WO2007049361A1

WO2007049361A1 - 肝線維化抑制剤

Info

Publication number: WO2007049361A1
Application number: PCT/JP2005/020154
Authority: WO
Inventors: Hiroyuki Yoneyama; Tomoyuki Nagahata; Kyoko Wakamatsu
Original assignee: Stelic Corp.
Priority date: 2005-10-27
Filing date: 2005-10-27
Publication date: 2007-05-03
Also published as: EP1941906A4; WO2007049424A1; TW200803897A; US20090060892A1; EP1941906A1; JPWO2007049424A1

Abstract

　本発明は、コンドロイチナーゼABCを有効成分として含む、肝硬変などの肝線維化疾患の治療又は予防に好適な、肝線維化抑制剤に関する。本発明はまた、コンドロイチナーゼABCを被験体に投与することによる肝線維化抑制方法、及びそれを利用した肝硬変等の肝線維化疾患の治療又は予防方法にも関する。

Description

肝線維化抑制剤技術分野

本発明は、肝線維化抑制剤、肝線維化の抑制方法、及び該方法に基づく肝線維化疾患の治療又は予防方法に関する。明

背景技術

慢性線維化疾患は、肝臓（肝硬変症）田、腎臓（腎硬化症）、糖尿病性網膜症（網膜）など、様々な臓器で発症しうる慢性炎症状態の終末像の総称であり、組織の過剰な線維化を伴う。慢性線維化疾患は、進行性の臓器機能不全を経て死あるいは失明に至ることが多い重篤な疾患群であるが、未だに決定的な治療法が存在しない。現時点では、肝硬変症に対しては肝移植、腎硬化症に対しては腎移植ならびに人工透析による治療が行われているものの、それらの治療法では患者の Q0 L (qual ity of l ife) が著しく阻害されるばかり力、移植した臓器が再度線維化に陥るケースも多い。最近では、 TGF- /3阻害剤やアンギオテンシン阻害剤などが線維化疾患に対する新規の治療剤として期待されているが、その有効性は確立されていない。このため、患者の Q0Lを向上させ、，線維化の進行を有効に阻止又は遅延させることができる新しい薬剤の開発が切に望まれている。

線維化疾患については、現在までその原因や病態形成機序が明らかにされていない。線維化疾患は、病理組織学的にはコラーゲンなどの細胞外基質（ECM : ext racel lular matrix) の過剰蓄積を特徴とする。近年は線維芽細胞の過剰活性化がその過剰蓄積の大きな原因とみなされており、そのため線維芽細胞は治療標的としても注目されつつある。

現在、線維化疾患の候補治療薬として、慢性炎症を抑制する副腎皮質ステロイド、コルヒチン、 IL- 10など；線維芽細胞を活性化する TGF- i3阻害剤、 HGF (TGF- の作用を抑制）、エンドセリン阻害剤、アンギオテンシン阻害剤など；コラーゲンを除去する隱 (matrix metal loproteinase；マ卜リックス · メタ口プロテイナーゼ）などが期待されているが、いずれも治療法の確立には至っていない（非特許文献 1 [最新総説]、並びに非特許文献 2及び 3 ) 。

プロテオダリカン（PG) は、コア蛋白質とよばれる蛋白質に、 1本以上のダリコサミノダリカン（GAG) 鎖が共有結合している構造をもつ分子である。 GAG鎖の特異的な糖鎖構造が PGの多彩な機能を担うと考えられている。 PGは、 GAG鎖の種類に基づいて、コンドロイチン硫酸プロテオダリカン（CSPG) 、デルマタン硫酸プロテオダリカン（DSPG) 、へパラン硫酸プロテオダリカン（HSPG) 、ケラタン硫酸プロテオダリカン（KSPG) と 4つに大別される（非特許文献 4及び 5 [総説] ) 。とくに HSPGは多彩なサイト力イン、ケモカインと結合し、その機能を大きく修飾することから良く研究されてきた。

—方、コンドロイチン硫酸プロテオダリカン（CSPG) については、胎生期には必須の分子であり、各臓器に豊富に存在するが出生 ·成長 ·老化に伴い徐々に減少することが知られている。しかし驚くべきことに、その特性の多彩さからか、 CSPGの生体内機能は未だ明らかにされていない。一方、 CSPGについて、肝硬変や肺線維症などの病変臓器で増加しているとの報告（非特許文献 6及び 7 ) がある。しかし、それら疾患における CSPG増加の意義は全く明らかになっていない。近年では、 CSPGを遺伝的に欠損させたマウスが胎生致死や器官形成不全に陥ることが判明したことから、 CSPGは生体に必須の分子であるとの認識が強まっている。コンドロイチナーゼは、コンドロイチン硫酸（コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）を分解する活性を有する細菌性の酵素として知られている。コンドロイチナーゼを用いた治療薬としては、コンドロイチナーゼ ABCを用いる椎間板ヘルニァの治療薬（特許文献 1 ) 、コンドロイチナーゼ AC又はコンドロイチナーゼ B 創傷治癒促進薬（特許文献 2 ) 、コンドロイチナーゼ AC又はコンドロイチナーゼ Bを用いた強皮症、乾癬、ケロイド及び肺線維症の治療薬（特許文献 3 ) などが知られている。

特許文献 1 ：米国特許第 6 , 0 0 1， 6 3 0号明細書

特許文献 2 ：米国特許第 5， 9 9 7 , 8 6 3号明細書

特許文献 3 ：国際公開第 2 0 0 1 / 0 3 9 7 9 5号パンフレツト

非特許文献 1 ： Batal ler R & Brenner DA, J. Cl in. Invest. (2005) 115 -218

非特許文献 2 Iredale JP, BMJ (2004) 327:143—147

非特許文献 3 Bissell DM, Exp. Mol. Med. (2001) 33:179—190 非特許文献 4 Lin X， Development (2004) 131:6009-6021

