KR20200018779A - 혈관 오가노이드, 상기 오가노이드의 제조 및 사용 방법 - Google Patents

혈관 오가노이드, 상기 오가노이드의 제조 및 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 혈관 분화할 수 있는 줄기세포를 제공하는 단계, 상기 줄기세포에서 중배엽 분화를 자극하는 단계, 상기 줄기세포에서 혈관 분화를 자극하는 단계, 상기 줄기세포로부터 세포 응집체를 발달시키는 단계, 상기 세포 응집체를 콜라겐성 3D 기질에 매립하는 단계 및 상기 콜라겐성 3D 기질에서 응집체의 혈관 분화를 자극하는 단계를 포함하는, 인공 혈관 오가노이드를 생성하는 방법; 상기 방법으로부터 수득 가능한 오가노이드, 연구되는 조작 및 스크리닝에서 상기 방법 및 오가노이드의 용도 및 방법을 수행하기 위한 키트에 관한 것이다.

Description

혈관 오가노이드, 상기 오가노이드의 제조 및 사용 방법
본 발명은 인공 혈관 오가노이드 분야에 관한 것이다.
혈관은 혈관 질환으로 불리는 다양한 질환에 걸리기 쉽다. 혈관 망상구조의 장애는 심각할 수 있거나 치명적인 것으로 판명될 수 있는 다양한 건강 문제를 일으킬 수 있다. 이러한 질병은 환경적으로 야기되는 병인으로 인해 또는 발달 결함으로 인해 발생할 수 있다.
굿윈(Goodwin)(Microvasc Res. 2007; 74(2-3): 172-183)은 많은 질병의 발병에서 혈관형성에 영향을 미치는 제제의 활성을 평가하기 위한 시험관 내 혈관형성 분석을 기술한다.
더피 등(Duffy et al.)(European Cells and Materials 21, 2011: 15-30)은 표면 부착성 2D 배양물에서 콜라겐-글리코사미노글리칸 스캐폴드의 시험관 내 혈관화를 기술한다.
나카가미 등(Nakagami et al.)(Hypertension 2006; 48: 112-119)은 배아 줄기세포를 내피세포 및 혈관 평활근 세포를 함유하는 발아 혈관(sprouting blood vessel)으로 발달하게 만드는 매트리겔(matrigel)을 사용한 세포-기질 상호작용에 의한 혈관화 방법을 제공한다.
쿠수마 등(Kusuma et al.)(PNAS 110(31), 2013: 12601-12606), 게레흐트-니어 등(Gerecht-Nir et al.)(Laboratory Investigation 83(12), 2003: 1811-1820), 제WO2007/140340 A2호, 제WO2014/145871 A1호, 제US 2014/273220 A1호 및 제WO2017/015415 A1호는 조작된 기질에서 단리된 초기 혈관 세포로부터의 혈관 구조의 형성을 기술한다. 기질에 도입 전에, 세포는 초기 혈관 세포로 분화된 다음 (트립신화 및/또는 40 μm 메쉬 여과에 의해) 개별화되는 인간 만능성 줄기세포로부터 유래될 수 있다. 개별 세포는 기질에서 성장하고 거기서 조립되어 혈관 망상구조를 형성한다. 이 논문의 목적은 재생 의학에 유용한 자가-조립 세포를 제공하는 것이었다.
제WO2011/115974 A1호는 표면에 2D 배양된 혈관 망상구조를 형성하기 위한 장치에 관한 것이다.
쉔 등(Shen et al.)(Cell Research 13 (5) (2003): 335-341)은 성체 토끼 평활근 세포 및 마우스로부터 분화된 내피세포로부터의 조작된 혈관의 형성을 기술한다.
여전히, 선행 혈관 모델은 자연 생체 내 형성된 혈관 망상구조와 충분한 유사성이 부족하며, 개선되고 보다 실물과 유사한 혈관 모델이 필요하다.
따라서, 본 발명의 목적은 개선된 혈관 모델뿐만 아니라 질병 모델 및 스크리닝 절차에서의 시험과 같은 더욱 광범위한 용도를 허용하는 모델을 제공하는 것이다.
본 발명은 혈관 분화할 수 있는 줄기세포를 제공하는 단계, 상기 줄기세포에서 중배엽 분화를 자극하는 단계, 상기 줄기세포에서 혈관 분화를 자극하는 단계, 상기 줄기세포로부터 세포 응집체를 발달시키는 단계, 상기 세포 응집체를 콜라겐성 3D 기질에 매립하는 단계 및 상기 콜라겐성 3D 기질에서 응집체의 혈관 분화를 자극하는 단계를 포함하는, 인공 혈관 오가노이드를 생성하는 방법을 제공한다.
밀접하게 관련된 측면에서, 본 발명은 10%-50% 라미닌, 20%-70% 콜라겐 I, 및/또는 2%-30% 콜라겐 IV를 포함하는 콜라겐성 3D 기질에 혈관 줄기세포를 매립하는 단계 및 상기 콜라겐성 3D 기질에서 상기 줄기세포의 혈관 분화를 자극하는 단계를 포함하는, 인공 혈관 오가노이드를 생성하는 방법을 제공한다.
이러한 방법들은 본 발명의 추가의 측면을 형성하는 혈관 오가노이드를 제공하는데 사용될 수 있다. 특히, 본 발명은 혈관 모세관의 상호연결된 망상구조를 포함하는 인공 혈관 오가노이드 배양물을 제공하며, 상기 모세관은 내피 및 혈관주위 혈관주세포를 갖는 기저막을 포함하고, 여기서 (i) 상기 오가노이드는 본 발명의 방법에 의해 생산되고/되거나 (ii) 모세관은 콜라겐을 갖는 하이드로겔을 포함하는 인공 3D 기질에 매립되고/되거나 (iii) 오가노이드 배양물은 개별 혈관 및 모세관 교차점 사이의 혈관을 계수함으로써 계수되는 바와 같이 40 내지 1000개의 혈관을 포함한다. 세 가지 특성 (i), (ii) 및 (iii) 모두가 본 발명의 인공 혈관 오가노이드 배양물에 의해 개별적으로 또는 조합하여 요구될 수 있는 본 발명의 특징이다.
본 발명은 추가로, 본 발명의 인간 혈관 오가노이드를 비-인간 동물에게 도입하는 단계 및 상기 오가노이드가 이의 혈관 모세관을 자라게 하는 단계를 포함하는, 인간 혈관 모세관을 갖는 비-인간 동물 모델을 제공하는 방법을 제공하고, 여기서 상기 인간 모세관은 내피 및 혈관주위 혈관주세포를 갖는 기저막을 포함한다.
본 발명은 또한, 이러한 인공 혈관 오가노이드 배양물을, 예를 들어, 삽입물(insert)로서 포함하는 비-인간 동물 모델에 관한 것이다. 게다가, 인간 혈관 모세관을 갖는 비-인간 동물 모델이 제공되며, 여기서 상기 인간 모세관은 내피 및 혈관주위 혈관주세포를 갖는 기저막을 포함한다.
본 발명은 추가로, 병리, 예를 들어, 당뇨병의 모델로서 생성하는데 있어서의 본 발명의 배양물 또는 비-인간 동물 모델 또는 방법의 용도에 관한 것이며, 여기서, 방법의 세포, 오가노이드 또는 비-인간 동물 모델의 오가노이드는 상기 병리, 예를 들어 당뇨병의 경우 고혈당증 또는 췌장 베타-세포의 파괴를 발생시키는 병인에 적용된다.
본 발명은 추가로, 본 발명의 임의의 측면에 따르는 배양물 또는 비-인간 동물 모델에 또는 상기 배양물 또는 비-인간 동물 모델의 생성 동안 상기 후보 화합물을 투여하는 단계 및 후보 화합물을 투여하지 않은 상기 배양물 또는 동물 모델과 비교하여 상기 배양물 또는 동물 모델에서의 생리학적 차이를 모니터링하는 단계를 포함하는, 병인 또는 병리에 영향을 미치는 후보 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명은 당뇨병에 대한 새로운 치료 모델을 제공하였다. 따라서, 본 발명은 당뇨병성 혈관병증(diabetic vasculopathy), 폐쇄성 혈관병증(occlusive angiopathy), 변경된 혈관 투과성(altered vascular permeability), 조직 저산소증(tissue hypoxia), 심장 질환(heart disease), 뇌졸중(stroke), 신장 질환(kidney disease), 실명(blindness), 상처 치유 장애(impaired wound healing) 또는 만성 피부 궤양(chronic skin ulcer)에서와 같은 비후화된 모세관 기저막의 치료 또는 예방에 있어서의 Notch3 활성화 경로 억제제 (예를 들어, 감마-세크레타제 억제제, Notch3 억제제, DLL4 억제제 또는 이들의 조합)의 용도를 제공한다. 또한 이러한 치료 또는 예방에 사용하기 위한 Notch3 활성화 경로 억제제 (예를 들어, 감마-세크레타제 억제제, Notch3 억제제, DLL4 억제제); 또는 이러한 치료 또는 예방을 위한 약제 또는 약제학적 조성물의 제조에 사용하기 위한 Notch3 활성화 경로 억제제 (예를 들어, 감마-세크레타제 억제제, Notch3 억제제, DLL4 억제제)의 용도가 제공된다.
마지막으로, 본 발명은 (i) Wnt 효능제 또는 GSK 억제제; (ii) VEGF, FGF, BMP로부터 선택되는 혈관 분화 인자; (iii) 콜라겐성 3D 기질을 포함하는, 임의의 본 발명의 방법에 따르는 인공 혈관 오가노이드의 생성에 적합한 키트를 제공한다.
본 발명의 모든 실시양태는 하기 상세한 설명에서 함께 기술되며 모든 바람직한 실시양태는 모든 실시양태, 측면, 방법, 오가노이드, 동물 모델, 용도 및 키트에 똑같이 관련된다. 예를 들어, 키트 또는 이들의 구성요소는 본 발명의 방법에 사용되거나 적합할 수 있다. 기술된 방법에 사용된 모든 구성요소는 키트에 들어 있을 수 있다. 본 발명의 오가노이드는 본 발명의 방법의 결과이거나 본 발명의 방법 및 용도에서 사용될 수 있다. 본 발명의 방법의 바람직한 상세한 설명은 본 발명의 생성되거나 사용된 오가노이드 또는 동물 모델의 적합성에 대해 동일하게 판독한다. 달리 언급되는 경우를 제외하고, 모든 실시양태는 서로 조합될 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 인공 혈관 오가노이드를 생성하는 방법을 제공한다. 이러한 인공 오가노이드는 시험관 내에서 성장하지만 생체 내 모세관 구조와 매우 유사하다. 오가노이드는 사실적인 미세-해부구조를 보이는 3차원으로 시험관 내에서 생산된 기관의 소형화되고 단순화된 버전이다. 이들은 조직, 배아 줄기세포 또는 유도 만능성 줄기세포로부터의 1개 또는 수 개의 세포로부터 유래되며, 이들은 자기-재생 및 분화 능력으로 인해 3차원 배양물에서 자기-조직화될 수 있다.
인간 줄기세포로부터 유래된 본 발명의 오가노이드는 인간 혈관의 구조 및 기능을 나타낸다. 배아 줄기세포 및 유도 만능성 줄기세포로부터의 3D 혈관 오가노이드가 제공된다. 이들 혈관 오가노이드는 내피, 혈관주위 혈관주세포, 및 기저막을 함유하고, 내강화된 상호연결된 모세관 망상구조로 자기-조립된다. 마우스에게 이식된 인간 혈관 오가노이드는 인간 세동맥 및 세정맥을 포함한 관류된 인간 혈관 수상구조(vascular tree)를 형성한다. 흥미롭게도, 시험관 내에서 고혈당증 및 염증성 사이토킨에의 혈관 오가노이드의 노출은 기저막의 비후화 및 내피세포의 전사 변화를 유도하여, 당뇨병 환자에서의 미세혈관 변화를 모방한다. 약물 스크린이 혈관 오가노이드에서 이러한 "당뇨병성" 혈관병증을 약화시키는 γ- 세크레타제 억제제를 규명하였다. γ- 세크레타제를 수억 명의 환자에게 영향을 미치는 당뇨병성 혈관병증에 대한 잠재적 치료 표적으로 확인함으로써 본 발명자들이 보여준 바와 같이, 혈관 오가노이드는 약물 발견을 위한 질병 모델을 생성하는데 사용될 수 있다.
이러한 오가노이드를 생성하는 방법은 혈관 분화할 수 있는 줄기세포를 제공하는 단계, 상기 줄기세포에서 중배엽 분화를 자극하는 단계, 상기 줄기세포에서 혈관 분화를 자극하는 단계, 상기 줄기세포로부터 세포 응집체를 발달시키는 단계, 상기 세포 응집체를 콜라겐성 3D 기질에 매립하는 단계 및 상기 콜라겐성 3D 기질에서 응집체의 혈관 분화를 자극하는 단계를 포함한다.
혈관 분화할 수 있는 줄기세포는 예를 들면 만능성 줄기세포이다. 만능성 줄기세포는 배아 줄기세포로부터 유래될 수 있거나 이들은 유도 만능성 줄기세포 (iPS)일 수 있다. iPS가 바람직하다.
줄기세포는 중배엽-혈관 경로로 분화된다. 분화는 세포를 조직 (중배엽/혈관) 특이적 성장 또는 분화 인자와 접촉시킴으로써 달성할 수 있다. 그후 세포는 원하는 조직으로 발달할 수 있다. 이러한 조직 특이적 성장 또는 분화 인자는 바람직하게는 본 발명의 방법의 상이한 단계들에서 사용되는 중배엽 및/또는 혈관 분화 인자일 수 있다. 이것은 후기 발달에서 각 유형의 세포 조직으로의 발달을 결정할 것이다. 이에 의해 세포는 만능성(pluripotent)에서 다능성(multipotent) 세포로 전이될 것이다. 다른 조직 유형은 가능하지 않거나 만능성 상태로의 복귀에 의해서만 다시 가능할 수 있다. 통상적으로 모든 세포가 선택된 조직 유형으로 분화되는 것은 아니다. 이것은 통상적으로 세포의 약 50% 이상 또는 적어도 55% 또는 적어도 60%, 또는 적어도 65% 또는 적어도 70% 또는 적어도 75%가 선택된 조직 유형 (특히 중배엽)으로의 분화를 시작하고 처음으로 각각의 조직 운명을 갖는 다능성 세포에 의한 분화 능력 (세포량의 분율로서의 %-값)을 감소시키도록 변환될 때 충분하다. 물론, 이러한 분화 운명은 인공 성장 및 역분화 자극의 사용에 의해 미분화된 또는 덜 분화된 상태로 되돌아가지 않는 세포에만 적용된다. 분명히, 체세포조차도 만능성 세포로 되돌릴 수 있으며 이것이 본원에서 분화된 상태를 정의할 때를 의미하는 것은 아니다. 바람직하게는, 일단 중배엽 또는 혈관 분화가 개시되면, 세포를 만능성 세포로 되돌리는 어떠한 인자도 세포에 도입되지 않는다.
본 발명의 오가노이드는 만능성 줄기세포를 배양하여 수득될 수 있다. 원칙적으로, 윤리적 이유가 허용되는 경우, 세포는 또한 전능성(totipotent)일 수 있다.
"전능성" 세포는 발달에서 정상적으로 발생하는 것과 같은 자극에 노출된 후 생식 계열을 포함한 신체의 어떠한 세포 유형으로도 분화될 수 있다. 따라서, 전능성 세포는 전체 유기체로 성장, 즉 발달할 수 있는 세포로서 정의될 수 있다.
본 발명에 따르는 방법에서 사용되는 세포는 바람직하게는 전능성이 아니라 (엄격하게는) 만능성이다.
특히 바람직한 실시양태에서, (이와 관련된 모든 추가의 실시양태를 포함한) 본 발명의 세포는 만능성이다.
"만능성" 줄기세포는 전체 유기체로 성장할 수는 없지만, 세 가지 모든 배엽, 즉 중배엽, 내배엽 및 외배엽에서 유래하는 세포 유형을 야기할 수 있고, 유기체의 모든 세포 유형을 야기할 수 있다. 만능성(pluripotency)은 예를 들어 특정 줄기세포에서 그 자체로 세포의 특징일 수 있거나, 이것은 인공적으로 유도될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 만능성 줄기세포는 체세포, 다능성 세포, 단능성 세포 또는 전구 세포로부터 유래되며, 여기서 만능성이 유도된다. 이러한 세포를 본원에서는 유도 만능성 줄기세포라고 한다. 체세포, 다능성 세포, 단능성(unipotent) 세포 또는 전구 세포는 예를 들어 환자로부터 사용될 수 있으며, 이것은 본 발명의 방법에 적용되는 만능성 세포로 전환된다. 이러한 세포 또는 생성된 오가노이드 배양물은, 예를 들어, 본 발명의 방법에 따른 오가노이드 배양물 개발 동안 이상(abnormality)에 대해 연구될 수 있다. 환자는 예를 들어 혈관 장애를 앓고 있을 수 있다. 상기 장애의 특징이 본 발명의 오가노이드에서 재현되고 조사될 수 있다.
"다능성" 세포는 유기체의 둘 이상의 상이한 기관 또는 조직 각각으로부터 적어도 하나의 세포 유형을 야기할 수 있으며, 여기서 상기 세포 유형은 동일하거나 상이한 배엽으로부터 기원할 수 있지만, 유기체의 모든 세포 유형을 야기할 수는 없다.
이와 달리, "단능성" 세포는 단지 하나의 세포 계통의 세포로 분화할 수 있다.
"전구 세포"는, 줄기세포와 같이, 통상적으로 단 하나의 표적 세포만으로 분화할 수 있는 제한된 옵션을 갖는 특정 유형의 세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포이다. 전구 세포는 통상적으로 단능성 세포이며, 이것은 또한 다능성 세포일 수 있다.
분화 능력이 감소함에 따라, 줄기세포는 다음 순서로 분화된다: 전능성, 만능성, 다능성, 단능성. 본 발명의 오가노이드의 발달 동안, 줄기세포는 만능성 (또한, 전능성 세포가 가능함)에서 다능성 중배엽, 혈관 또는 내피 줄기세포로 분화되고, 내피세포 및 혈관주세포의 단능성 줄기세포로 더욱 분화된다.
바람직하게는, 줄기세포는 포유류, 파충류, 조류, 양서류 또는 어류와 같은 척추동물로부터 유래된다. 육지에 사는 척추동물이 특히 바람직하다. 비-인간 동물 및 인간이 가능하다. 본 발명의 모든 측면 및 실시양태에 대해 포유류, 예를 들어 마우스, 소, 말, 고양이, 개, 비-인간 영장류가 특히 바람직하며; 인간 세포가 가장 바람직하다. 오가노이드를 포함하는 비-인간 동물 모델은 동일한 동물로부터 선택될 수 있다. 줄기세포 및 동물 모델은 동일한 유기체가 아닐 수 있다.
줄기세포의 분화는 당업계에서 표준 기술이 되었다. 예를 들면, 혈관 이식편을 형성하기 위한 분화 및 성장 인자는 제WO2016/094166 A1호에 개시되어 있다. 이러한 성장 인자가 또한 분화 인자로서 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 중배엽 분화를 유도하는 단계를 포함한다. 한 방향(예를 들어, 중배엽)으로 특이적으로 분화를 유도하는 분화 자극 및 비특이적 분화를 유도하는 분화 자극이 있으며, 몇몇 다른 분화 경로 중에는 중배엽이 있다. 이러한 비특이적 분화는 게레흐트-니어 등에서 사용된 바와 같이 FBS (태아 소 혈청)와 같은 혈청에 의해 달성될 수 있다 (배경 항목 참조). 비특이적 분화는 신경 외배엽을 포함한 외배엽 및 내배엽을 포함하여 다양한 배엽이 존재하게 할 수 있다.
본 발명의 선호에 따르면, 특이 중배엽 분화는 예를 들어 중배엽 특이 분화 인자에 의해 수행된다. 대안적이지만 덜 바람직하게는, 중배엽은 분화된 세포로부터 선택될 수 있다. 선택은 특이 분화 자극과 조합될 수 있다. 세포의 선택은 세포의 단리 및 개별화를 필요로 하기 때문에 바람직하지 않다. 본 발명에 따르면, 이러한 개별화는 세포가 이 단계에서 응집체를 형성하거나 형성하기 시작해야 하기 때문에 불리하다. 바람직하게는, 중배엽 자극 후 세포는 이의 세포의 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 70% 또는 심지어 적어도 80%가 중배엽 분화 중에 있다. 바람직하게는, 중배엽 분화는 줄기세포를 Wnt 효능제 또는 GSK 억제제, 바람직하게는 CHIR99021로 처리하는 것을 포함한다. Wnt 효능제 또는 GSK 억제제는 높은 비율의 중배엽 분화를 달성한다. Wnt 효능제는 CHIR99021과 같은 Wnt 자극제일 수 있다.
줄기세포는 또한 혈관 분화에 의해 처리된다. 혈관 분화는 본 발명의 방법에서, 특히 3D 기질 내에서, 또한 세포가 상기 응집체를 형성하고 있을 때 세포의 응집체가 3D 기질로 도입되기 전에 연속적으로 또는 반복적으로 자극된다.
혈관 분화는 내피 분화를 포함할 수 있고 작은 모세관 또는 모세관 전구체 형성을 초래한다. 방법의 초기 단계에서, 예를 들어, 3D 기질 처리 이전에, 이러한 내피/혈관 분화는 3D 기질에서 형태를 변화시킬 동일한 잘 정의되고 실물과 유사한 모세관을 야기하지 않을 수 있다.
중배엽 분화에서와 같이, 바람직하게는 혈관 분화는 이의 세포의 바람직하게는 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 70% 또는 심지어 적어도 80%가 혈관 분화 중에 있는 특이 혈관 분화이다. 바람직하게는 상기 줄기세포에서 혈관 분화는 줄기세포를 VEGF 및/또는 FGF 및/또는 BMP 및/또는 12% (v/v) 이하 대기 산소의 저산소 조건으로 처리하는 것을 포함한다. VEGF, FGF, BMP 및 저 산소는 조합될 수 있다. 바람직한 VEGF는 VEGF-A이다. 바람직한 FGF는 FGF-2이다. 바람직한 BMP는 BMP4이다. 저산소 조건은 12% (v/v) 이하의 대기 산소, 즉, 세포에 공급된 기상(gas phase)의 산소이다. 기상은 바람직하게는 대기압에 있다. 바람직하게는 산소 함량은 훨씬 적으며, 바람직하게는 10% 이하, 보다 바람직하게는 8% 이하, 예를 들어 6% 이하이다 (모두 v/v %이다). 산소 함량은 바람직하게는 2% 이상, 예를 들어 2% 내지 12%이다 (모두 v/v %이다). 바람직하게는, 세포는 10 ng/ml 내지 50 ng/ml, 바람직하게는 약 30 ng/ml 농도의 VEGF를 갖는 배지에서 배양된다. 바람직하게는, 세포는 10 ng/ml 내지 50 ng/ml, 바람직하게는 약 30 ng/ml 농도의 FGF를 갖는 배지에서 배양된다. 바람직하게는, 세포는 10 ng/ml 내지 50 ng/ml, 바람직하게는 약 30 ng/ml 농도의 BMP를 갖는 배지에서 배양된다.
