TW200803897A - Hepatic fibrosis inhibitor - Google Patents

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200803897 4 参 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於肝纖維化抑制劑、肝纖維化之抑制方 法，及基於該方法之肝纖維化病症的治療或預防方法。 【先前技術】 肝臟之慢性纖維化病症為會在肝臟發病之慢性發炎狀 悲的終末像的總稱，伴隨著組織的過度纖維化。肝臟之慢 性纖維化病症，為經過進行性的肝臟功能衰竭而多數最後 •會致死的嚴重病症群，但是，到目前尚未存在決定性的治 ,療方法。目前對於肝硬變症係以肝臟移殖進行治療，但是 該等治療方法不但對於患者的生活品質（Q〇L，quaUty Μ 11 ie)有顯著的妨害，而且許多案例中，已經移殖的臟器會 再度陷入纖維化。最近，期待TGF—《抑制劑或血管升壓素 (angiotensin)抑制劑等成為對抗纖維化病症之新治療 劑，但是其有效性並未被確立。因此，熱切地期待有能提 高患者Q0L，使肝纖維化之進行有效阻止或延遲之新的藥 胃劑開發。 現在，就肝纖維化病症之候選治療藥而言，被期待的 有：抑制慢性發炎的副腎皮質類固醇、秋水仙素 (colchicine)、IL—10等；使纖維芽細胞活化之TGF-p抑 制劑、HGF(抑制TGF -/3之作用）、内絲胺酸（end〇serine) 抑制劑、血管升壓素抑制劑等，·除去膠原蛋白之(基質 金屬蛋白酶，matrix metal l〇proteinsase);等，但皆未到 達治療方法之確立（非專利文獻丨[最新總說]，及非專利文

2125-8362-PF 5 200803897 獻2及3)。 蛋白多糖（PG)’係在稱為核蛋白的蛋白質上，具有以 共價鍵結1條以上糖胺聚多糖（GAG)鏈之構造的分子。GAG 鍵之特異構造可認為是負責PG之多樣功能。PG基於GAG 鏈之種類’大致分為4類：硫酸軟骨素（ch〇ndr〇itin sul fate)蛋白多糖（CSPG)、硫酸皮膚素（dermatan sul f ate) 蛋白夕糖（DSPG)、&酉夂乙醯肝素（heparin sulfate)蛋白 鲁多糖（HSPG)及硫酸角質素（ker討in sulfate)蛋白多糖 (KSPG)(非專利文獻4及5[總說])。尤其，HspG會與多樣 的細胞素（cytokine)、化學素（chem〇kine)結合，並將其功 能大幅地修飾，故被研究地多。

另一方面，關於硫酸軟骨素蛋白多糖（CSPG)，為胎生 期必要的分子，已知在各臟器存在量多，但是隨著出生、 成長、老化而緩慢地減少。但是令人驚訝的是其特性的多 樣化，CSPG於活體内之功能尚未被解明。另一方面，關於 _CSPG，有於肝硬變或肺纖維病症等之病變臟器中增加的報 告（非專利文獻6及7)。但是，但是該等病症之中⑵…增 加的意義完全未解明。近年來，由於已瞭解基因上欠缺cspG 之小鼠會有胎生致死或器官形成不全的情形，因此，對於 CSPG為活體必要分子的認識增強。 軟骨素酶，已知為具有將硫酸軟骨素（硫酸軟骨素蛋白 多糖）分解之活性的細菌性酵素。使用軟骨素酶之治療藥， 已知例如：使用軟骨素酶之椎間盤脫出之治療藥（專利文獻 Π'軟骨素酶AC或軟骨素酶傷治瘡促進藥（專利文獻

2125-8362-PF 6 200803897 2)、使用軟骨素酶AC或軟骨素酶B之強皮症、乾癣、疤痕 增長症（Keloid)及肺纖維症之治療藥（專利文獻3)等。 專利文獻1:美國專利第6, 001，630號說明書 專利文獻2:美國專利第5, 9 97, 863號說明書 專利文獻3:國際公開第2001 /039795號小冊 非專利文獻 l:Betaller R & Brenner DA，J. Clin. Invest. (2005) 115:209-218 非專利文獻 2:Iredale JP，BMJ(2004)327:143-147 _ 非專利文獻 3 : Bi sse 11 DM, Exp. Mo 1 · Med· (2001 ) 33:1 79-1 90 非專利文獻 4:Lin X， Development(2004) 1 31 : 6009-6021 非專利文獻 5:HackerUetal· Nature Rev. Cell Biol (2005)6:530-541 非專利文獻 6:Kovalski I et al.，〇rv Hetil (1993) ^134:p.2019-2026 非專利文獻 7 : Wes ter gren-Thors son Get al.，J Clin Invest. (1993) 92:p· 632-637 【發明内容】 [發明之揭示] 本發明目的之一為提供對於肝纖維化病症之治療或預 防有用之能抑制肝組織中纖維化的藥劑、及以·該藥劑為有 效成分的肝纖維化病症之治療劑，及肝纖維化抑制劑之篩 選方法。 $

2125-8362-PF 7 200803897 本發明者等為了開發像這種藥劑，再三地研究，考慮 7為止未視為肝纖維化病症之病因的硫酸軟骨素蛋白多 糖⑽PG)的過度堆積，可能會促進肝組織之纖維化。本發 明者等基於此考量淮^千仰 〒里進仃研究，結果發現藉由為硫酸軟骨素 蛋白多糖分解酵素之趟皆 . 素 (chondri t inase)ABC 能將堆 積於纖維化肝的CSPr古4、方， 有效率地分解，並藉由體内（in vivo) 投予軟骨素酶ABC，铁紙μ # ^ b多句員者地抑制肝組織的纖維化。再 者，猎由投予具有蔣氣 有將為硫酸軟骨素蛋白多糖之一種的 versican的核蛋白

• 辦之功犯的稱為ADAMTS-4( A

disintegrin anH metalloproteinase with thrombospondin mn十w ^ 樣的治療效果。：Π白質的咖 白多糖之堆積或生人：了藉由抑制硫酸軟骨素蛋 [1]:種肝纖維化抑制劑，含有抑制硫酸軟骨素蛋白多糖產 生或堆積之物質作為有效成分。 蛋白夕糖產 [2 ]如[1 ]之樂劑，f v ^ “中，該物質為具有硫酸軟骨辛蛋白夕 糖分解促進作用之物質。 月I蛋白多 [3 ] 如[1 ]之藥齋丨， . ，、中，該物質為具有硫酸軟骨辛蛋白夕 糠合成抑制作用之物質。 a I蛋白多 [4]如[1]之藥劑， ”中’該物質為且有疏酸軟骨夸 糖脫硫酸化作用之物質。 人月素蛋白多 [5 ]如[1 ]之藥劑， 其中，該物質為且有硫酸軟骨去 糖硫酸化抑制作用之物， 八 素蛋白多 [6 ]如[1 ]至[5 ]中 _ 一項之樂劑，其中，係抑制在肝中硫

2125-8362-PF 8 200803897 酸軟骨素蛋白多糖之產生或堆積。 [7]如[1]至[6]中任—項之藥劑，其中，係、 病症之治療或預防。 ’、於肝纖維化 ⑻如m之藥劑，其中，該肝纖維化病 [9 ]如[7 ]之藥叫，甘士 又〖生肝病症。 纖維症、肝硬變肝二，該肝纖維化病症為慢性^ 1叉欠、肝衮竭，或肝癌。 ⑽-種㈣維化抑制劑之篩選方法 試樣中，選擇I右女^ + /、知徵在於··從受試 t擇具有抑制硫酸軟骨素蛋 作用的物質。 夕糖之產生或堆積 [11] 如[10]之篩選方法，其中， 之中任-項作用之物質的步驟：〜擇具有以下⑷〜⑷ ⑷硫酸軟骨素蛋白多糖之分解促進作用 (b)硫酸軟骨素蛋白多糖之合成抑制作用 (C)硫酸軟骨素蛋白多糖之脫硫酸化作用 ⑷疏酸軟骨素蛋白多糖之硫酸化抑制作用 [12] 如[10]或[u]之篩選方法，其 係用於肝纖維化病症之治療或預防〃纖維化抑制劑 又’本發明包含以下· [13] 種肝纖維化抑制劑，含有赴# 4 分。 有車人月素酶ABC作為有效成 [广 14]如上述[13]之肝纖維化抑制劑，其中，係於慢性肝病 症之治療用或預防用。 〖生肝病 [15]如上述[14]之肝纖維化抑 症為肝硬變。 制d，其中，上述慢性肝病

2125-8362-PF 200803897 [16]如上述[13]-[15]中任一馆 , 私風 項之肝纖維化抑制劑，豆 中，軟骨素酶ABC來自μ , 市」片』 其 vulgaris) 。 ι 枰囷（Proteus 再者，本發明係關於以下。 [17 ] —種用途，係將[1 ]至I； 9 ] 造肝纖維㈣·。 巾任―項之藥劑使用於製 […-種肝纖維化之治療方法，包含將⑴ 項之藥劑對個體（患者）投予之步驟。 [1 9 ] 一種組成物，包含[丨]至「 」王L 9」之中任一項之藥劑攀 上可容許的擔體。 系d及柰子 由本發明瞭解到，肝硬蠻夕八产> 更欠之發病與硫酸軟骨素蛋白多 糖之生成或堆積有關。藉由抑制 ^ - P制石瓜酸軟骨素蛋白多糖之生 成或堆積顯示能抑制肝纖維化。 此棱供至此為止尚沒有的 新概念的肝纖維病症的治療筚。 欲去尤其，肝纖維化在現代社 會t的患者數增多，與慢性肝炎、 > 人 ΛΤ纖維症、肝硬變、肝 衰竭、肝癌等慢性肝病症密 相關新概念的治療藥劑在 酉療上及產業上也具有重要的意義。 【實施方式】 (據以實施發明之最佳形態） 以下，更詳細說明本發明。 就代表性的慢性肝病症之一的肝硬變所伴隨的病態， 有肝中的纖維化。本發明者等為了將改善肝中纖維化狀態 :為肝硬變治療之有效方法之一，著眼於硫酸軟骨素蛋白 多糖之功能。並且，將抑制硫酸軟骨素蛋白多糖堆積狀態

2125-8362-PF 10 200803897 :肝硬變模式小鼠中製作，並 數比起野生型的肝，硫酸軟骨素蛋白==觀察到多 細胞’同時肝硬變的病態有所改善。才唐堆積有所改善的 硫酸軟骨素蛋白多糖之生成或堆積，=足發現如果抑制 切相關之之肝中硫酸軟 /匕促進與肝硬變密 與肝纖維化之改善相關連搪的異常堆積的改善， 骨素=㈣：關於一種肝纖維化抑制劑’含有抑制硫酸軟 -夕;’’之生成或堆積的物質作為有效成分。 為代=中，「硫酸軟骨素蛋白多糖」為-種蛋白多糖， 質(核蛋白、:;酸化黏多糖硫酸軟骨素，硫酸皮膚素與蛋白 貝/核蛋白貝）之共價鍵化合物的總稱。本發明中，「硫酸 軟：素蛋白多糖」’較佳為人類的硫酸軟骨素蛋白多糖， 但是其由來之生物種不特別限制’與人類以外之生物中硫 酸軟骨素蛋白多糖為同等的蛋白質(h〇m〇i〇g、。咐。二 也包含在本發明中之厂硫酸軟骨素蛋白多糖」。例如，只 要是具有與人類硫酸軟骨素蛋白多糖相當之蛋白質，及具 有與人類之硫酸軟骨素蛋白多糖同等之蛋白質的生物，則 可實施本發明。X，本發明之巾，硫酸軟骨素蛋白多糖， 也包含由於發炎等於糖胺聚多糖（GAG)而暫時鍵結成為蛋 白多糖之各種部分時間（part time)蛋白多糖。 於以下之記載，硫酸軟骨素蛋白多糖，例 如：aggrican、versican、神經蛋白聚醣（neur〇can)、 brevican、沒醣基（/? giycan)、核心蛋白聚醣（De⑶rin)、

Bigiycan、纖調蛋白（Fibromodul in)、PG-Lb。本發明中， 2125-8362-PF 11 •200803897 硫酸軟骨素蛋白多糖不限於該等，只要具有作為硫酸軟骨 素蛋白多糖之活性的物質即可。在此，硫酸軟骨素蛋白多 糖之活性，意指例如細胞接著能力，或細胞增殖促進等。 該技術領域之人士可以用如下方法評價作為硫酸軟骨素蛋 白多糖之活性。於含有硫酸軟骨素蛋白多糖之胺基酸序列 一部分區域之蛋白質，或與一部分區域具有高相同性（通常 為70%以上，更佳為80%以上，又更佳為9〇%以上，最高為 95%以上）之蛋白質存在下，測定腫瘤細胞（例如Cac〇 — 2、 HT-29細胞等）之分裂增殖。具有促進分裂增殖效果之蛋白 質可以判定為具有硫酸軟骨素蛋白多糖活性之蛋白質（int J Exp Pathol· 2005 Aug;86(4):219-29 及 Histochem Cell

Biol· 2005 Aug;124(2):1 39 —49)。在此，高相同性，意指 50%以上，較佳為70%以上，更佳為8〇%以上，又更佳 以上（例如，95%以上，再者96%、97%、98%或99%以上）之0 相同性。該相同性，可由mBLAST演算法（Aitschui Μ _al.(199〇) Pr〇c· Nat1· Acad· Sci· USA 87:2264 一 8; Karlin and Altschul(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7)決定。 本發明中，「肝纖維化」係指肝組織中之纖維化狀離。 例如’肝組織中之膠原蛋白等細胞外基質的堆積、纖維芽 細胞之活化等，但不限於該等。 本發明之中，硫酸軟骨素蛋白多糖之「抑制生成或堆 積」，例如：硫酸軟骨素蛋白多糖之「分解促進」、「合 成抑制」、「脫硫酸化」、「硫酸化抑制」等，但不限於