非特許文献 5 Hacker U et al. ature Rev. Cell Biol. (2005) 6:530—

541

非特許文献 6 ： Kovalski I et al. , Orv Hetil. (1993) 134： p. 2019-20

26

非特許文献 7 Westergren-Thorsson G et al. , J し lin Invest. (1993) 632-637 発明の開示

本発明は、肝線維化疾患の治療又は予防に有用な、肝組織における線維化を抑制できる薬剤を提供することを 1つの目的とする。

本発明者らは、そのような薬剤を開発するため鋭意研究を重ねるうち、これまで線維化疾患の病因とはされていなかったコンドロイチン硫酸プ口テオダリカン (CSPG) の過剰な蓄積が、組織の線維化を促進するのではないかと考えた。本発明者らは、この考えに基づいて研究を進めた結果、コンドロイチナーゼ ABCが線維化肝に蓄積した CSPGを効率よく分解できること、そしてコンドロイチナーゼ AB Cを in vivo投与することにより肝組織の線維化を顕著に抑制できることを見出し、本発明を完成させた。

本発明は以下を包含する。

[1] コンドロイチナーゼ ABCを有効成分として含む、肝線維化抑制剤。

[2] 慢性肝疾患の治療用又は予防用の、上記 [1]に記載の肝線維化抑制剤。

[3] 慢性肝疾患が肝硬変である、上記 [2]に記載の肝線維化抑制剤。

[4] コンドロイチナーゼ ABCがプロテウス .ブルガリス（Proteus vulgaris) 由来である、上記 [1]〜 [3]のいずれかに記載の肝線維化抑制剤。図面の簡単な説明

図 1は、四塩化炭素によって誘導された肝硬変モデルマウスにおける CSPG、 C4 SPG、 C6SPG、及び HSPGの検出結果（茶色シグナル）を示す写真である。倍率 100 倍。括弧内は、検出に用いた抗体クローン名を示す。

図 2は、四塩化炭素によって誘導された硬変肝における、 PBS (コンドロイチナーゼ（一））、 Chase AC, Chase B、又は Chase ABCでの処理後の CSPGの検出結果（茶色シグナル）を示す写真である。倍率 200倍。

図 3は、四塩化炭素によって誘導された肝硬変モデルマウスにおける Chase AB C投与後の III型コラーゲン（赤色シグナル）の減少効果を示す写真である。倍率 100倍。

図 4は、四塩化炭素によって誘導された肝硬変モデルマウスにおける Chase AB C、 Chase A 又は Chase B投与後の線維化度数を示すグラフである。 *p < 0. 05 、 * *pく 0. 01 (t-検定）。

図 5は、四塩化炭素によって誘導された肝硬変モデルマウスにおける Chase AB C投与後の I型コラーゲン（赤色シグナル）の減少効果を示す写真である。倍率 10 0倍。

図 6は、四塩化炭素によって誘導された肝硬変モデルマウスにおける Chase AB C, Chase AC、又は Chase B投与後の III型コラーゲン陽性面積率（％) を示すグラフである。 *p < 0. 05、 * *pく 0. 01 (t-検定）。

図 7は、四塩化炭素によって誘導された肝硬変モデルマウスにおける Chase AB C投与後の CSPG、 C4SPG、 C6SPGの検出結果（茶色シグナル）を示す写真である。倍率 200倍。

図 8は、四塩化炭素によつて誘導された肝硬変モデルマゥスにおける線維芽細胞の分布（茶色シグナル）と Chase ABC投与後の分布の変化を示す写真である。倍率 100倍（上段）、 200倍（下段）。

図 9は、四塩化炭素によって誘導された肝硬変モデルマウスにおけるマクロファージの分布（茶色シグナル）と Chase ABC投与後のその分布の変化を示す写真である。倍率 200倍。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明をさらに詳細に説明する。

本発明は、コンドロイチナーゼ ABCを有効成分として含む肝線維化抑制剤に関する。

コンドロイチナーゼ ABCは、酵素番号 EC 4. 2. 2. 4に分類されるリアーゼ（コンドロイチン ABCリアーゼ）である。コンドロイチナーゼ ABCは、 1， 4- ]3 - D-へキソサミニド結合、及び 1， 3_ ]3 - D -ダルクロノシル結合若しくは 1, 3- α -L -ィズロノシル結合を含有する多糖を、 4-デォキシ- /3 -D -ダルク- 4-ェヌ口ノシル基を含有する二糖へと分解除去する活性を有する。コンドロイチナーゼ ABCは、コンドロイチン硫酸 A (コンドロイチン- 4-硫酸）、コンドロイチン硫酸 B (デルマタン硫酸 ) 、及びコンドロイチン硫酸 C (コンドロイチン- 6-硫酸）、並びにヒアルロン酸に作用してそれらを分解する。

