JP5547964B2 - 生理活性物質を定着および発現させる方法 - Google Patents
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Description
本発明は、標的とする粘膜下組織に生理活性物質を投与することを特徴とする、該組織特異的に生理活性物質を定着および発現させる方法に関する。
非臨床実験レベルでは、目的遺伝子を導入したり、逆にRNA干渉により目的遺伝子の発現を抑制させたりする手技によって、モデル疾患動物を治療する事が可能になってきた。このような遺伝子やsiRNA（「核酸」と総称）を用いる「核酸医薬品」では、生体内に投与した核酸が継続的に効果を発揮し、かつ、長期間定着する必要がある。そのためのドラッグ・デリバリー・システム（DDS）を如何に構築するかが、核酸医薬品の治療効果を獲得するための重要な要素となる。
一方、核酸をそのまま生体に投与した場合、迅速に分解され効能を発揮できない。そのため、従来これらの核酸はウイルスベクター、リポソーム、アテロコラーゲンなどの担体をDDSとして使用することにより、生体に投与されてきた。
しかしながら、担体自身が生体にとって有害な免疫応答を誘発する等、核酸医薬品作成に関しては、核酸そのものに加え、担体そのものの生体への影響を検討しなければならないという大きな欠点を持っていた。例えばアテロコラーゲンを担体とする場合、コーケンアテロコラーゲンインプラント（シリンジタイプ）の商品に添付されている取り扱い説明書内（非特許文献１）にて、臨床において総症例1,192件中、24件に有害事象が認められた旨が記載されており、仔牛真皮由来コラーゲンに対する過敏な免疫反応が現れることが報告されている。
なお、たとえ担体を用いた場合であっても、通常１週間ほどしか導入した核酸を維持することができないという問題点があった。
しかしながら、担体自身が生体にとって有害な免疫応答を誘発する等、核酸医薬品作成に関しては、核酸そのものに加え、担体そのものの生体への影響を検討しなければならないという大きな欠点を持っていた。例えばアテロコラーゲンを担体とする場合、コーケンアテロコラーゲンインプラント（シリンジタイプ）の商品に添付されている取り扱い説明書内（非特許文献１）にて、臨床において総症例1,192件中、24件に有害事象が認められた旨が記載されており、仔牛真皮由来コラーゲンに対する過敏な免疫反応が現れることが報告されている。
なお、たとえ担体を用いた場合であっても、通常１週間ほどしか導入した核酸を維持することができないという問題点があった。
また先行技術文献として、例えば以下の特許文献１〜７があるが、いずれも担体を利用したものであって、上述の問題点は解消されていなかった。
特表２００３−５１６３６５号
特表２００５−５３８９４３号
特表平９−５０５５７５号
再公表ＷＯ０１−０９３８５６号
特表２００５−５０３１９９号
特開２００７−１１９４９８号
特許第４０５４３５２号
コーケンアテロコラーゲンインプラント（シリンジタイプ）の商品に添付されている取り扱い説明書
本発明は、生理活性物質を投与局所に限局して定着および発現させる方法を提供する。即ち、標的とする粘膜下組織に生理活性物質を投与することにより、該組織特異的に生理活性物質を定着および発現させる方法を提供する。
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意研究を行った。即ち、上述の問題を解決しうる新しい方法として、担体を使用せず生理活性物質の効果を発揮させる方法の確立について検討した。
本発明者らは、具体的には、ラットなどの実験動物の大腸粘膜下組織に、生理活性物質の一態様である核酸を注入するという実験を行い、その効果について確認した。従来の常識では、これらの溶液は拡散あるいは分解して迅速に消失するものと想定されていた。しかしながら、本発明者らが実際に粘膜下組織に対して注入を行なったところ、注入された核酸を含む溶液が拡散せずに投与局所に定着し、かつ、リザーバーのように働いて効果を発揮するという予想外の結果を得た。これは、粘膜下が極めて特殊な微小環境を持ち、生体自身が自己の環境を利用して担体と同じように機能する事を示している。これは、従来の筋肉、血管、粘膜内を介したデリバリー方法では認められなかった現象であり、まさに粘膜下微小環境のみで成し遂げられる現象である。すなわち、生体の中そのものに、DDSとしての役割を果たすスポットが存在していたという発見であり、本発明者らは「nature's DDS」という新しい概念および方法を確立することに成功した。
腸管粘膜下組織は、例えば膵臓のランゲルハンス島を試験管内で培養する際に、他の基質に比較して著しく効果的である事が示されており（Tian XH et al. Hepatobiliary Pncreat Dis Int. 4:524, 2005）、その点でも非常に特殊な微小環境を有していると考えられる。とりわけ、粘膜下のpHや、糖鎖、細胞構成が核酸を維持するのに非常に適した環境になっているものと考えられる。
さらに本発明者らは、ラットおよびマウスの大腸粘膜下組織に、生理活性物質の一態様であるイオパミドール、墨汁、もしくはsiRNAを注入し、いずれの物質についても注入した大腸粘膜下組織に選択的に定着する、という結果を得た。
またマウス大腸炎モデルの大腸粘膜下にsiRNAを投与することによって、大腸におけるGalNAc4S-6ST遺伝子の発現上昇が有意に抑制され、一方で他の正常臓器へは影響を及ぼさないことを見出した。また大腸におけるGalNAc4S-6ST遺伝子の発現が抑制されることにより、炎症の活動性が抑制され、腸管線維性変化も強く抑制されることが明らかになった。さらに大腸組織の上皮の破壊、粘膜固有層および粘膜下層の炎症細胞の浸潤、筋層の肥厚が顕著に抑制され組織学的にも治療効果があることが見出された。
またマウス大腸炎モデルの大腸粘膜下にsiRNAを投与することによって、大腸におけるGalNAc4S-6ST遺伝子の発現上昇が有意に抑制され、一方で他の正常臓器へは影響を及ぼさないことを見出した。また大腸におけるGalNAc4S-6ST遺伝子の発現が抑制されることにより、炎症の活動性が抑制され、腸管線維性変化も強く抑制されることが明らかになった。さらに大腸組織の上皮の破壊、粘膜固有層および粘膜下層の炎症細胞の浸潤、筋層の肥厚が顕著に抑制され組織学的にも治療効果があることが見出された。
以上のように本発明によって、被験体の大腸粘膜下に、経内視鏡的に核酸を投与する事によって、該核酸が投与局所に限定して長期間定着し、効果も維持可能であることが見出された。また本発明によって、担体を利用せずに生理活性物質の効果を発揮させることができるようになり、従来の担体利用に関する課題も解消することができた。
本発明は、標的とする粘膜下組織に生理活性物質を投与することを特徴とする、該組織特異的に生理活性物質を定着および発現させる方法に関し、より具体的には、
〔１〕 標的とする粘膜下組織特異的に生理活性物質を定着および発現させる方法であって、該粘膜下組織に生理活性物質を投与することを特徴とする方法、
〔２〕 前記生理活性物質が、核酸、タンパク質、糖質、脂質、あるいは低分子化合物のいずれかから選択される、〔１〕に記載の方法、
〔３〕 前記核酸が、siRNAである、〔２〕に記載の方法、