2125-8362-PF 12 200803897 該等，意指硫酸軟骨素 比較對象為低或消失 ：置、功能或活性較 之「抑制生成或堆積的Γ所 硫酸軟骨素蛋白多糖 軟骨素蛋白多糖之「貝」不特別限定’較佳為硫酸 入具有分解促進作用之物質 「 e成抑制作用之物 、」、具有 戎「呈古七 、」、具有脫硫酸化作用之物曾 或具有抑制硫酸化之物質」。 艾物貝」’ 硫酸軟骨素蛋白多糖之」「分解促進 " 酸軟骨素蛋白多^#01 」，例如使成為硫 核的蛋白質表現抑制、存左坫丨、 此，成為硫酸軟骨素I6 > 減 >。在 子人月京蛋白多糖之核的蛋白晳 r 基質（matrix)刑栌舱& 1 贪白貝」，如果為 • χ)型硫酸軟骨素蛋白多糖，例如 versican、mpi1rrx aggrican、 can、brevi can等核蛋白皙 膜型硫酸軟骨蛋白貝。又，如果為 Blglycan、F h多糖，例如1 例示，不限於兮笪 貝"亥4皆為 糖之妨^ 4 ’只要是廣泛的成為硫酸軟骨辛蛋白多 糖之核的蛋白質即可。 月I蛋白夕 及蛋=」「=基因之「轉錄」，或「轉譯」為多肽， 核的蛋白質的^ Ρ制」。「成為硫酸軟骨素蛋白多糖之 蛋白多糖之’意指發生由編碼為成為硫酸軟骨素 錄：=:!白質的基因轉錄及轉譯，或藉由該等轉 音。又二：f 硫酸軟骨素蛋白多糖之核的蛋白質之 Μ 又 成為硫酸軟骨辛I> 意指例如該… 糖之核的蛋白質的功能」， 胞中的構成要素結合等。卜、十、Γ— 月匕，或與其他細 士可你 、 迷各種功能，該技術領域之人 —般的技術，適當評價(測定）。具體而言，可實

2125-8362-PF 13 200803897 施後述實施例記載之方法，或將該方法適當改變後實施。 ώ再者’硫酸軟骨素蛋白多糖之「分解促進」，可為將 硫酸軟骨素蛋白多糖切斷或者分解的酵素或與該等有關連 的酵素的表現上升。該等酵素之例，例如：金屬蛋白酶（例 如：侧、纖MTS_4、麵TS—5等），或軟骨素酶、 al阳η I等，但不限於該等。又，「分解促進」，可為 3衫料酵素或部分而使硫酸軟骨素蛋 存在量減少。 白夕 Λ解促進」’也可投予促使表現硫酸軟骨素蛋 ^ Ρ制的物質。該等物質，例如：n-bUt細e、Diethyl Γ a:aZePine: TUn“、職^⑽idal estr〇gen、

Ye o enil deiphen〇1等，但不限於該等。 以下解促進作用之物質」之較佳態樣，例如擇自 a) (c)所構成群之化合物（核酸）。 (a )與編碼為硫酸軟骨去 釺產铷+甘 素蛋白夕糖之核蛋白質之基因的轉 錄產物或其一部分對應的反義核酸 (b )具有將編碼為硫 的轉錄產物專一性的=素二白多糖之核蛋白質之基因 酸 、赴叙的核糖酵素（riboZyme)活性的核 (c)具有將編碼為硫酸 的表現以_效果予,蛋白多糖之核蛋白質之基因 文果予以抑制之作用的核酸 所構二促進作用之物質」’例如擇…咖 (軟骨素蛋白多糖之核蛋白質結合之抗體

2l25-8362-PF 14 200803897 (b) 對硫酸軟骨素蛋白多糖之核蛋白質具有優勢負面效應 (d〇minant negaive effect )之性質的硫酸軟骨素蛋白多 糖變異體 (c) 舆硫酸軟骨素蛋白多糖之核蛋白質結合的低分子化合 夕硫酸軟骨素蛋白多糖之「合成抑制」，例如：糖胺聚 多糖生合成之抑制、與硫酸軟骨素蛋白多糖合成有關之酵 素的抑制等’但不—定限於該等，意指硫酸軟骨素蛋白多 糖合成過程中的任何抑制。 P制”l S夂軚月素蛋白多糖合成之物質，就抑制糖胺聚 夕糖生、合成之物質，例如：/?-D-xyl〇side 、 2-deoxy-D-gluc〇Se(2-DG) > ethane-1-hydroxy-l,i_ diphosphonate(ETDP) . 5-hexyl-2-deoxyuridine(HUdR) 等。以S亥等物質抑制糖胺聚多糖生合成，並抑制碳酸軟骨 素蛋白多糖合成。 與軟骨素合成有關之酵素

力 “ ’八 ^ 闕〜崎系，例 如：^版邮1、h驗4ST个嶋s —6ST、UA2〇st、 n\、GalT—11、gicaim、xyiQsyi τ 等。藉由抑制對 亥等之酵素抑制表現，抑制硫酸軟骨素蛋白多糖 成0 σ 例如擇自 因的轉錄 具有合成抑制作用之物質」的較佳態樣， 以下（a) (c)所構成群之化合物（核酸）。 (a)與編碼為硫酸軟骨素蛋白多糖合成酵素之基 產物或其—部分對應的反義核酸 "

2125-8362-PF 15 200803897 (b)具有將編碼為硫酸 轉錄產物專一性的 "、夕糖合成酵素之基因的 (〇且有將編石^ 酵素（rib〇Zyme)活性的核酸 (:)，、有將編碼為硫酸軟骨素蛋白多 表現以_效果予以抑制之作用的核酸 基因的 又’「具有合成抑制作用之物 所構成群之化合物。 、擇自以下（a)〜（c) (a)與硫酸軟骨紊j ⑴ |蛋白多糖之合成酵素結合之抗體 〇〇對硫酸軟骨素蛋白多糖 1 (d〇mi腿t negaive pff + /酵素具有優勢負面效應 糖合成酵素變異體ec之性質的硫酸軟骨素蛋白多 (c )與硫酸軟骨幸|ώ夕 物 u蛋白多糖之合成酵素結合的低分子化合 骨素蛋白多糖之「脫硫酸化」， ^蛋白多糖中之硫酸基除去，例如以内在性或 =脫硫酸化酵素進行脫硫酸化，或以抑制硫酸化之化合 卩制硫酸化等’但不限於該等，意指除去硫酸基之過程。 (c二硫酸化酵素’例如：軟骨素+硫酸…

二—“ulfatasW 〇π r〇ltln-6-sulfatase)〇x,#f|Ji^^^^^^^ • orate^EGF ^ ^ #-J (EGF receptor antagonist) 等0 、具有脫硫酸化作用之物質」的較佳態樣，例如擇自 以下（a)〜（c)所構成群之化合物（核酸）。 (a)與編碼為硫酸軟骨素蛋白多糖脫硫酸酵素抑制蛋白質

2125-8362-PF 16 200803897 之基因的轉錄產物或其一部分對應的反義核酸 (b) 具有將編瑪為硫酸赴|去又& #丨士 、> :屬月素蛋白多糖脫硫酸酵素抑制蛋 貝土 、轉錄產物專一性的開裂的核糖酵幸 (ribozyme)活性的核酸 東 (c) 具有將編碼為硫酸軟骨素蛋白多糖脫硫酸酵素抑 白質之基因的表現以RNAi效果予以抑制之作用的核酸

又’「具有脫硫酸化作用之物質」，例如擇自以下（3)〜 所構成群之化合物。 C (a)與硫酸軟骨素蛋白多糖之脫硫酸酵素抑制蛋白質結八 之抗體 、^ η (b )對;^ g欠幸人月素蛋白多糖脫硫酸酵素抑制蛋白質具有停 勢負面效應（dominant negaive effect )之性質的硫酸敕 月素蛋白多糖脫硫酸化抑制蛋白質變異體 (c)與硫酸軟骨素蛋白多糖之脫硫酸酵素抑制蛋白質結合 的低分子化合物 ° 在此，「脫硫酸化抑制化合物」，不限於蛋白質，包 含例如輔酶等非蛋白質化合物。 硫酸軟骨素蛋白多糖之「硫酸化抑制作用」，例如硫 酸基轉移酵素之抑制，但不限於此，意指硫酸軟骨素蛋白 多糖合成過程中所發生之硫酸化被抑制之意。 硫酸基轉移酵素，例如：C4ST—1(Ch〇ndr〇itin D—N-acetylgalactosamine-4-0-sulfotransferase 1) 、 C4ST-2 (Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-0-sulfotransferase 2) 、 C4ST-3(Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-〇- 2125-8362-PF 17 200803897 SUlf〇「transferase 3)、mst、C6ST小 C6ST_2 等。 「具有硫酸化抑制作sn的較佳態樣，例如擇 以下U)〜（c)所構成群之化合物（核酸）。 (a)與編碼為硫酸赴晋| 夂季人月素蛋白多糖硫酸基轉移酵素之基因 的轉錄產物或其一部分對應的反義核豸 ⑻具有將編碼為硫酸軟骨素蛋白多糖硫酸基轉移酵素之 基因的轉錄產物專一性的開裂的核糖酵素(―)活性 的核酸 (C)具有將編碼為硫酸軟骨素蛋白多糖硫酸基轉移酵素之 基因的表現以RNAi效果予以抑制之作用_ 又’ 「具有硫酸化抑制作用之物質」，例如擇自以下 (a) 〜（c)所構成群之化合物。 u)與硫酸軟骨素蛋白多糖之硫酸基轉移酵素結合之抗體 (b) 硫酸軟骨素蛋白多糖硫酸基轉移酵素變異體 人月素蛋白多糖之硫酸基轉移酵素結合的低分 子化合物 上述例示之酵素，不僅是對應於一基因之一酵素，也 包含共有某特徵的酵素群。例如，軟骨素酶，料有黏多 糖分解酵素之特徵，但是基質專—性等不同之ABC、AC、B 等酵素的總稱。例如’軟骨素酶AC !，將硫酸軟骨素類 C或E)、軟骨素、硫酸軟骨素_硫酸皮膚素雜交塑及透明質 酸之N-乙喊己糖醯胺（hexQsaffiinide)鍵⑽離反應地切 斷，而產生在非還原末端具有Δ4_葡糖駿酸殘基之寡糖。 本酵素對硫酸皮膚素（硫酸軟骨素Β、就己糖㈣而言具有

2125-8362-PF 18 200803897 L-艾杜糖盤酸（i duroni c aci d)、硫酸角質素、硫酸乙醯肝 素及肝素作用。又，軟骨素酶AC 11，將軟骨素、硫酸軟 骨素類 A及硫酸軟骨素C之N-乙醯基己糖醯胺 (hexosaminide)鍵以脫離反應地切斷，而產生A4-不飽和 雙糖（ADi-0S、ΔΙΗ-4S、及ADi-eS)。本酵素對透明質酸 也作用良好。對於硫酸皮膚素（硫酸軟骨素不作用，成 為本酵素之競爭性抑制劑。軟骨素酶B(Dermatanase)，將 結合於硫酸皮膚素之L-艾杜糖醛酸（iduroni c aci d)的之 春N-乙醯基己糖醯胺（hexosaminide)鍵以脫離反應地切斷， 而產生於非還原末端具有△ 4-己糖醛酸殘基之募糖糖及 4糖）。本酵素對於不含L-艾杜糖酸酸之硫酸軟骨素a及硫 酸軟骨素C不作用。硫酸皮膚素之硫酸基已去除之衍生物 皮膚素，並非該酵素之基質。硫酸皮膚素之L—艾杜糖醛酸 單位的第2位被硫酸化之部位經常被本酵素所切斷。軟骨 素酶ABC，將硫酸軟骨素A、硫酸軟骨素（：、硫酸皮膚素、 _軟骨素及透明質酸的N-乙醯基己糖醯胺（hex〇saminide)鍵 以脫離反應地切斷，而主要產生於非還原末端具有Δ4-己 糖醛酸殘基之二糖。本酵素對於硫酸角質素、肝素及硫酸 乙醯肝素不作用。軟骨素酶為像這種具有不同性質，同時 具有黏多糖分解酵素之共通性質的酵素總稱，不一定限於 此處所例示的 Ch〇ndr〇itinase Ac ac

Il^Chondroitinase B ^ Chondroitinase ABC 〇 X ’共有像這種特徵的酵素群，不—枝對應於基因 體（gen〇me)DNA上的一基因。例如， 2125-8362-PF 19 200803897 chondroitin~4-sulfatase ^ chondroitin-6-sulfatase ^ 都是基因體資料庫上於公共基因資料庫Genbank所檢索以 多數登‘編號參照的序列（例如，於Genbank登記編號 NT_039500(其一部分以登記編號CAAA01 098429(序列編 號：68)表示）、NT—078575、NT 一 039353、NW—001 030904、 NW—001030811 、 NW—001030796 、 NW—000349)。 上述例示者中，對應於個別基因者如下所示。也就是 曰兒：上述例示之硫酸軟骨素蛋白多糖：aggrican、 versican λ neurocan λ brevican λ β glycan % Decorin ^ Biglycan、Fibromodulin、PG-Lb、就將硫酸軟骨素蛋白多 糖切斷或分解之酵素或與該等有關連的酵素例示 者：ADAMTS-1、ADAMTS-4、ADAMTS-5、Calpain I;與軟骨素 合成有關的酵素例示者：GalNAc4ST-1、GalNAc4ST-2、 GALNAc4S-6ST 、 UA20ST 、 GalT-I 、 GalT-II 、 GlcAT-I 、 XylosylT;就硫酸基轉移酵素例示者：C4ST-1、C4ST-2、 C4ST-3、D4ST、C6ST-1、C6ST-2等，其於人類之中，編碼 之基因於公共基因資料庫Genbank中之登記編號、驗基序 列、胺基酸序列如下所示。 aggr ican(登記編號NM-007424、驗基序列之序列編號：1、 胺基酸序列之序列編號：2) versican(登記編號BC096495、驗基序列之序列編號：3、 胺基酸序列之序列編號：4) 1^111'〇〇&11(登記編號丽一01 0875、鹼基序列之序列編號：5、 胺基酸序列之序列編號·· 6 ) 2125-8362-PF 20 200803897 brevican(登記編號NM—007529、鹼基序列之序列編號：7、 胺基酸序列之序列編號：8 ) 冷glycan(登記編號、驗基序列之序列編號· 9 胺基酸序列之序列編號：10)