本発明で用いるコンドロイチナーゼ ABCとしては、限定するものではないが、伊 Jえば、プロテウス 'ブノレガリス（Proteus vulgari s) などのプロテウス（Prot eus) 属糸田菌、及びノくクテロイデス ·ステノレリス (Bacteroides stercori s) などのバクテロイデス（Bacteroides) 属細菌由来のものが好ましい。本発明で用いるコンドロイチナーゼ ABCは、プロテウス ·ブノレガリス（Proteus vulgari s) 由来であることがより好ましい。本発明のコンドロイチナーゼ ABCは、プロテゥス ·ブルガリス（Proteus vulgari s) の抽出物から硫安沈殿及び DEAE-セルロースクロマトグラフィーによって精製されたものであってよレ、（Yamagata, T. et al. , J. Biol. Chem. , (1968) 243, p. 1523-1535) 。本発明のプロテウス 'ブノレガリス（Proteus vulgari s) 由来のコンドロイチナーゼ ABCの例としては、特開平 06- 098769に開示されている配列番号 9で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質や、 DDBJ/EMBL/GenBank国際塩基配列データベース（例えば、 DNA Data Ba nk of Japan (DDBJ)のウェブサイト http： //www. ddb j. nig. ac. jp/Welcome— j. htm 1からアクセスできる）にァクセッション番号 E07183で登録されている塩基配列にコードされたタンパク質が挙げられる。本発明のコンドロイチナーゼ ABCは、コンドロイチン硫酸 A (コンドロイチン- 4-硫酸）、コンドロイチン硫酸 B (デルマタン硫酸）、及びコンドロイチン硫酸 C (コンドロイチン- 6-硫酸）並びにヒアルロン酸を分解する活性を少なくとも有することが好ましい。

本発明のコンドロイチナーゼ ABCとしては、市販品、例えばコンドロイチナーゼ ABC (Proteus vulgari s) (生化学工業株式会社、東京、日本）、又はコンドロィチナ— feABC (Proteus vulgari s) (Si gma- Aldrich社、 Saint Loui s, Mi ssouri , USA) を用いることができる。さらに本発明のコンドロイチナーゼ ABCは、当業者であれば、コンドロイチナーゼ ABCをコードする DNA (例えば、ァクセッション番号 E07183で登録されている塩基配列を有するもの）から組換え法によりタンパク質を発現させることによって、容易に製造することができる。組換え法などの分子生物学の' I貫用手法については、例えば、 Molecular Cloning : A Laboratory Manual/ Volume 3. Joseph Sambrook and David W Russel l. 第 3 flR New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001等に詳述されてレヽる。

本発明の肝線維化抑制剤は、肝組織の線維化（肝線維化）を効果的に抑制することができる。本発明において「線維化を抑制する」とは、線維化が生じた組織における線維化病変を減少若しくは消失させるか、又はそれ以上の線維化の進行を遅延若しくは阻止する（線維化病変の増大を抑制する）ことを意味する。

肝組織における線維化の程度は、当業者に公知の様々な方法によって評価することができる。最も基本的な方法としては、肝生検における線維化所見、例えば肝生検サンプルの特殊染色（ァニリンブルー、トリクローム、又は銀染色など）によって強調された線維化組織の像を、組織学的に評価すればよい。線維化の具体的な評価は、例えば、 Dai K， et al. World J Gactroenterol. 31 : 4822-4826, 2005、 Hi l lebrandt S, et al. Nature Genetics 37 : 835 - 843， 2005に従って、免疫組織学的染色に基づき各試料の肝線維化レベルを線維化度数で表すことによつて行うことができる。またヒアルロン酸、 I型、 I I I型、及び IV型等のコラーゲン、線維芽細胞、マクロファージ等の肝線維化マ一カーを用いて、より簡便に肝組織における肝線維化の程度を評価してもよい。簡便だが肝線維化の程度を鋭敏に反映する血小板数の計測に基づく検査も都合よく利用することができる。腹部超音波検査などの肝画像診断によっても肝線維化の程度を大まかに予測することが可能である。さらに、近年ェコセンス社（EcoSence、フランス）によって開発されたトランジエンド ·エラストグラフィー技術に基づく非侵襲的肝線維化測定法のための測定機器（Fibro S_Can502など）を用いて、肝線維化の程度を評価することもできる。本発明の肝線維化抑制剤による肝線維化の抑制レベルは、これらの方法によって得られる肝線維化の程度の評価に基づいて決定すればよい。本発明の肝線維化抑制剤による肝線維化抑制効果は、特に、肝組織における II I型コラーゲンの伸長抑制、 I型コラーゲンの沈着抑制、線維芽細胞の集積抑制、及びマクロファージの集積抑制のうち少なくとも 1つを伴うことが好ましく、これら全てを伴うことがより好ましい。本発明の肝線維化抑制剤による肝線維化抑制レベルは、これらの抑制効果のうちの 1つ以上を指標として決定してもよい。本発明は、本発明の肝線維化抑制剤の有効成分であるコンドロイチナーゼ ABC 力後述の実施例で実証しているように、非常に高い肝線維化抑制効果を奏するという全く新しい知見に基づくものである。このコンドロイチナーゼ ABCの肝線維化抑制効果は、他のコンドロイチナーゼと比較しても顕著に優れている。このコンドロイチナーゼ ABCの優れた効果は、線維化肝組織にコンドロイチナーゼ AC ゃコンドロイチナーゼ B等では切断されにくい種類又は量のコンドロイチン硫酸が蓄積しており、それがコンドロイチナーゼ ABCによって初めてうまく切断されることに起因すると考えることもできる。近年、硫酸化のグレードが異なるものや硫酸基の付加位置が異なるものなど、様々な種類のコンドロイチン硫酸の存在が報告されてきていることからも、この仮説はかなり説得力があるものと言える。但し本発明は、このような仮説によって何ら限定されるものではない。