3D 기질에 도입 전 줄기세포는 세포의 응집체를 형성하고 있다. 바람직하게는 이들 세포는 이러한 응집을 가능케 하는 현탁 배양 중에 있다. 이것은 중배엽 및/또는 혈관 분화를 위해 처리된 줄기세포가 이미 작은 응집체로 있음을 의미한다. 이러한 응집체는 통상적으로 안정한 3D 기질 없이 액체 배양 배지에서 현탁 배양으로 현탁될 수 있도록 작다.
분화 후, 이제는 응집체로 분화된 줄기세포를 3D 기질에 매립하기 전 통상적으로 응집체의 세포의 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 예를 들어 약 50%는 내피세포이다. 바람직하게는 응집체의 세포의 적어도 20%, 예를 들어 30%는 혈관주세포이다. 이와 함께, 바람직하게는 세포의 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 예를 들어 약 80%는 혈관 세포이다.
일단 응집체가 3D 기질에 매립되면, 본 발명의 방법은 또한 상기 3D 기질에서의 응집체의 혈관 분화를 포함한다. 바람직하게는 또한 이러한 혈관 분화는 특이 혈관 분화를 포함한다. 응집체의 특히 바람직한 혈관 분화는 응집체의 세포를 VEGF 및/또는 FGF로 처리하는 것을 포함한다. 바람직한 VEGF는 VEGF-A이다. 바람직한 FGF는 FGF-2이다. 바람직하게는, 기질 중의 응집체는 60 ng/ml 내지 150 ng/ml, 바람직하게는 약 100 ng/ml 농도의 VEGF를 갖는 배지에서 배양된다. 바람직하게는, 기질 중의 응집체는 60 ng/ml 내지 150 ng/ml, 바람직하게는 약 100 ng/ml 농도의 FGF를 갖는 배지에서 배양된다.
배양 후, 특히 중배엽 및/또는 혈관 분화 동안 줄기세포로부터 형성된 세포 응집체는 3D 기질에 매립된다. 3D 기질에 매립된 이러한 응집체는 바람직하게는 적어도 30개 세포 또는 적어도 50개 세포, 바람직하게는 적어도 100개 세포, 특히 바람직하게는 적어도 300개 세포, 예를 들어 약 1000개 세포의 크기를 갖는다. 바람직하게는 크기는 100000개 세포 미만, 예를 들어 30000개 세포 미만이다. 세포 응집체는 확립된 크기를 가져야 하지만 액체 현탁 배양에서 낮은 안정성을 겪을 정도로 너무 커서는 안된다. 응집체는 특히 세포간 결합 및 세포간 연결에 의해 서로 부착된 세포의 축적이다.
바람직하게는, 상기 응집체는 응집체 형성 개시로부터 7 내지 15일째에 콜라겐성 3D 기질에 매립된다. 이때, 응집체는 통상적으로 적절한 크기와 분화 상태를 갖는다. 바람직한 연대표 (time-line)가 도 1a에 도시되어 있다. 바람직하게는, 중배엽 분화 자극 (중배엽 유도)는 2-6일째이고, 바람직하게는 혈관 분화 자극 (혈관 계통 촉진)은 4-14일째이다.
세포를 3D 기질에 매립하는 것은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 방법은 3D 기질 물질을 유동화하고 세포의 응집체 주위에서 3D 기질을 고화 또는 겔화시키는 것이다.
3D 기질은 콜라겐성 기질이며, 이것은 바람직하게는 적어도 50 wt.-% 콜라겐을 갖는다. 콜라겐은 콜라겐 I, 콜라겐 II, 콜라겐 III 및 콜라겐 IV를 포함한다. 콜라겐 I 및 콜라겐 IV가 가장 바람직하다. 바람직하게는 적어도 50%는 콜라겐 I 또는 콜라겐 IV로 이루어지며, 가장 바람직하게는 콜라겐 I과 콜라겐 IV의 혼합물로 이루어진다.
응집체는 삼차원 (3D) 기질에서 배양된다. 3D 기질은 평평한 표면 상의 접시에서의 2D 배양과 같은 2D 배양과는 구별된다. "3D 배양"은 배양이 한쪽 벽 (예를 들어 접시의 바닥 판)에 의해 막히지 않고 3차원 모두로 확장될 수 있음을 의미한다. 바람직하게는 3D 기질을 포함한 이러한 배양은 바람직하게는 현탁 배양이다. 3D 기질은 겔, 특히 강성의 안정한 겔일 수 있으며, 이것은 성장하는 세포 배양물/조직의 추가의 확장 및 분화를 초래한다. 겔은 하이드로겔일 수 있다. 본 발명에 따르는 적합한 3D 기질은 콜라겐을 포함한다. 보다 바람직하게는 3D 기질은 세포외 기질 (ECM) 또는 콜라겐, 라미닌, 엔탁틴, 및 헤파린-설페이트 프로테오글리칸 또는 이들의 조합으로부터 선택된 이의 임의의 성분을 포함한다. 세포외 기질은 엥겔브레스-홀름-스웜 종양 (Engelbreth-Holm-Swarm tumor) 또는 라미닌, 콜라겐, 바람직하게는 타입 4 콜라겐, 엔탁틴, 및 임의로 추가의 헤파란-설페이트 프로테오글리칸 또는 이의 임의의 조합과 같은 이의 임의의 성분으로부터 유래할 수 있다. 이러한 기질은 매트리겔이다. 매트리겔은 당업계에 알려져 있으며 (US 4,829,000) 이전에 3D 심장 조직 (WO 01/55297 A2) 또는 신경 조직 (WO 2014/090993)을 모델링하는데 사용되었다. 바람직하게는 기질은 라미닌, 콜라겐 및 엔탁틴을, 바람직하게는 20%-85% 라미닌, 3%-50% 콜라겐 및 기질이 겔을 형성하도록 하기에 충분한 엔탁틴, 통상적으로 0.5%-10% 엔탁틴의 농도로 포함한다. 라미닌은 콜라겐 양이 겔을 형성하기에 불충분하다면 겔을 형성하기 위해 엔탁틴의 존재를 필요로 할 수 있다. 매트리겔-풍부 기질은 약 50%-85% 라미닌, 5%-40% 콜라겐 IV, 임의로 1%-10% 니도겐, 임의로 1%-10% 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 및 1%-10% 엔탁틴을 중량부로 함유하는 적어도 3.7 mg/ml의 농도를 포함할 수 있다. 본 발명에 따르면, 콜라겐 함량은 바람직하게는 증가되며, 특히 바람직하게는 콜라겐 I에 의해 증가된다. 모든 실시양태에서 본 발명의 특히 바람직한 기질은 10%-50% 라미닌, 20%-70% 콜라겐 I, 및/또는 2%-30% 콜라겐 IV; 바람직하게는 추가로 0.5%-10% 니도겐, 0.5%-10% 헤파란 설페이트 프로테오글리칸, 및/또는 0.5%-10% 엔탁틴 (모두 wt.-%)을 포함한다. 이러한 백분율은 고체 단백질성 성분에만 관련되며, 즉 하이드로겔 중의 주성분일 수 있는 물과 같은 액체 성분에는 관련되지 않는다. 매트리겔의 고체 성분은 통상적으로 대략 60% 라미닌, 30% 콜라겐 IV, 및 8% 엔탁틴을 포함한다. 3D 기질은 매트리겔과 콜라겐의 혼합물, 예를 들어 2:1 내지 1:3 혼합물, 바람직하게는 약 1:1의 매트리겔:콜라겐 I일 수 있다. 기질 성분에 대해 제공된 모든 %-값은 wt.-%이다. 이러한 값은 공급원에 따라, 예를 들어, +/- 30%까지 변할 수 있다. 엔탁틴은 라미닌 및 콜라겐과 상호작용하는 가교 (bridging) 분자이다. 이러한 기질 성분은 단계 r)에서 첨가될 수 있다. 이들 성분은 또한 본 발명의 키트의 바람직한 부분이다. 3D 기질은 EGF (표피 성장 인자), FGF (섬유 아세포 성장 인자), NGF, PDGF, IGF (인슐린-유사 성장 인자), 특히 IGF-1, TGF-β, 조직 플라스미노겐 활성화제 중 어느 하나와 같은 성장 인자를 추가로 포함할 수 있다. 3D 기질은 또한 이러한 성장 인자들 중의 어느 것을 함유하지 않을 수 있다.
일반적으로, 3D 기질은 생체적합성 기질의 3차원 구조이다. 이것은 바람직하게는 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 히알루로난, 메틸셀룰로스, 라미닌 및/또는 알기네이트를 포함한다. 기질은 겔, 특히 하이드로겔일 수 있다. 유기-화학적 하이드로겔은 폴리비닐 알콜, 나트륨 폴리아크릴레이트, 아크릴레이트 중합체 및 풍부한 친수성 그룹을 갖는 공중합체를 포함할 수 있다. 하이드로겔은 친수성이며 때로는 물이 분산 매질인 콜로이드 겔로 발견되는 중합체 쇄의 망상구조를 포함한다. 하이드로겔은 고흡수성 (이들은 99 wt.-% 이상의 물을 함유할 수 있음) 천연 또는 합성 중합체이다. 하이드로겔은 또한 이들의 상당한 수분 함량으로 인해 자연 조직과 매우 유사한 유연성 정도를 갖는다. 3차원 기질 또는 이의 성분, 특히 ECM 또는 콜라겐이 여전히 생성된 조직 배양물에 남아있을 수 있다. 바람직하게는 3D 기질은 콜라겐성 기질이며, 바람직하게는 이것은 타입 I 및/또는 타입 IV 콜라겐을 함유한다.
바람직하게는 3D 기질은 하이드로겔이다. 기질, 특히 하이드로겔은 10 내지 30의 점탄성 저장 계수 G'를 가질 수 있다. 점탄성 물질에서 저장 계수는 탄성 부분을 나타내는 저장된 에너지 및 점성 부분을 나타내는 열로 소산된 에너지를 측정한다. 예를 들어 유량계에 의해 본 발명에 따라 사용될 수 있는, 저장 계수를 결정하는 방법은 문헌[Anguiano et al. PLoS ONE 2017, 12(2): e0171417]에 제공되어 있다.
바람직하게는 콜라겐성 3D 기질은 10%-50% 라미닌, 20%-70% 콜라겐 I, 및/또는 2%-30% 콜라겐 IV; 바람직하게는 추가로 0.5%-10% 니도겐, 0.5%-10% 헤파란 설페이트 프로테오글리칸, 및/또는 0.5%-10% 엔탁틴 (모두 wt.-%)을 포함한다. 매트리겔은 통상적으로 50%-85% 라미닌, 5%-40% 콜라겐 IV, 1%-10% 니도겐, 1%-10% 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 및 1%-10% 엔탁틴 (고체, 단백질성 성분만)을 포함한다.
본 발명은 또한 혈관 줄기세포를 10%-50% 라미닌, 20%-70% 콜라겐 I, 및/또는 2%-30% 콜라겐 IV를 포함하는 콜라겐성 3D 기질에 매립하는 단계 및 상기 콜라겐성 3D 기질에서 상기 줄기세포의 혈관 분화를 자극하는 단계를 포함하는, 인공 혈관 오가노이드를 생성하는 방법을 제공한다. 지금까지 논의된 모든 측면 및 바람직한 실시양태가 이 방법에 적용되며, 이것이 또한 본 발명의 독립적인 측면을 형성한다. 본원에서, 이러한 3D 기질은 생체 내 혈관 망상구조를 연상시키는 매우 유리한 혈관 망상구조를 초래하는 것으로 나타났다. 특히, 이러한 망상구조는 큰 내강을 가지며 모델 동물의 순환계와 연결되어 모델 동물에 통합될 수 있다. 바람직하게는 혈관 줄기세포는 중배엽 줄기세포를 혈관 줄기세포로 분화시킴으로써 생성되며, 바람직하게는 중배엽 줄기세포는 특히 상기 언급된 바와 같이 만능성 줄기세포에서 중배엽 분화를 자극함으로써 수득되었다. 이러한 측면들 모두는 상기 설명과 조합 가능하다.
본 발명의 모든 실시양태 및 측면에서, 바람직하게는 응집체의 세포는 적어도 5일, 바람직하게는 적어도 7일 동안 상기 3D 기질에서 배양된다. 3D 기질에서의 배양은 5 내지 60일 또는 그 이상, 바람직하게는 적어도 10일 동안 이루어질 수 있다.
3D 기질 자체는 현탁 배양에서 현탁될 수 있다.
3D 기질에서, 응집체는 기저막을 형성하는 혈관주위 혈관주세포로 둘러싸인 내피세포에 의해 형성된 내피를 포함하는 혈관 망상구조를 형성하며, 이것은 하기에 추가로 기술된다. 혈관 망상구조의 자가-조립은 통상적으로 혈관을 기질로 발아시킴으로써 발아 혈관신생(sprouting angiogenesis)을 통해 발생한다.
본 발명은 혈관 모세관의 상호연결된 망상구조를 포함하는 인공 혈관 오가노이드 배양물을 추가로 제공하며, 상기 모세관은 내피 및 혈관주위 혈관주세포를 갖는 기저막을 포함하고, 여기서 (i) 상기 오가노이드는 본 발명의 방법에 의해 생산되고/되거나 (ii) 모세관은 콜라겐을 갖는 하이드로겔을 포함하는 인공 3D 기질에 매립되고/되거나 (iii) 오가노이드 배양물은 개별 혈관 및 모세관 교차점 사이의 혈관을 계수함으로써 계수되는 바와 같이 40 내지 1000개의 혈관을 포함한다. 세 가지 특성 (i), (ii) 및 (iii) 모두가 본 발명의 인공 혈관 오가노이드 배양물에 의해 개별적으로 또는 조합하여 요구될 수 있는 본 발명의 특징이다. 오가노이드는 여전히 3D 기질 또는 이의 일부를 포함할 수 있다 (ii). 상기 방법에서 3D 기질에 대해 전술한 바와 동일한 것이 오가노이드에 적용된다.
오가노이드는 인공 조직으로 간주된다. "인공"은 이것이 시험관 내에서 성장하며 크기, 조도, 형태 및 세포 조직화와 같은 인공 배양물의 특정한 특성을 갖는다는 것을 의미한다. 형태는 불규칙하고 자연 발생 조직과 다를 수 있으며 세포 조직화는 크기 제한으로 인해 상이할 수 있다. 특히, "인공"은 자연 발생 조직 및 기관과 이의 일부, 예를 들어 자연 조직 박편을 제외한다. 3D 기질은 여전히 배양물에 존재할 수 있고/있거나 오가노이드는 이러한 기질에서의 성장에 의해 결정되는 형태를 가질 수 있다. 예를 들어 오가노이드는 3D 기질, 특히 상기한 바와 같은 것에서 성장에 의해 수득될 수 있다. 인공 오가노이드 배양물은 특히 생체 내 발달된 혈관계 또는 이의 조직 샘플의 배양물이 아니다.
오가노이드에서 혈관의 수는 놀랍게도 높으며 인공 배양물에서 이전에는 달성되지 않았다 (iii). 바람직하게는, 오가노이드 배양물은 개별 혈관 및 모세관 교차점 사이의 혈관을 계수함으로써 계수되는 바와 같이 적어도 40개, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 60개, 적어도 100개, 적어도 200개 또는 적어도 300개 또는 그 이상의 혈관을 포함한다. 1000개 모세관의 상한값은 예를 들어 세포 배양 웰 플레이트에서의 스크리닝 방법을 위해 여전히 관리할 수 있는 작은 크기를 갖는 통상의 오가노이드의 결과이지만, 물론 오가노이드 배양을 계속함으로써 훨씬 더 큰 크기 및 모세관 수가 가능하다. 모세관 수는 당해 분야에서 통상적인 바와 같이, 즉, 개별 혈관 및 모세관 교차점 사이의 혈관을 계수함으로써 계수된다. 수는 오가노이드의 작은 부분에서 계수하고 그 수를 전체 오가노이드에 외삽하는 것으로 추론될 수 있다.
바람직하게는, 인공 혈관 오가노이드 배양물의 혈관 모세관은 1 μm 내지 30 μm, 바람직하게는 5 μm 내지 20 μm의 평균 직경을 갖는다. 모세관의 이러한 큰 직경 및 용적은 순환 동물 모델에서 관류를 가능하게 한다. 바람직하게는, 혈관 모세관의 평균 직경은 적어도 1 μm, 보다 바람직하게는 적어도 2 μm, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 3 μm, 적어도 4 μm, 적어도 5 μm, 적어도 6 μm 또는 그 이상이다.
인공 혈관 오가노이드는 바람직하게는 가장 큰 치수에서 100 μm 내지 10 mm의 크기를 갖는다. 250 μm 내지 10 mm 또는 500 μm 내지 5 mm의 크기가 바람직하다. 이러한 크기는 오가노이드 자체, 즉 전체 혈관 망상구조를 포함하는 배양물의 크기이며, 바람직하게는 오가노이드는 여전히 3D 기질에 있다.
이러한 특히 약 1-2 mm의 크기는 오가노이드를 대규모 시험 목적으로 사용될 수 있는 96 웰 플레이트와 같은 세포 배양 웰 플레이트에 대해 관리 가능하게 한다. 오가노이드는 안정하고, 물리적 스트레스를 견딜 수 있어 예를 들어 피펫에 의해 운반할 수 있으며, 따라서 이들은 일상적인 실험실 취급 또는 스크리닝 로봇에서의 자동화 처리에 적합하다.
인공 혈관 오가노이드는 구상체(globular body)의 형태로 제공될 수 있으며, 예를 들어 특히 가장 짧은 치수가 가장 긴 치수의 20% 이상, 특히 가장 긴 치수의 30% 이상 또는 40% 이상이다. 바람직하게는 인공 혈관 오가노이드의 용적은 적어도 1×106 μm3, 특히 바람직하게는 적어도 2×106 μm3, 적어도 4×106 μm3, 적어도 6×106 μm3, 적어도 8×106 μm3, 적어도 10×106 μm3, 적어도 15×106 μm3이고/이거나 크기는 적어도 250 μm, 특히 바람직하게는 적어도 350 μm이다.
오가노이드는 또한 디스크로 제공될 수 있으며, 이것은 용이한 취급을 위해 자유 부유 환경 (free floating environment)에서 현탁될 수 있다.
본 발명의 인공 오가노이드에서 충분한 혈관주위 혈관주세포의 존재는 특히 놀라우며 오가노이드에서의 본 발명의 혈관 망상구조가 생체 내 특성을 달성하였음을 보여준다. 혈관주위 혈관주세포가 내피세포를 지원한다. 내피세포와 혈관주위 혈관주세포의 비는 오가노이드 배양 시간에 따라 변할 수 있다. 바람직하게는, 인공 혈관 오가노이드 배양물에서 내피세포 대 혈관주위 혈관주세포의 비는 100:1 내지 1:10 사이이다. 바람직하게는, 비는 50:1 내지 1:5, 또는 25:1 내지 1:4 또는 10:1 내지 1:3 또는 5:1 내지 1:2이다. 통상적으로, 어린 오가노이드에서는, 내피세포가 과잉이고, 더 오래된 오가노이드에서는 비가 약 1:1일 수 있거나, 심지어 내피세포에 비해 혈관주세포 과잉을 초래할 수 있다.
바람직하게는 인공 혈관 오가노이드 배양물의 혈관 모세관은 성숙 내피세포를 포함한다. 성숙 내피세포는 ICAM-1 발현에 의해 반응함으로써 TNF-알파에 반응성일 수 있다. 바람직하게는 인공 혈관 오가노이드 배양물의 혈관 모세관은 성숙 혈관주세포를 포함한다. 혈관주세포의 성숙도는 성숙한 혈관주세포의 발현 마커를 결정함으로써 검출될 수 있다.
내피세포는 기저막 (바닥막이라고도 함)에 의해 둘러싸일 수 있다. 기저막은 콜라겐 IV, 피브로넥틴 및/또는 라미닌을 포함할 수 있으며; 이것은 콜라겐 IV가 풍부할 수 있다. 기저막 두께가 모세관의 건강에 대한 마커일 수 있으며 스크리닝 또는 다른 시험 방법의 지표로서 결정될 수 있다. 인공 혈관 오가노이드 배양물의 혈관 모세관의 기저막은 모세관의 크기에 따라 0.1 μm 내지 3 μm, 바람직하게는 0.3 μm 내지 2.5 μm 범위의 두께를 가질 수 있다. 바람직하게는 인공 혈관 오가노이드의 혈관 모세관의 기저막의 평균 두께는 0.3 μm 내지 2.5 μm, 바람직하게는 0.6 μm 내지 2.1 μm, 특히 바람직하게는 0.8 μm 내지 1.8 μm, 가장 바람직하게는 약 1.2 μm이다. "약"은 이 경우 +/- 30%를 의미한다.
본 발명의 또 다른 특징은 오가노이드가 생체 내 혈관 수상구조에서 발견되는 바와 같이 세정맥 및 세동맥을 발달시킨다는 것이다.
본 발명은 추가로, 특히 상기한 바와 같은 본 발명의 인간 혈관 오가노이드를 비-인간 동물에게 도입하는 단계 및 상기 오가노이드가 이의 혈관 모세관을 자라게 하는 단계를 포함하는, 인간 혈관 모세관을 갖는 비-인간 동물 모델을 제공하는 방법을 제공하고, 여기서 상기 인간 모세관은 내피 및 혈관주위 혈관주세포를 갖는 기저막을 포함한다. 바람직하게는, 상기 인간 오가노이드는 비-인간 동물의 신장 위에 또는 안에 도입된다. 본 발명은 또한 본 발명에 따르는 삽입된 인공 혈관 오가노이드 배양물을 포함하는 비-인간 동물 모델을 제공한다. 상기한 바와 같이, 본 발명의 오가노이드의 이점은 이의 다양성 및 혈관 모세관의 생체 내-유사 구조이다. 비인간 동물에 도입하여 생체 내에서 이러한 모세관의 거동을 연구하는 것이 가능하다.