Decor in(登記編號龍―007833、鹼基序列之序列編號：11、 胺基酸序列之序列編號：12) B i g 1 y c a η (登記編號B C 0 5 71 8 5、驗基序列之序列編5虎· 13 胺基酸序列之序列編號：14 ) _ Fibromodulin(登記編號ΝΜ—021355、驗基序列之序歹〗、’爲 號：15、胺基酸序列之序列編號·· 1 6 ) PG-Lb(登記編號NM_007884、鹼基序列之序列編號：I7、胺 基酸序列之序列編號：1 8) ADAMTS-1 (登記編號NM—0 0 962卜鹼基序列之序列編號：19、 胺基酸序列之序列編號：2 0) ADAMTS-4C登記編號匪-172845、鹼基序列之序列編號：21、 胺基破序列之序列編號：2 2 ) _ ADAMTS-5(登記編號AF140673、鹼基序列之序列編號：23、 胺基酸序列之序列編號：24)

Calpain I(登記編號NM—007600、鹼基序列之序列編 號：25、胺基酸序列之序列編號：26)

GalNAc4ST-l (登記編號NM—175140、驗基序列之序列編 號：27、胺基酸序列之序列編號：28)

GalNAc4ST-2(登記編號NM—1 99055、驗基序列之序列編 號：29、胺基酸序列之序列編號：30) 2125-8362-PF 21 200803897 6八1^人648-681'(登記編號丽-〇29935、驗基序列之序列編 號：31、胺基酸序列之序列編號：32) 2081'(登記編號，一177387、驗基序列之序列編號：33、 胺基酸序列之序列編號：34)

GalT-1 (登記編號NM一〇 1 6769、驗基序列之序列編號：35、 胺基酸序列之序列編號：36)

GalT-I I (登記編號BC064767、驗基序列之序列編號：37、 胺基酸序列之序列編號：3 8) _GlcAT-I(登記編號BC058082、驗基序列之序列編號：39、 胺基酸序列之序列編號：4〇 ’或登記編號ΝΜ-0 242 5 6、驗基 序列之序列編號：41、胺基酸序列之序列編號：42) XylosylT(登記編號丽—145828、驗基序列之序列編號：43、 胺基酸序列之序列編號：44) C4ST-1 (登記編號NM-021439、驗基序列之序列編號：45、 胺基酸序列之序列編號：46) C4ST-2(登記編號NM—021 528、驗基序列之序列編號：47、 胺基酸序列之序列編5虎：4 8) C4ST-3C登記編號XM—355798、鹼基序列之序列編號：49、 胺基酸序列之序列編號：50) D4ST(登記編號腿_〇28117、鹼基序列之序列編號：51、胺 基酸序列之序列編號·· 5 2) C6ST-1 (登記編號NM—01 6803、鹼基序列之序列編號：53、 胺基酸序列，之序列編號：54) C6ST-2(登記編號AB046 929、鹼基序列之序列編號：55、胺 2125-8362-PF 22 200803897 基酸序列之序列編號β· 56) 上述以外的蛋白質，只凑 只要例如舆序列表所記載之序列

能（例如，與細胞内之構成ϋ鮭厶夕ι —

加成、缺失、取代、插入之胺基酸序列所構成的蛋白質， 通常變化的胺基酸數在30個胺基酸以内，較佳為1〇個胺 基酸以内，更佳為5個胺基酸以内，最佳為3個胺基酸以 本發明中’上述基因中，包含例如與序列編號：1、3 5、7、9、η、13、15、17、19、2卜 23、25、27、29、31 51、 53、 55 其中 33 、 35 、 37 、 39 、 41 、 43 、 45 、 47 、 49 、 之一記載之鹼基序列所構成之DNA對應之於其他生物的内 在性的基因（人類之上述基因的同族體（h〇m〇1〇g)等）。 又，與序列編號：1、3、5、7、9、11、13、1 5、17、 19、21、23、25、27、29、3卜 33、35、37、39、4卜 43、 45、47、49 ' 51、53、55其中之一所記载之鹼基序列所構 成之DNA對應的其他生物的内在性DNA，一般而言，各與 序列編號：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、 25、27、29、3卜 33、35、37、39、4卜 43、45、47、49、

2125-8362-PF 23 200803897 51、53、55其中之一所記載之DNA具有高相同性。具有高 相同性意指，具有50%以上，較佳為7〇%以上，更佳為80% 以上，又更佳為90%以上（例如，95%以上，更佳為96%、97%、 98%或99%以上）之相同性。該相同性，可藉由11^1^3丁演算 法（Altschul et al. ( 1 990) Proc. Natl· Acad· Sci· USA 87:2264-8; Karlin and A1tschul( 1 993) Proc. Natl. Acad.

Sci· USA 90:5873-7)決定。又，該DNA於從活體單離之情 形，被認為與序列編號：1、3、5、7、9、11、1 3、1 5、1 了、 馨 19、21、23 ' 25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、 45、47、49、5卜 53、55 所記載之 DNA 於嚴格（stringent: 條件下會雜交。在此，「嚴袼條件」例如「2xSSC、〇. 1%SDS、 5(TC」、「2xSSC、〇.l%SDS、4rc」、「lxSSC、〇 mDS、 37(：」，更嚴格條件，例如「2><%(：、〇1%81)3、65它」、

〇· 5xSSC、0· USDS、42°C」及「〇· 2xSSC、0· USDS、65°C 之條件。 …卩一心阿吖日鬥怔ι蛋 質’將與上述蛋白質在功能上為同等的蛋白質，藉由炉 軟骨素蛋白多糖之分解促進作用、合成抑制作用、脫硫 化作用或硫酸化抑制作用夕、、本α、ηϊ + 1 仰制作用之活性測定方法而適當取得。 體的活性敎方法，記载於後述本發明之篩選方法的項 中又，錢術領域之人士，可將其他生物中相當於上 基因之内在性基因，以卜、+、 、 取彳β $ 士 以上述基因之鹼基序列為基礎而適 取仔。又，本說明蚩φ 祖 月曰中，對於人類以外生物之中盥 白質及基因相當之上述蛋 ，、上这: 心皮曰貝及基因，或者與上述蛋白；

2125-8362-PF 24 200803897 及基因在功能上為同等的上述蛋白質及基因，有時單以上 述名稱記載。 本發明之上述蛋白質，除了天然蛋白質以外，也可為 利用基因重組技術所調製之重組蛋白質。天然蛋白質，例 如可藉由將例如認為表現上述蛋白質之細胞（組織）的萃取 液，使用對抗上述蛋白質之抗體之親和性層析方法調製。 另一方面，重組蛋白質，例如可藉由培養經過編碼為上述 蛋白質之DNA進行形質轉換之細胞而調製。本發明之上述 蛋白質’例如可適用於後述篩選方法。 丰愈月之中，「核酸」意指RNA或DNA。又，所謂pNA( 核酸，Peptide nucleic acid)等化學合成核酸類似; 力 g)也i 3於本發明之核酸。PNA係將為核酸基本 ^構造之五碳糖•磷酸骨架，取代為以甘胺酸為單位之: I胺月木者，具有與核酸很相似的三維構造。 就抑制特定内在基因表現之方法而言，利用幻

Se)技術之方法為該技術領域之人士所熟知的。2 義核酸對於目標基因表 — Η 之抑制作用，存在如以下多數ό 二就疋說:由於形成三條鏈造成抑制轉錄開始、“ 議聚合酶而局部打開成環〇卿）狀構 轉錄抑制、於内子(11二成進订中之職形成雜交造# 交造成剪切r ,· η)與外子（exon)之接合點形成n 呷位m SP 1Clng)抑制、與剪接體(spliceosome)形成 口P位形成雜交造成剪 取 核移動到細胞質:::、與成雜交造成抑制從 風巾目（CaPping)部位或多（A)加成部位

2125-8362-PF 25 200803897 形成雜交造成剪切抑制、與 成轉譯起始抑制、與起始密碼；二°因子結合部位雜交造 交造" 附近的核糖體結合部位雜

又i攻轉澤抑制、與mRNA 結合部位雜$、皮# a 学匚域或多核醣體（polysome) …:成多肽鏈伸長抑制，及與核酸與蛋白質之 父互作用部位雜交造成…蛋白貝之 iir m ^ Λ, S 見抑制等。以該方式，反義 核齩猎由抑制轉錄、剪切 我 m ^ ^ m ίτ ^ /轉專專各個過程，抑制目標基 因之表現（平島及井上，新一 土 ^ .. φ 生化予貫驗講座2核酸IV基因 之禝製與表現，曰本生仆風 土 u r319_347)。 予I扁，東京化學同人，1 993, 本發明中使用的反義核酴 、 我孩酉文，可猎由上述其中之一的作 用’將編碼為上述硫酸敕骨 热主 季人月素蛋白多糖之核蛋白質、合成

酵素、脫硫酸化酵素抑制I 、p制蛋白貝、硫酸基轉移酵素其中之 一之基因的表現及/或功台匕 力月b予以抑制。就一態樣而言，如果 在編碼為上述硫酸軟骨素蛋白多糖之核蛋白f、合成酵 素、脫硫酸化酵素抑制蛋白質、硫酸基轉移酵素其中之一

之基因的mRNA的5，糾I 附近故計與非轉譯區互補的反義序 列’呑忍為對基因之轉譯永矣| 科夺抑制為有效果的。也可使用與編碼 區或3’狀非轉譯區為互補的序列。以上述方式，不僅 是編碼為上述琉酸軟骨素蛋白多糖之核蛋白質、合成酵 素、脫石瓜酉义化酵素抑制蛋白質、硫酸基轉移酵素其中之— 之基因的轉譯區，包含非轉譯區之序列的反義序列的核 酸，也包含在本發明可利用的反義核酸。所使用之反義核 酉夂’連L於適田的促進子（则下游，較佳為在3， 側連結包含轉錄終結信號的序列。

2125-8362-PF 26 200803897 以該方式所調製之核酸，可藉由公知的方法所 的動物（細月包）進行形質轉換。反義核酸的序列’則土為盘 =綱質轉換的動物(細胞)具有的内在性硫酸軟骨素 夕糖之核蛋白質、合成酵素、脫硫酸化酵素抑制蛋白 2或硫酸基轉移酵素之基因或其部分為互補的序列，p 只要能夠有效地抑制基因表現， 疋 取佳為95%以上的互補性。使 . ± B 從用夂義核酸有效果地抑制目 払基因表現，較佳為反義核酸 ^ 〇r ^ ^ 又王夕馬1 5個鹼基以上不 :25:驗基’但本發明之反義核酸不-定限於該長度，例 如可為100個驗基以上，或咖個驗基以上。 例 美因反義核酸不特別限制，例如可基於v⑽咖 號⑻、土C4ST:GTnk之登記編號BC096495 序列編 序列編 序列編 合成酵 enBank之登記編號龍_〇21439 ;C4ST-2(GenBank 之登記編號題―〇21528 ::4cn、C4ST—抑—磁之登記編號Μ一355798 谠：49)等製作。

編碼為上述硫酸軟骨素I 素，酸化酵素抑制核蛋白f、合成酵 現的抑制，可利用核糖料或編;:;轉移酵素之基因表 /一 、$、、扁碼為核糖酵素之DNA推 订。核糖酵素係指具有觸媒 4腦進 在具有各種活性者，其中，ώ A刀子。核糖酵素存 核糖酵素為研究關 =作為將驗切斷之酵素的 切斷的核糖酵素。核糖酵;中： 晖素中，有丨群内子（GroupI intr〇n)

2125-8362-PF 27 200803897 型或包含於RNase P中之M1 RNA之大小為4〇〇個核苷酸以 上者，也有具有鄉頭（hammer head)型或稱為髮夾型之4〇 個核苷fee左右之活性結構域（d〇mai n)者（小泉誠及大塚榮 子’蛋白質核酸酵素，1 990, 35, 21 91·) 例如，鄉頭（hammer head)型核糖酵素之自切斷結構 域，係將稱為G13U14C15序列之C15的3，側切斷，其活 性在U14與A9之鹼基對形成為重要的，且顯示將α5改為 A15 或 U15 也可以切斷（Koizumi，M· et al·，FEBS Le^， 1 988，228，228·)。如果設計基質結合部位與標的部位附 近之RNA序列為互補的核糖酵素，則可製作認識標的 中之UC、UU或UA序列之限制酵素性的RNA切斷核糖酵素 (Koizumi，M· et al·，FEBS Lett，1 988，239，285·、小 泉誠及大塚榮子，蛋白質核酸酵素，199〇, 35, 219l.、