〔４〕 前記生理活性物質が、薬理学的に許容される担体と組み合わせて投与される、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法、
を、提供するものである。
〔１〕 標的とする粘膜下組織特異的に生理活性物質を定着および発現させる方法であって、該粘膜下組織に生理活性物質を投与することを特徴とする方法、
〔２〕 前記生理活性物質が、核酸、タンパク質、糖質、脂質、あるいは低分子化合物のいずれかから選択される、〔１〕に記載の方法、
〔３〕 前記核酸が、siRNAである、〔２〕に記載の方法、
〔４〕 前記生理活性物質が、薬理学的に許容される担体と組み合わせて投与される、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法、
を、提供するものである。
さらに本発明は、
〔５〕 疾患を有する粘膜下組織に生理活性物質を投与し、該組織特異的に生理活性物質を定着および発現させる工程を含む、疾患の治療もしくは予防方法、
を提供する。
〔５〕 疾患を有する粘膜下組織に生理活性物質を投与し、該組織特異的に生理活性物質を定着および発現させる工程を含む、疾患の治療もしくは予防方法、
を提供する。
本発明によって、標的とする粘膜下組織に生理活性物質（例えば核酸、蛋白質、糖質、脂質、低分子化合物など）を長期間維持し、生体に有用な生理活性物質を継続的に産生し続ける、あるいは生体に有害な生理活性物質を継続的に除去し続けるためのDDSが提供された。本発明によって、担体を利用せずに生理活性物質を安全かつ効果的に長期間にわたって投与局所に定着させることが可能になった。従って従来のように担体の副作用を考慮することなく、生理活性物質を定着させる事が可能になり、生理活性物質を用いた医薬品（例えば核酸医薬品）の臨床における実現性が非常に高くなる。また、上記医薬品は注入局所に限局して効果を発揮するため、全身的副作用が極めて少なく、従来の方法を遥かにしのぐ安全性を獲得できる。
消化器疾患に関しては、診断時に必ず内視鏡検査（食道、胃、小腸、大腸）を行なうため、診断と同時に生理活性物質（例えば核酸）の注入（＝治療）を行なえるメリットがある。さらに、鼻粘膜下、結膜下などにも応用できると考えられるので、従来生理活性物質のデリバリーが困難であった、脳神経疾患や眼疾患に対する医薬品の臨床実現を可能とする。いずれも従来の局所投与法、すなわち、注腸、点鼻、点眼よりも優れた効果を示す。
本発明者らは、粘膜下組織に直接生理活性物質を投与することによって、該生理活性物質が消失あるいは拡散したりせず、長期間にわたって投与局所に定着し、さらにはリザーバーのように働き効果を発揮することを見出した。
本発明は、標的とする粘膜下組織に生理活性物質を投与することを特徴とする、該組織特異的に生理活性物質を定着および発現させる方法を提供する。
本発明における「粘膜」とは、即ち、消化管、呼吸器、泌尿生殖器系などに属する中腔性臓器の、肉眼的に認められる内腔の表面を覆う膜を指し、気道に連絡する耳管や中耳腔、さらに眼球、眼瞼の結膜側などを覆う膜も含まれる。通常、上皮が最表層にあり、その下層が粘膜固有層である。
本発明において用いられる「粘膜下組織（Tela submucosa）」とは、上皮を支持する固有層の下の組織を指す。なお実際の臨床において、「粘膜下組織」の区別は、医師の感覚的なものにたよる場合もあり、上皮の下を「粘膜内組織」、粘膜内よりも深く粘膜と筋肉との間を「粘膜下組織」とすることもある。
本発明における「粘膜下組織」としては、本発明の生理活性物質を維持するのに適した条件（pH、糖鎖、細胞構成など）を有する粘膜下組織であれば特に限定されない。例えば、腸管、目、耳、鼻、子宮、膀胱、口腔、または皮下等の粘膜下組織などを挙げることができるが、これらに制限されない。
特に、腸管粘膜下組織については、膵臓のランゲルハンス島を試験管内で培養する際に、他の基質に比較して著しく効果的である事が示されており（Tian XH et al. Hepatobiliary Pncreat Dis Int. 4:524, 2005）、その点でも非常に特殊な微小環境を有していると考えられる。即ち本発明における粘膜下組織の好ましい態様としては、腸管粘膜下組織を挙げることができる。
上記「腸管粘膜下組織」としては、例えば食道、胃、十二指腸、小腸、虫垂、大腸、直腸等の腸管における粘膜下組織を挙げることができる。さらに本発明における腸管粘膜下組織の好ましい態様としては、大腸粘膜下組織を挙げることができる。
本発明における「生理活性物質」とは、生命体に様々な生理作用を及ぼす化学物質の総称であり、特に制限はない。本発明においては、例えば、核酸、タンパク質、糖質、脂質、あるいは低分子化合物のいずれかから選択されることが好ましい。
本発明において用いられる「核酸」とはRNAまたはDNAを意味する。また所謂PNA（peptide nucleic acid）やモルフォリノアンチセンスオリゴ（Morpholino antisense oligo）等の化学合成核酸アナログも本発明の核酸に含まれる。PNAは核酸の基本骨格構造である五単糖・リン酸骨格を、グリシンを単位とするポリアミド骨格に置換したものであり、モルフォリノアンチセンスオリゴはモルフォリノ骨格に置換したもので、核酸と類似の３次元構造を有する。
目的（標的）遺伝子の発現を抑制することを目的とする場合、本発明における核酸としては、例えば標的遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸、標的遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸、標的遺伝子の発現をRNAi効果により阻害作用を有する核酸などを挙げることができる。
特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者によく知られている。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点とのハイブリッド形成よるスプライシング阻害、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害、キャッピング部位やポリ(A)付加部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害（平島および井上、新生化学実験講座2 核酸IV遺伝子の複製と発現、日本生化学会編、東京化学同人、1993、319-347）、アンチセンスRNAについてはmRNAとのハイブリッド形成による二本鎖RNA形成よりRNAi効果による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は転写、スプライシング、翻訳などの様々過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を阻害する。