당뇨병과 같은 혈관 질환을 연구하고 조사하기 위한 동물 모델은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어 WO 2015/044339 A1). 이러한 모델은 통상적으로 질병 상태를 일으키는 유전적 변형을 가진 동물을 기반으로 한다. 그러나, 이러한 돌연변이는 또한 연구 전제를 변경시키고 잠재적으로 질병 발생뿐만 아니라 임의의 시험된 치료 옵션에 대한 반응을 변경시킨다. 따라서, 실제와 같은 상황을 연구할 필요가 있다. 인간 혈관 시스템의 모델이 특히 바람직하다. 본 발명은 시험 동물에서의 이식에 적합한 오가노이드를 제공함으로써 그 목표를 달성한다. 상기 기술된 바와 같이, 시험관 내에서 성장된 본 발명의 오가노이드는 생체 내에서, 그러나 인공 및 제어 가능한 환경에서 (예를 들어 여전히 결합 조직 대신 3D 기질에서) 형성되는 혈관 망상구조와 높은 유사성을 갖는다. 이제 비-인간 동물에 도입될 수 있는 본 발명의 혈관 시스템의 특성 중에는 내피 및 혈관주위 혈관주세포를 갖는 기저막을 갖는 모세관이 있다. 따라서, 본 발명은 또한 인간 혈관 모세관을 갖는 비-인간 동물 모델을 제공하며, 여기서 상기 인간 모세관은 내피 및 혈관주위 혈관주세포를 갖는 기저막을 포함한다. 이러한 모든 종류의 동물 모델이 함께 기술되며 각각의 바람직한 또는 추가의 실시양태가 모든 본 발명의 동물 모델에 대해 판독된다.
본 발명은 이제 비-인간 동물에서 인간 혈관 모세관을 연구할 수 있게 한다. 따라서, 바람직하게는 오가노이드는 비-인간 동물에서 인간 세포, 즉 인간 혈관 모세관을 갖는 것으로부터 유래된다. 비-인간 동물은 바람직하게는 척추동물, 예를 들어 포유류, 파충류, 조류, 양서류 또는 어류이다. 육지에 사는 척추동물이 특히 바람직하다. 본 발명의 모든 측면 및 실시양태에 대해 포유류, 예를 들어 마우스, 소, 말, 고양이, 개, 비-인간 영장류가 특히 바람직하다. 물론, 또한 임의의 척추동물이 오가노이드 및 이에 따라 혈관 모세관의 공급원으로서 사용될 수 있다. 그러나 물론, 주목할만한 장점은 인간 오가노이드와 관련이 있으며 오가노이드를 사용하지 않고도 비-인간 동물을 모델 유기체로 만드는 것이 또한 가능하다. 바람직하게는, 비-인간 동물은 오가노이드 거부를 피하기 위해 면역력이 저하된다.
배경 섹션에 요약된 바와 같이 인간 내피세포를 포함하는 이전의 비-인간 동물과 달리, 본 발명은 인간 세포를 비-인간 동물에 도입할 뿐만 아니라 인간의 완전히 발달된 모세관 시스템을 비-인간 동물에 도입한다. 즉, 인간 내피세포가 인간 모세관 수상구조, 특히 세정맥 및 세동맥을 포함한 모세관 시스템을 연상시키는 구조로 인간 기저막 및 인간 혈관주세포의 주변에서 조사된다.
바람직하게는 인공 혈관 오가노이드 배양물의 혈관 모세관 또는 동물 모델에서의 인간 혈관 모세관은 비-인간 동물의 혈액 순환계에 의해 관류된다. 상기 한 바와 같이, 오가노이드의 모세관이 비-인간 동물 모델의 혈관계에 연결될 수 있다는 것이 본 발명의 이점 중 하나이다. 이러한 연결은 일단 동물의 적절한 위치에 이식되면 형성될 것이다. 매우 반응성인 위치는 신장 막이지만, 조직 이식 및 트랜스-그래프팅 연구 기술에 대해 당업계에 공지되어 있는 바와 같이 다른 위치도 물론 적합하다. 복강내 임의의 기관 또는 피하 이식에 의한 임의의 기관과 같은 다른 기관이 사용될 수 있다. 특정 경우에, 주어진 위치는, 예를 들어 하이드로겔 또는 스펀지와 같은 적합한 기질에 성장 인자를 공급함으로써 모세관 성장의 추가 자극을 필요로 할 수 있다.
본 발명의 인공 혈관 오가노이드 배양물은 또한 오가노이드에서 세포의 성장과 활성에 대한 외부 (예를 들어 약물 또는 다른 자극) 또는 내부 (돌연변이) 영향의 효과를 연구하기 위한 연구 도구로서 사용될 수 있다. 따라서, 추가의 측면에서, 본 발명은 (i) 본 발명의 방법 동안 임의의 단계에서 또는 발달된 (완성된) 오가노이드 또는 동물 모델에 대한 세포에서 관심 유전자의 발현을 감소 또는 증가시키는 단계, 또는 (ii) 본 발명의 방법 동안 임의의 단계에서 오가노이드의 발달 동안 세포에 또는 발달된 (완성된) 오가노이드 또는 동물 모델에 관심 후보 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 발달 혈관 조직 효과, 예를 들어 결함, 특히 발달 결함을 조사하는 방법을 제공한다. 관심 유전자는 건강한 혈관 조직 발달 동안 활성일 때 필수적이거나 유해한 것으로 의심되는 유전자일 수 있다. 바람직한 유전자는 질병과 관련된 유전자, 예를 들면, 유전자 질환의 원인 인자인 유전자이다. 유전자에서 발현을 감소시키거나 증가시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 녹아웃, 녹다운 방법 또는 돌연변이유발 (특히 RNA 간섭, 안티센스 억제, shRNA 침묵, CRISPR-Cas에 의한 돌연변이유발 등), 또는 이식유전자의 도입 (예를 들어 녹인)을 각각 포함한다. 이러한 감소 또는 증가는 예를 들어 유도성 프로모터 및/또는 조건부 녹-아웃 또는 녹-다운 또는 녹-인을 갖는 유전자 작제물을 도입함으로써 조건부일 수 있다. 필수 유전자의 조건부 돌연변이의 도입 또는 치사 유전자의 도입은 예를 들어 가역적 유전자 트랩을 포함하는 적합한 조건부 돌연변이 벡터를 사용함으로써 가능하다. 조건부 돌연변이는 바람직하게는 가역적 돌연변이를 촉진하며, 이것은 예를 들어 이중-플렉스 시스템(double-Flex system)(WO 2006/056615 A1; WO 2006/056617 A1; WO 2002/88353 A2; WO 2001/29208 A1)에서와 같이 자극시 각각 유전자 활성 또는 비활성 상태로 역전될 수 있다. 돌연변이는 특정 유전자에서 무작위적이거나 부위-지향적일 수 있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 가역적 돌연변이는 무작위 (정방향) 또는 부위 지향적 (역방향) 돌연변이유발에 의해 만능성 줄기세포에 도입된다. 적합한 벡터는 가역적 돌연변이를 갖는 삽입 카세트를 포함한다. 돌연변이는 본 발명의 방법의 임의의 단계에서 켜지거나 꺼질 수 있다. 벡터 또는 다른 핵산은 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 전기천공법으로 세포에 도입될 수 있다. 주어진 돌연변이를 갖는 세포를 제공하는 것도 물론 가능하다. 이러한 세포는 환자로부터 단리될 수 있으며, 이어서 만능성 줄기세포 상태를 유도하는 단계 및 세포를 예를 들어 상술한 방법에 의해 본 발명의 조직으로 발달되게 하는 단계가 뒤따를 수 있다. 환자는 특정 관심 질환, 특히 혈관 결함 또는 모세관 기형을 가질 수 있다. 후보 화합물이 후보 치료 가능성과 관련하여 아래에 추가로 설명된다. 그러나, 임의의 후보 화합물이 또한 세포, 모세관 또는 전체 오가노이드에 대한 임의의 원하는 효과에 대해 분석될 수 있다. 바람직한 후보 화합물은 작은 유기 분자이다.
본 발명의 임의의 방법 또는 배양물 또는 비-인간 동물 모델에서, 바람직하게는 혈관 또는 모세관이 병인에 적용되며 상기 오가노이드 또는 인간 동물 모델이 병리의 모델이다.
본 발명의 모세관 형성 과정은 장애를 겪을 수 있다; 대안적으로, 병리학적 상태가 오가노이드에 그대로, 예를 들어 배양물에, 또는 동물 모델에서 임플란트로서 도입될 수 있다.
연구 목적을 위한 병리의 유도는 당업계에 공지되어 있으며, 유해한 화합물 또는 병원체에의 노출, 불리한 식이 또는 기계적 스트레스 또는 상해 또는 이들의 조합일 수 있다 (예를 들어 US 2010/124533 A1에 개시된 바와 같음). 병원체는 미생물, 특히 박테리아 또는 진균 및 바이러스를 포함한다. 병리는 또한 유전 장애 또는 기능부전의 결과일 수 있다.
병인은 고혈당증 및/또는 염증을 포함할 수 있다. 이들 둘 다는 예를 들면 당뇨병에서 발견될 수 있다. 특히 바람직하게는, 병리는 당뇨병이다. 염증은 하나 이상의 염증성 사이토킨, 바람직하게는 TNF-알파 및/또는 IL-6의 노출 또는 유도를 포함할 수 있다. 고혈당증은 2형 당뇨병을 연상시키는 증가된 글루코스 수준을 의미한다. 이러한 글루코스 수준은 예를 들어 적어도 50 mM, 바람직하게는 적어도 70 mM일 수 있다. 당뇨병을 유도하는 조건의 예는 1-2.5주 동안 75 mM D-글루코스 + 1 ng/mL TNF-α + 1 ng/mL IL-6이다. 오가노이드의 혈관에서의 당뇨병성 변화는 기저막의 비후화 (증가된 콜라겐 타입 IV, 피브로넥틴, 라미닌, 퍼레칸), 감소된 혈관 성장 및 내피/혈관주세포 사멸을 포함한다. 동물 모델에서, 당뇨병은 또한 췌장 베타-세포의 결핍과 같은 당뇨병의 유기적 원인을 갖는 동물을 선택함으로써; 또는 췌장 베타-세포 부족을 유발함으로써 유도될 수 있다. 베타-세포 부족은 1형 당뇨병에서와 같은 자가면역 파괴에 의해 또는, 예를 들어 스트렙토조토신에 의해 유도되는 화학 독성에 의해 야기될 수 있다.
자가면역 1형 및 특히 2형 당뇨병 (T2D)의 유병률은 지속적으로 증가하고 있으며, 이로 인해 전세계적으로 이미 4억 4천만 명 이상의 환자에서 유행하고 있다. T2D에는 다른 인구의 유전적 소인 이외에 비만, 노화, 영양 상태 및 신체 비활동성과 같은 다양한 위험 요인이 있다. 높은 혈중 글루코스의 결과는 손상된 혈관을 포함하여, 죽상동맥경화 및 만성 당뇨병성 미세혈관병증을 야기한다. 당뇨병성 미세혈관병증의 구조적 특징은 세포외 기질 단백질, 특히 IV형 콜라겐의 증가된 발현 및 침착으로 인한 모세관 기저막의 비후이다. 이러한 변화는 폐쇄성 혈관병증, 변경된 혈관 투과성, 또는 조직 저산소증을 야기하여, 심장 질환, 뇌졸중, 신장 질환, 실명, 상처 치유 장애, 만성 피부 궤양, 또는 절단과 같은 합병증을 초래한다. 이러한 병태가 본 발명의 오가노이드에서 연구될 수 있지만, 반드시 동물 모델에서 연구되는 것은 아니다.
당뇨병성 미세혈관 변화가 개, 햄스터, 또는 원숭이에서 발생할 수 있지만, 단일 실험 동물 모델이 인간 환자에서 보이는 혈관 변화의 모든 임상적 특징을 표시하지는 않는다. 더욱이, 이러한 혈관 변화는 이전의 인간 시험관 내 세포 배양 모델에서 불충분하게 나타난다. 따라서, 삶을 바꾸는 이환율 및 더욱 증가하는 사망률을 야기하는, 수억 명의 당뇨병 환자에게 영향을 미치는 혈관 변화에 대한 포괄적인 이해는 여전히 부족하다. 본 발명의 3D 인간 혈관 오가노이드는 진짜 인간 미세혈관의 형태학적 특징 및 분자 서명을 나타낸다. 이러한 인간 3D 혈관은 마우스와 같은 비-인간 동물에서 생체 내에서 혈관 수상구조를 성장시킬 수 있다. 중요하게는, 이들 오가노이드는 당뇨병성 미세혈관병증을 모델링하고 "당뇨병"-유도된 혈관 손상으로부터 보호하도록 표적화될 수 있는 경로를 스크리닝하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 추가로, 본 발명의 임의의 측면 및 실시양태에 따르는 배양물 또는 비-인간 동물 모델에 또는 상기 배양물 또는 비-인간 동물 모델의 생성 동안 상기 후보 화합물을 투여하는 단계 및 후보 화합물을 투여하지 않은 상기 배양물 또는 동물 모델과 비교하여 상기 배양물 또는 동물 모델에서의 생리학적 차이를 모니터링하는 단계를 포함하는, 병인 또는 병리에 영향을 미치는 후보 화합물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 스크리닝에 사용된 방법, 오가노이드 또는 비-인간 동물 모델에서 사용되는 줄기세포는 상기 언급된 바와 같이 병리를 가질 수 있거나 병리를 발병하고 있거나 병인을 겪는다. 혈관 모세관 및 이들의 망상구조의 특성, 변화 및 발달에 영향을 미치는 후보 화합물을 시험 또는 스크리닝하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 본 발명 중의 어느 하나의 방법에서 세포 또는 오가노이드 또는 동물을 후보 화합물과 접촉시키거나 본 발명의 오가노이드를 후보 화합물과 접촉시키는 단계 및 상기 접촉된 오가노이드를 배양물에 또는 생체 내에 유지시키는 단계, 및 오가노이드의 발달된 또는 발달하는 모세관의 (생리학적 변화 또는 유전자 발현 변화와 같은) 변화를 포함하여, 상기 후보 화합물과 접촉하지 않은 상기 오가노이드와 비교하여 오가노이드의 모세관에서 발달 변화와 같은 임의의 변화를 관찰하는 단계를 포함한다.
접촉 단계는 본 발명의 오가노이드로 발달될 세포 또는 오가노이드 또는 이의 전구 세포 응집체의 처리 단계이다. 후보 화합물은 100 Da 내지 5000 Da의 질량을 갖는 분자와 같은 작은 유기 분자일 수 있다. 다른 후보 화합물은 단백질, 핵산 또는 탄수화물과 같은 생체분자일 수 있다. 추가의 후보 화합물은 에탄올과 같은 용매 - 물론 세포에 대해 일반적으로 실행 가능한 농도로 사용됨 - 또는 중합체와 같은 벌크 화학물질일 수 있다. 처리는 화합물의 특정 효과가 예상될 수 있는 농도에서 이루어져야 한다. 다양한 농도가 동시에 시험될 수 있다. 통상적으로 후보 화합물의 농도는 1 ng/ml 내지 100 mg/ml, 예를 들어 100 ng/ml 내지 1 mg/ml이다.
예를 들어 본 발명의 분화 방법을 수행함으로써 본 발명의 오가노이드를 제공하는 단계 및 (상기와 같은) 방법 동안의 임의의 단계에서, 바람직하게는 모든 단계에서 상기 세포에 또는 병리-영향을 받는 오가노이드에 후보 제제를 투여하는 단계를 포함하는, 관심 오가노이드에서 병리를 치료하는데 적합한 후보 치료제를 스크리닝 또는 시험하는 방법이 또한 제공된다. 상기와 같이, 오가노이드의 혈관 망상구조의 변화를 이러한 후보 제제가 없는 것과 비교하여 관찰한다. 이러한 변화는 예를 들어 당뇨병의 경우에 관찰되는 바와 같이 기저막의 두께의 변화일 수 있다.
이 방법은 상기 언급된 당뇨병 모델에서 사용되었다. 따라서, Notch3 활성화 경로, 특히 감마-세크레타제 및 이의 경로가 당뇨병 치료에 적합한 개선제로서 확인되었다. 따라서, 본 발명은 또한 당뇨병성 혈관병증, 폐쇄성 혈관병증, 변경된 혈관 투과성, 조직 저산소증, 심장 질환, 뇌졸중, 신장 질환, 실명, 상처 치유 장애 또는 만성 피부 궤양에서와 같은 비후화된 모세관 기저막의 치료 또는 예방에 있어서의 Notch3 활성화 경로 억제제 (예를 들어 감마-세크레타제 억제제, Notch3 억제제, DLL4 억제제 또는 이들의 조합)의 용도를 제공한다.
예시적인 Notch3 활성화 경로 억제제, 특히 감마-세크레타제, Notch3, 또는 DLL4의 억제제는 감마-세크레타제, Notch3, 또는 DLL4의 억제 항체 및 결합 파트너이다. 항체는 항체 단편, 예를 들어 Fab, F(ab)2, Fv, 단일 쇄 항체 (scAb), 나노바디 등의 낙타과 항체(camelid antibody), 또는 항체 항원 결합 도메인을 포함한 임의의 기능적 등가물 및 이의 유도체를 포함한다. 감마-세크레타제, Notch3, 또는 DLL4에 특이적으로 결합하는 항체가 본 발명에 의해 포함된다. 항체는 전장 단백질, 가용성 형태의 단백질, 또는 이의 단편으로 면역화함으로써 생산될 수 있다. 본 발명의 항체는 다클론성 또는 단클론성일 수 있거나, 경쇄 및 중쇄 상의 뮤린 불변 영역이 인간 서열로 대체된 키메라 항체, 또는 상보적 결정 영역 만이 뮤린 기원인 CDR-이식된 항체와 같은 재조합 항체일 수 있다. 본 발명의 항체는 또한, 예를 들면, 인간 항체를 생산할 수 있는 형질전환 동물의 면역화에 의해 제조되는 인간 항체일 수 있다 (WO 93/12227). 항체는 생물학적 샘플에서 감마-세크레타제, Notch3, 또는 DLL4를 검출하는데 유용하며, 이에 의해 단백질을 생산하는 세포 또는 조직의 식별을 가능하게 하고, 또한 감마-세크레타제, Notch3, 또는 DLL4에 결합하는 (및 다른 결합 화합물과의 상호작용을 차단하는) 항체는 감마-세크레타제, Notch3, 또는 DLL4 억제제로서의 치료학적 용도를 갖는다. 항-감마-세크레타제 항체가 특히 바람직하다. 바람직한 항-Notch3-항체는 타렉스투맙이다. Abcam 항-DLL4 항체는 예를 들면 ab7280, ab176876, ab183532이다.
이러한 성분의 추가의 억제제는 감마-세크레타제, Notch3, 또는 DLL4를 봉쇄하고 따라서 생물학적 활성을 감소시키는 수용체 또는 리간드와 같은 임의의 (생리학적) 결합 파트너일 수 있다. 결합 파트너는 바람직하게는 결합 단백질이다. Notch 3에 대한 예시적인 리간드는 재조합 가용성 DLL4 단백질이다. 이러한 결합 파트너 (이는 바람직하게는 기질 또는 막에 가교결합되지 않으며, 예를 들어 플레이트 상에 가교결합됨)는 활성화 없이 상응하는 Notch 수용체에 결합할 것이다. 따라서 재조합 DLL4 단백질은 내피세포 표면과 같은 세포 표면에 제시되지 않기 때문에 억제제로서 작용할 수 있다 (Scehnet et al. Blood 2007 109(11): 4753-4760; Noguera-Troise et al. Nature 2006 444(7122): 1032-1037). 바람직하게는 이러한 결합 단백질은 고체 표면 또는 세포막에 고정화되지 않고 가용성 형태로 제공되며, 특히 다른 단백질과의 복합체로 제공되지도 않는다. 이러한 가용성 형태는 각각의 표적 (예를 들어 감마-세크레타제, Notch3, 또는 DLL4)에 결합하지만 신호전달 캐스케이드를 활성화하지 못하고 대신 표적을 차단함으로써 이를 억제한다. 결합 단백질은 또한 표적에 결합하고 활성화 신호전달 분자의 결합을 방지하는 복합체 형성으로 인해 이의 효과를 차폐하는 봉쇄제 또는 차폐제로서 제공될 수 있다.
추가의 Notch3 활성화 경로 억제제, 특히 감마-세크레타제, Notch3, 또는 DLL4 억제제는 소분자 억제제이다. 소분자는 통상적으로 5000 Dalton 이하, 예를 들어 2500 Dalton 이하, 또는 심지어 1000 Dalton 이하의 크기를 갖는 작은 유기 화합물이다. 소분자 억제제는 본원에 개시된 방법에 의해 용이하게 시험될 수 있는 바와 같이 당뇨병성 오가노이드에 대한 감마-세크레타제, Notch3, 또는 DLL4의 활성을 억제한다. 예시적인 감마-세크레타제 억제제는 세마가세스타트 (Semagacestat), 아바가세스타트 (Avagacestat), RO4929097, DAPT, LY3039478 (Crenigacestat), LY411575, 데하이드록시-LY411575, LY 450139, MK-0752, IMR-1, 디벤즈아제핀, PF-03084014 (Nirogacestat), L-685,458, FLI-06, NGP 555, 플루르비프로펜 및 설린닥이다.
추가의 억제제는 (CRISPR-Cas와 조합하여) siRNA, shRNA 또는 sgRNA와 같은 억제성 핵산이다. RNA 간섭 (RNAi)은 서열 특이적 방식으로 유전자 발현을 억제하는 메커니즘이다. RNA 간섭 (RNAi)은 진핵 세포에서 특정 유전자 기능의 억제에 매우 효과적인 방법이다. 세포 및 유기체에 적용되는 경우, RNAi는 짧은 간섭 RNA (siRNA) 올리고 또는 짧은-헤어핀 RNA (shRNA) 인코딩 벡터의 형질감염시 표적 mRNA의 분해를 수반한다. 다양한 RNAi 방법이 기술되었으며 예를 들면 제US 2002/0162126호 및 제US 2002/0173478호에 기술된 바와 같이 식물 세포, 초파리 및 인간 흑색종 세포에서의 유전자 발현 변형을 위해 일반적으로 알려져 있다. 본 발명의 방법 및 조성물에 사용하기 위한 siRNA는 감마-세크레타제, Notch3, 또는 DLL4 신호전달 경로의 원하는 분자 또는 이러한 분자의 조합을 표적으로 하도록 선택된다. 이러한 방식으로 이들은 표적 유전자에 해당하는 다양한 RNA에 표적화된다. 본원에 기술된 바와 같은 siRNA는 또한 혼성 DNA/RNA 작제물 또는 이의 임의의 등가물인 변형된 siRNA, 이중-가닥 RNA, 마이크로RNA (miRNA), 및 siRNA 형태, 예를 들어 siRNA 복제, 바이러스 및 비-바이러스 벡터의 작은 헤어핀 RNA (shRNA) 및 운반체의 siRNA 또는 shRNA를 포함할 수 있는 것으로 당업계의 숙련가에 의해 이해된다.
예를 들면 제WO 02/055692호, 제WO 02/055693호, 제EP 1 144 623 B1호 및 제WO 03/074654호에 기술된 바와 같이 RNAi를 사용하여 유전자 발현을 억제하는 몇 가지 방법이 당업계에 존재한다. siRNA 요법을 사용함으로써, 본 발명의 감마-세크레타제, Notch3, 또는 DLL4 길항 및 억제 요법에 대해 임의의 세포 인자가 표적화되고 억제될 수 있다. 따라서, 이러한 임의의 화합물이 감마-세크레타제, Notch3, 또는 DLL4 억제제로서 사용될 수 있다.
