방법.
  13. UPS21 조절 약물 또는 UPS21 억제제를 유효성분으로 포함하는, 골격근의 산화형 근섬유로의 전환이 필요한 질환; 근육내의 지방을 감소시키면서 근육량의 증가가 필요한 질환; 비만; 과체중; 또는 지방 연소가 필요한 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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