アンチセンス核酸は、上記のいずれの作用により、標的遺伝子の発現および／または機能を阻害してもよい。一つの態様としては、標的遺伝子のmRNAの5’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは3’側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、標的遺伝子の翻訳領域だけでなく、非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も、本発明で利用されるアンチセンス核酸に含まれる。使用されるアンチセンス核酸は、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは3’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして構築された核酸は、公知の方法を用いることで所望の動物（細胞）に導入することができる。アンチセンス核酸の配列は形質転換される動物（細胞）が有する内在性の標的遺伝子またはその一部と相補的な配列が好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは標的遺伝子に対して好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上の相補性を有する。アンチセンス核酸を用いて、標的遺伝子の発現を効果的に阻害するには、アンチセンス核酸の長さは少なくとも15塩基以上25塩基未満であることが好ましいが、本発明のアンチセンス核酸は必ずしもこの長さに限定されず、例えば100塩基以上、または、500塩基以上であってもよい。
上述の標的遺伝子の発現の阻害は、リボザイム、またはリボザイムをコードするDNAを利用しておこなうことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子を指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、RNAを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムにはグループIイントロン型やRnasePに含まれるM1 RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子、蛋白質核酸酵素、1990、35、2191）。
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15という配列のC15の3’側を切断するが、その活性にはU14とA9との塩基対形成が重要とされ、C15の代わりにA15またはU15でも切断され得ることが示されている（Koizumi M, et al., FEBSLett, 1988, 239, 285、小泉誠および大塚栄子、蛋白質核酸酵素、1990、35、2191、Koizumi M, et al., Nucl Acids Res. 1989, 17, 7059）。
また、ヘアピン型リボザイムも有用である。このリボザイムは、例えば、タバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見いだされる（Buzayan JM., Nature, 1986, 323, 349）。ヘアピン型リボザイムからも標的特異的なRNA切断リボザイムを作出できることが示されている（Kikushi Y. & Sasaki N., Nucl. Acids Res., 1991, 19, 6751.、菊池洋, 化学と生物, 1992, 30, 112）。このように、リボザイムを用いて上述の標的遺伝子の転写産物を特異的に切断することによって、該遺伝子の発現を阻害することができる。
また本発明における核酸の好ましい態様としては、RNAi効果により阻害作用を有する核酸（siRNA）が挙げられる。
標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖RNAを用いたRNA干渉（RNA interference、以下「RNAi」と略称する）という方法が、標的遺伝子の発現を抑制する方法として知られている。
RNAiは二本鎖RNAと相補的な塩基配列を持ったmRNAが分解される現象である。RNAiはこの現象を利用して人工的に21〜23merの二本鎖RNA（small interfering RNA；siRNA）を導入することにより、任意の遺伝子の発現を抑制する方法である。1998年にFireらが線虫を用いて二本鎖RNAが配列特異的に遺伝子のサイレンシングを引き起こすことを発見して以来（Fire A. et al., Nature, 1998, 391, 806-811）、21〜23merにプロセッシングされた二本鎖RNAがmRNAを切断する機構（Zamore PD. et al., Cell, 2000, 101, 25-33）やRISC（RNA-induced silencing complex）の存在（Hammond SM. et al., Science, 2001, 293, 1146-1150）、Dicerのクローニング（Bernstein E. et al., Nature, 409, 363-366）を経て、2001年にElbashirらによって哺乳類細胞でもsiRNAによる配列特異的な発現抑制が可能であることが証明され（Elbashir SM. et al., Nature, 2001 411, 494-498）、遺伝子治療への応用が期待されている。
RNAi効果により阻害作用を有する核酸は、一般的にsiRNAもしくはショートヘアピンRNA（short hairpin RNA；shRNA）とも呼ばれる。RNAiは標的遺伝子のmRNAと相同配列からなるセンスRNAとこれと相補的な配列からなるアンチセンスRNAとからなる短鎖二本鎖RNA（以下「dsRNA」と略称する）を細胞等に導入することにより、標的遺伝子mRNAに特異的かつ選択的に結合して破壊を誘導し、当該遺伝子転写産物を切断することにより標的遺伝子の発現を効率よく阻害する（抑制する）現象である。例えば、dsRNAを細胞に導入すると、そのRNAと相同配列を持つ遺伝子の発現が抑制（ノックダウン）される。このようにRNAiは標的遺伝子の発現を抑制し得ることから、従来の煩雑で効率の低い相同組み替えによる遺伝子破壊方法（ノックアウト）に変わる簡易な遺伝子ノックアウト方法として、または遺伝子治療へ応用可能な方法として注目されている。RNAiに用いるRNAは、標的遺伝子もしくは該遺伝子の部分領域と必ずしも完全に同一である必要はないが、完全な相同性を有するRNAであることが好ましい。
siRNAの設計にあたっては、標的遺伝子における領域であれば特に限定されるものではなく、任意の領域をすべて標的候補とすることが可能である。
また、上記二本鎖RNAは一方の端が閉じたヘアピン構造を有するRNA（shRNA）でもよい。shRNAとは一本鎖の一部の領域が他の領域と相補鎖を形成するためステムループ構造を有するRNA分子である。このように分子内で二本鎖RNAを形成し得る分子もsiRNAに含まれる。
本発明のsiRNAには、例えば1もしくは少数の塩基の欠失あるいは付加された構造の二本鎖RNAであっても、標的遺伝子の発現をRNAi効果によって抑制する機能を有するものであれば、本発明のsiRNAに含まれる。
RNAi機構の詳細については未だに不明な部分が多いが、DICERと呼ばれる酵素（RNaseIII核酸分解酵素ファミリーの一つ）が二本鎖RNAと結合し、二本鎖RNAがsiRNAとよばれる小さな断片に分解されるものと考えられている。本発明におけるRNAi効果を有する二本鎖RNAには、このようにDICERによって分解される前の二本鎖RNAも含まれる。すなわち、そのままの長さではRNAi効果を有さないような長鎖のRNAであっても、細胞内においてRNAi効果を有するsiRNAへ分解されることが期待されるため、本発明における二本鎖RNAの長さは、特に制限されない。