암호화 핵산 형태의 억제제가 또한 제공된다. 억제성 핵산, 항체 또는 결합 파트너 (예를 들어 수용체 또는 리간드)는 세포에서 상기 억제제를 발현하는 핵산 상에 암호화될 수 있으며, 이에 의해 억제 작용을 나타낸다.
억제제는 통상적으로 당뇨병 형태를 상당히 감소시키도록 감마-세크레타제, Notch3, 또는 DLL4 활성을 감소시키는 양인 치료적 유효량으로 투여된다. 바람직하게는 감마-세크레타제, Notch3, 또는 DLL4 활성은 치료 (달리 유사한 조건)가 없는 양과 비교하여 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%까지 감소된다. 바람직한 실시형태에서 이러한 감소는 감마-세크레타제, Notch3, 또는 DLL4 세포내 수준과 같다.
억제제는 약제학적 조성물로 제공될 수 있다. 치료적 또는 예방적 용도를 위한 약제학적 조성물 또는 제형은 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 보존제 및/또는 보조제를 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 치료적 유효량의 감마-세크레타제, Notch3, 또는 DLL4 억제제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 용어 "치료적 유효량"은 특정 병태 및 투여 경로에 대해 치료 효과를 제공하는 양을 의미한다. 조성물은 액체 또는 동결건조된 형태일 수 있고 다양한 pH 값 및 이온 강도를 갖는 희석제 (트리스, 아세테이트 또는 포스페이트 완충액), 트윈 또는 폴리소르베이트와 같은 가용화제, 인간 혈청 알부민 또는 젤라틴과 같은 담체, 티메로살 또는 벤질알콜과 같은 보존제, 및 아스코르브산 또는 아황산나트륨 (sodium metabisulfite)과 같은 항산화제를 포함한다. 특정 조성물의 선택은 치료되는 병태, 투여 경로 및 원하는 약동학적 파라미터를 포함한 다수의 인자에 따라 좌우될 것이다. siRNA 제형은 바람직하게는 리포솜 제형으로 투여된다.
본 발명은 추가로, 조직 대체 요법에서 임플란트로서의, 바람직하게는 콜라겐을 갖는 하이드로겔을 갖는 본 발명의 배양물로부터 수득되는 것과 같은 본 발명에 따르는 인공 혈관 오가노이드의 용도를 제공한다. 본 발명의 오가노이드를 사용하는 치료법은 인공 혈관 오가노이드를 상처에 배치하고 상기 인공 혈관 오가노이드 배양물을 상처에 통합되도록 함을 포함할 수 있다. 임플란트로서의 사용은 오가노이드를 치료하고자 하는 대상체에, 특히 결합 조직 재성장을 필요로 하는 위치에 배치함을 포함할 수 있다. 이러한 재성장은, 예를 들어 당뇨병과 같은 재성장을 손상시키는 질병, 또는 약물 또는 다른 치료법, 예를 들어 화학요법 또는 방사선 사고에서와 같이 화학요법 또는 방사선으로 인해 정지될 수 있다. 상처는 바람직하게는 치료된다. 이러한 상처는 만성 상처, 특히 30일 또는 60일 또는 심지어 90일 내에 다물어지지 않는 상처일 수 있다. 만성 상처는 상기 상황, 질병, 약물 또는 치료법으로 인한 것일 수 있다. 특히, 상처는 당뇨병성 족부 궤양과 같은 당뇨병성 상처, 또는 3도 화상과 같은 화상이다. 상처는 피부 상처를 포함할 수 있다. 피부 상처는 표피 및 진피 층 둘 다에 대한 손상을 포함할 수 있다. 피부 상처를 포함한 모든 상처는 기초 근육, 뼈 및 힘줄에 대한 외상을 포함할 수 있다. 치료법은 상처 세정, 특히 재성장을 용이하게 하기 위한 죽은 조직의 제거를 포함할 수 있다.
이러한 치료법에서, 하나 이상의 오가노이드(개수는 상처의 크기에 따라 좌우된다)를 상처와 같은 치료하고자 하는 체적에 배치하고, 오가노이드를 체적을 둘러싼 조직과 통합되게 할 수 있다. 상기 체적은 바람직하게는 상기 하나 이상의 오가노이드의 외부에 대향하는 하나 이상의 오가노이드 표면적의 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 75%에서 환자의 조직에 의해 둘러싸여 있다 (다른 오가노이드에 대향하는 하나 이상의 오가노이드의 경우에는 내부 표면적을 계수하지 않음). 이것은 체적이 대부분 내부에 있으며 대상제 내에 통합할 수 있음을 의미한다. 상처는 내부 상처 또는 열린 상처일 수 있다. 열린 상처조차도 피부 상처와 같은 열린 표면에 대향하는 이러한 체적을 가질 수 있다.
오가노이드를 상처에 통합되도록 하는 것은 통상적으로 본 발명의 오가노이드의 혈관의 존재에 의해 개선되는 재생 과정을 포함한다. 상기 혈관은 환자의 순환계와 연결될 수 있고 손상된 조직의 산소화 및 그 결과 이의 재생을 개선할 수 있다.
오가노이드 및 이의 세포에 대한 면역반응을 피하기 위해, 오가노이드의 세포는 바람직하게는 환자와 동일한 유기체 (바람직하게는 둘 다 인간, 또는 둘 다 동일한 비-인간 동물, 바람직하게는 포유동물)의 세포이고, 환자와 MHC 일치한다. 이러한 적합한 오가노이드를 신속하게 제공하기 위해, 다양한 문서화된 MHC-유형을 갖는 오가노이드 라이브러리를 생성할 수 있다. 이의 오가노이드는 환자에게 신속하게 제공될 수 있다.
화합물 및 물질의 키트가 추가로 제공된다. 키트는 본 발명의 방법 중 어느 것을 수행하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 물론, 일부는 표준 화학물질이거나 통상적으로 이용 가능하므로 모든 물질을 포함할 필요는 없다. 그럼에도 불구하고, 바람직하게는 핵심 물질이 제공된다. 또 다른 키트에는, 희귀 물질이 제공된다. 본 발명의 키트 또는 이들의 물질은 조합될 수 있다. 키트의 성분들은 통상적으로 바이알 또는 플라스크와 같은 별도의 용기에 제공된다. 용기는 함께 포장될 수 있다. 바람직하게는 키트는 본 발명의 방법 또는 이의 단계들을 수행하기 위한 설명서 또는 지침서를 포함한다.
본 발명의 방법에 따라 인공 혈관 오가노이드를 생성하는데 적합한 키트가 제공된다. 키트는 (i) Wnt 효능제 또는 GSK 억제제; (ii) VEGF, 바람직하게는 VEGF-A, FGF, 바람직하게는 FGF-2, BMP, 바람직하게는 BMP4로부터 선택되는 혈관 분화 인자; (iii) 바람직하게는 10%-50% 라미닌, 20%-70% 콜라겐 I, 및/또는 2%-30% 콜라겐 IV (모두 wt.-%)를 포함하는 콜라겐성 3D 기질을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 키트는 상기한 바와 같은 3D 기질, 또는 이러한 3D 기질을 생성하기 위한 이들의 성분을 포함한다. 기질 성분은 예를 들어 수화에 의해 기질로 재구성될 동결건조된 상태와 같은 고체 상태로 제공될 수 있다. 상기한 바와 같은 임의의 기질 또는 이들의 성분이 키트에 포함될 수 있다. 바람직하게는 기질은 하이드로겔, 특히 상기한 바와 같은 콜라겐성 하이드로겔이다. 키트는 이러한 재구성 가능한 (바람직하게는 콜라겐성) 성분을 포함할 수 있다. 추가로 바람직한 기질 성분은 탄수화물, 특히 중합체 형태 (다당류)의 탄수화물이다. 바람직한 다당류는 아가로스이다.
임의의 키트는 세포 성장 영양소, 바람직하게는 DMEM/F12, 녹-아웃 혈청 대체 (KOSR) 배지, 글루타맥스, 또는 필수 아미노산 및/또는 비필수 아미노산 (NEAA), 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 실시예에 언급된 임의의 화합물이 키트에 포함될 수 있다.
본원에 기술된 임의의 방법 또는 생성물은 본원에 기술된 임의의 다른 방법 또는 생성물과 관련하여 구현될 수 있으며 상이한 실시양태들이 조합될 수 있는 것으로 고려된다.
키트는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 지침서를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 지침서는 적합한 데이터 매체 상에 인쇄된 형태 또는 컴퓨터-판독 가능한 형식일 수 있다.
원래 제출된 청구항은 제출된 청구항 또는 제출된 청구항의 조합에 따라 크게 좌우되는 청구항을 포괄하는 것으로 고려된다. 본원에서 논의된 임의의 실시양태는 본 발명의 임의의 방법 또는 생성물과 관련하여 구현될 수 있으며, 그 반대도 가능한 것으로 고려된다. 특정 조건과 관련하여 논의된 임의의 실시양태는 다른 조건과 관련하여 적용되거나 구현될 수 있다. 게다가, 본 발명의 조성물 및 키트는 본 발명의 방법을 달성하는데 사용될 수 있다.
"포함하는"은 개방형 용어, 즉 추가 성분 또는 물질의 단계를 허용하는 것으로 이해된다. "구성되는"은 추가의 성분 또는 물질의 단계가 없는 폐쇄된 용어로 이해된다.
본 출원 전반에 걸쳐, 용어 "약"은 값이 값을 결정하기 위해 사용되는 장치 또는 방법에 대한 표준 오차 편차를 포함하거나 설정 값이 ±10%를 지칭할 수 있음을 나타내는데 사용될 수 있다.
본 발명은 하기 바람직한 실시양태 및 정의에서 추가로 정의되며, 이것은 모두 상기 상세한 설명과 조합될 수 있다:
1. 혈관 분화할 수 있는 줄기세포를 제공하는 단계, 상기 줄기세포에서 중배엽 분화를 자극하는 단계, 상기 줄기세포에서 혈관 분화를 자극하는 단계, 상기 줄기세포로부터 세포 응집체를 발달시키는 단계, 상기 세포 응집체를 콜라겐성 3D 기질에 매립하는 단계 및 상기 콜라겐성 3D 기질에서 응집체의 혈관 분화를 자극하는 단계를 포함하는, 인공 혈관 오가노이드를 생성하는 방법.
2. 콜라겐성 3D 기질이 적어도 50 wt.-% 콜라겐을 포함하는, 1의 방법.
3. 콜라겐성 3D 기질이 10%-50% 라미닌, 20%-70% 콜라겐 I, 및/또는 2%-30% 콜라겐 IV; 바람직하게는 추가로 0.5%-10% 니도겐, 0.5%-10% 헤파란 설페이트 프로테오글리칸, 및/또는 0.5%-10% 엔탁틴 (모두 wt.-%)을 포함하는, 1 또는 2의 방법.
4. 혈관 줄기세포를 10%-50% 라미닌, 20%-70% 콜라겐 I, 및/또는 2%-30% 콜라겐 IV (모두 wt.-%)를 포함하는 콜라겐성 3D 기질에 매립하는 단계 및 상기 콜라겐성 3D 기질에서 상기 줄기세포의 혈관 분화를 자극하는 단계를 포함하는, 인공 혈관 오가노이드를 생성하는 방법.
5. 혈관 줄기세포가 중배엽 줄기세포를 혈관 줄기세포로 분화함으로써 생성되고, 바람직하게는 여기서 중배엽 줄기세포가 만능성 줄기세포에서 중배엽 분화를 자극함으로써 수득되는, 4의 방법.
6. 세포 분화할 수 있는 줄기세포가 만능성 줄기세포, 바람직하게는 유도 만능성 줄기세포인, 1 내지 5 중의 어느 하나의 방법.
7. 콜라겐성 기질에 매립된 세포 응집체가 적어도 50개 세포를 포함하는, 1 내지 6 중의 어느 하나의 방법.
8. 중배엽 분화가 줄기세포를 Wnt 효능제 또는 GSK 억제제, 바람직하게는 CHIR99021로 처리하는 것을 포함하는, 1 내지 7 중의 어느 하나의 방법.
9. 상기 줄기세포에서 혈관 분화가 줄기세포를 VEGF, 바람직하게는 VEGF-A, 및/또는 FGF, 바람직하게는 FGF-2, 및/또는 BMP, 바람직하게는 BMP4, 및/또는 12% (v/v) 이하 대기 산소의 저산소 조건으로 처리하는 것을 포함하는, 1 내지 8 중의 어느 하나의 방법.
10. 응집체의 혈관 분화가 응집체의 세포를 VEGF, 바람직하게는 VEGF-A, 및/또는 FGF, 바람직하게는 FGF-2로 처리하는 것을 포함하는, 1 내지 9 중의 어느 하나의 방법.
11. 상기 응집체가 응집체 형성 개시로부터 7일째 내지 15일째에 콜라겐성 3D 기질에 매립되는, 1 내지 10 중의 어느 하나의 방법.
12. 응집체의 세포가 적어도 5일, 바람직하게는 적어도 7일 동안 상기 3D 기질에서 배양되는, 1 내지 11 중의 어느 하나의 방법.
13. 3D 기질이 하이드로겔, 바람직하게는 10 내지 30의 점탄성 저장 계수 G'를 갖는 하이드로겔인, 1 내지 12 중의 어느 하나의 방법.
14. 혈관 모세관의 상호연결된 망상구조를 포함하는 인공 혈관 오가노이드 배양물로서, 상기 모세관이 내피 및 혈관주위 혈관주세포를 갖는 기저막을 포함하고, 상기 오가노이드가 1 내지 13 중의 어느 하나의 방법에 의해 생산되고/되거나 모세관이 콜라겐을 갖는 하이드로겔을 포함하는 인공 3D 기질에 매립되고/되거나 오가노이드 배양물이 개별 혈관 및 모세관 교차점 사이의 혈관을 계수함으로써 계수되는 바와 같이 40 내지 1000개 혈관을 포함하는 인공 혈관 오가노이드 배양물.
15. 혈관 모세관이 1 μm 내지 30 μm의 평균 직경을 갖는, 14의 인공 혈관 오가노이드 배양물.
16. 내피세포 대 혈관주위 혈관주세포의 비가 100:1 내지 1:5 사이인, 14 또는 15의 인공 혈관 오가노이드 배양물.
17. 혈관 모세관이 성숙 내피세포 및/또는 성숙 혈관주세포를 포함하는, 14 내지 16 중의 어느 하나의 인공 혈관 오가노이드 배양물.
18. 인간 혈관 모세관을 갖는 비-인간 동물 모델을 제공하는 방법ㅇ으로서, 상기 인간 모세관이 내피 및 혈관주위 혈관주세포를 갖는 기저막을 포함하고, 상기 방법이 14 내지 17 중의 어느 하나의 인간 혈관 오가노이드를 비-인간 동물에 도입하는 단계 및 상기 오가노이드가 이의 혈관 모세관을 성장하게 하는 단계를 포함하고, 바람직하게는, 상기 인간 오가노이드가 비-인간 동물의 신장 위에 또는 그 안에 도입되는, 방법.
19. 14 내지 18 중의 어느 하나에 따르는 삽입된 인공 혈관 오가노이드 배양물을 포함하는 비-인간 동물 모델.
20. 내피 및 혈관주위 혈관주세포를 갖는 기저막을 포함하는 인간 혈관 모세관을 갖는 비-인간 동물 모델.
21. 인공 혈관 오가노이드 배양물의 혈관 모세관 또는 인간 혈관 모세관이 비-인간 동물의 혈액 순환계에 의해 관류되는, 19 또는 20의 비-인간 동물 모델.
22. 혈관 또는 모세관이 병인에 적용되고 상기 오가노이드 또는 인간 동물 모델이 병리의 모델인, 1 내지 21 중의 어느 하나의 방법 또는 배양물 또는 비-인간 동물 모델.
23. 병인이 고혈당증 및/또는 염증을 포함하고/하거나 상기 병리가 당뇨병이고, 바람직하게는 상기 염증이 하나 이상의 염증성 사이토킨, 바람직하게는 TNF-알파 및/또는 IL-6에의 노출을 포함하는, 22의 방법 또는 배양물 또는 비-인간 동물 모델.
24. 1 내지 23 중의 어느 하나에 따르는 배양물 또는 비-인간 동물 모델에 또는 상기 배양물 또는 비-인간 동물 모델의 생성 동안 상기 후보 화합물을 투여하는 단계 및 후보 화합물을 투여하지 않은 상기 배양물 또는 동물 모델과 비교하여 상기 배양물 또는 동물 모델에서의 생리학적 차이를 모니터링하는 단계를 포함하는, 병인 또는 병리에 영향을 미치는 후보 화합물을 스크리닝하는 방법.
25. (i) 제1항 내지 제21항 중의 어느 한 항의 방법 동안 임의의 단계에서 또는 오가노이드 또는 동물에 대한 세포에서 관심 유전자의 발현을 감소 또는 증가시키는 단계, 또는 (ii) 제1항 내지 제21항 중의 어느 한 항의 오가노이드 또는 동물 동안 임의의 단계에서 오가노이드의 발달 동안 세포에 관심 후보 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 발달 혈관 조직 효과, 예를 들어 결함, 특히 발달 결함을 조사하는 방법.
26. 조직 대체 요법, 특히 바람직하게는 인공 혈관 오가노이드를 상처에 배치하고 상기 인공 혈관 오가노이드 배양물을 상처에 통합되도록 함을 시킴을 포함하는 요법에서 임플란트로서의 제14항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 따르는 인공 혈관 오가노이드의 용도.
27. 당뇨병성 혈관병증, 폐쇄성 혈관병증, 변경된 혈관 투과성, 조직 저산소증, 심장 질환, 뇌졸중, 신장 질환, 실명, 상처 치유 장애 또는 만성 피부 궤양에서와 같은 비후화된 모세관 기저막의 치료 또는 예방에 있어서의 Notch3 활성화 경로 억제제 (예를 들어 감마-세크레타제 억제제, Notch3 억제제, DLL4 억제제 또는 이들의 조합)의 용도.
28. (i) Wnt 효능제 또는 GSK 억제제; (ii) VEGF, 바람직하게는 VEGF-A, FGF, 바람직하게는 FGF-2, BMP, 바람직하게는 BMP4로부터 선택되는 혈관 분화 인자; (iii) 바람직하게는 10%-50% 라미닌, 20%-70% 콜라겐 I, 및/또는 2%-30% 콜라겐 IV (모두 wt.-%)를 포함하는 콜라겐성 3D 기질을 포함하는, 1 내지 13 중의 어느 방법에 따르는 인공 혈관 오가노이드의 생성에 적합한 키트.
본 발명은 본 발명의 이러한 특정 실시양태에 제한되지 않으면서 하기 도면 및 실시예에 의해 추가로 예시된다.
도 1. 인간 줄기세포로부터의 인간 혈관 망상구조의 생성. a, 인간 배아 줄기세포 (ESC) 및 인간 iPSC를 혈관 망상구조 및 자유-부유 혈관 오가노이드로 분화시키는 프로토콜의 개략도. 하부 패널은 지시된 분화 단계에서 관찰된 대표적인 형태를 보여준다. b,c, CD31-발현 내피세포에 대한 면역형광은 콜라겐 I/매트리겔 기질에서 복잡한 상호연결된 혈관 망상구조의 확립을 보여준다. d, 공초점 이미징을 기반으로 하는 CD31+ 혈관 망상구조의 3D-재구성. 재구성의 규모는 3개 축으로 나타내어진다. e, ICAM-1 발현의 유도에 의해 밝혀진 3D 내피 망상구조의 TNFα-매개된 활성화. f-h, CD31+ 내피 및 혈관주세포-특이 마커 CNN1, PDGFRβ 및 SMA에 의해 결정된 혈관 망상구조의 내피 (녹색) 및 혈관주세포 (적색) 범위. 기저막의 형성은 콜라겐 타입 IV (ColIV) 발현에 의해 나타난다. i, 내피 관을 코팅하는 기저막의 침착을 시각화하기 위한 콜라겐 타입 IV (ColIV)에 대한 면역형광법에 의해 나타내어진 자가-조직화 인간 모세관 오가노이드. 주목할 점은, b-i의 데이터는 인간 배아 줄기세포로부터 유래된 혈관 오가노이드로부터의 것이라는 점이다. DAPI 염색은 핵을 이미징하기 위해 나타내었다. 배율은 각 패널에 나타내어져 있다.
도 2. 성숙하고 지속적인 인간 모세관의 생성. a, 자유-부유 오가노이드는 PDGFRβ 발현에 의해 결정된 바와 같이, 혈관주세포에 의해 단단히 덮인 조밀한 내피 망상구조 (CD31+)를 보인다. 3D-재구성이 또한 전체 자유-부유 오가노이드 (왼쪽 상단 패널)에 대해 나타내어져 있다. b, CD31+ 내피에 대한 면역형광 및 H&E 염색으로 나타낸 자유-부유 혈관 오가노이드에서의 내피 내강 형성. c, 자유-부유 혈관 오가노이드의 대표적인 전자 현미경법. 밀착 연접 (흰색 화살촉)과 기저막 (흑색 화살표)이 보이는 내강화된 연속 모세관-유사 구조의 생성을 주지한다. L, 내강; E, 내피세포. d, CD31+ 정단 세포 (화살촉)는 새로 형성되는 세포를 표시한다. 혈관신생 부위에 ColIV+ 기저막이 없음을 주지한다. 배율은 각 패널에 나타내어져 있다.
도 3. 마우스에서의 기능적 인간 혈관 수상구조의 확립. a, NOD/SCID 마우스의 신피막(kidney capsule)에의 인간 혈관 오가노이드의 이식. 왼쪽 상단 패널은 이식 부위를 나타낸다 (화살표). 인간 오가노이드 유래 혈관구조는 마우스 신장의 염색 (삽도)에 의해 예시되는 뮤린 내피와 교차 반응하지 않는 인간-특이 CD31 항체에 의해 시각화된다. b-c, FITC-덱스트란 관류 (녹색)에 의해 밝혀진 마우스에서의 기능성 인간 혈관구조 (인간-특이 항-CD31 면역 염색에 의해 검출됨, hCD31, 적색). d, 관류된 인간 혈관을 표지하기 위한 인간 특이 항-CD31 항체의 주입. 뮤린 혈관은 마우스-특이 항-CD31 항체 (mCD31, 녹색)에 의해 시각화된다. e, H&E 염색된 조직학적 섹션에 의해 나타낸 인간 혈관 오가노이드 이식물 내에 보이는 대표적인 세동맥 (A) 및 세정맥 (V). f, 인간 이식된 혈관 오가노이드에서의 인간 세동맥 (A) 및 세정맥 (V)의 생성. 세동맥은 SMA, 칼포닌 및 MYH11 면역염색에 의해 검출된 혈관 평활근 세포 (vSMC)로 단단히 덮힌 인간 CD31+ 내피세포 (적색)에 대한 염색으로 나타난다. 세정맥은 전형적인 편평한 내피 표현형 및 희소 vSMC 범위를 보여준다. 뮤린 세동맥의 내피세포는 신장 혈관에 대해 나타낸 바와 같이 인간 특이 CD31 항체와 교차 반응하지 않는다 (하단 오른쪽 패널). 배율은 각 패널에 나타내어져 있다. g, MRI에 의해 측정된 대표적인 축방향 T2-가중 영상, 혈류 (관류), 상대 혈액량 (rBV), 평균 통과 시간 (MTT) 및 누출 (K2). 축방향 평면은 신장 (흰색으로 표시)과 이식물 (적색으로 표시)이 모두 보이도록 선택되었다. 근육 조직은 녹색으로 표시되어 있다. 관류, rBV, MTT 및 K2에 대한 정량적 값 (+/- SD)은 아래 표에 제공되어 있다. n = 3마리의 마우스가 분석되었다.