本発明では、本発明の肝線維化抑制剤を肝組織試料に添加して反応させることにより、その肝組織における線維化の程度を低減させることができる。

また本発明では、本発明の肝線維化抑制剤を被験体に投与することにより、被験体の肝臓の組織の線維化を効果的に抑制することができる。肝線維化抑制剤の投与経路としては、限定されるものではないが、非経口経路が好ましい。非経口経路の好適な例としては、静脈内、動脈内、腹腔内、肝臓内、直腸内、及ぴ皮下経路が挙げられる。本発明の肝線維化抑制剤は、全身投与してもよいし、局所投与（例えば肝臓の繊維化組織に直接投与）してもよい。

本発明は、本発明の肝線維化抑制剤を被験体に投与することによる、被験体の肝臓における線維化を抑制する方法にも関する。さらに本発明の肝線維化抑制剤は、肝組織の線維化を効果的に抑制できることから、肝線維化疾患（肝組織の過剰な線維化を伴う疾患）の治療及び予防のために有利に使用することができる。本発明においてより好適な肝線維化疾患の例は、限定するものではないが、慢性肝疾患である。慢性肝疾患は、一般的に肝線維化を伴う。本発明に係る慢性肝疾患の具体例としては、慢性肝炎（慢性 B型肝炎、慢性 C型肝炎等）、肝線維症、肝硬変、肝不全、肝癌などが挙げられる。本発明の肝線維化抑制剤は、特に、肝硬変の治療及び予防のために有用である。本発明において「肝硬変」とは、肝臓に広範な線維化が生じており、かつ正常な肝小葉構造が失われて異常な構造（偽小葉 Z再生結節）に改築されている肝臓の状態を言う。肝硬変は、その病因や偽小葉の特性などによって多くの種類に分類されている。またこのような状態の肝臓を、硬変肝と呼ぶ。これに対し、「肝線維症」は、異常な線維化を呈しているが肝小葉の改築は生じていない状態であり、一般的には肝硬変の前段階と言える。本発明における肝硬変の具体例としては、ゥィルス性肝硬変、寄生虫性肝硬変、中毒性肝硬変、栄養障害性肝硬変、アルコール性肝硬変、うつ血性肝硬変、肝硬化症、シャルコー肝硬変、トッド肝硬変、原発性胆汁性肝硬変、続発性胆汁性肝硬変、単葉性肝硬変、慢性非化膿性破壊性胆管炎から移行した肝硬変、閉塞性肝硬変、胆細管性肝硬変、胆汁性肝硬変、萎縮性肝硬変、壊死後性肝硬変、肝炎後肝硬変、結節性肝硬変、混合型肝硬変、小結節性肝硬変、代償性肝硬変、非代償性肝硬変、大結節性肝硬変、中隔性肝硬変、特発性肝硬変、門脈周囲性肝硬変、門脈性肝硬変等が挙げられるが、これらには限定されない。

本発明の肝線維化抑制剤を投与すべき被験体としては、ヒト、家畜、愛玩動物、実験動物等を含む哺乳動物が好ましい。特に、肝線維化疾患、例えば肝硬変や肝線維症などに罹患している哺乳動物（患者）力本発明に係る被験体として好ましい。別の実施形態では、将来的に肝硬変に移行しやすい肝線維化疾患（例えば慢性非化膿性破壊性胆管炎など）に罹患している哺乳動物（患者）も被験体として好ましい。本発明では、被験体に本発明の肝線維化抑制剤を投与することにより、肝臓の線維化の程度を低減するか又はその線維化の進行を遅延若しくは阻止して、その結果、線維化による肝臓障害を低減し、肝機能がより高レベルに維持又は改善されるようにすることにより、肝線維化疾患を治療又は予防することができる。

本発明の肝線維化抑制剤の投与量は、当業者が適宜定めることができるが、一般的には、コンドロイチナーゼ ABCの量で体重 l kg当たり 10 g〜lmgである。本発明は、このようにして本発明の肝線維化抑制剤を被験体（例えば患者）に投与することによる、慢性肝疾患を始めとする肝線維化疾患（特に、肝硬変等）の治療又は予防方法にも関する。

本発明の肝線維化抑制剤は、コンドロイチナーゼ ABCに加えて、製薬上許容される（薬学的に不活性な）担体、賦形剤、及びノ又は希釈剤を任意に含む医薬組成物であってもよい。そのような担体、賦形剤、及び Z又は希釈剤の例としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝バッファー、ポリビニルアルコール、ポリビュルピロリドン、カルボキシビュルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、ぺクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコーノレ、ポリエチレングリコーノレ、ワセリン、ノ《ラフィン、ステアリノレアルコーノレ、ステアリン酸、ヒト血清ァノレブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクト一スなどが挙げられるがこれらに限定されない。本発明の医薬組成物は、保存剤等の添加剤をさらに含んでもよい。本発明の医薬組成物は、さらに他の薬理成分を含有していてもよい。

本発明の医薬組成物は、経口製剤又は非経口製剤として提供してもよいが、非経口製剤として提供することがより好ましい。非経口製剤としては、液剤、懸濁剤等の液体製剤が好ましく、特に注射剤が好ましい。

実施例 ·

以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例 1 ：マウス肝硬変モデルにおけるコンドロイチン硫酸プロテオダリカン（ CSPG) 発現の増加

この実施例では、慢性線維化疾患モデルマウスの典型例として四塩化炭素（CC 1₄) で誘導されるマウス肝線維症モデルを用いて、マウス肝硬変モデルを作製し、プロテオダリカンの蓄積状態を免疫組織学的染色法によって調べた。このマウス肝線維症モデルは再現性に優れており、肝硬変モデルの実験系としても広く使用されている（Sakaida I， et al. Hepatology 40 : 1304—1311， 2004) 。