例えば、標的遺伝子のmRNAの全長もしくはほぼ全長の領域に対応する長鎖二本鎖RNAを、例えば、予めDICERで分解し、その分解産物を利用することも可能である。この分解産物にはRNAi効果を有する二本鎖RNAが含まれることが期待される。この方法によれば、RNAi効果を有することが期待される領域を特に選択しなくともよい。すなわち、RNAi効果を有する本発明の上述の遺伝子のmRNA上の領域は、必ずしも正確に規定される必要はない。
本発明におけるsiRNAは、必ずしも標的配列に対する一組の二本鎖RNAである必要ではなく、標的配列を含んだ領域に対する複数組の二本鎖RNAの混合物であってもよい。また、本発明のsiRNAには、所謂「カクテルsiRNA」が含まれる。
また、本発明におけるsiRNAは必ずしもすべてのヌクレオチドがリボヌクレオチドでなくともよい。すなわち、本発明において、siRNAを構成する1もしくは複数のリボヌクレオチドは対応するデオキシリボヌクレオチドであってもよい。この「対応する」とは、糖部分の構造は異なるものの、同一の塩基種（アデニン、チミン（ウラシル）、グアニン、シトシン）であることを指す。例えば、アデニンを有するリボヌクレオチドに対応するデオキシリボヌクレオチドとは、アデニンを有するデオキシリボヌクレオチドのことをいう。また、前記の「複数」とは特に限定されないが、好ましくは2〜5個程度の少数を指す。
本発明におけるsiRNAとしては、例えば配列番号：１および／または２に記載のsiRNAを挙げることができる。
また、標的遺伝子の発現を抑制することを目的とする核酸の他の態様としては、microRNA（miRNA）、アプタマー、オリゴヌクレオチドを改質したロックド核酸（Locked Nucleic Acid; LNA）などを挙げることができる。
本発明においては、上述の核酸に制限されず、用途に応じて適切な核酸を用いることができる。
本発明においては、上述の核酸に制限されず、用途に応じて適切な核酸を用いることができる。
また本発明における「タンパク質」とは、複数のアミノ酸からなる重合体を指し、ポリペプチドだけでなく、オリゴペプチドも含まれる。ここで、ポリペプチドとは、天然に存在する状態から修飾されていないもの、および修飾されているものの双方が含まれる。修飾としては、アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸の転移RNA媒介付加、ユビキチン化などが含まれる。
目的（標的）タンパク質の機能を阻害（抑制）することを目的とする場合、本発明におけるタンパク質としては、例えば、標的タンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有する標的タンパク質変異体、標的タンパク質に結合する抗体を挙げることができる。
「標的タンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有する標的タンパク質変異体」とは、該タンパク質をコードする遺伝子を発現させることによって、内在性の野生型タンパク質の活性を消失もしくは低下させる機能を有するタンパク質を指す。
また標的タンパク質に結合する抗体は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして得ることができる。天然の標的タンパク質、あるいはGSTとの融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発現させたリコンビナント標的タンパク質、またはその部分ペプチドをウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、標的タンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。モノクローナル抗体であれば、例えば、標的タンパク質若しくはその部分ペプチドをマウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、標的タンパク質に結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、標的タンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。
上記抗体の形態には、特に制限はなく、標的タンパク質に結合する限り、上記ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のほかに、ヒト抗体、遺伝子組み換えによるヒト型化抗体、さらにその抗体断片や抗体修飾物も含まれる。
抗体取得の感作抗原として使用される標的タンパク質は、その由来となる動物種に制限されないが哺乳動物、例えばマウス、ヒト由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。感作抗原として使用されるタンパク質は、完全なタンパク質あるいはタンパク質の部分ペプチドであってもよい。タンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、タンパク質のアミノ基（N）末端断片やカルボキシ（C）末端断片が挙げられる。本明細書における「抗体」とはタンパク質の全長又は断片に反応する抗体を意味する。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばEBウィルスに感染したヒトリンパ球をin vitroでタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、タンパク質への結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる。
得られた抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型抗体であることが好ましい。
本発明におけるタンパク質のその他の態様としては、例えば酵素等を挙げることができるが、その形態は特に制限されない。
また本発明における「糖質」には、単糖、オリゴ糖、多糖のいずれの形態も含まれる。またこれら糖質がタンパク質や脂質などと共有結合した複合糖質、単糖やオリゴ糖の還元基にアルコール、フェノール、サポニン、色素などのアグリコンが結合した配糖体も本発明の糖質に含まれる。
また本発明における「脂質」には、単純脂質、複合脂質、および誘導脂質（derived lipid）のいずれの形態も含まれる。
また本発明における「低分子化合物」には、分子量が一般的に約数百から数千で化学的に合成された低分子量の物質が含まれる。標的タンパク質の機能を阻害（抑制）することを目的とする場合、例えば標的タンパク質に結合する低分子量物質を用いることができる。標的タンパク質に結合する低分子量物質は、天然または人工の化合物であってもよい。通常、当業者に公知の方法を用いることによって製造または取得可能な化合物である。
本発明における生理活性物質のその他の態様として、例えば天然化合物、有機化合物、無機化合物などの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が挙げられるが、これらに限定されない。また上述の生理活性物質はそれぞれ単独で用いられても良いし、他の生理活性物質と組み合わせて用いられても良い。
