JP5543774B2 - ドナー収獲工程の間に島細胞がアポトーシスすることを防止する新規方法 - Google Patents
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Description
本願は、2007年3月20日に出願された米国特許出願第60/783,414号に基づく優先権を主張し、当該出願の全体を本明細書中に援出する。
ランゲルハンス島は、膵臓内でインスリンを生産する細胞を含む多細胞体である。平均的なヒトは、約百万個の島を有し、そしてそれらは、膵臓内の細胞の全数の約2〜3パーセントを含む。膵臓は、インスリンを生産するベータ細胞を宿すランゲルハンス島を含む。ベータ細胞は、血中グルコースレベルをモニターし、そしてグルコールのピークと釣り合うように細かく計測された量のインスリンを放出する。I型及びII型糖尿病は、これらのベータ細胞の90パーセント超が損傷を受けたときに発症する。
したがって、収獲プロセスの間に島細胞がアポトーシスから保護する方法が必要である。本発明は、この必要性に応えるものである。
本発明は、ドナーの収獲プロセスの間に島細胞がアポトーシスを経験することを阻害する方法であって、島単離に先立って、eIF5A siRNAを島細胞ドナーの島細胞に投与することを含み、ここで、当該eIF5A siRNAが当該島細胞内でのeIF5Aの発現を阻害し、そしてそれにより当該島細胞におけるアポトーシスが阻害される前記方法を提供する。siRNA又はアンチャンス構築物は、当該構築物がeIF5Aの発現を阻害する限り、使用されうる。好ましいsiRNAは、以下のヌクレオチド配列:
AGUCGACCUUCAGUAAGGCdTdT
を含む。
AGUCGACCUUCAGUAAGGCdTdT
を含むeIF5A siRNAを含む。
AGUCGACCUUCAGUAAGGCdTdT
を含む。2005年11月28日に出願された同時係属中の出願第11/293,391号(その全体を本明細書中に援用する)は、追加の例示的eIF5A siRNAsを提供し、そして他の細胞型においてeIF5Aの発現を阻害するために使用されてきた、そしてまたアポトーシスを阻害することが示されていた他のアンチャンスを提供する。当業者は、上記eIF5A配列が与えられれば、他のeIF5A siRNAsを設計し、そして過度な実験を実施せずに発現を阻害するsiRNAの能力について容易に試験することができるであろう。図6〜11は、eIF5A、例示的eIF5A siRNAs、及びアンチャンス構築物の配列を提供する。本発明の他の態様においては、eIF5Aのアンチャンス構築物は、eIF5Aの発現を阻害するために使用され、そしてそれゆえ島細胞のアポトーシスを阻害することができる。
AGUCGACCUUCAGUAAGGCdTdT
を含む。
AGUCGACCUUCAGUAAGGCdTdT
を含む。
全RNAを、単離されたマウス島から抽出し、そしてβ−アクチン及びeIF5AについてRT−PCRを実施した(図1)。休止した刺激されていない島は、eIF5A−mRNAの陽性レベルを示した。
マウスに、遅い逆行門脈灌流(図2)により、1mlのsiRNA(CT(対照)配列又はeIF5A,5μg)又は生理食塩水を、群当りn=2で導入した。膵臓を、膵管のコラゲナーゼ灌注により消化し、そして島を、Lewis et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,102:12153−12158 Epub 12005 Aug.12100,2005により記載されたように単離した。(マウス当り50個の)島を16時間インキュベートした。次いで全RNAを抽出し、そしてβ−アクチン及びeIF5AについてRT−PCRを実施した(図3)。eIF5A/β−アクチンに関するmRNA比は、5.24(CT−siRNA)と3.01(eIF5A−siRNA)であった。図3は、eIF5AのmRNAレベルが、siRNAで処理された細胞において低下していたことを示す。この実験をn=3マウスで繰り返し、そして島をRNA抽出のために3連でインキュベートした;結果は、最初の観察と一致していた。
マウスに、5秒以内で完結する流体力学的逆行門脈灌流により、群当りn=2で、1mlのsiRNA(CT又はeIF5A,5μg)又は生理食塩水を導入した。
ビオチン化siRNA(50μg)を、前記したように島内に灌流させた(遅い灌流、n=1)。膵臓を、染色のためにホルマリン中に固定した。
siRNA分子を、Dharmacon,Lafayette,COにより合成した。eIF5Aと対照siRNAの配列は、それぞれ、以下の:
5’CGGAAUGACUUCCAGCUGAdTdT3’
と
AGUCGACCUUCAGUAAGGCdTdT
であった。
島の1回細胞懸濁を温やかなトリプリン処理により達成した。細胞を、PBSで洗浄し、そしてPBS中、0.3%サポニン、EDTA 1mM,Rnase,1%アジド、1%FCS、及び50μg/ml PIを含むサポニン−PI混合物を添加した。細胞を十分にボルテックスし、そしてFACSによりサブ−GI集団について分析する前6時間暗所4℃でインキュベートした。
Claims (11)
- ヒトドナー収穫工程の間に島細胞がアポトーシスを経験しないように阻害するための医薬の製造におけるeIF5A1 siRNAの使用であって、前記eIF5A1 siRNAが配列番号37に記載のヌクレオチド配列を標的とし、前記eIF5A1 siRNAが当該島細胞内でのeIF5A1の発現を阻害し、そしてそれにより当該島細胞内でのアポトーシスを阻害する、使用。
- 前記eIF5A1 siRNAが、配列番号38に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載の使用。
- 前記eIF5A1 siRNAが、2本の異なる鎖を含む、請求項1に記載の使用。
- 前記siRNAの鎖の1本が、配列番号38に記載のヌクレオチド配列を含み、前記siRNAの鎖の反対の鎖が、配列番号39に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項3に記載の使用。
- 前記医薬が、前記島細胞ドナーの門脈を通しての灌流を介して投与される、請求項1に記載の使用。
- 前記医薬が、前記島細胞ドナーの門脈を通しての流体力学的灌流を介して投与される、請求項1に記載の使用。
- 収穫された島細胞におけるアポトーシスを阻害するための医薬の製造における配列番号38に記載のヌクレオチド配列を含むeIF5A1 siRNAの使用であって、前記eIF5A1 siRNAは、当該島細胞内でのeIF5Aの発現を阻害し、そしてeIF5A1発現の阻害がアポトーシスを阻害する、使用。
- eIF5A1 siRNAを含む、島細胞におけるアポトーシスを阻害するための組成物であって、当該siRNAがeIF5A1の発現を阻害し、そしてそれにより当該島細胞におけるアポトーシスを阻害し、前記eIF5A1 siRNAが配列番号37に記載のヌクレオチド配列を標的とする、組成物。
- 前記eIF5A1 siRNAが、配列番号38に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項8に記載の組成物。
- 前記eIF5A1 siRNAが、2本の異なる鎖を含む、請求項8に記載の組成物。
- 前記siRNAの鎖の1本が、配列番号38に記載のヌクレオチド配列を含み、前記siRNAの鎖の反対の鎖が、配列番号39に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項10に記載の組成物。
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