도 4. 인간 혈관 오가노이드에서의 당뇨병성 미세혈관병증 모델링. a, 기저막을 검출하기 위한 PAS 염색 (왼쪽) 및 CD31+ 내피세포 및 ColI V에 대한 염색에 의해 나타내어지는 후기 2형 당뇨병 환자의 피부 생검에서의 진피 모세관의 기저막 비후화. 비-당뇨병 환자로부터의 진피 혈관은 대조군으로 나타내어진다. b, 후기 2형 당뇨병 및 비-당뇨병 환자의 진피 모세관의 대표적인 전자 현미경법은 비-당뇨병 대조군 (화살촉)의 기저막과 비교하여 당뇨병 환자 (양측 화살표)에서의 비정상적으로 두꺼운 기저막의 형성을 보여준다. L, 내강; E, 내피세포; P, 혈관주세포. 막대 그래프는 기저막 비후의 정량화를 보여준다 (평균값 +/- SD). n = 6. *** p<0.001 (비쌍체, 양측 t-검정). c-d, 인간 혈관 오가노이드는 고혈당증 [75 mM 글루코스]시 증가된 콜라겐 타입 IV 침착을 보이며, 이것은 전염증성 사이토킨 IL6 [1 ng/mL] 및 TNFα [1 ng/ml]와 함께 고 글루코스 ("당뇨병 칵테일")로의 처리에 의해 유의적으로 더욱 증가된다. c, 기저 비후화의 대표적인 이미지; 삽도는 내강 혈관의 공초점 단면을 나타낸다. d, 공초점 단면을 사용하여 콜라겐 타입 IV 비후화를 정량화하였다; 개별적으로 측정된 혈관은 점으로 표시된다. >130개의 혈관 내강을 3개의 독립적인 생물학적 복제물로부터 각 실험 조건에 대해 분석하였다. *** p<0.001 (Student's t-검정). e, 고 글루코스/IL6/TNFα 처리는 인간 모세관을 라이닝한 Col IV-양성 기저막의 현저한 확장을 야기한다. 우측 패널은 CD31+ 내피 관을 직접 코팅하는 기저막 비후의 3D 재구성을 보여준다. 칼포닌 면역염색은 혈관주세포를 표시한다. f, "당뇨병" 및 비-당뇨병 상태하에서 배양된 혈관 오가노이드의 대표적인 전자 현미경 이미지는 당뇨병 치료시 현저한 기저막 비후화를 확인시켜 준다. 대조군 오가노이드 (화살촉)에서는 관찰할 수 없는 당뇨병 상태 (양측 화살표)에서의 기저막의 다중 층을 주지한다. L, 내강; E, 내피세포; P, 혈관주세포. 모든 배율이 나타내어져 있다.
도 5. γ-세크레타제의 억제는 당뇨병성 혈관 오가노이드에서 혈관 기저막 비후를 없애준다. a, 당뇨병 (고 글루코스/IL6/TNFα) 및 비-당뇨병 상태하에서 배양된 혈관 오가노이드로부터 분류된 CD31+ 내피세포 FACS의 전사체 분석. 별도로 발현된 유전자 및 상위 5개의 상향조절된 유전자 (p-값에 의해 순위가 매겨짐)의 히트 맵(heat map) 및 상향조절된 유전자의 GO:생물학적 과정이 당뇨병 vs 비-당뇨병 상태를 비교하여 나타내어져 있다. "당뇨병" 혈관 오가노이드 및 II형 환자-유래 진피 내피 CD31+ 세포로부터의 상향조절된 유전자를 비교하는 공통 GO:분자 기능 항이 각각의 p-값과 함께 플롯팅된다. 환자의 상향조절된 유전자는 비-당뇨병 개인으로부터의 것과 비교하여 II형 당뇨병 환자로부터의 분류된 CD31+ 내피세포로부터 유래되었다. b,c, 일반적으로 처방되는 당뇨병 약물은 당뇨병 칵테일(고 글루코스/IL6/TNFα)로의 인간 혈관 오가노이드의 처리시 기저막 비후에 영향을 미치지 않는다. b, 콜라겐 IV (ColIV) 염색을 사용한 기저막 비후의 대표 이미지. 삽도는 콜라겐 IV (녹색)로 덮인 내강 혈관의 공초점 단면을 나타낸다. c, 광학 단면을 사용하여 기저막 비후를 정량하였다. 각 내강화된 혈관은 점으로 표시된다. >130개 내강을 3개의 독립적인 생물학적 복제물로부터 각각의 실험 조건에 대해 분석하였다. *** p<0.001 (비히클 및 약물 처리된 오가노이드를 비-당뇨병 상태하에서 동시에 배양된 오가노이드와 비교한 Student's t-검정). 나타낸 비교 이외에, 다른 모든 약물 처리는 비-당뇨병 상태와 비교하여 p <0.001이었고, 이들 각각의 비히클-당뇨병 상태 대조군과 비교하여 유의하지는 않았다. 약물 용량 및 배양 조건은 방법에 기술되어 있다. d,e, DAPT에 의한 γ-세크레타제의 억제는 ColIV에 의해 시각화된 "당뇨병" 상태하에서 배양된 혈관 오가노이드에서 혈관 기저막의 비후를 없애준다. d, 다양한 신호전달 경로의 소분자 억제제로 처리된 당뇨병성 혈관에서의 기저 비후의 대표적인 이미지. 삽도는 콜라겐 IV (ColIV, 녹색)로 둘러싸인 내강 혈관의 공초점 단면을 보여준다. e, 공초점 단면을 사용하여 기저막 비후를 정량하였다. >130개의 내강화된 혈관 (각 혈관은 개별 점으로 표시됨)을 3개의 독립적인 생물학적 복제물로부터 각각의 실험 조건에 대해 분석하였다. ** p<0.01; *** p<0.001 (Student's t-검정). 중요하게도, 나타낸 비교 이외에, 다른 모든 약물 처리는 비-당뇨병 상태와 비교하여 p<0.001이었고, 비히클-당뇨병 상태 대조군과 비교하여 유의하지는 않았다. 약물 용량 및 배양 조건은 방법에 기술되어 있다. f,g, γ-세크레타제 억제제 DAPT에 의한 기저막 비후의 방지는 용량 의존적이다. 정량화는 나타낸 조건에 노출된 적어도 상이한 오가노이드로부터 >130개 내강화된 구조 (점)의 ColIV 두께를 보여준다. *** p<0.001 (Student's t-검정).
도 6. 혈관 오가노이드로의 인간 ES 세포의 분화. a, 3D 내피 관에서의 내피 마커 CD31 및 VE-카데린의 공동-발현. 콜라겐 I 기질에서 성장한 ESC-유래 오가노이드로부터의 대표적인 데이터가 나타내어져 있다. b,c 인간 iPS 세포는 CD31+ 양성 관에서 효율적으로 분화한다. b, 20번 이상 반복된 실험의 대표적인 이미지를 보여준다. c, 공초점 이미징에 기반하는, iPS 세포로부터 유래된 CD31+ 혈관 망상구조의 3D 재구성. 재구성의 규모는 3개 축으로 나타내어진다. b와 c 및 콜라겐 기질에서 성장한 오가노이드로부터의 데이터. d, 3D-재구성은 iPS 세포로부터 유래된 전체 자유 부유 오가노이드에 대해 나타내어져 있다. 데이터는 항-CD31 항체로 이미지화된 전체 오가노이드의 공초점 이미징을 사용하여 유도하였다. 재구성의 규모는 3개 축으로 나타내어진다. 모든 배율은 각 패널에 나타내어져 있다.
도 7. 혈관 오가노이드의 분자 특성화. a, 지시된 조직으로부터의 유전자형-조직 발현 (GTEx) RNASeq 데이터와 비교한 혈관 오가노이드로부터의 FACS 분류된 CD31+ 내피세포의 전사체 (RNAseq)의 히트 맵. 인간 혈관 조직과 가장 가까운 시험관 내 생성된 내피 관 클러스터의 유전자 발현 프로파일 (GTEX_동맥_관상동맥, GTEX_동맥_대동맥, GTEX_동맥_경골) b, 만능성, 혈관주세포 및 내피세포에 대한 마커 유전자의 히트 맵. 혈관 오가노이드로부터의 FACS 분류된 CD31+ 내피세포를 2D 배양 조건에서 iPS 세포로부터 유래된 이전에 공개된 1차 분화된 내피세포와 비교하였다 (Patsch et al. Nat. Cell Biol. 17, 994-1003 (2015).). c, 혈관 오가노이드에서 CD31+ 내피 관 (녹색)을 둘러싸는 기저막을 이미지화하기 위한 라미닌 발현 (파란색). 콜라겐 I 기질에서 성장한 인간 ESC-유래 혈관 오가노이드에 대한 대표적인 이미지가 나타내어져 있다. 배율은 각 패널에 나타내어져 있다.
도 8. 일반 당뇨병 설치류 모델은 피부 미세혈관구조에서 기저막 비후를 나타내지 않는다. a, 비-당뇨병 대조군 코호트와 비교하여 당뇨병의 지시된 래트 및 마우스 모델에서 진피 모세혈관의 기저막 두께의 정량. 세부사항은 추가 표 2를 참조한다. 데이터는 분석된 혈관의 평균값 +/- SD로 나타내어진다. 코호트당 n>5마리 동물. 연령 일치된 C57 BL/KsJ 및 C57 BL/Ks WT 마우스를 대조군으로 사용하였다. ZDF 래트 모델의 경우, 이종접합 래트 (fa / +)를 대조군으로 사용하였다. 기저막 비후는 콜라겐 IV 면역염색의 형태학적 분석에 기초하여 결정되었다. b, CD31+ (적색) 양성 혈관을 덮고 있는 ColIV (녹색) 침착을 입증하기 위한 다양한 마우스 모델의 피부 절편의 대표적인 이미지.
도 9. 인간 ESC-유래 혈관 오가노이드에서의 기저막 비후. a, ES-세포 유래된 혈관구조를 당뇨병성 배지 (고 글루코스/IL6/TNFα)로 처리되거나 정상 조건(비-당뇨병성)하에서 배양하였다. 기저막의 비후는 CD31 양성 (적색) 내피 관 주위의 Col IV 특이 항체 (녹색)로 시각화되었다. 삽도는 공초점 단면을 보여준다. CNN1은 혈관주세포를 표시한다. b, 당뇨병성 혈관 오가노이드에서의 강화된 Col IV 발현. Col4a1 및 Col4a2 발현을 2주 동안 당뇨병성 배지 (고 글루코스/IL6/TNFα)로 처리된 혈관 오가노이드에서 qPCR을 통해 결정하고 비-처리된 대조군 오가노이드와 비교하였다. 값은 평균 +/- SD로 나타내어진다. * p<0.05 (Student's t-검정). >15개의 혈관 오가노이드의 혼주물을 2개의 독립적인 실험에 사용하였다.
도 10. 혈관 오가노이드에서 내피세포 및 혈관주세포로의 만능성 줄기세포의 효율적인 분화. a, 18일째의 확립된 혈관 망상구조 및 30일째의 후기 혈관 오가노이드를 이들의 내피세포 및 혈관주세포 함량에 대해 FACS에 의해 분석하였다. 두 경우 모두에서, 분화 후 세포 집단의 >80%가 내피세포 (CD31+) 및 혈관주세포 (CD140b+)에 존재한다. P, 혈관주세포; EC, 내피세포 b, 조혈 세포 (CD45+)는 거의 생성되지 않고 (~1%), 분화 후 발견된 세포의 약 10%가 세포 (CD73+, CD90+)와 같은 중간엽 줄기세포이다.
도 11. 혈관 오가노이드에서의 성숙한 내피세포. a, 혈관 오가노이드의 내피세포는 폰빌레브란트 인자 (vWF)를 발현하고 바이벨-펠라드 소체(Weibel-Palade body)의 형성을 보인다 (우측 패널). b, 혈관 오가노이드의 모세관 구조에 대한 울렉스 오이로패우스 응집소(Ulex Europaeus Agglutinin 1)(UEA-1)의 결합은 성숙한 내피세포의 존재를 나타낸다. c, 자유 부유 혈관 오가노이드의 성숙 내피세포는 아세틸화된 LDL (ac-LDL)을 효율적으로 흡수한다.
도 12. 당뇨병 마우스에서의 이식된 인간 혈관의 기저막 비후. 혈관 오가노이드를 면역저하된 NOD/SCID/감마 (NSG) 마우스에 이식하고, 이어서 (1개월 후) 스트렙토조토신 (STZ)으로 처리하여 중증 고혈당증을 유도하였다. 3개월 후, 인간 이식물을 수확하고 당뇨병성 기저막 비후에 대해 분석하였다. 이식된 오가노이드-유래 혈관은 인간 특이적 CD31 (hCD31) 항체를 사용하여 확인하였다. 콜라겐 타입 IV 염색 (상부 패널) 및 전자 현미경 (중간 패널; 화살표는 침착된 콜라겐 원섬유를 나타낸다)에 의해 나타낸 정상혈당 마우스 (Ctrl)와 비교한 당뇨병 마우스 (STZ)로부터 유래된 인간 혈관 오가노이드에서의 심한 기저막 비후. 대조적으로, 뮤린 신장의 내인성 혈관은 그 단계에서 기저막 (하부 패널; A, 세동맥, C 모세관)의 변화를 보이지 않는다. 신장에서 CD31 신호의 부재는 항체의 인간 특이성을 입증한다.
도 13. 당뇨병성 혈관 퇴행은 인간 혈관 오가노이드 이식물에서 반복된다. 인간 혈관 오가노이드를 NSG 마우스에 이식하고 1개월 후 STZ로 처리하여 당뇨병을 유도하였다. 당뇨병 마우스 (STZ)로부터의 이식물은 당뇨병 유도 3개월 후 내피 (CD31) 및 혈관주세포 (SMA) 염색 (상부 패널)에 의해 나타낸 정상혈당 마우스 (Ctrl)와 비교하여 전체적으로 감소된 혈관 밀도를 보인다. 당뇨병 마우스 (STZ)의 인간 혈관은 피검되는 세포에 의해 나타내어지는 아폽토시스 (채워진 화살촉) 및 SMA 양성 혈관벽에서 내피세포의 부족 (비어 있는 화살표)과 같은 혈관 퇴행의 징후를 보인다.
도 14. Notch3 수용체 또는 리간드 Dll4의 차단은 당뇨병 성 기저막 비후를 억제한다. 혈관 오가노이드를 시험관 내에서 2주 동안 당뇨병성 배지 (고혈당 + IL-6 + TNF-α)로 처리하여, 콜라겐 타입 IV 염색 (Col IV)에 의해 나타내어지는 대조군 배지 (Ctrl)와 비교하여 모세관의 대량 기저막 비후를 야기하였다. 당뇨병성 혈관 기저막 비후를 방지할 수 있는, 이전에 확인된 γ-세크레타제 억제제 DAPT의 직접적인 표적을 밝히기 위해, Notch 경로의 특정 구성원을 당뇨병 조건하에서 기능적 차단 항체 (α-Notch1, α-Notch3, α-Jagged1) 및 비-가교결합된 재조합 단백질 (Dll1, Dll4)을 사용하여 억제하였다. Notch-1, Jagged-1 또는 Dll1을 차단하는 것은 혈관 기저막의 당뇨병 매개된 비후화에 영향을 미치지 않은 반면 Notch-3 또는 Dll4를 차단하는 것은 기저막 비후화를 완전히 차단하였다. 혈관계에서, Notch3 수용체는 혈관주세포에서, Notch 리간드 Dll4는 내피에서 특이적으로 발현되며, 이것은 이제 Notch3/Dll4를 통한 이들 두 세포 유형 사이의 혼선이 당뇨병성 혈관 기저막 비후를 매개한다는 것을 시사한다.
도 15. 혈관 오가노이드의 세포적 및 기능적 특성화. a, 초기에 생성된 혈관 망상구조 및 말기 혈관 오가노이드 (NC8)에 존재하는 상이한 세포 집단을 결정하기 위한 FACS 분석. CD31+ 내피세포, PDGFR-β+ 혈관주세포, CD45+ 조혈 세포, 및 CD90+CD73+ 중간엽 줄기세포 (MSC)-유사 세포의 백분율. 우측 패널의 막대 그래프는 혈관 망상구조 및 혈관 오가노이드에서 내피세포 (EC) 및 혈관주세포 (P)의 상대적 모집단을 나타낸다. 그래프는 실험당 >50개의 혈관 망상구조/오가노이드를 사용한 n=2 독립적인 실험으로부터의 평균 ± S.E.M을 나타낸다. b, 만능성, 혈관주세포 및 내피세포에 대한 원형 마커 유전자의 히트 맵. 혈관 망상구조 또는 혈관 오가노이드로부터의 FACS 분류된 CD31+ 내피세포 (EC) 및 PDGFR-β+ 혈관주세포 (P)를 RNAseq로 분석하고 모 iPSC 세포주 (NC8)와 비교하였다. c, ICAM-1 발현의 유도에 의해 밝혀진 혈관 오가노이드 (NC8)의 TNFα-매개된 활성화. ICAM-1 유도는 TNFα (용량)를 첨가한지 24시간 후에 결정되었다. DAPI는 핵을 대조염색하는데 사용되었다. d, 혈관 오가노이드 (NC8)로부터의 내피세포 (CD31+)에서의 폰빌레브란트 인자 (vWF) 발현. Col IV 염색은 또한 기저막의 윤곽을 나타내는 것으로 나타났다. 우측 패널은 바이벨-펠라드 소체의 외관을 밝히는 전자 현미경법을 보여준다. e, 혈관 오가노이드 (NC8)의 내피 망상구조 (CD31+)는 아세틸화된 저밀도 지단백질 (ac-LDL)을 흡수한다. f, 렉틴 울렉스 오이로패우스 응집소 (UEA-1)에 대해 양성인 혈관 오가노이드 (NC8) 염색. 기준자: d=50 ㎛, 500nm (EM-상부 패널), 100nm (EM-하부 패널), e,f=100 ㎛ 또는 이미지에 표시된 바와 같음
도 16. 당뇨병성 혈관 오가노이드의 분석. a,b 비-당뇨병성 및 당뇨병성 (고 글루코스/IL6/TNFα) 배지에서 배양된 (a) CD31+ 내피세포 분획 및 (b) PDGFR-β+ 혈관주세포의 백분율을 결정하기 위한 혈관 오가노이드 (H9)의 FACS 분석.
도 17. γ-세크레타제의 억제는 인간 혈관 오가노이드의 당뇨병성 미세혈관증을 없애준다 a, 혈관 투과성을 FITC-Ddextran의 i.v. 주사에 의해 평가하고 hCD31로 공동-염색하여 인간 혈관구조를 시각화하였다. 당뇨병성 STZ 마우스의 확산 FITC 신호는 혈관 누출을 나타냄을 주지한다. DAPT 처리는 당뇨병성 혈관 투과성을 정상화하였다. b, FITC-Dextran 혈관외 유출에 의해 결정된 혈관 누출의 정량. n= (대조군=3, STZ=7, STZ+DAPT=5) 마우스. ** p<0.01, * p<0.05 (일원 ANOVA). c,d, DAPT 처리는 당뇨병성 STZ 마우스에서 인간 혈관 밀도를 회복시킨다. 인간 혈관 이식물의 모세관 밀도는 인간 특이적 항-CD31 항체 (흑색)로 염색하여 결정하였다. c, 이식된 혈관 오가노이드에서의 인간 혈관 밀도의 정량. n= (대조군=3, STZ=5, STZ+DAPT=4) 마우스. *** p<0.001 (일원 ANOVA). d, 대조군, STZ 및 STZ + DAPT 처리된 마우스에서 인간 CD31+ 혈관 밀도의 대표적인 이미지. 기준자, a,d=50 ㎛ 또는 이미지에 표시된 바와 같음.
도 18. 당뇨병성 혈관 기저막 비후에 대한 후보 경로로서의 Dll4-Notch3의 확인. a, 고 글루코스/IL6/TNFα (당뇨병)에 노출되고 Jagged-1, Notch1, Notch3, 또는 재조합 Dll1 및 Dll4에 대한 항체로 처리된 혈관 오가노이드 (NC8 iPSC로부터 유래)에서 Col IV에 대해 염색된 기저막의 대표적인 이미지. 삽도는 콜라겐 타입 IV (Col IV, 녹색)으로 둘러싸인 개별 혈관의 공초점 단면을 보여준다. Col IV에 의해 연속적으로 둘러싸인 내강의 두께를 광학 단면에서 측정하였다. 정량 (우측 패널)을 위해, 총 >130개 내강을 동일한 샘플 크기를 갖는 3개의 독립적인 생물학적 복제물로부터 각각의 실험 조건에 대해 분석하였다. 내강화된 혈관으로부터의 각 개별 측정치는 점으로 표시된다. 비-당뇨병성 오가노이드에 대한 대표적인 이미지 및 정량은 대조군으로 제시된다. *** p<0.001 (일원 ANOVA). b, 고 글루코스/IL6/TNFα (당뇨병)에 노출되거나 표준 배양 조건 (비-당뇨병) 하에서 유지된 대조군, Dll4 KO, 및 Notch3 KO 혈관 오가노이드 (NC8 iPSC)로부터의 Col IV에 대해 염색된 기저막의 대표적인 이미지. Col IV에 의해 연속적으로 둘러싸인 내강의 두께를 광학 단면에서 측정하였다. 내강화된 혈관으로부터의 각 개별 측정치는 우측 패널에 점으로 표시된다. 총 >180개 내강을 동일한 샘플 크기를 갖는 3개의 독립적인 생물학적 복제물로부터 각각의 실험 조건에 대해 분석하였다. *** p<0.001 (일원 ANOVA). c, 인간 혈관 오가노이드 (H9 ESC)가 이식된 STZ 마우스를 Notch3 차단 항체로 처리하고, 이식물을 기저막 마커 Col IV 및 인간 특이적 CD31에 대해 염색하여 인간 혈관을 시각화하였다. 개별 인간 혈관 (hCD31+)의 기저막 두께는 Col IV 염색에 기초하여 결정하였다. n>140개 혈관. *** p<0.001 (일원 ANOVA). n = (대조군=3, STZ=3, STZ+αNotch3=2) 마우스. 기준자, a,b,c=50 ㎛, c 삽입물=10 ㎛.