なお本発明における生理活性物質は、修飾や標識を行わないそのままの形態（本発明では「裸」と記載する場合がある）で用いられる（投与される）ことが好ましい。
本発明における生理活性物質は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。この標識は特に制限されないが、アルカリホスファターゼ標識、ペルオキシダーゼ標識、ビオチン標識−ストレプトアビジン結合酵素（アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ等）、あるいはFITC（fluorescein isothiocyanate）などが挙げられる。
また本発明における生理活性物質は、薬理学的に許容される担体と組み合わせて用いることもできる。本発明における「薬理学的に許容される担体」とは、例えば通常、遺伝子治療用ベクターとして用いられるベクターが挙げられる。
上記ベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターやリポソーム、アテロコラーゲンなどの非ウイルスベクターなどを例示することができる。該ベクターを利用して、ex vivo法やin vivo法などにより、本発明における生理活性物質の投与を行うことができる。
本発明の薬剤は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝バッファー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシルビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが含まれていてもよい。本発明の生理活性物質には保存剤等の添加物をさらに含んでもよい。本発明の生理活性物質はさらに他の薬理成分を含有していてもよい。
本発明の生理活性物質は、好ましくは非経口製剤であり、液剤、懸濁剤等の液体製剤が好ましく、例えば注射剤の形態を挙げることができる。他にも、例えばバルーンやステント等の挿入器具の表面に塗布あるいはコーティングするための塗布剤やコーティング剤の形態を挙げることができる。
本発明の生理活性物質の個体（患者等）への投与は、標的とする粘膜下組織に対し注射する方法、あるいはバルーンやステント等の挿入器具の表面に塗布あるいはコーティングして投与する方法など当業者に公知の方法により行いうる。投与の際には、内視鏡等の器具を必要に応じ用いてもよい。
本発明の生理活性物質の投与量は、個体（患者等）の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
さらに本発明は、疾患を有する粘膜下組織に生理活性物質を投与し、該組織特異的に生理活性物質を定着および発現させる工程を含む、疾患の治療方法もしくは予防方法を提供する。
上記「疾患」としては、粘膜に関わる疾患（具体的には炎症性腸疾患、クローン病）、線維化疾患、関節炎（変形性関節炎及びリウマチ様関節炎）、アルツハイマー病、臓器移植毒性及び拒絶、悪液質、アレルギー、癌（例えば、固形腫瘍癌であって、結腸、乳房、前立腺、脳を含むもの、並びに白血病及びリンパ腫を含む造血性悪性腫瘍）、組織潰瘍形成、再狭窄、歯周病、表皮水疱性、骨粗しょう症、人工関節インプラントのゆるみ、アテローム性動脈硬化症（アテローム性動脈硬化斑裂開を含む）、大動脈瘤（腹部大動脈及び脳大動脈瘤を含む）、うっ血性心不全、心筋梗塞、発作、脳虚血、頭部外傷、脊髄損傷、神経変性疾患（急性及び慢性）、自己免疫疾患、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、片頭痛、うつ病、末梢ニューロパシー、痛み、脳アミロイド血管障害、向知性又は認識性亢進、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、眼血管形成、角膜損傷、黄斑変性症、異常外傷治癒、熱傷等を挙げることができるが、本発明の方法に適合する疾患であれば、特にこれらに限定されない。
上記「疾患」としては、粘膜に関わる疾患（具体的には炎症性腸疾患、クローン病）、線維化疾患、関節炎（変形性関節炎及びリウマチ様関節炎）、アルツハイマー病、臓器移植毒性及び拒絶、悪液質、アレルギー、癌（例えば、固形腫瘍癌であって、結腸、乳房、前立腺、脳を含むもの、並びに白血病及びリンパ腫を含む造血性悪性腫瘍）、組織潰瘍形成、再狭窄、歯周病、表皮水疱性、骨粗しょう症、人工関節インプラントのゆるみ、アテローム性動脈硬化症（アテローム性動脈硬化斑裂開を含む）、大動脈瘤（腹部大動脈及び脳大動脈瘤を含む）、うっ血性心不全、心筋梗塞、発作、脳虚血、頭部外傷、脊髄損傷、神経変性疾患（急性及び慢性）、自己免疫疾患、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、片頭痛、うつ病、末梢ニューロパシー、痛み、脳アミロイド血管障害、向知性又は認識性亢進、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、眼血管形成、角膜損傷、黄斑変性症、異常外傷治癒、熱傷等を挙げることができるが、本発明の方法に適合する疾患であれば、特にこれらに限定されない。
本発明の生理活性物質を投与する個体としては、ヒト、家畜、愛玩動物、実験動物を含む哺乳動物が好ましい。特に上記疾患を罹患している哺乳動物（患者）が本発明にかかわる個体として好ましい。
なお本明細書中で引用した全ての刊行物、特許および特許出願はその全体を参照により本明細書中に組み入れるものとする。
以下実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されない。
〔実施例１〕
デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）(3%、分子量50,000)を12週齢の雄Wistarラットに自由飲水させることでDSS腸炎を惹起させた（Okayasu I, Hatakeyama S, Ohkusa T, Inagaki Y, Nakaya R. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology 1990;98: 694-702.）。DSS飲水開始0、3日に、ヒト用極細径内視鏡をネンブタールで麻酔したラット大腸内に挿入した。粘膜の観察を行った後に、左側結腸に4箇所均等間隔をあけてsiRNAを粘膜下に注入した。極細径内視鏡はヒト上部消化管内視鏡として開発されたOLYMPUSの外径5.6mm、直径2mmの操作鉗子チャンネルを有する試作機を使用した。対照には無治療ラットを使った。
〔実施例１〕
デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）(3%、分子量50,000)を12週齢の雄Wistarラットに自由飲水させることでDSS腸炎を惹起させた（Okayasu I, Hatakeyama S, Ohkusa T, Inagaki Y, Nakaya R. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology 1990;98: 694-702.）。DSS飲水開始0、3日に、ヒト用極細径内視鏡をネンブタールで麻酔したラット大腸内に挿入した。粘膜の観察を行った後に、左側結腸に4箇所均等間隔をあけてsiRNAを粘膜下に注入した。極細径内視鏡はヒト上部消化管内視鏡として開発されたOLYMPUSの外径5.6mm、直径2mmの操作鉗子チャンネルを有する試作機を使用した。対照には無治療ラットを使った。