Koizumi，l et. Al·，Nucl Acid Res，1 989，17，7059 )。 又’髮夾型核糖酵素對於本發明之目的也是有用的。 該核糖酵素例如被發現在煙草環斑病毒（T〇bacc〇 ringspot Vlrus )之衛星 RNA 的負鏈（Buzayan，jm.， Nature，1 986，323，349)。有人報告從髮夾型核糖酵素也 能製作出標的專一性的RNA切斷核糖酵素（Kikuchi， Y.&Sasaki，N·，Nucl Acids Res，1991，19，6751•、菊 池洋，化學與生物，1 992,30，112·)。以該方式，藉由使用 核糖酵素，將編碼為上述硫酸軟骨素蛋白多糖之核蛋白 質、合成酵素、脫硫酸化酵素抑制蛋白質或硫酸基轉移酵 素之基因的轉錄產物以專一性的切斷，可以抑制該基因的

2125-8362-PF 28 200803897 表現。 内在性基因表現之抑制，尚可藉由ΜΑ干擾（RNA interference，以下略稱為「RNAi」），以具有與標的基因 序列具有相同或類似序列之雙股RNA來進行。 ， *由於近年來基因體計晝之完成，人類的全鹼基序列被 解項出來’許多疾病相關的基因被熱烈的鑑定，現在以特 定基因為標的之治療法 '新藥開發被積極地進行中。其中， 以發揮專-性轉錄後抑制效果之小干擾腿（伽u interferingRNA，siRNA)在基因治療上的應用受到注目。 RNAi為一種當雙股RNA(dsRNA)直接進入細胞，則會使帶有 2該dsRNA相同序列之基因表現受到抑制之方法，為目前 又到重視的方法。於哺乳動物細胞中’藉由使用短鏈 ds職（si讀），可誘導RNAi，則與基_除小鼠比較， 八有效果安定、實驗容易、費用便宜等許多優點。 由於.Ai效果而具有抑制作用的核酸，一般稱 3撕或处謝。_卜係藉由將具有與標的基因之顧 為相同序列所構成之有義RNA及與該有義RNA為互補的序 列所構成之反a RNA而構成的短鏈雙股RNA(以下 因：：」）導入：胞等，會專一且選擇性地結合於標的基 ^ ，而誘導破壞，並藉由將該標的基因切斷而以？择 政率抑制(inhibit)標的基因表現的現象。例如，如二 d_A導入細胞，則與該_為相同序列之基 心 到抑制（knock down) 〇 以哕方★ ΡΜΔ. At ,Α 4 Μ 文 )以4方式，⑽Αχ能夠抑制標的基 表現，因此就取代習知須雜且低效率之以相同重組進行

2l^5-8362-PF 29 200803897 基口破壞方法之簡易基因剔除一 v ^ J除方法而吕，或者應用於基因 >口療方法而言，受刹舌雜 .j. 又到重視。使用於RNAi之RNA，不一定必

需與編碼為上述硫酸軟骨辛I 年月京蛋白多糖之核蛋白質、合成酵 素、脫硫酸化料㈣蛋自質或硫酸基轉料素之基因或 δ亥基因之部分區域完全相同’但較佳為具有完全的相同性。 於3薦設計時，就乾而言，只要是編碼為上述硫酸 軟骨素蛋白多糖之核蛋白f、合成酵素、脫硫酸化酵素抑 制蛋白質或硫酸基轉移酵素之基因，則不㈣限定，任音、 區域都可以作為乾的候選者。例如可基於Versican基因之 驗基序列（序列編號：3)、⑽—！基因之驗基序列（序列編 说.45) C4ST-2基因之驗基序列（序列編號：47)、c4st_3 基因之驗基序列（序列編號：49)等製作。更具體而言，可將 該序列一部分的區域作為靶的候選者，例#，可基於

VerSiCan基因之驗基序列的—部分區域（序列編號：57)、 C4ST-1基因之驗基序列的一部分區域（序列編號：58)、 C4ST-2基因之驗基序列的一部分區域（序列編號：59)、 C4ST-3基因之驗基序列的—部分區域（序列編號：6〇)、 C6ST-1基因之鹼基序列的—部分區域(序列編號:61)、 C6ST-2基因之驗基序列的-部分區域（序列編號：62)、 GalNAc4ST-l基因之鹼基序列的一部分區域（序列編 號：63)、GalNAc4ST-2基因之鹼基序列的一部分區域（序列 編號：64) 、GALNAC4S-6ST基因之鹼基序列的一部分區域 (序列編號：65)等製作。 將siRNA導入細胞，例如可採用將於.體外（in vi1;r〇) 2125-8362-PF 30 200803897 口成之s i R N A連结；^暂雜Λ 口於貝體DNA而將該等導入細胞之方法 將2股RNA黏合（anneal)之方法等。 、又’上述2股隨分子，在此可為其中之一端為封閉 構l的刀子，例如，具有髮夾構造之（讣。财 被稱為短髮夾RNA(short hairpin謝），為因為單股的— 部分區域與其他區域形成互補鏈，而具有莖環(st.i〇〇p)

構le之RNA刀+。亦即’能於分子内形成雙股腿構造之 分子也包含於本發明之siRM。 C4ST 1 C4ST 2、C4ST-3等之表現藉由RNAi效果而抑制 的RNA(S1RNA) ’於以本說明書中具體顯示之腿序列（序 列編號:57〜65)為標的siRNA中’例如，即使是有j個或少 數RNA被加成或缺失之構造的雙股RNA，只要是具有抑制 編碼為上述硫酸軟骨素蛋白多糖之核蛋白質、合成酵素、 脫硫酸化酵素抑制蛋白質或硫酸基轉移酵素之基因表現的 功能’則包含於本發明之s i RNA。 又，就本發明之較佳態樣而言，為能將Versican、

為了題Ai(siRNA)使用的RNA，不需要與編碼為上述蛋 白質或該基因之部分區域完全同一（相同），但以具有完全 同一（相同）性為較佳。 A王 對於RNAi機制之細節，尚有不明瞭的部分，但有人卞 為是稱為DICER之酵素（RNase ΠΙ核酸分解酵素家族之2 種）與雙股RNA接觸，並將雙股題Α分解為 巧僻钓small interfering RNA或^1^八之小斷片。本發明之中， RNAi效果之雙股RNA，亦包含以該方式被dicer八二 刀解別的

2125-8362-PF 200803897 雙股RNA。亦即，即使為以原狀態的 的長物，由於能期待在細胞中分解：具效果 siRNA，IU此本發明之中雙股讓的長.NAi放果之 , .. 又不4寸別限定。 例如，將對應於編碼為上述硫酸 蛋白暂、人 > 说士 月素蛋白多糖之核 蛋貝曰成酵素、脫硫酸化酵素抑制蛋自併 =:基因的-全長或幾乎全長區域的長鏈；: ^ ^如預腦分解，可將該分解產物 之樂劑㈣。該分解產物中，期待包含具有咖效果之雔 股RNA分子（siRNA)。依照該方法， 又 J M不必特別選擇期待 具有撕效果之囊上的區域。亦即，二，:待 1 -、有RNAi效果之 本舍明之上述基因之mRNA上的區域 』匕4不一定需要精確地規 定。 本發明之上述「可藉由r A ; M s y 1 』猎由KNAl效果而抑制的雙股RNA」， 於該技術領域之人士 ’可基於以成為該雙股職之標的之 編碼為上述硫酸軟骨素蛋白多糖之核蛋白質、合成酵素、 •脫硫酸化酵素抑制蛋自質或硫酸基轉移酵素之基因的驗基 序列’而適當製作。舉一例來說，可基於序列編號:57之 鹼基序列，製作本發明之雙股RNA。亦即，基於序列編號：57 之鹼基序列，選擇為該序列之轉錄產物mRNA之任意連續 RNA區域，並製作與該區域對應之雙股RNA，對於該技術領 域之人士而言，可在通常的試作範圍内適當進行。又，從 該序列之轉錄產物mRNA，選擇具有較強RNAi效果之siRNA 序列，對於該技術領域之人士而言，可使用公知的方法適 當實施。又，如果其中一股被解明，則該技術領域之人士 2125-8362-PF 32 200803897 可以輕易地知道另一股（互補股）的鹼基序列。siRNA，該技 術領域之人士可使用市售的核酸合成機適當地製作。又， 對於所望RNA之合成，可使用一般的合成委託服務。 又，本發明之中，s i RNA不一定必需為對應於標的序 列的一組雙股RNA，也可為對應於包含標的序列之多組雙 股RNA的混合物。在此，作為與標的序列對應之核酸混合 物的siRNA，該技術領域之人士可使用市售的核酸合成機 及DICER酵素而適當製作，又，對於所望RNA合成，可利 用一般的合成委託服務。又.，本發明之siRNA，包含所謂 「混合 siRNA(cocktail siRNA)」。 疋所有的核苷酸為 又’本發明之siRNA，也可以不一 核糖核苷酸（RNA)。亦即，本發明中，構成3刪之】或多 數核糖核苦酉夂’可為對應的去氧核糖核普酸。該「對廣 :指雖然糖部分的構造不同，但是為相同的驗基種類(二 呤、鳥糞°票呤、胞嘴°定、胸腺哺唆（尿嘴咬））。例如，與具 有腺嗓呤之核糖核普酸對應之去氧核糖核普酸，係指具； 腺不V之去氧核糖核苷酸。又，前述「多數」不 較佳為指”〜5個左右的少數。 限疋’ •再者，本發明中可表現上述RNA之DNA(載體）， 抑制編碼為上述蛋白f之基因表現的化合物的^ :例如，本發明中可表現上述雙股·Α之DNA(载體） 為=將編碼為該雙股腿#中之—的股的嶋，及編石馬 結二1::: 一股的醜，以分別可表現之方式，連 促進子的構造的DNA。本發明之上述DNA，對於該技術

25-8362-PF 33 200803897 領域：人：，可依照一般的基因工程技術適當製作。更具 體而吕’ #由將編碼為本發明RNA #職適當插入公知的 各種表現載體，可製作本發明之表現载體。 又，本發明之表現抑制物 匕β稭由與編碼為上述 =軟骨素蛋白多糖之核蛋白質、合成酵素、脫硫酸化酵 素抑制蛋白質或硫酸基轉移酵素之基因的表現調節區域 例如’促進子區域。具體例’例如·為Μ—以之促進子區 編號：66表示的鹼基序列）結合，而抑制編碼為上 述石瓜酸軟骨素蛋白多糖之核蛋白質 鉍U 。 口成酵素、脫硫酸化 酵素抑制蛋白質或硫酸基轉移酵素之基因表現的化合物。 5亥化合物，可使用例如編碼為上述硫酸軟骨素蛋白多糖之 =白質、合成酵素、脫硫酸化酵素抑制蛋白質或硫酸基 =酵素之基因的促進子嶋斷片，藉由以與該鳩斷片 :合活性作為指標的筛選方法而取得。χ，該技術領域 卷對於所望化合物’判斷有無抑制編碼為上述硫酸 核蛋白質、合成酵素、脫硫酸化酵素抑 本白為或硫酸基轉移酵素的基因表現，可藉由公知的方 ’ ’例如報告基因分析(reportor assay)法等適當實施。 入处再者，本發明中可表現上述RNA之舰（載體），尚包 各月匕將編碼為上述硫酸軟骨素蛋白多糖之核蛋白質、合成 酵素、脫硫酸化酵素抑制I白新斗，W 4 辟下邳制蛋白貝或硫酸基轉移酵素的基因 表現予以抑制之化合物的較佳態樣，如，本發明 =述雙股鹽之繼（載體），為具有將編碼為該雙股腿 /、中之-的股的驗’及編碼為該雙股腿中另一股的

2l25-8362-PF 34 200803897 觀，以分別可表現之方式，連結於促進子的構造的腦。 本發明之上述MA，對於該技術領域之人士，可依奶一# 的基因工程技術適當製作。更具體而言，藉由將編：為： 發明應㈣Μ適當插入公知的各種表現載體 作 發明之表現載體。 下本 本發明之上述載體的較佳態樣，例如：表現能將

Wn、⑽-卜⑽_2、⑽_3等之表現藉由讓2 效果而抑制之题A(sip财）的載體。 與上述硫酸軟骨素蛋白多糖之核蛋.白質、合成酵素、 脫硫酸化酵素抑制化合物或硫酸基轉移酵素結合之抗體， 可依照该技術領域之人士公知 " 體，則例如可以下方法^ = 如果為多株抗 卜万法侍到。可將天然的上述蛋白質，或 就與GST融合的融合蛋白質而言在微生物中表現的重組 (recombinant)蛋白質，或並邻公 、U刀肽，對兔子等小動物免疫 並付到血清。將該等藉由硫安沉澱、蛋白f a、蛋 管柱、刪離子交換層析、偶合有上述硫酸軟骨素蛋白 糖之核蛋白貝、合成酵素、脫硫酸化酵素抑制化合物或硫 &基轉私酵素或合成肽之親和管柱而精製以調製。又:如 果為=株抗體，則例如可將上述硫酸軟骨素蛋白多糖之核σ 蛋白質、合成酵素、脫硫酸化酵素抑制化合物，或硫酸= 轉移酵素或其部分妝斟丨& & 飞瓜ϊ夂基 刀狀對小乳專小動物進行免疫，從該 摘出脾臟’並打碎將么的八 、 丁珥將細胞分離，將該細胞舆小鼠骨髓細胞 使用聚乙二醇等每筵^^ 二田5，從藉此產生的融合細胞人 瘤，咖心a)之中，選擇產生與上述硫酸軟骨素蛋(=