まず、 C57BL6/Jマウス（雌、 5〜6週齢、日本クレア社製）に、四塩化炭素（25 Ai L/lOOg体重； Sigma- Aldrich社製）を、週 2回ずつ 4週間にわたり（8回）、腹腔内に注射し、肝線維症を惹起した。さらに四塩化炭素を週 2回ずつ 2週間にわたつて追加投与し（総計 12回）、肝硬変を誘導した。肝硬変が誘導されたマウスを屠殺し、その肝臓を採取した（硬変肝）。一方、対照実験では、四塩化炭素の投与を行っていない同週齢の C57BL6/Jマウス（雌、日本クレア社製）から肝臓を採取した（正常肝）。

採取した肝臓の第 2葉の一部を凍結用包埋剤 OCTコンパウンド（Mi les社製）に包埋し、液体窒素で凍結ブロックを作製した。その凍結ブロックからクライオスタツト（Microm社製）を用いて厚さ 6 mの切片を作製した。

得られた切片をアセトン（和光社製）で 10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、さらに一次抗体として抗コンドロイチン硫酸プロテオダリカン（CSPG) 抗体（クローン CS56、マウスモノクローナル抗体、 10 /i g/mL；生化学工業社製）、抗コンドロイチン- 4-硫酸プロテオグリカン（C4SPG) 抗体（クローン LY111、マウスモノクローナル抗体、 10 ;U g/mL；生化学工業社製）、抗コンドロイチン- 6 -硫酸プロテオグリカン（C6SPG) 抗体（クローン MC21C、マウスモノクロ一ナノレ抗体、 lO /^ g/mL；生化学工業社製）、又は抗へパラン硫酸プロテオダリカン（HSPG) / パールカン（Perlecan) 抗体（ラットモノクローナル抗体、 10 μ _g/mL；大日本製薬社製）を添加し、室温で 1時間反応させた。続いて、ヒストファインマウススティンキット（ニチレイ社製；マウスモノクローナル抗体に対して使用）、又はペルォキシダーゼ標識抗ラット IgG (バイオソース社製； 1 ： 200希釈；ラットモノクローナル抗体に対して使用）を用いて二次抗体反応を行った後、 DAB基質（ニチレイ社製）を添加した。光学顕微鏡（ライカ社製）下で試料を観察し、茶色のシグナルで可視化された抗体結合を確認した。

得られた肝組織の免疫染色像の例を図 1に示す。図 1中、左側の列が正常肝、右側の列が硬変肝を示す。正常肝、すなわち未処置の同週齢マウスの肝臓では、 CSPG (最上段）、 C4SPG (二段目）について肝類洞内にわずかに陽性シグナルが認められたが、 C6SPG (三段目）については全く検出されなかった。一方、硬変肝、すなわち四塩化炭素により肝硬変様の線維化が誘導された肝臓においては、 CSPG (最上段）、 C4SPG (二段目）、 C6SPG (三段目）のいずれについても、類洞中心に、正常肝と比較してシグナル強度が著しく増強された陽性シグナルが広範に認められた。へパラン硫酸プロテオダリカン（HSPG) に関しては、正常肝において類洞中心に強い陽性シグナルが検出されたが、硬変肝でもシグナルの強度や分布に大きな差異は認められなかった。従って、本肝硬変モデルでは、肝臓内の CSPG量の増加が、 HSPGと比べて劇的であることが判明した。実施例 2 ：マウス硬変肝に蓄積したコンドロイチン硫酸に対する各種コンドロイチナーゼの切断能

本実施例では、各タイプのコンドロイチナーゼの、硬変肝の組織切片中のコンドロイチン硫酸 (CSPG) に対する切断能を検討した。以下のように、硬変肝の組織切片をコンドロイチナーゼで処理し、その酵素反応終了後、組織切片に残存する CSPG、すなわちコンドロイチナーゼ処理によって切断されなかった分の CSPGを、免疫染色法で検出した。

まず、 C57BL6/Jマウス（雌、 5〜6週齢、日本クレア社製）に、四塩化炭素（25 ^ L/lOOg体重； Sigma-Aldrich社製）を週 2回ずつ 4週間にわたり（8回）、腹腔内に注射し、肝線維症を惹起した。さらに四塩化炭素を週 2回ずつ 2週間にわたって追加投与し（総計 12回）、肝硬変まで誘導した。肝硬変が誘導されたマウスを屠殺し、その肝臓を採取した（硬変肝）。

得られた切片をアセトン（和光社製）で 10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、続いて、 Tris- HCL緩衝液（20mM、 pH 8. 0) 中、 37°Cにて 15分インキュベートした後、コンドロイチナーゼ ABC溶液（生化学工業社製； 5U/mL) 、コンドロイチナーゼ AC溶液（生化学工業社製； 5U/mL) 、コンドロイチナーゼ B溶液（生化学工業社製； 5U/mL) 、又は緩衝液のみ（コンドロイチナーゼ（一））を 1切片あたり 100 Ai L添加して切片を覆い、さらに 37°Cで 1時間ィンキュベートした。

酵素反応終了後、抗 CSPG抗体（クローン CS56、マウスモノクローナル抗体、 10 μ g/mL；生化学工業社製）を添加し、室温で 1時間反応させた後、ヒストフアイン .マウス染色キット（ニチレイ社製）を用いて反応させてから、 DAB基質（二チレィ社製）を添加した。光学顕微鏡（ライカ社製）下で試料を観察し、茶色のシグナルで可視化された抗体結合を確認した。