治療群および対照群で、体重減少・下痢・下血の三項目から算出したClinical Disease Activity Index (CDAI)、腸管長、および大腸切片より作成したHE染色標本を用いた病理組織学的解析をもとに治療効果判定を加えた。
〔実施例２〕ラット大腸粘膜下における生理活性物質定着
次に、正常ラットでの粘膜下組織における生理活性物質の定着を、X線、CTという臨床的に汎用されている画像診断で解析した。12週齢の雄Wisterラットをネンブタールで麻酔後、ヒト用極細径内視鏡を大腸内に挿入し、内視鏡的に局注針を用いて左結腸粘膜下に造影剤であるイオパミドールを単独で20μl注入した。
次に、正常ラットでの粘膜下組織における生理活性物質の定着を、X線、CTという臨床的に汎用されている画像診断で解析した。12週齢の雄Wisterラットをネンブタールで麻酔後、ヒト用極細径内視鏡を大腸内に挿入し、内視鏡的に局注針を用いて左結腸粘膜下に造影剤であるイオパミドールを単独で20μl注入した。
イオパミドール（Iopamidol）とは、化学名N,N'-Bis[2-hydroxy-1-(hydroxymethyl)ethyl]-5-[(2S)-2-hydroxypropanoylamino]-2,4,6-triiodoisophthalamide、分子式C17H22I3N3O8、分子量777.09、構造式（式(I)）で表わされる化合物である。
（式(I)）
１時間後にX線、CTで撮影を行った。結果を図２に示す。X線では、注入されたイオパミドールが、結腸粘膜下に定着し、腹腔内への漏出や、他の部位への移動は全く認められなかった。CTでもイオパミドールが注入部に限局して定着し、他のスライス面への拡張は認められなかった。したがって、本発明の方法は、極めて限定的に標的とする粘膜下組織に生理活性物質を定着させうる方法である事が、臨床的な評価法によっても確認できた。
〔実施例３〕マウス大腸粘膜下における生理活性物質定着
次に、より汎用されている実験動物であるマウスにおいて、生理活性物質定着を検討した。８週齢の雌C57BL/6Jマウスをネンブタールで麻酔後開腹し、下部大腸を露出させ、目視下で粘膜下に、本願発明の生理活性物質に相当するカーボンパーティクル（墨汁）を単独で20μl注入後、閉腹した。
次に、より汎用されている実験動物であるマウスにおいて、生理活性物質定着を検討した。８週齢の雌C57BL/6Jマウスをネンブタールで麻酔後開腹し、下部大腸を露出させ、目視下で粘膜下に、本願発明の生理活性物質に相当するカーボンパーティクル（墨汁）を単独で20μl注入後、閉腹した。
５日後にマウスを屠殺し、大腸組織切片を作成、光学顕微鏡下で観察した。結果を図３に示す。注入したカーボンパーティクルは粘膜下に定着しており、他の部位への物理的拡散、漏出を認めなかった。
〔実施例４〕マウス大腸局所における核酸の定着
実施例１、３と同様の方法で、BLOCK-iT Fluorescent Oligo(invitrogen社製)のFITC標識siRNA 20μl(20μM)をマウス大腸粘膜下に注入し、２４時間後に蛍光実体顕微鏡（ライカ社製）にて注入したsiRNAの定着を検討した。
実施例１、３と同様の方法で、BLOCK-iT Fluorescent Oligo(invitrogen社製)のFITC標識siRNA 20μl(20μM)をマウス大腸粘膜下に注入し、２４時間後に蛍光実体顕微鏡（ライカ社製）にて注入したsiRNAの定着を検討した。
結果を図４に示す。FITC標識siRNAは注入した大腸局所に限局していた。実施例１の図１は同じFITC標識siRNAをラット大腸粘膜下に注入した組織像であるが、マウス大腸粘膜下においても上記結果より、同様の結果が得られると考えられる。
以上の結果より、本発明の方法により大腸粘膜下に注入されたsiRNAを含む生理活性物質が、粘膜下組織に選択的に定着するという結果が、臨床的指標（X線、CT）、生存個体における顕微鏡的指標、更には組織学的指標という多角的な視点により全て確認できた。
〔実施例５〕マウス大腸粘膜下における核酸の動態
次に、生化学的手法によっても大腸粘膜下に注入したsiRNAの定着を確認するために、既報（Rosie Z et al. Analytical Biochem. 304:19-25, 2002）の如く、siRNAを直接的に測定するELISA法を駆使して、大腸におけるsiRNA濃度を測定した。本実施例に用いたGalNac 4S-6ST siRNAの塩基配列について以下に示す。配列は必ずしも本例のみに限定されない。
次に、生化学的手法によっても大腸粘膜下に注入したsiRNAの定着を確認するために、既報（Rosie Z et al. Analytical Biochem. 304:19-25, 2002）の如く、siRNAを直接的に測定するELISA法を駆使して、大腸におけるsiRNA濃度を測定した。本実施例に用いたGalNac 4S-6ST siRNAの塩基配列について以下に示す。配列は必ずしも本例のみに限定されない。
［human GalNac4-6STsiRNA］(Gene Bank accession number NM_015892)
（北海道システムサイエンス社製）
5’-ggagcagagcaagaugaauacaauc-ag -3’（配列番号：１）
3’-ua-ccucgucucguucuacuuauguuag -5’ （配列番号：２）
（北海道システムサイエンス社製）
5’-ggagcagagcaagaugaauacaauc-ag -3’（配列番号：１）
3’-ua-ccucgucucguucuacuuauguuag -5’ （配列番号：２）
実施例３と同様の方法で、８週齢の雌C57BL/6Jマウスの大腸粘膜下3ヶ所にGalNAc4S-6ST siRNA（0.3μg/10μl）を注入し、0.5時間、3時間、6時間、24時間後にマウスを屠殺、大腸組織標本を作製し、siRNA濃度をELISA法にて測定した。
結果を図５に示す。陽性対照としては、注入前の1μg/mLのsiRNAをそのまま用いた。0.5時間後は極めて高濃度にsiRNAが定着しており、3時間後には半減していたが、その後24時間後も持続的に定着している結果であった。
したがって、画像診断学的、組織診断学的、さらに生化学的にも本発明の方法によって生理活性物質が有効に注入部に定着する事が立証された。
したがって、画像診断学的、組織診断学的、さらに生化学的にも本発明の方法によって生理活性物質が有効に注入部に定着する事が立証された。
〔実施例６〕GalNAc4S-6ST siRNA安定性試験