2125-8362-PF 35 200803897 =之核蛋白質、合成酵素、脫硫酸化酵素抑制蛋白* 酸基轉移酵素結合之抗體的選殖體 ^ < 龍内攸小鼠回收腹水，將得到的單株抗於 以例如硫安沉澱、蛋白質 體， 始麻』 Λ 资白貝G官柱、DEAE離子夺 、曰斤、偶“上述硫酸軟骨素蛋白多糖之核蛋 二酵素、脫硫酸化酵素抑制化合物，或硫酸基轉移酵： 合成肽的親和管柱而精製以調製。 素次 本發明之抗體，σ i η &丄… ,^ ^ /、要疋與本發明之上述硫酸軟骨素蛋 白多糖之核蛋白質、人忐祕 ”隻 或疏酸基轉移酵辛二ΓΓ 化酵素㈣化合物 .^时 ，、σ者，即不特別限定，除為上述多株 :人、早株抗體以外，也可為人類抗體、以基因重組製作 1型化抗體’更且為其抗體斷片或抗體修錦物。 作為取得抗原之感作抗原使用的本發明蛋白_， ㈣物種類不特別限制，較佳為哺乳動物，例如來自、於 /、或人類的蛋白質，尤佳為來自於人類的蛋白質。來自 2類的蛋白質，該技術領域之人士可使用本說明書揭示 的基因序列或胺基酸序列而適當取得。 月中’作為感作抗原使用之蛋白質，可為完整的 新：或者蛋白質之部分肽。蛋白質之部分肽，例如:蛋白 _ 2 土（Ν)末端斷片或羧基（c)端斷片。本說明書中，「抗 體」：指與蛋白質全長或斷片反應的抗體。 又除了將抗原對人類以外之動物免疫而得到上述融 Β瘤以外，可鸦：λ 丄 、類淋巴球，例如感染ΕΒ病毒的淋巴球， 蛋白質、蛋白質表現細胞或.其溶解物

2125-8362-PF 36 200803897 感作，並將感作淋巴球與來自於人類之具有永久分裂能力 的骨髓瘤細胞，例如ϋ266融合， 向传到融合瘤，該融合瘤 生產八有對蛋白質之結合活性的所望抗體。 入本發明之對抗上述硫酸軟骨素蛋白多糖之核蛋白質、 二硫酸化酵素抑制化合物或硫酸基轉移酵素之 抗體，猎由與該蛋白質社人 可期待抑制該蛋白質表現或 =效果。於將所得到之抗體以對人類投予為目的(抗體 用之情形’為使免疫原性降低，較佳為 或人類型化抗體。 枋疋再Ϊ ’本發明就能夠抑制上述硫酸軟骨素蛋白多糖之 財=、^成酵素、脫硫酸化酵素抑制化合物或硫酸基 =素之功能的物質而言，尚含有與上述硫酸軟骨素蛋 白多糖之核蛋白皙、人士级士 合成酵素、脫硫酸化酵素抑制化合物 或；丨L &L基轉移酵素結合之低旦所 該低分子量化合物，可為天”：貝(低分子化合物)。 該技術領域之人士二 的化合物。通常，為 物。 可使用公知的方法製造或取得的化合 二本發明之化合物，也可藉由後述篩選方法而取得。 核蛋白折、人^月^此夠抑制上述硫酸軟骨素蛋白多糖之 轉"I夺：Ϊ酵素、脫硫酸化酵素抑制蛋白質或硫酸基 現或功能的物質而言，例如對於上述硫酸軟骨 素蛋白多糖之核蛋白皙、人 白f 4 1 Μ 、 口成酵素、脫硫酸化酵素抑制蛋 體：二轉移酵素’具有優勢負面效應之性質的變異 勢負㈣蛋白f)。「對於上述硫酸軟骨素蛋 之核蛋白I合成酵素、脫琉酸化酵素抑制蛋白質或硫酸

2125-8362-PF 37 200803897 ;酵素’具有優勢負面效應之性質的該蛋白質變異 」广、指藉由使編碼.為對於硫酸軟骨素蛋白多糠之核蛋 :、:成酵素、脫硫酸化酵素抑制蛋白f或硫酸基轉移 =土因表現’而具有使内在性野生型蛋白質之活性消 像與野貝像-種優勢負面型蛋白質’例如 & rsican核蛋白質競爭與硫酸軟骨素之結合 的Versican核蛋白質變異體。 ::本發明中，抑制硫酸軟骨素蛋白多糖之產生或堆 織或細胞不特別限定，較佳為肝組織。 :制硫酸軟骨素蛋白多糖之產生或堆積的化合物，期 寺成為肝纖維化病症之治療或預防藥劑。在此，「治療或 預防」，對於呈現肝纖維 一 m哗化之、、且織或細胞，不一定必需要 -—的治療效果或預防效果，具有部分效果即可。 ;广即/巾肝纖維化病症只要是伴隨有肝纖維化之病 肝 不特別限定’較佳為例如：慢性肝炎、肝纖維症、 肝硬變 '肝衰竭、 # r , , Y、忮性肝病症。又，該等病症之合 也匕s在本發明之肝纖維化病症。 成因肝纖維化抑制劑，具有藉由抑制為肝纖維化 成因之硫酸軟骨辛I 夕 之祚用π ，蛋夕糖之產生或堆積’抑制肝纖維化 肝鑣❹^十 月之較“樣，例如提供以本發明之 抑制劑作為有效成分之慢性肝病症治療劑或者肝 硬變治療劑。 席d次者肝 又’本發明之’肝纖維化抑制劑」 維化治療劑」戋「肸输μ 丁兩肝纖 」&肝纖維化改善劑」等。又’本發明之中，

2125-8362-PF 38 200803897 w樂組成物 厂 治 「抑制劑」可表示為「醫藥品」

J 療用醫藥」等。 又’本發明之「治療」，包 3月匕將肝纖維化之發生預 先抑制之預防效果。又，對於肝_ 丁於肝纖維化表現細胞（組織）， 不疋限疋於具有完全的治療效果，a γ & 的情形。 果也可為具有部分效果 本發明之樂劑，可盘味裡與 ^ l、生理學上可容許的擔體、賦形劑 或稀釋劑專混合，作成醫藥組合物而以經口或非經口地投 予。經口劑可為顆粒劑、散劑、旋劑、膠囊劑、溶劑、乳 劑或懸浮劑等劑型。非經口劑， j &擇注射劑、點滴劑、 卜用樂诏、吸入劑或坐劑等劑 4 1 ，主射劑可表示皮下注射 背J、肌肉、/主射劑或鹿妒^肉、、士直 “ 心腹m射料。相錢，可表示經 冗投予劑或軟膏劑等。.以含有 々 有為主成分之本發明藥劑的方 式氣作上述劑型的製劑技術為公知的。 例#經口投予用的錠劑，可藉由在本發明的藥劑中 二賦形劑、朋散劑、結合劑及潤滑劑等並混合，進行壓 朋相，-般使用碳酸刪基甲基纖維素妈等。結合劑， ur伯膠、㈣甲基纖維素，或聚乙稀基^各咬酮。 e w，以滑石或硬脂酸鎂等為公知的。 於性Π本發明藥劑之錠劑’為了製作覆膜（_ k i n g )或腸 /合陡氣划，可以 产 A知的塗覆。塗覆劑，可使用乙基纖 維京或聚氧乙二醇等。 /主射4 ’可藉由將為主成分的本發明藥劑於適當

2125-8362-PF 39 200803897 的分散劑溶解、溶解或分散於分散劑而得到。藉由選擇分 散劑，，能成為水性溶劑及油性溶劑其中之一的劑型。製作 蒸餘水、生理食鹽水或林格氏液等作為分 ^ ’合剤可使用各種植物油或丙二醇等作為分散 需要亦可添加對經苯甲酸醋（P⑽ben)等保存劑。 注射月!ί中，可加入氯化納或葡萄糖等公知的等張劑。 再者，可添加氯化苯二甲烴銨咖㈣⑽龍㈣ 或普羅卡因鹽酸鹽（· ^Procaine hydrochloride)等止痛劑。 又’本發明之藥劑可藉由成為固體、液體或半固體化. 的組成物而作為外用劑。關於固體或液體組成物，可藉由 製作前述同樣的組成物而製成外用劑。半固體的組錢， 可在適當溶劑中視需要添加增黏劑而予以調製。溶劑，可 使用水、乙醇或聚乙二醇等。增黏劑，—般使用膨潤土、 聚乙烯醇、丙稀酸、甲基丙蝉酸或聚乙烯基吼㈣晒等。 該組成物中，可添加氯化苯二甲烴銨等保存劑。又，藉由 組合像可可脂之油性基材’或像纖維素衍生物之繼膠 基材作為擔體，能製作成坐劑。 本么明之藥劑於作為基因治療劑使用之情形，除了將 本發明藥劑以注射直接投予之方法以外，例如有投予來自 於重組有核酸之載體的方法。上述载體，例如:腺病毒載 體、腺病毒伴隨載體、疹病毒載體盧主 巧背戟股&病骨（vaccinia virus) 載體、反轉錄病毒載體、慢病毒（Lentivirus)載體等， 藉由使用该專病毒載體，能以良好效率投予。 又，本發明藥劑可導入於核糖體等鱗脂質小胞器，並

2125-8362-PF 40 200803897 扠予该小胞器。將保持有siRNA或shRNA之小胞器以微脂 粒感染法（iipofection)導入於既定的細胞。並且，將得到 之細胞對靜脈内、動脈内等全身投予。也可對肝纖維化組 織等進行局部投予。siRNA在體外呈現非常優異的專一性 、彔後抑制效果，但於體内由於血清中的核酸水解酶活性 而被迅速分解，使持續時間受限，因此希望開發更佳效果 的遞达系統。舉一例，〇chiya， T等於Nature ^ Med.,5:707-71 0, 1 999, Curr, Gene Ther., 1:31-52, 200 1 報告如果將為生體親合性材料的端膠原（Atei〇 —c〇ii叩⑷ ”戈此e形成複合體，則具有保護核酸免於受到活體中 刀解酵素之作用，為非常適當的的載體，但本發明 之藥劑導入方法不限於此等。 本t明之藥劑，係於安全的投予量範圍 類的甫礼動物，投予必要量（有效量）。本發明藥劑之投 予量，可考慮劑型種類、投予方法、患者年齡或體重、患 者症狀等，最後由醫師或獸醫師的判斷來適當決定。舉-例，雖然因年齡、性别、+ } 引 症狀、投予路徑、投予次數、劑 1有所不同’例如於腺病毒之情形’投予量為每曰卜欠 1(3〜1Q13個左右週的間隔投予。 又，為將siRNA或shRNA導入於目的組織或器官，可 使用市售的基因導入套 公司）。 ''' Adenoexpress:Clonetec 使用本發明樂劑之声 .^ 贯形’只要是表現肝纖維化之病症 其適用部位或病症種類 只不特別限定，例如適用於慢性肝

2125-8362-PF 41 200803897 火肝纖、，隹症肝硬變、肝衰竭、肝癌等對象。上述病症 可為與其他病症併發者。 又本务明之較佳態樣，關於含有軟骨素酶概作為 有效成分的肝纖維化抑制劑。 在此权月素酶ABC為分類在酵素編號EC4· 2. 2. 4的 解離酶（lyase)(軟月素酶ABC解離酶）。軟骨素酶取， 具有將含有1，4-/S-D-己糖醯胺（hexaminide)鍵結、 i，3m糖I基鍵結或u_a_L艾杜㈣基鍵結之多 糖’分解除去為含冑4_去氧1♦糖+醛基鍵結之二糖 的活性。軟骨素酶ABC’作用於硫酸軟骨1 A(軟骨素_4_ 硫酸)、硫酸軟骨素B(硫酸皮膚素），及硫酸軟骨素C(軟骨 素-6-硫酸）及透明質酸，並將該等分解。 、本發明使用之軟骨素酶胤，不予以限定，例如較佳 為來自於普$變型桿菌（PrQteus vui抓⑷等變型桿菌 (Proteus)f 細 n 來自於糞錢桿 g (Baeteroides stercoris)等擬桿菌（Bacter〇ides)屬細菌。本發明使用之 軟骨素酶ABC，較佳為來自於普通變型捍菌。本發明使用 之軟骨素酶ABC，可為藉由將普通變型桿菌办讨㈣ VUlgariS)之萃取物進行硫安沉澱及DEAE-纖維素層析予以 精製者（Yamagata，T. et al J Biol rh 仏，J. βι〇ΐ· Chem.，（1968) 243, P. 1523-1535)。本發明之來自於普通變型桿菌細_’ VUlgariS)的軟骨素酶ABC，例如：具有揭示於日本特開平 06-09讓之序列編號9的胺基酸序列的蛋白質，或於 DDBJ/EMBL/GenBank目際驗基序列資料庫（例如，可從雷

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Data Bank of Japan(DDBJ) 之 網 站 http: "www· ddb j. nig, ac· ip/Welcome-]存取）登 錄為登§己編號E 0 718 3之驗基序列所編碼的蛋白質。本發明 之軟骨素酶ABC，較佳為至少具有分解硫酸軟骨素A(軟骨 素-4-硫酸）、硫酸軟骨素B(硫酸皮膚素），及硫酸軟骨素 C(軟骨素-6-硫酸）及透明質酸之活性。 本發明之軟骨素酶ABC，可使用市售品，例如：軟骨素 酶ABC( Proteus vulgar is)(生化學工業（股）公司，東京， 曰本），或軟骨素酶 ABC(Proteus vulgaris)(Sigraa-Aldrich 公司，Saint Louis，Missouri， USA)。再者，本發明之軟骨素酶ABC，如果為該技術領域 之人士，可藉由將編碼為軟骨素酶(例如，具有登錄為 登δ己編號E 0 718 3之驗基序列）者，以重組法表現蛋白質， 而輕易地製造。關於重組法等分子生物學的慣用方法，例 如，詳述於 Molecular CloningrA Laboratory ^ Manual/Volume 3. Joseph Sambrook and David W Russell. 第 3 版 New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press， 2001 等。 ’ 含有本發明之軟骨素酶ABC作為有效成分的肝纖維化 抑制劑，能有效果地抑制肝組織的纖維化（肝纖維化。本發 月中 抑制纖維化」，意指使產生纖維化之組織中的纖 維化病變減少或消|，或延遲或阻止更進n纖維化進 行（抑制纖維化病變的增大）。 肝組織中纖維化的程度，可由該技術領域之人士以公