結果を図 2に示した（倍率 200倍）。緩衝液のみで処理した切片（すなわち、酵素処理を行っていない切片）では、 CSPG陽性シグナル（茶色）力図 1の硬変肝と同程度の著しく高い強度で広範囲に検出された（図 2 ；最左；コンドロイチナーゼ（-：)）。一方、コンドロイチナーゼ ACで処理した切片では、コンドロイチナーゼ（-)の切片と比較して CSPG陽性シグナルが減弱しており、陽性の面積も減少していた（図 2 ；左から 2番目；コンドロイチナーゼ AC) 。このことは、コンドロイチナーゼ ACが硬変肝組織中に蓄積した CSPGを確かに切断できることを示していた。しかしコンドロイチナーゼ ACで処理したこの切片には、完全には切断されずに残存している CSPGが尚も検出された。またコンドロイチナーゼ Bで処理した切片では、コンドロイチナーゼ ACで処理した切片と比較して、 CSPG陽性シグナルがさらに減弱しており、陽性の面積もさらに減少していた（図 2 ；右から 2番目；コンドロイチナーゼ B) 。このことから、コンドロイチナ一ゼ Bは硬変肝組織中に蓄積した CSPGをより多く切断できることが示された。しかし、コンドロイチナーゼ Bで処理した切片においても、偽小葉構築に沿つて残存する CSPGが検出された。このように、コンドロイチナーゼ ACや Bによる処理では、高度に線維化した硬変肝に沈着した CSPGを完全には切断しきれなかった。

これらの結果に対し、コンドロイチナーゼ ABCで処理した切片では、 CSPG陽性シグナル（茶色）はほとんど検出されず、コンドロイチナーゼ（-）の切片と比較して CSPGの消失がはっきりと示された（図 2 ；最右；コンドロイチナーゼ ABC) 。すなわち、コンドロイチナーゼ ABCは、肝硬変のように高度に線維化した病巣に沈着した CSPGを非常に効率良く切断することができることが示された。実施例 3 ：マウス肝硬変モデルにおけるコンドロイチナーゼ ABC (Chase ABC) の肝線維化抑制効果

C57BL6/Jマウス（雌、 5〜6週齢、日本クレア社製）に、四塩化炭素（25 /i L/lO 0g体重； Sigma- Aldrich社製）を、週 2回ずつ 4週間（8回）、腹腔内に注射し、肝線維症を惹起した。さらに四塩化炭素を週 2回ずつ 2週間にわたって追加投与した (総計 12回) 。

追加投与に先立ち、マウスには予め、コンドロイチナーゼ ABC (Chase ABC) ( 20U/ml； Sigma- Aldrich社製）、コンドロイチナーゼ AC (Chase AC) (20U/ml ； S igma- Aldrich社製）、コンドロイチナーゼ B (Chase B) (20U/ml； Sigma- Aldric h社製）、又は PBSのみを 150 1ずつ注入したアルゼット浸透圧ポンプ（室町機器社製）を、腹腔内に手術的に埋め込んだ。この処置を行ったマウス群を、各々 Ch ase ABC酵素群、 Chase AC酵素群、 Chase B酵素群、及び対照群と名付けた。この処置により、いずれの群も、 2週間の四塩化炭素の追加投与を受ける間、体内埋め込みポンプから常に一定量の液体が注入されることになつた。

四塩化炭素の追加投与終了後、各群の個々のマウスを屠殺し、その肝臓を採取した。採取した肝臓から、実施例 1と同様にして肝臓の凍結切片の試料を作製し、免疫組織学的解析を行った。

この解析では、一次抗体としてゥサギ抗マウス III型コラーゲン抗体（1 : 250 希釈；サンタクルーズ社製）を試料に添加し、室温で 1時間反応させた。続いて、二次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識抗ゥサギ IgG (1： 200希釈； Jac kson ImmunoResearch社製）を添加し、室温で 30分間更に反応させた後、アル力リフォスファターゼ発色基質（ベクター · レッド； Vector Laboratory社製）を添加した。光学顕微鏡（ライカ社製）下で試料を観察し、赤色のシグナルで可視化された抗体結合を確認した。

得られた肝組織の免疫染色像の例を図 3に示す。対照群では、ゥサギ抗マウス III型コラーゲン抗体によって検出された III型コラーゲン · ファイバーが、一般類洞のみならず、中心静脈から門脈まで連なって伸長し、一部には偽小葉を形成していることが示された（図 3の左のパネル）。これは、肝硬変に典型的な像であった。これに対し Chase ABC酵素群では、 III型コラーゲンの伸長はごく軽度であった（図 3の右のパネル）。

上記で行った免疫組織学的染色に基づき、各試料の肝線維化の程度を既報（Da i K, et al. World J Gactroenterol. 31 : 4822-4826, 2005、 Hi l lebrandt S, et al. Nature Genet ics 37 : 835-843， 2005) に従って、線維化度数で評価した。線維化度数の評価基準は以下の通りである。 0度：正常、 1度：中心静脈からの少量のコラーゲン伸長が認められる、 2度：中心静脈からの明白なコラーゲン伸長が認められるが、肝臓全体を取り囲まない程度である、 3度：中心静脈からの明白なコラーゲン伸長が認められ、肝臓全体を取り囲む程度である、 4度：肝臓全体の瀰漫性コラーゲン伸長が認められ、偽小葉を形成している。