本実施例は、実施例５と同一のGalNAc4S-6ST siRNAの物質としての安定性を評価する目的で行われた。最初に、1μgのGalNAc4S-6ST siRNAを200μlの滅菌済みリン酸緩衝液又は、0.1 %アテロコラーゲンに加えた後、4℃下で20分撹拌し、試験溶液を調製した。0.1 %アテロコラーゲンは、1％アテロコラーゲン（高研社製）に10倍量の滅菌済みリン酸緩衝液を加えて、4℃下で16時間撹拌することで調製した。次に、調製したGalNAc4S-6ST siRNA試験溶液に、40μgのRNA分解酵素（RNase A、SIGMA社製）を添加して、37℃下に静置させて反応させた。反応時間は5分、15分、30分、45分、60分で行った。反応終了後の試験溶液に500μlのRNA iso（タカラバイオ社製）を加え、氷上で5分静置させ、14000回転で15分間遠心した。得られた上清を採取し、500μlのisopropanolと1μlのグリコーゲン（インビトロジェン社製）を加えて15分静置させ、14000回転で15分間遠心した。上清を除いてペレットを保持し、1 mlの75％エタノールを加えて14000回転で15分間遠心した。この工程を2回繰り返した後、ペレットを乾燥させ、25μlの注射用水（大塚製薬社製）に溶解した。この液を10μl採取し、2μl Loading Dye (Invitrogen社製)を加え、3.5% UltraPure Agarose (インビトロジェン社製)ゲルを作製し、Mupid-2 plus(ADVANCE社製)により100 V、20分間 電気泳動を行った。泳動後、1×LoTE[組成：3 mM Tris-HCl (pH7.5) (インビトロジェン社製)、0.2 mM EDTA(pH7.5) (Sigma Aldrich Japan社製)]にて10000倍希釈Ethydium Bromide(インビトロジェン社製)染色液中で20分間振とうさせた後、Fluourchem (Innotech社製)にてゲルを撮影し解析を行った。
本実施例は、実施例５と同一のGalNAc4S-6ST siRNAの物質としての安定性を評価する目的で行われた。最初に、1μgのGalNAc4S-6ST siRNAを200μlの滅菌済みリン酸緩衝液又は、0.1 %アテロコラーゲンに加えた後、4℃下で20分撹拌し、試験溶液を調製した。0.1 %アテロコラーゲンは、1％アテロコラーゲン（高研社製）に10倍量の滅菌済みリン酸緩衝液を加えて、4℃下で16時間撹拌することで調製した。次に、調製したGalNAc4S-6ST siRNA試験溶液に、40μgのRNA分解酵素（RNase A、SIGMA社製）を添加して、37℃下に静置させて反応させた。反応時間は5分、15分、30分、45分、60分で行った。反応終了後の試験溶液に500μlのRNA iso（タカラバイオ社製）を加え、氷上で5分静置させ、14000回転で15分間遠心した。得られた上清を採取し、500μlのisopropanolと1μlのグリコーゲン（インビトロジェン社製）を加えて15分静置させ、14000回転で15分間遠心した。上清を除いてペレットを保持し、1 mlの75％エタノールを加えて14000回転で15分間遠心した。この工程を2回繰り返した後、ペレットを乾燥させ、25μlの注射用水（大塚製薬社製）に溶解した。この液を10μl採取し、2μl Loading Dye (Invitrogen社製)を加え、3.5% UltraPure Agarose (インビトロジェン社製)ゲルを作製し、Mupid-2 plus(ADVANCE社製)により100 V、20分間 電気泳動を行った。泳動後、1×LoTE[組成：3 mM Tris-HCl (pH7.5) (インビトロジェン社製)、0.2 mM EDTA(pH7.5) (Sigma Aldrich Japan社製)]にて10000倍希釈Ethydium Bromide(インビトロジェン社製)染色液中で20分間振とうさせた後、Fluourchem (Innotech社製)にてゲルを撮影し解析を行った。
その結果、図６に示すようにRNA分解酵素非存在下ではGalNAc4S-6ST siRNA は60分経過後も比較的安定であった。しかしながら、RNA分解酵素存在下では、15分経過時点で分解の進行が確認され、30分経過後にはバンドが消失した。これに対して、アテロコラーゲンで包合したGalNAc4S-6ST siRNA は、30分経過後もわずかではあるがバンドの存在が確認出来た。アテロコラーゲンで包合した短鎖RNA（siRNA）がRNA分解酵素抵抗性をもつことは以前より報告されており、本実施例においても同等の結果が得られた。また、アテロコラーゲンに限らず、同様の性質をもつ生体内物質との包合においても同等の結果が得られることが示唆された。
〔実施例７〕マウス大腸炎モデルにおける大腸粘膜下投与siRNAの遺伝子ノックダウン効率
C57BL/6Jマウス（♀、6週齢、日本クレア社製）にデキストラン硫酸ナトリウム（DSS; 和光社製）を3％含有する高塩素水を５日間自由飲水させることにより大腸炎モデルを作成した。本DSS誘導性大腸炎モデルは再現性に優れており、マウス潰瘍性大腸炎やクローン病という炎症性腸疾患の標準的実験モデルとして広く用いられている（Sasaki N, J Inflamm. 2005 2: 13、総説：Pucilowska JB et al. Am J Physiol Gastroenterol Liver Physiol. 279:G653-G659, 2000）。
C57BL/6Jマウス（♀、6週齢、日本クレア社製）にデキストラン硫酸ナトリウム（DSS; 和光社製）を3％含有する高塩素水を５日間自由飲水させることにより大腸炎モデルを作成した。本DSS誘導性大腸炎モデルは再現性に優れており、マウス潰瘍性大腸炎やクローン病という炎症性腸疾患の標準的実験モデルとして広く用いられている（Sasaki N, J Inflamm. 2005 2: 13、総説：Pucilowska JB et al. Am J Physiol Gastroenterol Liver Physiol. 279:G653-G659, 2000）。
3%DSS水を給水すると同時に、マウスには実施例５と同一のGalNAc4S-6ST siRNA（0.3μg/匹）を大腸粘膜下に注射した。対照群としては、スクランブルsiRNA（実施例4の「BLOCK-iT Fluorescent Oligo(invitrogen社製)」）を同様に注入した群と、DSS飲水のみの未処置群を設定した。3%DSS水を飲水させながら5日間体重と疾患の活動性インデックス（DAI）スコア（Kihara M, Gut. 2003 52: 713-9）を記録し、５日目にマウスを屠殺した。
摘出した臓器（大腸、腎臓）50 mg当たりに対し、RNA iso (タカラバイオ社製) 1 mLを加え、電動ホモジナイザー（DIGITAL HOMOGENIZER、AS ONE社製）にて粉砕させた後、chloroform 200μL(Sigma Aldrich Japan社製) を加え穏やかに混合後、約5分氷冷し、12,000 rpm、4℃、15分間 遠心分離機（Centrifuge 5417R、eppendorf社製）を用い遠心分離を行った。遠心分離後の上澄み液500μLを別のエッペンドルフチューブに移し、上澄み液と同等量のisopropannol 500μL(Sigma Aldrich Japan社製)を加え混合後、1μLのglycogen(Invitrogen社製)を加え、15分間氷冷した。氷冷15分後、12,000 rpm、4℃、15分間遠心し、その後、75 % Ethanol 1000μL(Sigma Aldrich Japan社製)で3回洗浄して得られたRNA沈殿物を30分間〜1時間、自然乾燥させた後、大塚蒸留水50μL(大塚製薬社製)に溶解させ、さらに大塚蒸留水(大塚製薬社製)にて100倍希釈し、UVプレート（コーニングコースター社製）上でプレートリーダー(POWER Wave XS、BIO-TEK社製)により抽出したサンプル中のRNA濃度を算出した。