2125-8362-PF 43 200803897 知的各種方法予以評價。就最基本的方法而言，將肝活體 檢查之中所見纖維化，例如將肝活體檢查樣本以特殊染色 (苯胺藍、Tri-Chrome或銀染色等）強調的纖維化組織的影 像，予以組織學評價。纖維化之具體評價，例如可依照 K, etal. World J Gactroenterol. 31:4822-4826, 2005,

Hillebrandt S, et al. Nature Genetics 37:835-843, 2005,基於免疫組織學染色，將各試樣的肝纖維化水平以 纖維化度數表示來進行。又，也可使㈣明㈣、！型、 ⑴型及IV型等㈣蛋白、纖維芽細胞、巨㈣等肝纖維 :標記’卩更簡便地評價肝組織中之肝纖維化程度。雖然 間便，但視情形，4 了將肝纖維化程度靈敏地反應，可基 於血小板數計測進行檢查。藉由腹部超音波檢㈣肝影像 H也可大致預騎纖維化之程度。再者，也可使用基 於近年來EC〇Sence(EcoSence，France)公司所開發之瞬時 舞性圖（transient elastGgraphy)技術的非侵人性肝纖維 化測定法的測定機器（Fibro Scan5〇2等），評價肝纖維化 含有本發明之軟骨素酶胤作為有效成分的肝纖維 化㈣劑對於肝纖維化之抑制水平，可藉由基於該等方法 所知到之肝纖維化程度評價來決定即可。 含有本發明之軟骨素酶ABC作為有效成分的肝纖維化 =劑對於肝纖維化之抑制效果，尤佳為伴隨著肝組織中 父膠原蛋白之延長抑制、！型谬原蛋白之沉殿抑制、纖 、准牙、、、田月已之累積抑制、及巨嗔體之累積抑制之中至 種’更佳為全部都有。含有本發明之軟骨素酶ABC作^有

2125-8362-PF 44 200803897 效成分的肝纖維化抑制劑對於肝纖維化之抑制水平，可r 將該等抑制效果其中1種以上作為指標來決定。 本發明’係基於含有本發明之軟骨素酶ABC作為有效 成分的肝纖維化抑制劑的有效成分軟骨素酶ABC ’在如後 述實施例實證，發揮了非常高之肝纖維化抑制效果之全新 見解者。該軟骨素酶ABC之肝纖維化抑制效果，與其他軟 骨素酶比較，顯著地較優異。該軟骨素酶ABc之優異效果，

可認為是由於纖維化肝組織不易被軟骨素酶ac或軟骨素 酶B等所讀的錢軟骨素種類或量堆積，而料可首攻 被軟骨素酶ABC良好地切斷的原故。從近年來，據報告存 在有硫酸化程度不同或硫酸基加成位置不同等各種種類的 硫酸軟骨素，也可支持該假說的說服力。但是，本發明不 受限於該假說。 、本發明’藉由將含有本發明之軟骨素酶贏作為有效 成分的肝纖維化抑制劑添加於肝組織試樣而使反應，能減 低該肝組織中纖維化的程度。 又’本發明，藉由將含有本發明之軟骨素酶ABC作為 有效成分的肝纖維化抑制騎受試體投予，能有效果地抑 制受試體之肝臟組織的纖維化。含有軟骨素酶侃作為有 效成分的肝纖維化抑制劑的投予路徑不限^，較佳為非婉 口路徑。非經口路徑之較佳例，例如：靜脈内、動脈内、2 腔内'肝_、直腸内及皮下路徑。含有本發明之軟骨素 酶ABC作為有效成分的肝纖維化抑制劑，可進行全身投 予，也可局部投予（例如，對肝臟之纖維化組織直接投予。）

2125-8362-PF 45 200803897 骨素酶ABC作為有 ，而抑制受試體之 本發明，係關於將含有本發明之軟 效成分的肝纖維化抑制劑對受試體投予 肝臟纖維化的方法。 再者，由於本發明含有之軟骨素酶ABC作為有效成分 的肝纖維化抑制劑能有效果地抑制肝組織纖維化，為^ 療及預防肝纖維化病症(與肝組織之過度纖維化 症可有利地使用。本發明-中，較佳肝纖維病症之例； 限疋’ Vk性肝病症。慢性病症_般伴隨肝纖維化。本發 明中：忮性肝病症之具體例’例如:慢性肝炎(慢性B型肝 尺k !生C型肝炎等）、肝纖維症、肝硬變、肝衰竭、肝癌 等。本發明之含有軟骨素酶ABC作為有效成分的肝纖維化 ㈣劑’尤其fi治療及預防肝硬變為有用#。本發明中， 肝硬薆」，係指肝臟發生廣泛的纖維化，且喪失正常的 ^小葉f壤，改樣為異常構造（偽小葉/再生結節）之肝臟狀 悲。肝硬變，以其病因或偽小葉之特性等而分類為許多種。 又，像這種狀恶的肝臟稱為肝硬化。相對於此，「肝翁維 症」係指呈現異常纖維化之狀態，但是肝小葉沒有發生改 樣的狀態，一般稱為肝硬變的前階段。本發明中，肝硬變 之具體例，例如··病毒性肝硬變、寄生蟲性肝硬變、中毒性/ 肝硬變、營養不良性肝硬變、酒精性肝硬變、缺血性肝硬 變、肝硬化症、夏柯（charC〇t)肝硬變、托德（T〇dd)肝硬 4、原發性膽汁性肝硬變、續發性膽汁性肝硬變、單葉性 肝硬變、伙fe性非化膿性破壞性膽管炎轉移之肝硬變、閉 鎖性肝硬變、膽細管性肝硬化、膽汁性肝硬變、萎縮性肝 46

2125-8362-PF 200803897 硬變、壞錢性肝硬變、肝炎後肝硬變、結節性肝硬變、 混合型肝硬變、小結節性肝硬變、代償性肝硬變、非 性肝硬變、大結節性肝硬變、巾隔性肝硬變、特發性肝= 變、門脈周圍性肝硬變、門脈性肝硬變等，但不限於該等。 就本發明之含有軟骨素酶ABC作為有效成分的肝纖維 化抑制劑能夠投予之受試體，較佳為包含人類、家畜、气 物、實驗動物等哺乳動物。尤其，罹患肝纖維化病症.，例 如肝硬變或肝纖維症等之哺乳動物（患者），作為本發明之 :试體為尤佳的。其他實施形態，以未來容易轉變為肝硬 文之肝纖維化病症(例如，慢性非化膿性破壞性膽管炎等) 之甫礼動物（患者）作為受試體亦為較佳的。本發明中，藉 由對受試體投予本發明之含有軟骨素酶ABC作為有效成: 的肝纖維化抑制劑’能將肝臟之纖維化程度減低或延遲或 :止其邊維化之進行，其結果，能減低纖維化造成之肝臟 P早礙並將肝功能維持或改善為高水平，能夠治療或預防 肝纖維化病症。 本t月之3有以軟骨素酶ABC作為有效成分的肝纖維 化：制劑的投予量，該技術領域之人士可適當決定，一般 口以車人月素酶ABC之量，為每公斤體重1〇μ g〜lmg。 么本發明亦關於藉由以該方式對受試體（例如患者）投予 本’:月之S有以軟骨素酶ABC作為有效成分的肝纖維化抑 制劑’而治療或預防包含慢性肝病症之肝纖維化病症（尤其 是肝硬變）的方法。 本&明之含有以軟骨素酶ABC作為有效成分的肝纖維

2125-8362-PF 200803897 化抑制劑，可為軟骨素酶ABC以外，含有任意製藥上可容 °午之（求學上不活化的）擔體、賦形劑、及/或稀釋劑的醫藥 組成物。像這種擔體、賦形劑及/或稀釋劑以，例如：水 生理食鹽水、磷酸緩衝液、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯啶酮、 羧基乙烯基聚合物、海藻酸納、水溶性葡聚糖、果膠、三 仙踢、阿拉伯勝、明膠、壤脂、甘油、丙二醇、聚乙二醇、 二士 蠟、硬脂醇、硬脂酸、人類血清白蛋白、甘露 ;，6山二乳糖等’但不限於該等。本發明之醫藥組成 ::二有保存劑等添加劑。本發明之醫藥組成 J 3有其他樂理成分。 本發明之醫藥組成物，可以經口製劑或非絲 =供，較佳為以非經口製劑之形式提供。非：：之 g為液劑、懸浮劑等液體製劑，尤佳為注射劑。 又’本置明提供—種肝纖維 特徵為從受續巧掸士哪 丨w d <師選方法，其 …疋又口式4樣中選擇具有抑制硫酸 生或堆積之作用的物質。 方^白夕糖產 率地取得肝纖維化抑制劑^師選方法，能有效 本發明之篩選方、土 種肝纖維化抑制 之一作用的物質 方去之較佳態樣， 劑之師選方法，包含 匕3選擇以下（a)〜（d) 的步驟。 ) (a )硫酸軟骨素蛋 (b)硫酸軟骨素蛋 (c )硫酸軟骨素蛋 白多糖之分解促進作用 白多糖之合成抑制作用 白多糖之脫硫酸化作用

2125-8362-PF 48 200803897 (d)硫酸軟骨素蛋白多糖之硫酸化抑制作用 就該等共通的篩選基本原理，代表例例如包含以下步 驟： (1 )石瓜軟骨素蛋白& 士电,4» ώ ,ΓΑΓΛ 蛋白夕搪（CSPG)本身/或糖胺聚多糖 (GAG)鏈/或產生（合成）CSPG或GAG鍵之細胞 (2)受試化合物(例如，製藥企業具有之龐大化合 ^貞測硫酸軟骨素蛋白多糖（GSpG)之切斷剖面/硫酸 車人月素蛋白多糖（咖…游離糖胺聚多糖（gag)鏈之方法 "使用上述3種卫具。希望為將⑴與⑵於試管内或培 養皿上混合，並對其效果以⑻簡便地谓測的步驟。口 …以下’例示本發明筛選方法之態樣。X，以下記載之 態樣中，使用之硫酸軟骨去 孕月素蛋白多糖、合成酵素、脫硫酸 化酵素抑制化合物、硫酸基轉移酵素、分解促進酵辛、脫 硫酸化酵素之由來，例如有來自於人類、小鼠、大鼠等， 自於該等。硫酸軟骨素蛋白多糖之一部分可為糖 f h贫白貝#構成要素或其一部分，不特別限 定。 又，用於以下態樣之受試化合物，不特別限定，例如. Μ化合物'有機化合物、無機化合物、蛋白質、狀等單 合物’及化合物庫⑴brary)、基因庫之表現產物、細 胞卒取物、細胞培養上清'發酵微生物產物、海洋生物萃 取物、植物萃取物等。 /又，以下態樣中對受試化合物之「接觸」，通常係將 ““人月素蛋白多糖、其一部分、合成酵素、脫硫酸化酵

2125-8362-PF 49 200803897 素抑制化合物、硫酸基轉移酵素 化酵素與受試化合物混合以進行，但並、酵素或脫硫酸 可藉由將表現該等蛋白質或表現A法不限。例如， 合物接觸，以、隹― /、 邛匀的細胞與受試化 口物接觸，以進行上述「接觸」。 又，以下態樣中，「細胞 小i、女白笙夕4 A 」乏由來，例如來自於人類、 用本“之細胞，但不限於來自該等的細月包，也可利 表現各“中使用的蛋白質之方式進行形質轉換的大 腸菌、酵母菌等微生物細胞。 、 W如 表現硫酸軟骨素蛋 白夕糖之細胞」’可利用：表現内在性硫酸軟骨素蛋白多糖 基因，細胞’或被導人外來性硫酸軟骨素蛋白多糖基因並 表現該基因之細胞。表現外來性硫酸軟骨素蛋白多糖之美 因的細胞’通常可藉由將插人有硫酸軟骨素蛋白多糖㈣ 之表現載體導入寄主細胞來製作。該表現載體，可用一般 的基因工程技術製作。 又，以下記載中，「硫酸軟骨素蛋白多糖核蛋白質」， _例如如果為基質（matrix)型硫酸軟骨素蛋白多糖，為例如 aggrican、versican、neurocan、brevican 等核蛋白質， 又’如果為膜型硫酸軟骨素蛋白多糖，為例如Decorin、 Biglycan、Fibromodul in、PG-Lb 等核蛋白質。又，「合 成酵素」，例如：GalNAc4ST-1 、 GalNAc4ST-2 、 GALNAC4S-6ST 、 UA20ST 、 GalT-I 、 GalT-II 、 GlcAT-I 、

XylosylT等。又，「硫酸基轉移酵素」，例如：C4ST-1 (Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-0-sulfotransferase 1)、 2125-8362-PF 50 200803897 C4ST-2(Chondrotin D-N-acety1 gal actosamine-4-0-sulfotransferase 2)、 C4ST-3(Chondroi tin D-N-acetylgalactosamine-4-0-sulfotransferase 3)、 D4ST、C6ST-1、C6ST-2等。又，「分解促進酵素」，例如： ADAMTS-1 、 ADAMTS-4 、 ADAMTS-5 、 Chondroitinase ABC(ChABC) 、 Chondroitinase AC 、 Chondroitinase B 、