도 19. Dll4 및 Notch3 녹아웃 iPSC의 생성 및 내피세포 및 혈관주세포에서의 Notch 수용체/리간드의 발현. a, b, CRISPR/Cas9 게놈 편집을 사용하여 Dll4 및 Notch3 녹아웃 iPSC (NC8)를 생성하였다. 단일 가이드 RNA (sgRNA)는 생성된 인델(indel) 뿐만 아니라 Notch3/Dll4 서열에 나타내어져 있다. c, 웨스턴 블롯은 표적 iPSC에서 Notch3 발현의 제거를 보여준다. 클론 #4 (적색)를 기능 분석에 사용하였다. FL, 전장 Notch3; TTM, 막관통 Notch3 서브유닛. d, 혈관 오가노이드에서의 면역염색은 내피세포 (CD31+)에서는 Dll4의 발현을 나타내지만 CRISPR/Cas9 게놈 편집된 iPSC에서는 그렇지 않다. 기준자: e=50 ㎛. e, FACS 분류에 의해 혈관 오가노이드로부터 단리된 내피세포 (EC) 및 혈관주세포에서 발현된 Notch 수용체/리간드의 히트 맵. 규모는 로그를 나타낸다 (정규화된 FKPM).
도 20. 혈관 오가노이드의 표현형적 특성화. a, 콜라겐 1 / 매트리겔 기질에서 분화된 (NC8) 내피세포 및 혈관주세포의 공생-배양. 형성된 내피 망상구조 (CD31+)는 혈관주세포 (PDGFR-β+)와 약한 상호작용을 보였으며 Col IV+ 기저막에 의해 둘러싸이지 않았다. b, 배아 줄기세포 (H9) 및 2개의 독립적인 iPS 세포주로부터의 혈관 망상구조의 성공적인 생성. PDGFR-β+ 혈관주세포가 어떻게 내피 관 (CD31+)에 근접하는지 및 Col IV+ 기저막의 형성을 주지한다.
도 21. 몇몇 γ-세크레타제 억제제는 인간 혈관 오가노이드에서 당뇨병 유도된 혈관 기저막 비후를 방지한다. 혈관 오가노이드를 γ-세크레타제 억제제 (10 μM RO4929097, 1 μM 데하이드록시-LY411575, 1 μM LY411575)의 존재 또는 부재하에 당뇨병 배지 (75 mM 글루코스, 1 ng/mL IL-6, 1 ng/mL TNF-α)에서 배양하였다. 이어서, 오가노이드를 고정하고 내피세포 (CD31), 혈관주세포 (PDGFRβ)에 대해 및 혈관 기저막 단백질 Col IV에 대해 염색하였다. 대표적인 이미지가 나타내어져 있다. 당뇨병 상태는 Col IV+ 기저막 (비히클)의 양을 증가시킨다. 3개의 독립적 인 γ-세크레타제 억제제로의 처리는 당뇨병 상태하에서 기저막 (Col IV)의 증가를 방지한다. 기준자 50 ㎛.
실시예
실시예 1: 재료 & 방법
인간 줄기세포 및 혈관 오가노이드로의 분화. 제시된 모든 실험은 인간 iPS 세포주 NC8 (Pripuzova et al. Stem Cell Res. 14, 323-338 (2015)) 또는 인간 배아 줄기세포주 (ESC) H9 (Thomson et al. Science 282, 1145-1147 (1998))에서 수행하였다. 모든 줄기세포는 이전에 기술된 바와 같이 화학적으로 정의된 배양보조세포-없는(feeder-free) 조건하에서 배양하였다 (Chen et al. Nat. Methods 8, 424-9 (2011)). 분화를 위해, H9 ESC 또는 NC8 iPS 세포를 0.5 mM EDTA를 사용하여 2분 동안 분해하고, 이어서 0.1% Stempro Accutase (Life Technologies)와 함께 3분 동안 항온처리하였다. 2×105개 세포를 50 μM Y-27632 (Calbiochem)를 포함하는 분화 배지 (DMEM:F12 배지, 20% KOSR, 글루타맥스, NEAA; 모두 Gibco 제품)에 재현탁시키고 세포 응집을 위해 초저 부착 표면 6개 웰 플레이트 (Corning) 중의 하나의 웰에 평판배양하였다. 세포 응집체를 3일째에 12 μM CHIR99021 (Tocris)로 처리하고 5, 7 및 9일째에 BMP4 (30 ng/mL, Stemcell Tech.), VEGF-A (30 ng/mL, Peprotech), 및 FGF-2 (30 ng/mL, Miltenyi)를 첨가하였다. 11일째에, 세포를 VEGF-A (30 ng/mL), FGF-2 (30 ng/mL) 및 SB43152 (10 μM)를 함유하는 배지로 전환시켜 내피/혈관주세포 비율의 균형을 맞추었다. 생성된 세포 응집체를 13일째에 매트리겔:콜라겐 I (1:1) 겔에 매립시키고 100 ng/mL VEGF-A 및 100 ng/ml FGF-2를 함유하는 분화 배지로 오버레이하였다. 이 분화 배지는 2일 내지 3일마다 교체하였다. 약 18일째에 혈관 망상구조를 확립하고 직접 분석하거나 개별 세포 응집체로부터의 망상구조를 겔로부터 절단하고 최대 3개월 동안 자유 부유 혈관 오가노이드로서 96개 웰 저 부착 플레이트 (Sumilon, PrimeSurface 96U)에서 추가로 배양하였다.
인간 iPSC의 재프로그래밍 및 특성화. 인간 진피 섬유아세포 (ATCC) 및 혈액 샘플을 이전에 기술된 바와 같이 재프로그램밍하였다 (Agu et al. Stem cell reports 5, 660-71 (2015)). 염색체 무결성을 확인하기 위해, 다중-형광 계내 혼성화 (M-FISH)를 Agu 등에 의해 기술된 바와 같이 수행하였다. 유전자형 분석을 위해, Illumina Inc.에 의해 권장되는 바와 같이 Infinium HTS 프로토콜 가이드에 따라 샘플 준비를 수행하였다. 유전자형 분석은 제조사의 지시에 따라 Illumina iScan 시스템으로 스캔된 Illumina Infinium PsychArray-24 BeadChip을 사용하여 수행하였다. 호출 속도가 <0.995인 샘플을 제외하고는 Genotyping 소프트웨어 (Module 2.0.1)를 갖는 Illumina GenomeStudio (Illumina, San Diego, CA, USA)를 사용하여 유전자형을 호출하였다. 분석을 위해 Illumina, InfiniumPsychArray-24v1-1_A1 매니페스트 및 Infinium PsychArray-24v1-1_A1_ClusterFile 클러스터 파일의 기본 설정을 적용하였다. CNV 분석 및 플롯팅은 bcftools cnv를 사용하여 수행하였다.
면역세포화학. 콜라겐 I:매트리겔 겔에서 혈관 망상구조를 20분 동안 고정시키고 자유 부유 혈관 오가노이드를 실온 (RT)에서 4% PFA로 1시간 동안 고정시키고 진탕기에서 RT에서 2시간 동안 3% FBS, 1% BSA, 0.5% 트리톤, 및 0.5% 트윈으로 차단하였다. 주목할 점은, 혈관 오가노이드는 3D 겔에서 초기에 형성된 혈관 망상구조보다 더 안정하며 따라서 표준 면역조직화학 절차에 사용될 수 있다는 것이다. 일차 항체를 차단 완충액에서 1:100-1:200으로 희석시키고 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 다음 항체들이 이 연구에서 사용되었다: 항-CD31 (DAKO, M082329), 항-VE-카데린 (Santa Cruz, sc-9989), 항-ICAM-1 (Sigma, HPA002126), 항-PDGFR-β (CST, 3169S), 항-SMA (Sigma, A2547), 항-칼포닌 (Abcam, AB46794), 항-콜라겐 타입 IV (Merck AB769), 항-라미닌 (Merck, 19012), 항-MYH11 (Sigma HPA014539). PBS-T (0.05%Tween)에서 3x 10분 세척 후 샘플을 Life Technologies로부터의 상응하는 이차 항체: Alexa Fluor 555 당나귀-항-마우스 (A31570), Alexa Fluor 647 당나귀-항-토끼 (A31573), Alexa Fluor 488 당나귀-항-염소 (A11055), Alexa Fluor 488 당나귀-항-양 (A11015)와 함께 실온에서 2시간 동안 차단 완충액에서 1:250로 항온처리하였다. TBST에서 3 20분 세척 후 샘플을 DAPI로 대조염색하였다. 샘플을 장착하고 (DAKO S302380), 밤새 건조시킨 다음 Zeiss 780 레이저 스캐닝 현미경으로 이미지화하였다.
혈관 오가노이드 이식. 혈관 오가노이드를 12-15주령 NSG 마우스의 신피막 하에 이식하였다. 모든 외과적 시술은 오스트리아 법과 윤리적 승인에 따라 수행하였다. 마우스를 MRI를 사용하여 영상화하여 시간 경과에 따른 이식물을 모니터링하였다. 인간 혈관 임플란트의 관류를 시험하기 위해, 마우스에게 FITC-덱스트란 (1.25mg/마우스, Invitrogen D1822) 또는 항-인간 CD31-Alexa 647 (2 μg/마우스, BD 558094)을 i.v. 주사하였다. 절개된 이식물을 RT에서 2시간 동안 4% PFA로 고정시키고 상기 혈관 오가노이드에 대해 기술된 바와 같이 전체적으로 염색하거나 면역조직화학 또는 표준 H&E 조직학을 위해 처리하였다. 내인성 마우스 및 이식된 인간 혈관구조를 구별하기 위해, 특이 항-인간 CD31 항체 (DAKO, M082329)를 사용하였고 뮤린 혈관을 시각화하기 위해, 특이 항-마우스 CD31 항체 (Abcam, AB56299)를 사용하였다. 가능한 교차-반응성을 배제하기 위해, 이러한 항체를 인간 및 마우스 대조군 절편 둘 다에 대해 시험하여, 특이성을 검증하였다. 샘플을 Zeiss 780 레이저 스캐닝 현미경으로 이미지화하였다.
MRI 이미징. MRI는 35 mM 구적 새장 코일을 갖는 15.2 T Bruker 시스템 (Bruker BioSpec, Ettlingen Germany)에서 수행하였다. 이미징 전에, 조영제의 전달을 위해 테일 라인을 삽입하였다 (실리콘 튜브가 있는 30-게이지 바늘). 모든 동물 (N=3)을 이소플루란 (4% 유도, 1.5%로 유지)으로 마취시켰다. 이미징 동안, 호흡을 모니터링하고, 호흡이 분당 <50회 또는 >80회 호흡인 경우 이소플루란 수준을 조정하였다. 물 펌프를 사용하여 순환되면서 37℃로 가열된 물로 마우스를 따뜻하게 유지시켰다. 임플란트의 해부학적 국소화 및 시각화를 위해 멀티-슬라이스 멀티-에코 (MSME) 스핀 에코 시퀀스를 사용하였다 (반복 시간 (TR)/에코 시간 (TE) = 3000/5.8-81.18 ms, 14 에코, 117 μm2 평면 분해능, 0.5 mm 슬라이스 두께, 실험 횟수 [NEX] = 1). 조영제 누출을 보정하기 위해 0.01 mol/l 가돌리늄-기반 조영제 (Magnevist, Berlex) 0.05 ml의 예비-농축괴 주사를 주입하였다. 동적 민감성 대조 (DSC) 관류 MRI는 0.05 mL의 0.25 mL/L Magnevist의 꼬리-정맥 주사 후 500.6ms 주기 해상도 (1 슬라이스; TR/TE = 500/1.7 ms; 플립-각도 = 5도; 468X468 μm2 평면 해상도; 1-mm 슬라이스 두께; NEX = 2; 360회 반복)으로 FISP(fast imaging with steady-state precession)를 사용하여 수집하였다. DSC 데이터를 사용하여 관류, 상대 혈액량 (rBV), 평균 통과 시간 (MTT) 및 누출 (K2)을 계산하였다. 프로세싱은 ImageJ (국립 보건원; rsbweb.nih.gov/ij/), 및 DSCoMAN 플러그인 (Duke University, dblab.duhs.duke.edu/wysiwyg/downloads/DSCoMAN_1.0.pdf)을 사용하여 오프라인으로 수행하였다. 분석은 안정-상태 자화를 보장하기 위해 DSC-MRI 시계열에서 처음 5개 시점을 생략하고, 픽셀 단위로 예비-농축괴 신호 강도 (
Figure pct00001
)를 계산하고, 생략된 DSC-MRI 시계열을 이완성-시간 곡선으로 변환시키고 (
Figure pct00002
),
Figure pct00003
는 동적 신호 강도 곡선이다), 이전에 기술된 바와 같이(Boxerman et al. Am. J. Neuroradiol. 27, 859-867 (2006)) 가돌리늄 누출 (K2)에 대해 보정하는 것으로 구성되었다.
인간 혈관 오가노이드에서의 당뇨병성 혈관병증 모델링. 혈관 오가노이드에서 확립된 내피 망상구조를, 콜라겐 타입 IV 면역염색 및 전자 현미경에 의해 기저막을 조사하기 전에, 최대 3주 동안 비-당뇨병 대조군 배지 (17mM 글루코스) 또는 당뇨병 배지 (인간 TNFα (1 ng/mL, Invitrogen PHC3011) 및/또는 IL-6 (1 ng/mL, Peprotech 200-06)의 존재 또는 부재하에 75 mM 글루코스)에서 배양하였다. D-만니톨을 비-당뇨병 배지에 사용하여 고삼투압 효과를 제어하였다. 기저막 정량화를 위해, 획득된 z-스택을 분석하고 내강 구조 주위의 ColIV 코트의 두께를 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정하였다. 약물 처리를 위해, 오가노이드를 다음의 약물의 존재 또는 부재하에 당뇨병 배지 (75 mM 글루코스, 1 ng/mL 인간 TNFα, 및 1 ng/mL IL-6)에 노출시켰다: 2,4-티아졸리딘디온 (5 mM, Abcam ab144811), 메트포르민 (5 mM, Abcam ab120847), 아카보스 (80 μg/mL, Sigma A8980), 나테글린딘 (100 μM, Sigma N3538), 디페닐렌요오도늄 (10 μM), 글리메피리드 (30nM, Sigma G2295), 피오글리타존 (10 μM, Sigma E6910). 다음의 소분자 억제제를 사용하였다: N-아세틸-L-시스테인 (500 μM, Sigma, A7250), CHIR99021 (10 μM, Tocris 4423), Goe6976 (100nM, Merck US1365250), MK2206 (10 μM, EubioS1078), QNZ (10 μM, Eubio S4902), SB203580 (10 μM, Eubio S1076), SCH772984 (500nM, Eubio S7101), SP600125 (10 μM, Eubio S1460) Y-27632 (10 μM, Calbiochem 688000), DAPT (25 μM, Sigma D5942), SB431542 (10 μM, Abcam ab120163).
혈관 오가노이드의 FACS 분석. 비-당뇨병성 및 당뇨병성 혈관 오가노이드를 37℃에서 45-60분 동안 PBS에서 25 μg/mL 히알루로니다제 (Worthington), 3U/mL 디스파제 (Gibco), 2U/mL 리베라제 (Roche) 및 100U DNAse (Stemcell Tech)를 사용하여 분해하였다. 이어서, 단일 세포를 다음의 항체로 염색하였다: 항-CD31 (BD, 558094), 항-PDGFR-β (BD, 558821), 항-CD90 (Biolegend, 328117), 항-CD45 (ebioscience, 11-0459-41), 및 항-CD73 (BD 742633). DAPI 염색을 사용하여 죽은 세포를 배제하였다. BD FACS Aria III을 세포 분류를 위해 사용하고 BD FACS LSR Fortessa II를 세포 분석을 위해 사용하였다.
CRISPR/Cas9를 사용한 게놈 편집. 2A-Puro 카세트13 (Addgene Plasmid: #62988;)로 에스. 피로게네스(S. pyogenes)로부터 Cas9를 발현하는 포유동물 발현 벡터를 U6 프로모터 직후 BbSI (Thermo Fisher ER1011)로 절단하였다. 이어서 신경원성 로커스 노치 상동체 단백질 3 (Notch3) 또는 델타-유사 단백질 4 (Dll4)에 대해 sgRNA를 도입하여 플라스미드를 재결찰시켰다. 다음의 프라이머가 sgRNA 어닐링을 위해 사용되었다: Notch3: 정방향, caccgGCCACTATGTGAGAACCCCG (서열번호 7); 역방향, aaacCGGGGTTCTCACATAGTGGCc (서열번호 8); Dll4: 정방향, caccgCAGGAGTTCATCAACGAGCG (서열번호 9); 역방향, aaacCGCTCGTTGATGAACTCCTGc (서열번호 10). sgRNA 플라스미드를 Sanger 시퀀싱에 의해 확인하고 4D-Nucleofector System (Lonza)으로의 iPSC (NC8)의 전기천공에 사용하였다. 2 μg 플라스미드 DNA를 P3 일차 세포 4D-Nucleofector 키트를 사용하여 형질감염시켰다. 형질감염된 NC8 세포를 50 μM Y27632 (Calbiochem)를 함유하는 필수 8 배지 (Gibco) 중에서 매트리겔 코팅된 6-웰 플레이트 상에 시딩하고, 48시간 동안의 퓨로마이신 처리 (0.2 μg/ml) 전에 24시간 동안 배양하였다. 콜로니 형성이 관찰될 수 있을 때까지 나머지 세포를 배양하고 단일 콜로니를 Sanger 시퀀싱으로 유전자형 분석을 위해 추가로 확장시켰다. 녹아웃 세포주는 웨스턴 블롯 또는 면역형광 염색에 의해 검증하였다.
생체 내 인간 혈관 오가노이드에서의 당뇨병 혈관병증 모델링. 인간 혈관 오가노이드 이식물을 지닌 면역결핍성 NSG 마우스에게 연속 5일 동안 40 mg/kg 스트렙토조토신 (STZ) (Merck, 572201)을 매일 i.p. 주사하였다. 매일, STZ를 시트레이트 완충액 (pH4.6)에 새로 용해시키고 즉시 사용하였다. OneTouch UltraEasy 시스템 (Lifetouch, AW 06637502C)을 사용하여 비-공복 글루코스를 측정함으로써 당뇨병을 확인하였다 (혈중 글루코스 >300 mg/dL). DAPT (Selleckchem S2215)를 에탄올에 용해시키고 주당 2일은 처리하지 않으면서 연속 5일 동안 5mg/kg으로 90% 옥수수유를 주사하였다. 항-Notch3 차단 항체 (R&D AF1559)를 3회/주 1 Mg/kg으로 주사하였다. 혈관 누출을 정량하기 위해, FITC-Dextran+ 면적을 측정하고 FIJI 소프트웨어를 사용하여 관류된 인간 혈관 (hCD31+)의 면적에 대해 정규화하였다. 비-당뇨병 마우스를 제어하기 위해 이 비율을 추가로 정규화하였다. 혈관 투과성에 대한 DAPT의 급성 효과의 측정을 피하기 위해, 치료 중단 2일 후 장기간 DAPT 치료된 혈관의 투과성을 측정하였다.
차세대 시퀀싱 및 qRT-PCR 분석. 비-당뇨병성 및 당뇨병성 혈관 오가노이드의 혈관 망상구조를 37℃에서 45-60분 동안 PBS 중의 25 μg/mL 히알루로니다제 (Worthington), 3 U/mL 디스파제 (Gibco), 2 U/mL 리베라제 (Roche) 및 100 U DNAse (Stemcell Tech)를 사용하여 분해하였다. 이어서, 단일 세포를 CD31 발현 (BD 558094)을 위해 염색하고 DAPI 음성 (=살아있는 세포)을 FACS Aria III 기기를 사용하여 FACS 분류하였다. CD31 양성, DAPI 음성 내피세포를 Trizol LS 완충액 (Invitrogen)으로 직접 분류하고 RNA 단리를 위해 추가로 처리하였다. RNA Seq를 위해 mRNA를 poly-A 농축 (NEB)에 의해 농축시키고 Illumnia HiSeq2500에서 시퀀싱하였다. qRT-PCR 분석을 위해, 총 RNA를 Trizol (Invitrogen)을 사용하여 전체 혈관 오가노이드로부터 추출하고, Biorad CFX 실시간 PCR 기기에서 SYBR Green 마스터 믹스 (Thermo)로 수행된 iscript cDNA 합성 키트 (Biorad)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 모든 데이터를 먼저 GAPDH에 대해 정규화한 다음 비-당뇨병 대조군 샘플과 비교하였다. 다음의 프라이머가 사용되었다:
Col4a1-FWD: TGCTGTTGAAAGGTGAAAGAG (서열번호 1)
Col4a1-REV: CTTGGTGGCGAAGTCTCC (서열번호 2)
Col4a2-FWD: ACAGCAAGGCAACAGAGG (서열번호 3)
Col4a2-REV: GAGTAGGCAGGTAGTCCAG (서열번호 4)
GAPDH-FWD: TCTTCTTTTGCGTCGCCAG (서열번호 5)
GAPDH-REV: AGCCCCAGCCTTCTCCA (서열번호 6)
FN1-FWD: ACACAAGGAAATAAGCAAATG (서열번호 11)
FN1-REV: TGGTCGGCATCATAGTTC (서열번호 12)
TUBB-FWD: CCAGATCGGTGCCAAGTTCT (서열번호 13)
TUBB-REV: GTTACCTGCCCCAGACTGAC (서열번호 14)
생물정보 분석. RNA-seq 판독치를 Tophat v2.0.10 및 bowtie2/2.1.0을 사용하여 인간 게놈 (GRCh38/hg38)에 맞춰 정렬하고, TPM, FPKM 및 예상 카운트에서의 유전자- 및 전사체-수준 풍부도 추정은 RSEM v1.2.25로 수행하였으며, 정렬된 판독치를 HTSeq v0.6.1p1로 계수하고, FDR 역치를 0.05로 하여 DESeq2 v1.10.1을 사용하여 차등 발현 분석을 수행하였다. Enrichr (Kuleshov et al. Nucleic Acids Res. 44, W90-7 (2016))를 사용하여 상향조절된 유전자의 GO 항을 확인하였다. 발현 프로파일 유사성 검색 서버 - CellMontage v2 CellMontage v2 (cellmontage2.cira.kyoto-u.ac.jp; Fujibuchi et al. Bioinformatics 23, 3103-3104 (2007))를 사용하여 정상 세포 유형과 관련하여 iPS.EC 세포의 발현 프로파일을 분류하였다. TPM에서의 평균 iPS.EC 세포 전사체 상대적 존재비를 2919개의 사전-프로세싱된 인간 유전자 발현 데이터세트와 비교하였다. 수득된 결과에 근거하여 iPS.EC가 내피세포와 가장 유사하고 - 상관관계가 가장 높은 75개의 데이터세트는 모두 내피세포로부터 유래되고 - 55개는 정맥 내피세포에서, 13개는 미세혈관 내피세포에서, 5개는 동맥 내피세포에서, 2개는 림프관 내피세포에서 유래되며. 이때 상관 계수는 0.69 내지 0.64 범위이고 p-값은 5.38e-2212 내지 6.39e-1828 범위이다. iPS.EC 발현 프로파일을 공개된 인간 조직 RNA-seq 데이터 (Lonsdale et al. Nat. Genet. 45, 580-5 (2013))와 비교하기 위해, 본 발명자들은 2338개의 조직 특이 유전자에 대한 로그-변환된 F/RPKM 값을 사용하여 이전에 기술된 바와 같이 (Danielsson et al. Brief. Bioinform. 16, 941-949 (2015)) 본 발명의 이용 가능한 발현 프로파일을 조합하고 (Cavalli et al. Genome Biol 12, R101 (2011)), ComBat을 사용하여 시퀀싱 연구 배치 효과를 제거하고 상관관계 히트 맵에서 샘플 클러스터링을 검사하였다. iPS.EC의 발현 프로파일은 GTEx 동맥 샘플의 발현 프로파일과 클러스터링되는 것으로 밝혀졌다.