次に、逆転写反応 (cDNA合成)を行うため以下の手技を行った。算出して得られたRNAサンプルを500 ng/20μLの濃度に調整し、68℃、3分間、BLOCK INCUBATOR(ASTEC製)にて加温し、10分間、氷冷した。氷冷後、予め調製していたRT Pre Mix 液（組成：25 mM MgCl218.64μL（Invitrogen社製）、5×Buffer 20μL（Invitrogen社製）、0.1 M DTT 6.6μL（Invitrogen社製）、10 mM dNTP mix 10μL（Invitrogen社製）、RNase Inhibitor 2μL（Invitrogen社製）、MMLV Reverse transcriptase 1.2μL（Invitrogen社製）、Random primer 2μL（Invitrogen社製）、滅菌蒸留水19.56μL（大塚蒸留水：大塚製薬社製）を80μL加えBLOCK INCUBATOR(ASTEC社製)にて42℃、1時間、加温反応させ、1時間後、BLOCK INCUBATOR(ASTEC社製)にて99℃、5分間、加熱した後、氷冷し求めるcDNA 100μLを作製し、合成して得られたcDNAを用いて、以下の組成で定量PCR反応を行った。定量PCRについては、SYBR premix kit（タカラバイオ社製）とReal-time PCR thermal cycler DICE（タカラバイオ社製）を用いて行った。PCR反応の条件は、95℃を10秒、95℃を5秒と60℃を30秒の40サイクルとし、最後に融解曲線分析を行った。定量PCRに用いたprimerの塩基配列については以下に示す。
[定量PCR Primer配列]
*mouse GalNac4S-6ST (タカラバイオ社製)
forward : 5’-GTGAGTTCTGCTGCGGTCCA-3’（配列番号：３）
reverse : 5’-AGTCCATGCTGATGCCCAGAG-3’ （配列番号：４）
*mouse GalNac4S-6ST (タカラバイオ社製)
forward : 5’-GTGAGTTCTGCTGCGGTCCA-3’（配列番号：３）
reverse : 5’-AGTCCATGCTGATGCCCAGAG-3’ （配列番号：４）
*mouse GAPDH (タカラバイオ社製)
Forward : 5’-CTGCCAAGTATGACATCA -3’ （配列番号：５）
Reverse : 5’-TACTCCTTGGAGGCCATGTAG -3’ （配列番号：６）
Forward : 5’-CTGCCAAGTATGACATCA -3’ （配列番号：５）
Reverse : 5’-TACTCCTTGGAGGCCATGTAG -3’ （配列番号：６）
結果を図７に示す。大腸においてはGalNAc4S-6STの発現が有意に上昇したが、注入したGalNAc4S-6ST siRNAは発現上昇を有意に抑制していた。一方、本モデルでは腎臓におけるGalNAc4S-6STの発現上昇を認めず、GalNAc4S-6ST siRNA注入後も変化は無かった。さらに、スクランブルsiRNAを注入した群ではGalNAc4S-6STの発現に有意な変化を認めなかった。したがって、大腸粘膜下に注入したGalNAc4S-6ST siRNAは選択的に大腸に定着し、かつ機能的にも大腸でのGalNAc4S-6STの発現上昇を有意に抑制する事が立証できた。本結果は、注入した生理活性物質の投与局所への定着とその作用が極めて効果的に発揮できる事を示し、かつ、他の正常臓器への副作用が認められない事を示している。
〔実施例８〕マウス大腸炎モデルにおける大腸粘膜下投与siRNAの遺伝子ノックダウンに伴う臨床的病像の修飾
siRNAの定着、作用が示されたので、次に実際の治療効果を検討した。実施例７と同様の方法で、大腸炎の活動の程度（DAI）を解析した。
DAIの評価基準は以下の表１の通りである。
siRNAの定着、作用が示されたので、次に実際の治療効果を検討した。実施例７と同様の方法で、大腸炎の活動の程度（DAI）を解析した。
DAIの評価基準は以下の表１の通りである。
DSS水給水初日（day 0）を1とし、個々のマウスのstool consistency（便の硬さ）、fecal blood（便潜血）を記録した結果を図８に示す。対照群に比較してGalNAc4S-6ST siRNA投与群の方が低スコアを示した。この結果より、大腸粘膜下に注入したGalNAc4S-6ST siRNAは、大腸選択的にGalNAc4S-6ST遺伝子の発現を抑制し、炎症の活動性を抑制する効果をもたらすことが示された。
〔実施例９〕マウス大腸炎モデルにおける大腸粘膜下投与siRNAの遺伝子ノックダウンに伴う大腸短縮の改善効果
さらに、５日目にマウス屠殺後に大腸長を測定したところ、GalNAc4S-6ST siRNA投与群で有意（p＜0.05、t検定）に大腸の短縮が抑制されていた（図９）。大腸長は、腸管線維化を反映する決定的な指標である。したがって大腸粘膜下に注入したGalNAc4S-6ST siRNAは、大腸選択的にGalNAc4S-6ST遺伝子の発現を抑制し、臨床的にも腸管線維性変化を強く抑制することが明らかになった。
さらに、５日目にマウス屠殺後に大腸長を測定したところ、GalNAc4S-6ST siRNA投与群で有意（p＜0.05、t検定）に大腸の短縮が抑制されていた（図９）。大腸長は、腸管線維化を反映する決定的な指標である。したがって大腸粘膜下に注入したGalNAc4S-6ST siRNAは、大腸選択的にGalNAc4S-6ST遺伝子の発現を抑制し、臨床的にも腸管線維性変化を強く抑制することが明らかになった。
〔実施例１０〕マウス大腸炎モデルにおける大腸粘膜下投与siRNAの遺伝子ノックダウンに伴う組織所見改善効果
さらに、採取した大腸組織切片を作成し、ヘマトキシリン・エオジン染色で組織像を解析した（図１０）。GalNAc4S-6ST siRNA投与群は、上皮の破壊、粘膜固有層及び粘膜下層の炎症細胞の浸潤、筋層の肥厚が顕著に抑制されていた。したがって大腸粘膜下に注入したGalNAc4S-6ST siRNAは、大腸選択的にGalNAc4S-6ST遺伝子の発現を抑制し、組織学的にも治療効果を認める事が明らかになった。
さらに、採取した大腸組織切片を作成し、ヘマトキシリン・エオジン染色で組織像を解析した（図１０）。GalNAc4S-6ST siRNA投与群は、上皮の破壊、粘膜固有層及び粘膜下層の炎症細胞の浸潤、筋層の肥厚が顕著に抑制されていた。したがって大腸粘膜下に注入したGalNAc4S-6ST siRNAは、大腸選択的にGalNAc4S-6ST遺伝子の発現を抑制し、組織学的にも治療効果を認める事が明らかになった。
Claims (1)
- 担体を使用しないsiRNAを成分とする大腸粘膜下組織投与用薬剤であって、投与局所において該siRNAが定着し効果を発揮することを特徴とする薬剤。
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