Calpain 等。又，「脫硫酸化酵素」，例 如：Chondroitin-4-sulfatase、Chondroitin-6-sulfatase 等。 本务明之篩選方法的態樣，例如包含選擇具有硫酸軟 骨素蛋白多糖之分解促進作用的化合物步驟的方法。本發 明之上述方法例如由包含以下步驟。 (a)使硫酸軟骨素蛋白多糖或其一部分與受試化合物 接觸之步驟 步 (b)測定硫酸軟骨素蛋白多糖或其一部分之存在量的 一（C)於雙試化合物非存在下測定之情形比較，選擇使存 在量降低之物質的步驟 八~上述方法之中，首先使硫酸軟骨素蛋白多糖或其一部 刀與文試化合物接觸。 :方& ’接著測定硫酸軟骨素*白多，或其一部分之 4子° 'Bj! ^ &面，該技術領域之人士可利用公知的方法 适仃。例如，At m

使用與硫酸軟骨素蛋白多糖或其一部分結合 2125-8362-PF 51 200803897 之經標§己的化合物或抗體’藉由測定桿吃 又，也可使用層析法或質量分析 二里可予以偵測。 太旅μ a 丨戌卞从读測。 " ，接著，與未接觸受試化人 加以比較，選擇使硫酸軟骨素蛋白:之情形（對照） 降低之化合物。使降低之化合，-部分存在量 藥劑。 、;肝纖維化治療的 對於評價(測定)受試化合物是否 進作用活性之方法，舉一簡單具體例如下。迹(a)分解促 關於上述（a)硫酸軟骨素 筛選法態樣： 蛋白夕搪之分解促進作用之 CS:二GAG而言，準備硫酸軟骨素·A)、C“、 CS-CX生化.工業公司，ICN公司、Si_等)、來 的蛋白多糖（BGN公司、ISL公司等）等， ^ ^ φ 乂 10/^g/inL 的遺 又、:、黎；96 井盤（依照 KawashimaHetai ;j· Bi〇i 如 277:12921-12930，2002 等已知方、、表、 · 各種…人板 ⑷方去)。於該盤的各井添加 各種又试化合物，於3rc反應2小時後，偵測cs_ga

變化。 J 广使測方法，例如WFA凝集素（紫藤凝集素）結合法為一 種簡便的方法。由於WFA凝集素會結合於cs_gag鏈之 GalNAc殘基，能簡便地偵測CS_GAG。受試化合物之陽性控 制組，使用軟骨素酶ABC。藉由添加軟骨素酶ABC，是因= 如果CS-GAG鏈分解，便不能與WFA凝集素結合，故利用此 原理。更具體而言，將FITC標記WFA凝集素（Εγ公司等）， 在混合受試化合物前後，添加於cs塗覆井，藉由CS〜G^

2125-8362-PF 52 200803897 分解，能將井中FITC螢光強度變化以螢光盤讀取儀或螢光 顯微鏡等偵測機器而極簡便地定量、數值化。於混合前後 螢光數值減少最多的化合物，可判定為符合本概念的新穎 的治療候選化合物。 又，其他偵測方法，可使用將（^乂^本身直接標記的 抗CS抗體（選殖體：CS56，生化學工業公司製）。與WFA凝 木素同樣，藉由將FITC標記抗CS抗體添加於cs塗覆井， 如果觀測螢光數值變化，則能於極短時間且簡便地進行大 _量篩選。 更#細的偵測方法，例如藉由以原狀態使用受試化合 物此合月後的盤，適用於sGAG Assay Kit(wlESLAB公司

製）、Sulphanated Glycosaminoglycans ELISA

Kit(FUNAK〇SHI公司製）等，將GAG含量精確定量、數值化 之方法。 更詳細地說，藉由於受試化合物混合前後的盤中添加 _2 AB(2 月女基笨甲醯胺，2 — amin〇benzamide)或 2-AP(2-胺 基吡啶，2-amin〇Pyridine;皆為LU])公司製等），將游離 GAG鏠之還原末端簡便地進行螢光標記，並將糖鏈之各型、 各型之含有率以HPLC、MALDI-MS、LC-MS等解析，能予以 更詳細的解析。為詳細檢查候選化合物特性之篩選的次一 階段的方法。 ^本發明篩選方法之其他態樣，例如：包含選擇具有硫酸 权骨素*白多糖之合成抑制作用《步驟的方法。本發明之 上述方法例如包含以下步驟。

2125-8362-PF 53 200803897 (a) 使表現硫酸軟骨素蛋白多糖或其一部分之細胞、該 細胞萃取物，或包含構成硫酸軟骨素蛋白多糖合成過程之 酵素及基貝專之物質群與受試化合物接觸之步驟 (b) 測定前述細胞、細胞萃取液或物質群中，硫酸軟骨 素蛋白多糖或其合成過程中之中間體合成量的步驟 (C )與未接觸受試化合物之情形比較，選擇使前述合成 量降低的化合物的步驟 上述方法中，首先使表現硫酸軟骨素蛋白多糖或其一 _部分之細胞、該細胞萃取物，或包含構成硫酸軟骨素蛋白 多糖合成過程之酵素及基質等之物質群與受試化合物接 觸。 接著，測定硫酸軟骨素蛋白多糖或其合成過程中之中 間體合成量。測定方面，該技術領域之人士可使用公知的 方法，例如，利用經過標記之抗體的方法、質量分析法、 層析法等而適當實施。 Φ 再者，與未接觸受試化合物（對照）之情形比較，選擇 使合成量降低（抑制）的化合物。使降低（抑制）之化合物成 為用於肝纖維化治療的藥劑。 對於評價（測定）受試化合物是否具有上述（b)合成抑 制作用之方法，舉一簡單具體例如下。 關於上述⑻琉酸軟骨素蛋白多糖之合成抑制作用之 篩選法態樣： 合成硫酸軟骨素之細胞、細胞株為該技術領域之人士 已知的。於人類，例如抽取健康者的微血管血後，藉由將

2125-8362-PF 54 200803897 單核球予以分離、培養之標準方法，進行1 6小時細胞培 養’產生硫酸軟骨素（Uhl in-Hansen L et a 1.，B1 ood 82 : 2880，1 993等）。又，更簡便地，將例如已知細胞株， 例如：纖維芽細胞株 NIH3T3(Phillip HA，etal. J. Biol.

Chem· 279:48640，2004等）、來自於腎小管之癌細胞株 ACHNCKawashima H et al., J. Biol. Chem. 277:12921 2 002)、來自於腎遠曲小管之細胞株MDCK(Borges FT et al

Kidney Int. 68:1 630， 2005等）、血管内皮細胞株 HUVEC(Schick BP et al·，Blood 97:449，2001 等）等多 種。於將像這種細胞培養一定時間的過程中，混合各種受 試化合物，能將培養前後CS-GAG量的變化以上述（a)之方 法簡便地數值化。抑制細胞培養後CS — GAG增加（亦即，反 映CS-GAG合成量）之化合物，可輕易地判定為滿足本概念 的治療候選化合物。 又，也可更有選擇性地，例如將GalNAc4ST—丨或 籲XylosylT等CS-GAG合成酵素之基因以周知的方法導入 細胞或L細胞，製作成隨時表現的細胞株。藉由使用像這 種隨時合成CS-GAG之細胞株，能夠更為清楚地判定治療候 選化合物。 Λ 本發明篩選方法的另-態樣，例如包含選擇具有硫酸 軟骨素蛋白多糖之脫硫酸化作用之物質的步驟。本發明之 上述方法例如包含以下步驟。 (a)使硫酸軟骨素蛋白多糖或其_部分與受試化合物 揍觸之步驟

2125-8362-PF 55 200803897 (b)測定硫酸軟骨素十 的量的㈣ 蛋白夕糖或其-部分受到硫酸化 (C)與党試化合物非存在下所測定之情形比 叉到硫酸化之量降低之物質的步驟 述方法中，f先使硫酸軟骨素蛋白多糖或其一部分 與5:试化合物接觸。 本發明接著，敎硫酸軟f素蛋白多糖或其—部分受 到硫酸化的量。須丨！定可/由1 則疋了使用该技術領域之人士所公知的方 :進行。例如使用與硫酸軟骨素蛋白多糖或其-部分中殘 !:脫硫酸化構造結合之經標記的化合物或抗體，藉由測 疋標纪量可予以偵測。又，也曰^ 等予則貞測。 用層析法或貝1分析法 本發明接著，與未接觸受試化合物之情形（對照）比 較’藥擇使賴料素蛋㈠㈣其1分之存在量降低 的化合物。使降低的化合物成為用於肝纖維化治療的藥劑。 對於評價（測定）受試化合物是否具有上述（c)脫㈣ 化作用活性之方法，舉一簡單具體例如下。 關於上述（C ) 硫酸敕骨去i &夕& 選法態樣： “素蛋b糖之脱錢作用之筛 基本上與上述⑷之方法同樣地，準備來自於人類之蛋 白多糖（BGN公司、ISL公司等），以的濃度塗覆 於 96 井盤（依照 KaWashima H et al;J· Bi〇i· 277:12921_1293ϋ，謹等已知方法）。於該盤的各井⑼ 各種受試化合物，於3rc反應2小時後，偵測cs—㈣的 2125-8362-PF 56 200803897 變化。 偵測方法，藉由脫硫酸化，使殘存於蛋白多糖之核蛋 白質側的脫硫酸化斷片的2糠構造，與抗蛋白多糖△ d丨4S 抗體（選殖體；2 -B- 6、認識4位受到硫酸化之部分）或抗蛋 白多糖△ d i 6S (選殖體；3-B-3、認識6位受到硫酸化之部 分，皆為生化學工業公司製）反應，能輕易地偵測受到硫酸 化之部分。因此’於混合培養前後的盤，使經過FI tc標記 •的2-B-6或3-B-3抗體反應，能簡便地偵測其螢光數值的 變化。使反應前後之螢光強度增加的化合物，可判定為較 能促進脫硫酸化的物質，能簡便地鑑定為滿足本概念之新 穎治療候選化合物。 本發明篩選方法的另一態樣，例如包含選擇具有硫酸 軟骨素蛋白多糖之硫酸化抑制作用之物質的步驟。本發明 之上缚方法例如包含以下步驟。 (a) 使表現硫酸軟骨素蛋白多糖或其一部分之細胞或 •細胞萃取液或包含構成硫酸軟骨素蛋白多糖之硫酸化過程 的酵素、基質等之物質群，與受試化合物接觸之步驟^ (b) 測定前述細胞、細胞萃取液或物質群中硫酸敕 蛋白多糖之硫酸化活性的步驟 人月” 選擇使前述活性 (c )與未接觸受試化合物之情形比較 降低之物質的步驟 上述方法中，首先使硫酸軟骨素蛋白多糖或复 八 與受試化合物接觸。 77 本發明接著，測定硫酸軟骨素蛋白多糖或其 為

2125-8362-PF 57 200803897 到硫酸化的量。測定可 ^ 用該技術領域之人士所公知的方 知、了例如使用與硫酸軟骨素蛋白多糖或其一部分之硫 馱化構造結合之經標記的化合物， 可予以偵測。又，也可傕用里 也了使用層析法或質量分析法等 測。 丨只 ^本發明接著，與未接觸受試化合物之情形（對照）比 車又’選擇使硫酸軟骨素蛋白多糖或其—部分之存在量降低 •的化合物。使降低的化合物成為用於肝纖維化治療的藥劑。 對於評價（測定）受試化合物是否具有上述（d)硫酸化 抑制活性之方法，舉一簡單具體例如下。 關於上述（d)硫酸軟骨素蛋白多糖之硫酸化抑用 之篩選法態樣： 促進硫酸軟骨素蛋白多糖之硫酸化的細胞、細胞株與 上壤(¢)1細胞、知聰楱為一藜的。於將像這種細胞株培養 -定時間的過程中’與各種受試化合物混合，例如以偵測 • 4位硫酸化之抗體（選殖體；LYm)或偵測6位硫酸化之抗 體（選瘦體；MC21C，皆為生化學工業公司製），.能簡便地進 行確認培養前後的硫酸化程度。也可使用螢光標記抗體， 比較培養前後的螢光數值，也可與上述（c)同樣地，於培養 月ίι後進行使用2-B-6或3-B-3抗體之偵測法。抑制培養後 硫酸化增加（LY111或M21C之螢光數值增加）的化合物，或 促進細胞培養後脫硫酸化進行（2-Β-6或3-Β-3之榮光數值 增加）的化合物，能輕易地判定為滿足本概念的治療候選化 合物。 2125-8362-PF 58 200803897 又，也可更有選擇性地，例如將C4ST-1或C6SH等 硫酸基轉移酵素之基因以周知的方法#人⑽細胞或^ 胞，製作成隨時表現的細胞株。藉由使用像這種隨時進行 硫酸基加成之細胞株’能夠更為清楚地判定治療候選化八 物。 。 本發明另-較佳態樣’為—種包含以下⑷〜⑷之步輝 的肝纖維化抑制劑的筛選方法，選擇使本發明之硫酸軟骨 素蛋白多糖之核蛋白質、人出祕主 。成酵素、脫硫酸化酵素抑制蛋 白質或硫酸基轉移酵素之基因表現水平降低之化合物 使硫酸軟骨素蛋白多糖之分解促進酵素或脫硫酸化酵素之 基因表現水平上升的化合物。 U)使編碼為表現硫酸軟骨素蛋白多耱之核蛋白質、合