II형 당뇨병 및 정상-혈당 조절 환자로부터의 피부 샘플. 인간 피부의 수술 샘플을 T2D 및 비-당뇨병 환자로부터 채취하였다. 비-괴사성, 건강한 피부를 다리 절단으로부터 채취하였다. T2D 환자의 다리 절단은 당뇨병성 족부 증후군 때문에 필요하였다. 비-당뇨병 환자의 다리 절단은 사고, 정맥 궤양 또는 T2D와 관련이 없는 다른 혈관 질환의 결과로 실시되었다. 본 연구는 지역 윤리 위원회에 의해 승인되었으며 포함된 모든 환자가 사전 동의를 제공하였다 (No. 449/2001; 81/2008). 주목할 점은, 본 발명자들은 다리 절단물의 임의의 궤양 또는 괴사의 가능한 최대 거리에서 분리된 진피를 포함시켰다. 환자 집단의 세부사항은 다음 표 1에 나타내어져 있다.
Figure pct00004
값은 평균 ± SD이다. n: 수, m: 남성, f: 여성, SD: 표준 편차, BMI: 체질량 지수, P: p-값, n.s.: 유의하지 않음, ** t-검정, * 당화 혈색소 퍼센트 (%).
환자 피부의 면역조직화학. 인간 피부 물질을 Geltol에 동결고정시키고 -80℃에서 보관하거나 4% 파라포름알데히드 고정 후 파라핀에 매립시켰다. 2-5 μm 절편을 절단하여 후속 면역형광 또는 면역조직화학 염색에 사용하였다. 파라핀 절편을 탈랍시키고, 수화시키고, 열 유도된 항원 회복을 수행하였다. 항원성은 마이크로웨이빙 (3×5분, 620W)에 의해 또는 10 mM 시트레이트 완충액 (pH 6.0)에서 오토클레이브 (60분)로 절편을 가열함으로써 회복시켰다. 동결 절편을 -20℃에서 보관하고, 사용시 해동 및 건조시키고, 빙냉 아세톤에 20분 동안 고정시켰다. 그후 지시된 일차 항체와 함께 항온처리하고 비오틴-스트렙트아비딘-호스래디쉬 퍼옥시다제 방법에 의해 또는 형광 표지된 이차 항체를 사용함으로써 시각화하였다.
인간 환자-유래 내피세포 제조. 4명의 T2D 및 6명의 비-당뇨병 환자를 분석하였다. BEC의 생체외 제조를 위해 (생략하지 않고 전부 씀), 이전에 기술된 바와 같이11 디스파제 I (Roche Inc., # 210455)의 사용을 포함하여, 기계적 및 효소적 미세제조 프로토콜을 사용하였다. 생성된 단일 세포 현탁액을 1× PBS-1% FCS로 차단하고 개입 세척 단계를 갖는 3단계 절차로 항-CD31, 항-CD45 및 항-포도플라닌 항체와 함께 항온처리하였다. 항체에 대해서는 상기 섹션을 참조한다. 이어서, 세포를 FACStar Plus (Becton Dickinson)를 사용하여 세포 분류에 적용하였다. 총 CD31+ 포도플라닌- 내피세포를 분리하고, 재분석하고, 2회 펠릿화하고 (200g), RLT 완충액 (Qiagen; # 74104)에 용해시키고 RNAseq를 위해 추가로 처리하였다.
전자 현미경검사. 혈관 오가노이드를 실온에서 1시간 동안 0.1 M 인산나트륨 완충액, pH 7.2에서 2.5% 글루타르알데히드를 사용하여 고정시켰다. 당뇨병성 및 비-당뇨병성 다리 절단물로부터의 진피 혈관의 전자 현미경검사를 위해, 인간 피부를 4% PFA 및 0.1% 글루타르알데히드에 고정시키고 Lowicryl-K4M에 매립하였다. 그후, 샘플을 동일한 완충액으로 세정하고, ddH2O 중의 1% 사산화오스뮴에 후-고정시키고, 등급화된 일련의 아세톤에서 탈수시키고 Agar 100 수지에 매립하였다. 당뇨병성 및 비-당뇨병성 다리 절단물로부터의 진피 혈관의 전자 현미경검사를 위해, 인간 피부를 4% PFA 및 0.1% 글루타르알데히드에 고정시키고 Lowicryl-K4M에 매립하였다. 70-nm 절편을 절단하고 2% 우라닐 아세테이트 및 Reynolds 시트르산납으로 후-염색하였다. 절편을 80 kV에서 작동하는 FEI Morgagni 268D (FEI, Eindhoven, Netherlands)로 검사하였다. 11 메가픽셀 Morada CCD 카메라 (Olympus-SIS)를 사용하여 이미지를 획득하였다.
당뇨병의 설치류 모델. 이 연구에 사용되고 참고문헌에 따르는 설치류 모델이 표 2에 열거되어 있다. 대조군은 표에 나타낸 바와 같이 연령 일치 WT 동물 또는 비처리 품종이었다. 모든 설치류 모델의 파라핀 매립된 피부 샘플의 절편을 HE 및 PAS로 염색하여 혈관 형태를 시각화하였다.
Figure pct00005
통계. 달리 명시되지 않는 한, 모든 값은 평균 ± SEM으로 제시된다. 통계 분석은 GraphPad Prism을 사용하여 수행하였다. 사용된 모든 통계 검정은 도면 범례에 기술되어 있다. P < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 받아 들여졌다.
실시예 2: 인간 3D 혈관 오가노이드의 확립
모세관은 벽의 내벽을 형성하는 내피세포와 주변 기저막 내에 매립된 혈관주세포로 구성된다. 인간 내피세포는 이전에는 인간 배아 줄기세포 (hESC)로부터 및 유도 만능성 줄기세포 (iPSC)로부터 유래되었다 (James et al. Nat Biotechnol 28, 161-6 (2010); Patsch et al. Nat. Cell Biol. 17, 994-1003 (2015)). 더욱이, 혈관 평활근 세포와 같은 혈관주위 세포는 인간 ESCc 및 iPSC로부터 생성될 수 있다 (Cheung et al. Nat. Biotechnol. 30, 165-73 (2012)). 그러나, 복잡한 혈관 질환의 메카니즘을 조사하기 위해, 내강화된 내피, 내피-혈관주세포 상호작용 및 공통 기저막의 형성과 같은 인간 미세혈관의 모든 특징과 유사하며 고속 대량 약물 스크리닝에 적용 가능한 고도로 정교한 모델이 필요하다. 따라서, 본 발명자들은 hESC 및 iPS 세포로부터 3D-인간 혈관 오가노이드를 확립하기 시작하였다.
이를 달성하기 위해, 본 발명자들은 중배엽 발달 및 혈관 지정에 관여하는 신호전달 경로를 조절하는 다단계 프로토콜을 개발하였다 (도 1). 본 발명자들은 먼저 저산소 조건하에서 인간 ES 세포 응집체를 배양하고 이들 세포 응집체를 GSK 억제제 CHIR99021에 노출시켜 Wnt 경로를 활성화시킴으로써 중배엽 분화를 유도하였다 (Pasch et al., supra; Sumi et al. Development 135, 2969-2979 (2008)). 이어서, 세포 응집체를 혈관 분화를 촉진하기 위해 BMP4, VEGF-A 및 FGF-2로 처리한 다음 (Bai et al. J. Cell. Biochem. 109, 363-374 (2010); Goldman et al. Stem Cells 27, 1750-1759 (2009)), VEGF-A, FGF-2 및 SB431542 (TGFβ 신호전달을 차단하기 위해)로 처리하였다 (James et al., supra; Watabe et al. J. Cell Biol. 163, 1303-11 (2003)). 이어서, 이들 세포 응집체를 3D 기질에 매립하고 혈관 분화를 유도하기 위해 VEGF-A 및 FGF-2로 추가로 자극하였다. 정의된 실험 조건을 시험하기 위한 다중 파일럿 후, 본 발명자들은 혈관 수상구조와 유사한 구조의 매우 재현가능한 결과물을 가능하게 하는 3D 매트리겔/콜라겐 I 기질을 개발하였다 (도 1a). 혈관 마커 CD31에 대한 면역염색은 이러한 결과물이 높은 비율의 내피 관을 함유함을 확인시켜 주었다 (도 1b, c). 본 발명자들은 또한 내피세포에 대한 추가의 원형 마커인 VE-카데린 (도 6a)에 대한 염색을 관찰하였다. 공초점 이미징은 CD31+ 내피 구조의 복잡하고 상호연결된 망상구조의 형성을 보여주었다 (도 1d). 본 발명자들은 또한 이 접근법을 사용하여 인간 iPSC로부터 CD31+ 혈관 오가노이드를 개발할 수 있었다 (도 6b-d).
다음으로, 본 발명자들은 CD31+ 혈관 오가노이드가 생체 내에서 인간 혈관의 특징을 나타낸다는 것을 입증하였다. 유전자 발현을 프로파일링하기 위해, 본 발명자들은 오가노이드를 분해하고, CD31+ 내피세포에 대해 분류하고 RNAseq를 수행하였다. 본 발명의 3D 배양물로부터의 CD31+ 내피세포의 유전자 발현 프로파일은 실제로 인간 혈관의 유전자 발현 프로파일 (GTEx)과 가장 가깝게 클러스터링하였다 (도 7a). SHOGoin Cellmontage2 분석은 본 발명의 오가노이드 내피세포가 인간 내피세포와 독점적으로 일치함을 추가로 보여주었다 (도시되지 않음). 더욱이, 오가노이드로부터 단리된 내피세포는 원형 hESC 마커 SOX2 및 Nanog를 발현하지도, 평활근 마커인 디스트로핀, 데스민, 및 미오게닌을 발현하지도 않았다; 그러나, 중요하게도, 이들은 일차 인간 내피세포 또는 CD34, CDH5, vWF, PECAM1, NOS3, 또는 RAMP2와 같은 이전에 보고된 2D 시험관 내 인간 내피 배양물의 바이오마커를 발현하지 않았다 (도 7b). 오가노이드로부터 단리된 내피세포는 또한 세포 부착 분자 ICAM1을 유도함으로써 TNFα 자극에 반응하였으며 (도 1e), 이것은 이들의 기능적 역량을 나타낸다. 가장 중요하게는, 이들 3D 혈관 오가노이드는 자가-조직화되었으며, 본 발명자들은 분자 마커 CNN1, SMA 및 PDGFRβ에 의해 정의되는 바와 같이 혈관주세포의 형성 및 적절한 국소화를 관찰하였다 (도 1f-h). 3D 구조는 또한 원형 혈관 기저막 마커인 콜라겐 IV (도 1h, i) 및 라미닌 (도 7c)에 대한 면역염색에 의해 결정되는 바와 같이 기저판에 의해 둘러싸여 있었다. 주목할 점은, 동일한 조건하에서 정제되고 분화된 내피세포와 혈관주세포의 공생-배양은, 단지 적은 혈관주세포 상호작용을 보이고 콜라겐 IV에 의해 덮이지 않은 미약한 내피 망상구조를 초래하였다는 것이다 (도 20a). 중요하게도, 본 발명자들은 인간 배아 줄기세포주 H9 뿐만 아니라 시험된 2개의 추가 iPSC 세포주를 사용하여 유사한 3D 혈관 망상구조를 재현 가능하게 생성할 수 있었다 (도 20b).
약물 스크리닝 접근법을 위해 이러한 시험관 내 미세혈관구조를 더욱 개선하고 표준화하기 위해, 본 발명자들은 자유-부유 3D 오가노이드 배양물을 96 마이크로웰 포맷으로 개발하였다 (도 1a). 이러한 1-2 mm 자유-부유 오가노이드는 단단히 결합된 혈관주세포와 함께 CD31+ 내피세포로 구성된 복잡한 분지형 3D 모세관 망상구조를 형성하였다 (도 2a). 인간 ESC 및 iPSC로부터의 자유-부유 오가노이드의 생성은 강력하고 재현 가능하였다. 중요하게도, 자유-부유 오가노이드 배양물은 면역조직학 및 전자 현미경 (EM)에 의한 처리를 위해 단일 오가노이드를 웰로 분리할 수 있게 하였다. 면역조직학 및 EM 이미징은 실제로 내피세포, 혈관주세포 및 기저막을 갖는 정형화된 모세관의 형성 뿐만 아니라 내피세포 사이의 전형적인 밀착 연접의 형성을 보여 주었다 (도 2b, c). 본 발명자들은 또한 새로 형성되는 혈관을 나타내는, 성장하는 혈관의 가장자리에서 CD31+ 정단 세포를 관찰하였다 (도 2d). 예상한 바와 같이, 이러한 정단 세포는 성숙한 모세관에서만 형성되는 기저막에 의해 둘러싸이지 않는다 (도 2d). 자유-부유 혈관 오가노이드는 배양물에서 약 3-4주 동안 확장한 다음 성장을 정지하고, 그후 적어도 2개월 동안 유지될 수 있었다.
다음으로, 본 발명자들은 FACS를 사용하여 혈관 망상구조 및 자유-부유 오가노이드의 세포 구성을 평가하였다. 둘 다 PDGFR-β+ 혈관주세포 및 CD31+ 내피를 다양한 정도로 함유하였다. 나머지 세포는 주로 CD90+ CD73+ 중간엽 줄기 같은 세포 및 CD90- CD45+ 조혈 세포의 소집단이었다 (도 15a). 본 발명의 혈관 망상구조 및 자유-부유 오가노이드로부터 단리된 CD31+ 내피세포의 유전자 발현 프로파일은 이들 세포가 폰빌레브란트 인자 (vWF)와 같은 성숙한 내피 마커를 발현하고 모 iPSC 만능성 마커를 효율적으로 하향조절한다는 것을 확인시켜 주었다 (도 15b). 3D 배양물로부터의 PDGFR-β+ 단리된 세포는 혈관 오가노이드에서 NG2 (GSPG4), SMA(Acta2) 또는 칼포닌-1 (CNN1)의 발현과 같은 전형적인 혈관주세포 시그니처로 변하는 초기 혈관 망상구조 단계에서의 혼합된 내피/혈관주세포 마커 발현을 나타내었다 (도 15b). 이 단계에서 본 발명자들은 또한 혈관 오가노이드에 여전히 존재할 수 있는 초기 PDGFR-β+ 혈관주세포 전구체로부터 발생할 수 있는 Oct-4 및 Nanog의 일부 발현을 발견하였다. 중요하게도, 본 발명의 자유 부유 오가노이드에서의 내피세포는 세포 부착 분자 ICAM1을 유도함으로써 TNF-α 자극에 반응하였으며 (도 15c), 이것은 기능적 역량을 반영한다. 더욱이, 본 발명자들은 폰빌레브란트 인자 (vWF)에 대한 면역염색 및 바이벨-펠라드 소체의 생성, 아세틸화된 LDL의 흡수, 및 렉틴 UEA-1로의 염색 (도 15d-f)을 관찰하였으며, 이들 모두는 성숙한 내피세포를 나타낸다. 따라서, 본 발명자들은 진짜 인간 미세혈관구조의 형태적 특징 및 분자 시그니처를 나타내는 hESC 및 iPSC로부터의 자가-조직화 3D 인간 혈관 오가노이드를 확립하였다.
따라서, 본 발명자들은 진짜 인간 미세혈관구조의 형태적 특징 및 분자 시그니처를 나타내는 hESC 및 iPSC로부터의 자가-조직화 3D 인간 혈관 오가노이드를 확립하였다.
실시예 3: 혈관 오가노이드는 마우스에서 기능적 인간 혈관구조를 확립함
혈관 오가노이드가 생체 내에서 기능적 혈관을 형성할 수 있는지 시험하기 위해, 본 발명자들은 hiPSC 및 hESC를 시험관 내에서 혈관 오가노이드로 분화시키고 면역결핍 숙주 마우스의 신피막 아래에 이들을 이식하였다. 인간 오가노이드는 이들의 조밀한 구조로 인해 재현 가능하게 이식할 수 있으며 마우스 환경에서, 일부 경우에는 6개월 이상 성장하고 생존할 수 있다. 본 발명자들은 인간-특이 항-CD31로 오가노이드 및 신장 조직을 염색하였으며, 이것은 인간 혈관구조가 내인성 마우스 혈관 옆에 확립되었음을 보여 주었다 (도 3a). 본 발명자들은 또한 정단 세포의 형성 및 인접 조직으로의 인간 혈관의 성장에 의해 결정되는 바와 같이, 인간 혈관의 발아(sprouting)를 관찰하였다. 혈액 순환을 평가하기 위해, 본 발명자들은 수용자 마우스에게 FITC-덱스트란을 관류시켰다. 본 발명자들은 인간 혈관이 내인성 마우스 혈관구조에 접근할 수 있음을 발견하였다 (도 3b,c). 유사하게, 본 발명자들은 인간-특이 항-CD31 항체로 마우스를 관류할 때, 뮤린-특이 항-CD31 염색에 의해 결정되는 바와 같이, 내인성 마우스 혈관구조와는 구별되는 혈관의 관류 및 염색을 관찰하였다 (도 3d).
중요하게는, 조직학적 횡단면측정은 이들 인간 혈관이 세동맥, 모세관 및 세정맥으로 지정되었음을 보여 주었다 (도 3e). 이러한 지정은 인간 CD31+ 내피에 대한 및 내피를 둘러싸고 있는 평활근 세포의 마커로서의 평활근 액틴 (SMA) 또는 칼포닌에 대한 면역조직화학을 사용하여 추가로 확인되었다 (도 3f). 본 발명자들은 또한 인간 미오신 중쇄 11 (MYH11)에 특이적인 항체로 평활근 세포를 검출하였다 (도 3f). 게다가, 이식된 인간 혈관 오가노이드의 관류를 MRI 영상화로 확인하였으며, 이것은 이식된 인간 혈관 오가노이드로의 유동, 및 중요하게는, 또한 혈관 수상구조로부터의 혈액의 배출을 검출하였다 (도 3g). 관류 속도 및 혈액량에 대한 정량적 MRI 측정은 혈관화되고 관류된 이식물을 잘 보여주었다; 게다가, 평균 통과 시간 (MTT) 및 낮은 혈관 누출 (K2)은, 인접한 내인성 마우스 신장 및 근육에서의 혈류 매개변수와 비교하여, 인간 혈관의 명백히 정상적인 조직화 및 기능을 확인시켜 주었다 (도 3g). 이들 데이터는 본 발명의 인간 3D 모세관 오가노이드가 생체 내에서 세동맥 및 세정맥으로 지정될 수 있고, 수용자 마우스에서 관류된 기능적 인간 혈관구조를 형성할 수 있음을 보여준다.
실시예 4: 인간 혈관 오가노이드에서의 당뇨병성 혈관병증
당뇨병은 실명, 신부전, 심장 마비, 뇌졸중 또는 사지 절단의 주요 원인이며; 대부분, 기저막의 확장에 의해 정의되는 혈관의 현저한 변화 때문이다. 당뇨병성 미세혈관병증으로 인한 이러한 구조적 변화는 인간 신장 또는 근육 생검에서 관찰되었다. 인간에서 당뇨병성 미세혈관 변화를 확인하기 위해, 본 발명자들은 정상-혈당 개인 및 2형 당뇨병 (T2D) 환자의 수술 표본에서 진피 피부 미세혈관구조를 조사하였다. 연령, 성별, 체질량 지수 (BMI), 혈청 크레아티닌 수준, 및 질병의 년수를 포함한 임상적인 특성이 표 1에 나타내어져 있다. 정상-혈당 대조군의 진피 혈관에서, CD31+ 모세관 내피는 콜라겐 IV에 의해 및 PAS 염색 (도 4a) 및 전자 현미경 (도 4b)에 의해 결정되는 바와 같이 얇은 기저막으로 둘러싸여 있었다. 본 연구에 포함된 모든 2형 당뇨병 환자의 진피 미세혈관구조는 세포외 세포 기질 단백질의 침착, 대규모 비후화된 양파-껍질 같은 층상화 및 기저막 층의 전형적인 분리에 있어서 현저한 변화를 나타내었다 (도 4a, b). 따라서, 본 발명자들은 예상대로 T2D 환자의 진피 모세관의 대규모 기저막 비후화를 관찰한다.
당뇨병성 미세혈관병증은 당뇨병 환자의 피부에서 명백하지만, 당뇨병의 다양한 설치류 모델에서는 이전에 관찰되지 않았다. 따라서 본 발명자들은 당뇨병의 여러 유전자 및 환경-유도된 마우스 및 래트 모델의 피부 미세혈관구조의 포괄적인 평가를 수행하였다. 그러나, 본 발명자들은 렙틴 및 렙틴 수용체 돌연변이 ob/ob 및 db/db 마우스, 스트렙토조토신-처리된 마우스, 독시사이클린 유도된 인슐린 수용체 녹아웃 마우스, 고지방식 마우스, 고 지방 및 글루코스 LDLR 돌연변이 마우스, 또는 렙틴 수용체 돌연변이를 갖는 Zucker 당뇨병 지방 래트, 및 스트렙토조토신 처리된 래트를 포함한 이러한 모델 중의 어느 것에서도 진피 혈관병증을 나타내는 증가된 기저막을 검출하지 못했다 (도 9a,b, 및 표 2). 따라서, 이러한 1형 및 2형 당뇨병의 매우 중증의 장기 설치류 모델 중 어느 것도 인간 당뇨병성 혈관병증의 주요 특징인 혈액 모세관 기저막의 비후화를 나타내지 않았다.