結果を図 4にグラフで示す。各バーは、各群における線維化度数の平均値土標準偏差を示している。図 4にも示されるように、対照群は 5. 3 ± 0. 4 (n=6) であるのに対し、 Chase ABC酵素群は 2. 0 ± 0. 6 (n=6) 、 Chase AC酵素群は 2. 9 ± 0. 7 ( n=6) 、 Chase B酵素群は 2. 6 ± 0. 5 (n-6) であった。対照群と比較すると、 Chase ABC酵素群（p=0. 00018、 t検定）及び Chase B酵素群（ρ=0· 0029、 t検定）で統計学的に有意に線維化が軽減されていた。とりわけ Chase ABC酵素群は、 Chase AC 酵素群（p=0. 0019、 t検定）や Chase B酵素群（p=0. 018、 t検定）に比較しても統計学的に有意に線維化抑制効果が高かった。一方、 Chase AC酵素群と Chase B 酵素群の比較では、統計学的な有意差は認めなかった（p=0. 15、 t検定）。なお四塩化炭素を投与しない正常マウスから採取した正常肝でも同様の免疫組織学的解析を行ったが、線維化度数は 0であった。このように、コンドロイチナーゼ AB Cの投与は、臨床的に優れた肝線維化抑制効果を発揮することが示された。実施例 4 ：マウス肝硬変モデルにおけるコンドロイチナ一ゼ ABC (Chase ABC) の I型コラーゲン沈着抑制効果

肝硬変を含む線維化疾患においては、 I型コラーゲン量の増加が、病変構成線維の形成における最重要因子であると考えられている。そこで、実施例 3で作製した各群由来の肝組織試料について、 I型コラーゲンの免疫染色実験を行った。実施例 3で作製した対照群、 Chase ABC酵素群、 Chase AC酵素群、及び Chase B 酵素群由来の切片試料に、一次抗体としてゥサギ抗マウス I型コラーゲン抗体（1 ： 100希釈； Rock l and社製）を添加し、室温で 1時間反応させた。続いて、二次抗体としてアルカリフォスファターゼ標識抗ゥサギ I gG ( 1 ： 200希釈； Jackson Im munoResearch社製）を試料に添加し、室温で 30分間更に反応させた後、アルカリフォスファターゼ発色基質（ベクター ' レッド； Vector Laboratory社製）を添加した。光学顕微鏡（ライカ社製）下で試料を観察し、赤色のシグナルで可視化された抗体結合を確認した。

得られた肝組織の免疫染色像の例を図 5に示す。図 5に示される通り、対照群では偽小葉様構築に沿って I型コラーゲンがはっきりと検出されたのに対し、 Cha se ABC酵素群では、わずかに散見されるのみであった。

そこで、上記で行った免疫組織学的染色に基づき、 I型コラーゲン陽性の面積を、ウンルーフ画像解析ソフトウェア（Win R00F；三谷商事株式会社）を使用して算出した。肝臓切片上の少なくとも 15mm²の範囲にわたり計測し、結果は計測した肝臓面積に対する陽性面積率（％) で示した。結果は図 6にグラフで示した。図 6にも示されるように、 I型コラーゲンの陽性面積率（％) は、対照群で 5. 1 6 ± 0. 98 %であったのに対し、 Chase ABC酵素群では 1. 61 ± 0. 29 %、 Chase AC酵素群では 4. 30 ± 0. 18 %、 Chase B酵素群では 3. 38 ± 0. 50%であった。対照群と比較して、全ての酵素群で I型コラーゲンの陽性面積率（％) が有意差をもって減少していた (Chase ABC酵素群： ρ=0· 0018、 Chase AC酵素群： ρ=0· 023、 Chas e B酵素群： p=0. 0059；全て t検定）。とりわけ Chase ABC酵素群では、 Chase AC酵素群及び Chase B酵素群と比較しても、 I型コラーゲンの陽性面積率（％) が統計学的に有意に減少しており（Chase AC酵素群との有意差： p=0. 0008、 Chase B酵素群との有意差： P=0. 003；いずれも t検定）、 I型コラーゲン沈着抑制効果が極めて高いことが示された。一方、 Chase AC酵素群と Chas e B酵素群の比較では、統計学的な有意差は認めなかった（p=0. 068、 t検定）。なお四塩化炭素を投与しない正常マウスから採取した正常肝でも同様の解析を行ったが、 I型コラーゲンの陽性面積率は 0 %であった。この結果から、コンドロイチナーゼ ABCの投与によって、線維化肝における I型コラーゲンの沈着を顕著に抑制できることが示された。実施例 5 ：マウス肝硬変モデルにおけるコンドロイチナーゼ ABC (Chase ABC) のコンドロイチン硫酸（CSPG) 沈着抑制効果

Chase ABCの投与によって線維化肝に沈着したコンドロイチン硫酸（CSPG) 力 S 分解されることを確認するために、実施例 3で作製した対照群及び Chase ABC酵素群の肝組織試料について、実施例 1と同様にして、抗 CSPG抗体、抗 C4SPG抗体、及び抗 C6SPG抗体を一次抗体として用いて免疫組織学的解析を行った。

得られた肝組織の免疫染色像の例を図 7に示す。図 7中、左側の列が対照群、右側の列が Chase ABC酵素群である。図 7に示される通り、対照群では、実施例 1の硬変肝と同様に、 CSPG、 C4SPG、 C6SPGのそれぞれに対し明瞭な陽性シグナルが観察された。一方、 Chase ABC酵素群では、対照群と比較して、 CSPG、 C4SPG、 C6SPGのいずれに対するシグナルも明白に減弱していた。とりわけ C6SPGの染色像 (最下段）においては、対照群において、実施例 4及び 5でコラーゲンの伸長が観察された偽小葉周囲に沿って、明瞭な陽性シグナルが検出されたのに対し、 Ch ase ABC酵素群においてはそのシグナルがほぼ完全に消失していた。