당뇨병의 설치류 모델이 당뇨병 환자에 존재하는 진피 혈관병증을 나타내지 않는 것을 고려하여, 본 발명자들은 본 발명의 인간 혈관 오가노이드에서 이러한 중요한 표현형을 모델링할 수 있는지 시험하고자 하였다. 이를 달성하기 위해, 본 발명자들은 증가된 글루코스를 갖는 배지에서 3D 혈관 오가노이드를 배양하고 인간 피부 샘플과 유사하게 콜라겐 IV에 의해 검출되는 바와 같이 기저막의 확장을 모니터링하였다. 흥미롭게도, 고혈당증은 인간 혈관 오가노이드에서 콜라겐 IV의 상당한 증가를 초래하였다 (도 4c,d). 당뇨병은 TNF-α 및 IL-6과 같은 전염증성 사이토킨의 상승된 혈청 수준을 포함하여 염증 상태를 동반하기 때문에, 본 발명자들은 또한 정상혈당 또는 고혈당 조건하에서 TNFα 및 IL6의 존재 또는 부재하에 혈관 오가노이드를 배양하였다. 정상-혈당 조건하에서, 혈관 오가노이드에서의 콜라겐 IV 발현은 TNFα 및 IL6에 단독으로 또는 조합하여 노출시켜도 유의적으로 변경되지 않았다. 그러나, 콜라겐 IV 침착은 증가된 글루코스 및 TNF-α와 IL-6 둘 다에 노출된 혈관 오가노이드에서 현저하게 향상되었다 (도 4c,d). 이러한 오가노이드의 공초점 횡단면측정은 TNFα, IL6 및 고 글루코스의 "당뇨병 칵테일(diabetic cocktail)"로의 처리에 반응한 콜라겐 IV의 현저한 확장 및 기저막의 비후를 확인시켜 주었다 (도 4e). 게다가, 인간 T2D 환자에 대한 본 연구결과와 일치하게 (도 4b), 본 발명자들은 EM에 의한 기저막 층의 대규모 비후화 및 분리를 관찰하였다 (도 4f). 당뇨병 칵테일에 반응한 혈관 기저막의 이러한 비후화는 인간 iPSC (도 4c-f) 뿐만 아니라 인간 ESC로부터 유래된 혈관 오가노이드에서 관찰되었다.
다음으로, 본 발명자들은 유전자 발현에 기초하여 고 글루코스/TNFα/IL6에 노출된 "당뇨병성 오가노이드"를 특성화하였다. 본 발명자들은 TNF-알파, IL6 및 고 글루코스에 노출된 혈관 오가노이드에서 내피세포의 현저한 감소 뿐만 아니라 혈관주세포 소실을 관찰하였다 (도 16a,b). 본 발명자들은 대조군 및 당뇨병 인간 혈관 오가노이드로부터 분류된 CD31+ 내피세포에 대해 RNAseq를 수행하였다. 안지오포이에틴 2, 아펠린, ESM1 및 TNFRSF11B를 포함하여, 인간에서 당뇨병에 대한 마커로서 이전에 연루된 유전자는 대조군 오가노이드에 비해 당뇨병 오가노이드에서 가장 상향조절된 상위 5개 유전자에 있었다 (도 5a). 실제로, 당뇨병 vs. 대조군 오가노이드 뿐만 아니라 T2D 환자 vs. 정상혈당 개인의 진피 혈관으로부터 생성된 차등 유전자 발현 프로파일은 세포외 기질, 세포 부착, 및 성장 인자 활성/결합으로 주석이 달린, 당뇨병 오가노이드 및 T2D 환자 간의 현저한 중첩을 나타내었다 (도 5a). 본 발명자들은 또한 대조군과 비교하여 당뇨병 오가노이드에서 콜라겐 IV의 증가된 mRNA 수준을 발견하였고 (도 9b), 대조군 및 당뇨병성 오가노이드로부터의 CD31+ 내피 사이의 차등적으로 발현된 유전자의 상위 5개 유전자 온톨로지 (GO) 경로 항은 모두 콜라겐 생합성 및 세포외 기질 재조직화와 연관된다는 것을 발견하였다 (도 5a). 혈관 오가노이드와는 달리, TNFα/IL6의 존재 또는 부재하에 고 글루코스에 노출된 다양한 내피세포는 HUVEC, 불멸화된 인간 미세혈관 내피세포주 HMEC1, 및 일차 또는 TERT-불멸화된 인간 혈관 내피세포 (BEC)를 포함하여 세포외 기질 및 콜라겐 생합성 성분을 상향조절하지 않았다. 따라서, 고 글루코스 및 염증성 환경에의 인간 혈관 오가노이드의 노출은 인간 당뇨병 미세혈관병증을 모델링하는 기저 혈관 막의 대규모 비후화 및 변경된 유전자 발현 프로파일을 야기한다.
실시예 5: γ-세크레타제 활성의 억제는 혈관 오가노이드의 "당뇨병성" 변화를 제거함
인간 당뇨병성 혈관병증의 시험관 내 오가노이드 모델을 조작하였으므로, 본 발명자들은 다음으로 고 글루코스/TNFα/IL6으로 처리된 인간 혈관 오가노이드에서 기저막의 비후화 및 확장을 차단할 수 있는 약물을 확인하고자 하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 먼저 당뇨병을 치료하기 위해 진료소에서 현재 사용되는 여러 승인된 약물을 시험하였다. 그러나, 본 발명자들이 시험한 의약품, 즉 메트포르민, 피오글리타존, 글리메피리드, 아카보스, 나테글린딘, 티아졸리딘디온 또는 디페닐렌요오도늄 중의 어느 것도 혈관 오가노이드에서 기저 혈관 막의 고 글루코스/TNFα/IL6-유도된 비후화에 영향을 미치지 않았다 (도 5b,c).
본 발명자들은 다음으로 다양한 일반적인 신호전달 및 다운스트림 경로의 소분자 억제제, 즉 GSK3, PKC, AKT, NFkB, ROS, p38-MAPK, JNK, ROCK 및 ERK로 당뇨병성 혈관 오가노이드를 스크리닝하였다. 본 발명자들은 이러한 억제제 중 어느 것도 콜라겐 IV 확장 및 모세관 기저막의 비후화에 유의적인 영향을 미치지 않음을 발견하였다 (도 5d,e). 주목할 것은, NFkB를 차단하면 기저막의 비후화가 사실상 현저하게 증가하였다는 점이다. 다음으로, 본 발명자들은 Notch를 포함하여 상이한 신호전달 경로를 활성화시키기 위해 상이한 수용체를 절단하는 효소인 γ-세크레타제의 억제제를 평가하였다. 본 발명자들은 γ-세크레타제 억제제 DAPT가 "당뇨병 칵테일"에 노출된 인간 혈관 오가노이드에서 콜라겐 IV의 확장 및 기저막 비후화를 완전히 없앤다는 것을 발견하였다 (도 5c,d). 또한, γ-세크레타제 억제제의 효과는 용량-의존적이며 (도 5e), 이것은 이의 특이성 및 효능을 추가로 확인시켜 준다. 중요하게도, 본 발명자들은 또한 인간 혈관이 당뇨병 마우스에서 누출되는 것을 관찰하여, 본 발명자들이 관찰한 형태학적 변화가 또한 혈관 기능 장애와 관련된다는 직접적인 증거를 제공하였다; 과도한 혈관 누출은 DAPT 치료에 의해 구제되었다 (도 17a,b). 게다가, 생체 내 DAPT 치료는 당뇨병 마우스에서 CD31+ 인간 혈관의 소실을 구제하였다 (도 17c,d). 이러한 데이터는 γ-세크레타제 활성의 억제가 시험관 내 및 생체 내에서 당뇨병성 혈관의 구조적 및 기능적 변화를 억제한다는 것을 보여준다.
실시예 6: 당뇨병성 기저막 비후의 후보 경로로서의 Dll4-Notch3의 확인
γ-세크레타제는 Notch를 포함하여 상이한 신호전달 경로를 활성화시키기 위해 다수의 상이한 수용체를 절단할 수 있는 효소이다. 본 발명의 실험적인 당뇨병성 혈관 변화로부터의 보호에 관여하는 분자 DAPT 표적을 확인하기 위해, 본 발명자들은 Notch 리간드 Jagged1, Dll1 및 Dll4 뿐만 아니라 Notch1 및 Notch3을 차단하였으며, 이들 모두는 혈관에서 현저하게 발현된다. Jagged1, Dll1 및 Notch1의 억제는 본 발명의 자유-부유 오가노이드의 "당뇨병성" 변화에 명백한 영향을 미치지 않았다; 그러나, Dll4 및 Notch3의 차단은 기저막 비후로부터 유의적으로 구제되었다 (도 18a). 이러한 연구결과를 확인하기 위해, 본 발명자들은 CRISPR/Cas9를 사용하여 Dll4 및 Notch3 돌연변이 인간 iPS 세포를 생성하였다 (도 19a-d). 이러한 돌연변이 iPS 세포로부터 본 발명자들은 혈관 망상구조 및 자유-부유 혈관 오가노이드를 용이하게 유도할 수 있었다 (도 18b). 중요하게는, Dll4 및 Notch3 돌연변이 혈관 둘 다는 고 글루코스, IL6 및 TNFa에 노출된 대조군 오가노이드에 비해 기저막의 현저하게 감소된 확장을 나타내었다 (도 18b). 마지막으로, 인간 혈관 수상구조를 지닌 STZ-처리된 마우스를 항-Notch3 항체로 생체 내 처리하면, Notch3 차단이 당뇨병 환경에 노출된 인간 혈관의 기저막 변화를 완화시키는 것으로 나타났다 (도 18c). 따라서, 다른 경로를 배제하지 않고, 본 발명자들은 당뇨병성 혈관병증에서 기저막 비후를 매개할 수 있는 주요 리간드-수용체 쌍으로서 Dll4-Notch3을 밝혀내었다.
결론
혈관은 본질적으로 모든 장기 시스템의 발달에 기여하며 뇌졸중에서 심장 마비 또는 암에 이르는 다수의 질병에서 중요한 역할을 한다. 이들의 중요성 때문에, HUVEC 세포와 같은 고전적인 내피세포주의 사용을 포함하여, 발달 및 질병 동안 혈관 생물학을 연구하기 위해 다중 세포 시스템이 개발되었다. 게다가, 내피세포 및 혈관주세포는 각각 인간 줄기세포로부터 개발되었다.
본 발명자들은 본 발명에 이르러 hESC 및 iPSC로부터 진짜 인간 모세관을 성장시키기 위한 강력하고 재현 가능한 시스템을 개발하였다. 이러한 혈관 오가노이드는 인간 오가노이드에 대해 이전에 정의된 모든 기준을 충족한다. 흥미롭게도, 면역결핍 마우스에 이식된 혈관 오가노이드는, 덱스트란 관류, 항체 주사, 및 내인성 마우스 기관에 필적하는 관류 및 누출 속도를 나타내는 혈류의 MRI에 의해 입증되는 바와 같이, 인간 혈관과 마우스 순환계 사이의 연결을 초래하였다. 인간 혈관구조를 마우스 순환계에 연결하면 뚜렷한 혈관 수상구조를 보인다. 가장 중요하게는, 이식된 인간 오가노이드는 생체 내에서 세동맥 및 세정맥으로 추가로 발달하여, 진정한 혈관 수상구조를 형성하며, 이것은 이전에 입증된 적이 없다. 따라서, 이러한 오가노이드는 또한 보다 복잡한 다중-계통 오가노이드를 개발하는데 사용될 수 있으며, 예를 들어 심근 세포를 갖는 혈관을 형성하거나 뇌 또는 간 오가노이드에서 혈관을 발달시키고자 하는데 사용될 수 있다. 이들은 또한 환자-유래 iPSC를 사용하여 희귀 혈관 질환을 연구하는데 사용될 수 있다.
당뇨병의 세계 유병률은 지난 30년 동안 거의 두 배가 되었으며, 현재 당뇨병 환자는 약 4억 2천만 명이고 더 많은 전당뇨병 환자가 있을 것으로 추정되어, 장기적인 이환율과 증가된 사망률을 초래한다. 당뇨병은, 다수의 경우에 불충분한 조직 산소화, 손상된 세포 트래피킹, 또는 혈관 파열을 야기하는 기저막의 대규모 비후와 같은 혈관 병리의 결과로서, 실명, 신부전, 심장 마비, 뇌졸중 및 사지 절단의 주요 원인이다. 설치류의 망막 및 신장에서 당뇨병성 혈관 변화의 특정 측면을 모델링할 수 있지만, 지금까지 인간에서 보이는 당뇨병성 혈관 변화의 모든 임상 특징을 나타내는 단일 모델은 없었다. 또한, 본 발명자들이 연구한 당뇨병 설치류 모델에서는 진피 미세혈관 변화가 발생하지 않으므로, 이러한 미세혈관 변화에서 작동할 수 있는 경로 및 잠재적 약물 표적을 확인하는 새로운 시스템을 개발하는 것이 중요하다. 본 발명의 혈관 오가노이드의 유용성을 입증하기 위해, 본 발명자들은 이들을 고 글루코스, IL6, 및 TNFα를 함유한 "당뇨병 칵테일"에 노출시켜, 콜라겐성 기저막의 현저한 확장 및 T2D 환자의 진피 모세관에서 관찰되는 미세혈관 변화와 유사한 유전자 발현 프로파일을 초래하였다.
본 발명자들은 다수의 현재 항-당뇨병 의약품 및 다중 공통 신호전달 경로의 소분자 억제제를 시험하였지만, 당뇨병 오가노이드에서 기저막의 확장에 영향을 미치는 것은 거의 없었다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 γ-세크레타제 억제제 DAPT가 본 발명의 오가노이드 배양물에서 기저막의 비후를 거의 완전히 방지한다는 것을 발견하였다. γ-세크레타제 억제제는 이미 알츠하이머 질환에 대한 임상 시험을 거쳤으며 현재 암 치료제로서 시험중이다. 이 약물은 인간에서 당뇨병성 혈관병증의 치료를 위해 용도를 변경할 수 있다. 중요하게도, 이러한 데이터는 당뇨병성 미세혈관병증에 대한 인간 혈관 오가노이드 모델이 미세혈관 변화를 완화시키는 신규 약물을 발견하기 위한 유용한 스크리닝 도구라는 원리 증명을 제공한다.
γ-세크레타제 억제제는 이미 알츠하이머 질환에 대한 임상 시험을 거쳤으며 γ-세크레타제 억제제 및 Notch2/3 차단제는 현재 암 치료제로서 시험중이다. 게다가, γ-세크레타제 억제제에 의해 Notch 경로를 억제하는 것은 당뇨병 래트에서 아폽토시스에 의한 족세포 소실 및 당뇨병-유도된 사구체경화증을 감소시켰다. 따라서 이들 약물은 인간에서 당뇨병성 혈관병증의 치료를 위해 용도를 변경할 수 있다. 중요하게도, 이러한 데이터는 인간 혈관 오가노이드 및 본 발명의 생체 내 당뇨병성 미세혈관병증 모델이 당뇨병에서 미세혈관 변화를 완화시키는 신규 약물을 개발하기 위한 유용한 스크리닝 도구일 수 있다는 원리 증명을 제공한다.
SEQUENCE LISTING <110> IMBA - INSTITUT FUR MOLEKULARE BIOTECHNOLOGIE GMBH <120> Blood vessel organoid, methods of producing and using said organoids <130> IPA191521-AT <150> EP 17176335.2 <151> 2017-06-16 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tgctgttgaa aggtgaaaga g 21 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cttggtggcg aagtctcc 18 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 acagcaaggc aacagagg 18 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gagtaggcag gtagtccag 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tcttcttttg cgtcgccag 19 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 agccccagcc ttctcca 17 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 caccggccac tatgtgagaa ccccg 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 aaaccggggt tctcacatag tggcc 25 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 caccgcagga gttcatcaac gagcg 25 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 aaaccgctcg ttgatgaact cctgc 25 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 acacaaggaa ataagcaaat g 21 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 tggtcggcat catagttc 18 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ccagatcggt gccaagttct 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gttacctgcc ccagactgac 20 <210> 15 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Notch 3 gRNA locus <400> 15 ccgcggggtt ctcacatagt ggccctgtgt a 31 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Notch3 KO mutation <400> 16 ccgcggttcc cacataaggg ccctgggta 29 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DLL4 gRNA locus <400> 17 ccgcgctcgt tgatgaactc ctgcagct 28 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DLL4 KO mutation <400> 18 ccgcgcttcg ttgatgaact cctgcagct 29

Claims (20)

  1. 혈관 분화할 수 있는 줄기세포를 제공하는 단계, 상기 줄기세포에서 중배엽 분화를 자극하는 단계, 상기 줄기세포에서 혈관 분화를 자극하는 단계, 상기 줄기세포로부터 세포 응집체를 발달시키는 단계, 상기 세포 응집체를 콜라겐성 3D 기질에 매립하는 (embedding) 단계 및 상기 콜라겐성 3D 기질에서 응집체의 혈관 분화를 자극하는 단계를 포함하는, 인공 혈관 오가노이드를 생성하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 콜라겐성 기질에 매립된 세포 응집체가 적어도 30개의 세포를 포함하는 것인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 중배엽 분화가 줄기세포를 Wnt 효능제 또는 GSK 억제제, 바람직하게는 CHIR99021로 처리하는 것을 포함하는 것인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 줄기세포에서의 혈관 분화가 줄기세포를 VEGF, 바람직하게는 VEGF-A, 및/또는 FGF, 바람직하게는 FGF-2, 및/또는 BMP, 바람직하게는 BMP4, 및/또는 12% (v/v) 이하 대기 산소의 저산소 조건으로 처리하는 것을 포함하는 것인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 응집체의 혈관 분화가 응집체의 세포를 VEGF, 바람직하게는 VEGF-A, 및/또는 FGF, 바람직하게는 FGF-2로 처리하는 것을 포함하는 것인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 콜라겐성 3D 기질이 적어도 50 wt.-% 콜라겐을 포함하고/하거나; 콜라겐성 3D 기질이 10%-50% 라미닌, 20%-70% 콜라겐 I, 및/또는 2%-30% 콜라겐 IV; 바람직하게는 추가로 0.5%-10% 니도겐, 0.5%-10% 헤파란 설페이트 프로테오글리칸, 및/또는 0.5%-10% 엔탁틴 (모두 wt.-%)을 포함하는 것인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 3D 기질이 하이드로겔, 바람직하게는 10 내지 30의 점탄성 저장 계수 G'를 갖는 하이드로겔인 것인, 방법.
  8. 혈관 모세관의 상호연결된 망상구조를 포함하는 인공 혈관 오가노이드 배양물로서, 상기 모세관이 내피 및 혈관주위 혈관주세포를 갖는 기저막을 포함하는, 인공 혈관 오가노이드 배양물.
  9. 제8항에 있어서, 오가노이드가 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항의 방법에 의해 제조되는 것인, 인공 혈관 오가노이드 배양물.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 모세관이 콜라겐을 갖는 하이드로겔을 포함하는 인공 3D 기질에 매립되는 것인, 인공 혈관 오가노이드 배양물.
  11. 제8항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 오가노이드 배양물이 개별 혈관 및 모세관 교차점 사이의 혈관을 계수함으로써 계산되는 바와 같이 40 내지 1000개의 혈관을 포함하는 것인, 인공 혈관 오가노이드 배양물.
  12. 제8항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 혈관 모세관이 1 μm 내지 30 μm의 평균 직경을 갖고/갖거나; 내피세포 대 혈관주위 혈관주세포의 비가 100:1 내지 1:5 사이이고/이거나; 혈관 모세관이 성숙 내피세포 및/또는 성숙 혈관주세포를 포함하는 것인, 인공 혈관 오가노이드 배양물.
  13. 인간 혈관 모세관을 갖는 비-인간 동물 모델을 제공하는 방법으로서, 상기 인간 모세관이 내피 및 혈관주위 혈관주세포를 갖는 기저막을 포함하고, 상기 방법이 제8항 내지 제12항 중의 어느 한 항의 인간 혈관 오가노이드를 비-인간 동물에게 도입하는 단계 및 상기 오가노이드가 이의 혈관 모세관을 자라게 하는 단계를 포함하고, 바람직하게는 상기 인간 오가노이드가 비-인간 동물의 신장 위에 또는 그 안에 도입되는, 방법.
  14. 제8항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 따르는 삽입된 인공 혈관 오가노이드 배양물을 포함하는 비-인간 동물 모델; 또는 인간 혈관 모세관을 갖는 비-인간 동물 모델로서, 상기 인간 모세관이 내피 및 혈관주위 혈관주세포를 갖는 기저막을 포함하고; 바람직하게는 인공 혈관 오가노이드 배양물의 혈관 모세관 또는 인간 혈관 모세관이 비-인간 동물의 혈관 순환계에 의해 관류되는, 비-인간 동물 모델.
  15. 제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 혈관 또는 모세관이 병인에 적용되고, 오가노이드 또는 인간 동물 모델이 병리의 모델이며; 바람직하게는, 병인이 고혈당증 및/또는 염증을 포함하고/하거나 병리가 당뇨병이고, 바람직하게는 염증이 하나 이상의 염증성 사이토킨, 바람직하게는 TNF-알파 및/또는 IL-6에의 노출을 포함하는 것인, 방법 또는 배양물 또는 비-인간 동물 모델.
  16. 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 따르는 배양물 또는 비-인간 동물 모델에 또는 상기 배양물 또는 비-인간 동물 모델의 생성 동안 병인 또는 병리에 영향을 미치는 후보 화합물을 투여하는 단계 및 후보 화합물을 투여하지 않은 상기 배양물 또는 동물 모델과 비교하여 상기 배양물 또는 동물 모델에서의 생리학적 차이를 모니터링하는 단계를 포함하는, 병인 또는 병리에 영향을 미치는 후보 화합물을 스크리닝하는 방법.
  17. 조직 대체 요법, 특히 바람직하게는 인공 혈관 오가노이드를 상처에 배치하고 상기 인공 혈관 오가노이드 배양물이 상처에 통합되게 하는 것을 포함하는 요법에서 임플란트로서의 제8항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 따르는 인공 혈관 오가노이드의 용도.
  18. 당뇨병성 혈관병증 (diabetic vasculopathy), 폐쇄성 혈관병증 (occlusive angiopathy), 변경된 혈관 투과성 (altered vascular permeability), 조직 저산소증 (tissue hypoxia), 심장 질환 (heart disease), 뇌졸중 (stroke), 신장 질환 (kidney disease), 실명 (blindness), 상처 치유 장애 (impaired wound healing) 또는 만성 피부 궤양 (chronic skin ulcer)에서와 같은 비후화된 모세관 기저막의 치료 또는 예방에 있어서의 Notch3 활성화 경로 억제제의 용도.
  19. 제18항에 있어서, Notch3 활성화 경로 억제제가 감마-세크레타제 억제제, Notch3 억제제, DLL4 억제제 또는 이들의 조합인 것인, 용도.
  20. (i) Wnt 효능제 또는 GSK 억제제; (ii) VEGF, 바람직하게는 VEGF-A, FGF, 바람직하게는 FGF-2, BMP, 바람직하게는 BMP4로부터 선택되는 혈관 분화 인자; (iii) 바람직하게는 10%-50% 라미닌, 20%-70% 콜라겐 I, 및/또는 2%-30% 콜라겐 IV (모두 wt.-%)를 포함하는 콜라겐성 3D 기질을 포함하는, 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항의 방법에 따라 인공 혈관 오가노이드를 생성하는데 적합한 키트.
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