以上の結果から、コンドロイチナーゼ ABCの投与により線維化肝に沈着した CSP Gが分解されることが実証された。実施例 6 ：マウス肝硬変モデルにおけるコンドロイチナーゼ ABC (Chase ABC) の線維芽細胞集積抑制効果

線維化を促進するコラーゲンの産生細胞としては、活性化線維芽細胞が中心的な存在である。線維芽細胞の過剰集積、定着、及び活性化は線維化病変を增悪させると言われている。そこで、肝硬変モデルにおける線維芽細胞の動態に関して、免疫組織学的検討を行った。

まず、実施例 3で作製した対照群及び Chase ABC酵素群由来の切片試料に、一次抗体としてラット抗マウス線維芽細胞抗体（クローン ER- TR7 ； 1 ： 500希釈； BM A社製）を添加し、室温で 1時間反応させた。続いて、二次抗体としてペルォキシダ一ゼ標識抗ラット IgG ( 1 ： 200希釈；バイオソース社製）を添加して、室温で 30分更に反応させた後、 DAB基質（ニチレイ社製）を添加した。光学顕微鏡（ライカ社製）下で試料を観察し、茶色のシグナルで可視化された抗体結合を確認した。なお四塩化炭素を投与しない正常マウスから採取した正常肝についても同様の免疫組織学的解析を行った。

得られた肝組織の免疫染色像の例を図 8に示す。図 8中、最左列が正常群（正常肝）、中間列が対照群、最右列が Chase ABC酵素群を示す。上段は倍率 100倍の像、下段は倍率 200倍の像である。未処置の正常マウス肝臓においては、線維芽細胞に対する陽性シグナルは門脈周辺に強く分布していた。また、対照群（硬変肝）では線維芽細胞が明白に偽小葉に沿って集積していることが示されたが、 Ch ase ABC群ではその集積の程度はごく軽度であった。このことから、線維化肝における線維芽細胞の過剰集積又は定着が、 Chase ABC投与により、顕著に抑制されたことが示された。

さらに、本実施例で硬変肝において線維芽細胞が偽小葉（線維化層）に沿って集積したこと、及び前述の実施例でも対照群の硬変肝において偽小葉周囲に沿つて明瞭な CSPG陽性シグナルが検出されたことから、肝臓の線維化においては CSPG が線維芽細胞の足場を提供することが考えられた。実施例 7 ：マウス肝硬変モデルにおけるコンドロイチナーゼ ABC (Chase ABC) のマクロファージ集積抑制効果

線維芽細胞を活性化させる因子を産生する細胞は、主にマク口ファージであると考えられている。そこで、肝硬変モデルにおけるマクロファージの動態に関しても免疫組織学的検討を行った。

まず、実施例 3で作製した対照群及び Chase ABC酵素群由来の切片試料に、一次抗体としてラット抗マウスマク口ファージ抗体（クローン F4/80； 1 ： 500希釈； BMA社製）を添加し、室温で 1時間反応させた。続いて、二次抗体としてペルォキシダーゼ標識抗ラット IgG ( 1 ： 200希釈；バイオソース社製）を添加して、室温で 30分更に反応させた後、 DAB基質（ニチレイ社製）を添加した。光学顕微鏡 (ライカ社製）下で試料を観察し、茶色のシグナルで可視化された抗体結合を確認した。なお四塩化炭素を投与しない正常マウスから採取した正常肝についても同様の免疫組織学的解析を行った。

得られた肝組織の免疫染色像の例を図 9に示す。図 9中、最左列が正常群（正常肝）、中間列が対照群、最右列が Chase ABC酵素群を示す。図 9に示される通り、正常肝では陽性シグナルは類洞に広く分布しており、これはクッパー細胞と考えられた。一方、対照群の硬変肝では明らかにマクロファージの数が増加しており、実施例 4及び 5で偽小葉を取り囲むように観察されたコラーゲンの脇にも、数多く認められた。一方、 Chase ABC酵素群では、マクロファージ数が対照群に比べて明白に減少していた。すなわち、 Chase ABC酵素群では、硬変肝におけるマクロファージの集積が抑制されることが示された。この結果から、対照群（硬変肝）では未だ進行性の線維化病変形成過程にあるのに対し、 Chase ABC酵素群では線維化の進行が抑制されていることが示唆された。産業上の利用の可能性

本発明に係る、コンドロイチナーゼ ABCを有効成分として含有する肝線維化抑制剤は、肝組織の線維化を抑制することにより、肝組織の過剰な線維化を伴う疾患（肝線維化疾患）の治療又は予防に効果を有する。本発明に係る肝線維化抑制剤は、線維化した肝組織において、 III型コラーゲンの伸長を抑制する効能、 I型コラーゲンの沈着を抑制する効能、線維芽細胞の集積を抑制する効能、マクロファージの集積を抑制する効能などの線維化に関連する様々な徴候を多面的に抑制する効能を有することから、肝臓の線維化を抑制する上で非常に有用である。本発明の肝線維化抑制剤を投与することによる肝線維化疾患の治療又は予防方法は、薬剤療法によって線維化病変を有効に改善できることから、患者の Q0Lの向上に役立つ優れた療法となりうる。本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はその全体を参照により本明細書中に組み入れるものとする。

Claims

請求の範囲

1 . コンドロイチナーゼ ABCを有効成分として含む、肝線維化抑制剤。

2 . 慢性肝疾患の治療用又は予防用の、請求項 1に記載の肝線維化抑制剤。

3 . 慢性肝疾患が肝硬変である、請求項 2に記載の肝線維化抑制剤。

4 . コンドロイチナーゼ ABCがプロテウス ' フ、'ノレガリス（Proteus vulgaris) 由来である、請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の肝線維化抑制剤。