成酵素'脫硫酸化酵素抑制蛋白質、硫酸基轉移酵素、I 解保酵素或脫硫酸化_夸夕| m k 刀 (b)測定前述細胞中基因表現量的步驟 (c )將該表現量|於辱叫 u化合物非存在下測定之情形 〔對肤）加以比較之步驟 ⑷於μ述基因為錢軟骨素蛋白多糖之核蛋白質、合 酵素1硫酸化酵素抑制蛋白f或硫酸基轉移酵素之: 形’選擇前述基因表旦 ' 見里與對照比較為降低之化合物，於 刖返基因為硫酸軟骨夸 化酵夸夕味 月素蛋白夕糖之分解促進酵素或脫硫酸 化合I 選擇前述基因表現量與對照比較為上升的

2125-8362-PF 59 200803897 糖之按去之中’百先使編碼為表現硫酸軟骨素蛋白多 合成酵素、脫硫酸化酵素抑制蛋白質、硫 =基2料、分解促進酵素或脫硫酸㈣素之基 胞，與受試化合物接觸。 著測定編碼為硫酸軟骨素蛋白多糖之核蛋白 二、Λ 脫硫酸化酵素抑制蛋白質、硫酸基轉移酵 4刀因#促進酵素或脫硫酸化酵素之基因的表現量。在此， 二表現量J包含轉錄及轉譯兩者。基因表現量之測定， 可利用该技術領域之人士所公知的方法進行。 取例Γ將峨從表現上述任-蛋白質之細胞以定法萃 取’亚貫施以該Α或f 4c , D…法等，可測定=:北方雜交法、RT-PCR法、 Α , ,. ΟΛ 土因之轉錄量。又，從表現編碼 :::壬蛋白質之基因的細胞中回收蛋白質區分，藉由 11轉i㈣之她ρ 等電泳法摘㈣測 :基=澤量。再者，使用對抗上述任一蛋白質之抗體， 貝施西方墨點法（West 譯量。使用於m Blottl叫）’也能敎基因的轉 即不特胸 偵測的抗體’只要是能偵測的抗體， ’ -ν’例如可利用單株抗體或多株抗體兩者。 “本發明，接著’與未接觸受試化合物之情形（對照）比 車父该基因之表現量。 本么月’接者’於前述基因為硫酸軟骨 核蛋白質、合成酸去^ ^ ㈡夕總< 棘#醢去 V “、石瓜酸化酵素抑制蛋白質或硫酸基 夕-形’選擇使前述基因表現量與對照比較為降 一 p 1之化合物。使降低（抑制）之化合物，成為用於肝

2125-8362-PF 60 200803897 b抑制之藥劑或肝纖維化治療的候選化合物。 去 於則述基因為硫酸軟骨素蛋白多糖之分解促進酵 為:脫硫酸化酵素之情形，選擇使前述基因表現量與對昭 成較為上升（增強）的化合物。使上升（增強）的化合物， = 肝纖維化抑制之藥劑或肝纖維化治療的候選化合 又’本發明篩選方 '兵 — 骨夸 心樣，為將使本發明硫酸軟 ►蛋白夕糖之核蛋白質、合成酵素、脫硫酸化酵素抑制 二::酸基轉移酵素之基因表現水平降低的化合物 之美^ 蛋自多糖之分解'促進酵素或脫硫酸化酵素 ==平上升的化合物，利用報告基因表現作= 才示而予以選擇的方法。本發明 勹扣 u)〜u)之步驟。 述方法例如包含以下 (a)像含有具有使編碼為硫酸軟骨n ώ & 白質、合成酵素、脫硫酸化酵素= 多糖之核蛋 酵素、分解促進酵素或脫硫酸化酵素之^的=基轉移 域與報告基因以功能性結合構造之m』的轉錄調節區 液’與受試化合物接觸之步驟。 的細胞或細胞萃取 =前述報告基因之表現水平的步驟 驟 未接觸受試化合物之情形（對幻加以比較之步 (d)於前述報告基因係與 多糖之核蛋白質、合成酵、、’、丸為硫酸軟骨素蛋白 硫酸基轉移酵素以功能性結合==酵㈣制蛋白質或 3 ^ ’選擇前述報告基因

2125-8362-PF 61 200803897 之表現水平與對照比較為降低之化合物，於前述報告基因 係與為2酸軟骨素蛋白多糖之分解促進酵素或脫疏酸化酵 素以功能性結合之情形，遗姐 選擇别述報告基因之表現水平盥 對照比較為上升的化合物。 〃 夕本方法之中’ f先使包含具有將編碼為硫酸軟骨素蛋 硫酸基轉移酵辛分解^酸去 酵素抑制蛋白質、 京”解促進酵素或脫硫酸化酵素之A因的 轉錄調節區域與報告基因以功能性結土 或細胞萃取液，與受試化合物接觸。〇 & 的細胞 在此’ 「功能性結合得 蛋白多糖之核蛋白質、人成酵=θ編碼為硫酸軟骨素 所心装# 、成酵素、脫硫酸化酵素抑制蛋白 素、分解促㈣素或脫硫酸化酵辛之灵 方式，__素蛋:多：=告基因表現之 素、脫硫酸化酵素抑制蛋白 '蛋白質、合成酵 進酵素或脫硫酸化酵素之基二轉移酵素、分解促 結合。因此，於報告基因已結合區域與報告基因 產物形成融合蛋白質之情形，只要是與其他基因 軟骨素蛋白多糖之核蛋白質、人、此藉由在編碼為硫酸 制蛋白質、硫酸基轉移酵素、^酵素、脫硫酸化酵素抑 素之基因的基因調節區域結合^ 進酵素或脫疏酸化酵 蛋白表現，則包含於上述「功能性結=’而能誘導該融合 為硫酸軟骨素蛋白多糖之核蛋白所、° 口」之意。基於編碼 酵素抑制蛋白質、硫酸基 :、合成酵素、脫硫酸化 ㈣素 '分解促進酵素或脫硫

2125-8362-PF 62 200803897 酸化酵素之基因的 η ί 鹼基序列，該技術領域之人士，可 以用周知的方法取得 ^ τ 蛋白多^ 土 _中所存在的編碼為硫酸軟骨素 贫臼夕搪之核蛋白質、入 ^ ^ 質、口成酵素、脫硫酸化酵素抑制蛋白 基轉移酵素、分解促進酵素 其 因的轉錄調節區域。 — 夂％呼|之基 本方法使用之報告基因，σ 不特別限定，例如谓/因月:夠偵測其表現即可， rin 、 土口、lacZ基因、發光酶 (uciferase)基因及 gfp 美 θ 笙「a '酸軟骨素I白夕 土 。匕含具有將編碼為硫 抑=! 核蛋白質、合成酵素、脫硫酸化酵素 抑制蛋白質、硫酸基轉移酵素、 、畔京 酵素之基因的轉錄調節區域 力^脫硫酸化 之舰的細胞」，例如導入有已:基=功月u生結合構造 有已插入像這種構造之韵雜沾 該技㈣域之人士周知的方法 二電脈衝穿孔法、微脂粒感染法、微注射法等實施。 、具有將編碼為硫酸軟骨素蛋白多糖之核蛋人 成酵素、脫硫酸化酵素抑制蛋白質、硫酸夸二 ==或脫硫酸化酵素之基因的轉錄調二 :於性結合構造之讓的細胞」，亦包含該構造插 ^色體的細胞。對染色體插入_構造，可使用該技 術領域之人士一般使用的方法 導入法進行。 u如利用相同重組的基因 「包含具有將編碼為硫酸軟骨素蛋白多糖之核蛋白 質、合成酵素、脫硫酸化酵素抑制蛋白質、硫酸基轉移酵

2125-8362-PF 63 200803897 素、分解促進酵素或脫硫酸化酵素之基因的轉錄調節區域 與報告基因以功能性結合構造之DNA的細胞萃取液」，例 如：在市售試管内轉錄轉譯套組所含的細胞萃取液中，添加 具有編碼為硫酸軟骨素蛋白多糖之核蛋白f、合成酵^、σ 脫硫酸化酵素抑制蛋白質或硫酸基轉移酵素之基因的轉錄 調節區域與報告基因以功能性結合構造之驗者。 、 在此，「接觸」係於「包含具有將編碼為硫酸軟骨音 :白多糖之核蛋白f、合成酵素、脫硫酸化酵素抑制蛋白 質、硫酸基轉移酵素、分解促進酵素或脫硫酸化酵素之其 因的轉錄調節區域與報告基因以功能性結合構造之職= 細胞」的培養液中添加受試化合物，或也可藉由將受試化 =物添加於包含該腿之上述市售細胞萃取液以進行。受 試化合物為蛋白質之情形，例如可藉由將表現該蛋白質之 DNA霧露麗寒細參導入以燦行。 ' 本方法中’接著，測定該報告基因之表現水平。報告

基因之表現水平，可視該報告基 ..L 口之種類，由該技術領域 之人士以公知的方法測定。 灼如5亥報告基因為CAT基因 < It形’可藉由測定該其 疋亥基因產物所致之綠黴素 =咖P—丨）乙酸化，而測定報告基因的表現量。 於報告基因為lacZ基因之情 ffl 了猎由偵測該基因表現產 ::;觸=用所致色素化合物之呈色，又，發光酶基因之 :榮 4錢因表現產物之觸酶作用所致螢光化合物 <愛先，又，為GFP基因之悟拟 π仏 螢央之障形，可偵測GFP蛋白質所致 愛九’而測定報告基因的表現量。

2125-8362-PF 64 200803897 本方法，接者，將所測定之報告基因表現水平， 叉試化合物非存在下測定之情形(對照)加以比較。、 酸軟=!:接著，於前述報告基因係與前述基因為破 女月素蛋白多糖之核蛋白質、合成酵素、脫硫酸化酵素 、、 付矽呷|以功能性結合之情形，選擇 人:】述報告基因之表現水平與對照比較為降低(抑制)之化 二：，、使降低(抑制)之化合物，成為用於肝纖維化抑制之 樂蜊或用於肝纖維化治療的候選化合物。 述報σ基111係與為硫酸軟骨素蛋自多糖之分 =進酵素或脫硫酸化酵素以功級結合之情形，選擇使 :述報告基因之表現水平與對照比較為上升(增強)的化合 南使上升（增強）的化合物’成為用於肝纖維化抑制之藥 j或用於肝纖維化治療的候選化合物。 ，錢m射㈣㈣轉維化抑制劑，較佳 纖維化病症之治療用或預防用。 ^本發明提供包含心實施本發明㈣方法用之 種樂劑、試藥等之套組。 合 本發”套組，❹可彳林發明之上述各種試藥之 :二實施筛選方法予以適當選擇。例如本發明之套组， 發明之賴軟骨素蛋自多糠作為構成要素。本發 ，等：：可進一步包含本發明方法使用之各種試藥、容 Γ丄例如，可適當包含抗硫酸軟骨素蛋白多糖抗體、探 試藥、細胞、培養液、對照樣本、緩衝液、 。己載有使用方法之說明書等。

2125-8362-PF 65 200803897 本發明之較佳態樣， 法，包含偵測是否抑制τ 肝纖維化抑制劑之篩選方 積的步驟。因此二:酸軟骨素蛋白多糖之產生或堆 素蛋白多糖侦物以用二中對=可包含在硫酸軟骨 白多糖之基因的探針或用、仏編碼為硫酸軟骨素蛋 jr ( · . ^ /以將该基因之任意區域放大的引

子（primer)等寡核苷酴，+ w , 八幻W 碰或認識硫酸軟骨素蛋白多糖之枋 體（抗硫酸軟骨素蛋白多糖 A/. ^ 體），作為本發明之抗肝纖維 化抑制劑師選用套組的構成要素。 上述寡核苦酸，例如與本發明之核蛋白質基 因的DNA專一性雜$去。α # 「 、 寻庄雜乂者。此處，「專一性雜交」，係指於 通常的雜交條件下’較佳為嚴格雜交條件下（例如，

Sambrook f > Molecular Cloning, Cold Spring Harbour

Laboratory Press，NewY〇rk，邶八，第卩版“⑽記載的 絛件）’见顧著赢皇鴒碼為其他胥白質之DNA產生交互雜 父。如果能專一性的雜交，則該寡核苷酸不需要與本發明 之Vers i can核蛋白質基因的驗基序列完全互補。 本發明中’雜交的條件，例如：「2xssc、0. 1%SDS、 50 C」、「2xSSC、0· USDS、42°C」、「lxSSC、0· 1%SDS、 37°C」，更嚴格條件，例如r 2XSSC、0· 1%SDS、65°C」、 「0· 5xSSC、〇· 1%SDS、42X：」及「0· 2xSSC、0· 1%SDS、65°C」

等之條件。更詳細地說，就使用 Rapid-hyb buifer(Amersham Life Science)之方法而言，可於 68°C 保持30分鐘以上進行雜交後，添加探針於68°C保持1小 時以後形成雜交物，之後於2xSSC、0. 1%SDS中，於室溫清 2125-8362-PF 66 200803897 洗20分鐘3次，接著，於lxSSC、〇1%SDs中，在37亡進 行20分鐘之清洗3次，最後，於lxSSC、〇 i%s此中，在 5〇°C進行20分鐘之清洗2次。此外，例如，於吻匕

Hybridization Soluti〇n(CLONTECH)中，於 55t：進行 3〇 分鐘以上預雜交後，添加標記探針，於37〜55它溫育1小 時以上，於2xSSC、0.USDS中，於室溫清洗2〇分鐘3次， 於以^觸…在咖進行別分鐘之清幻次。 在此，藉由將預雜交、雜交或第2次清洗時的溫度設定為 較高，能成為更為嚴格的條件。例如，可將預雜交及雜交 溫度設為6『C ’更嚴格之條件定為阶。如果為該技術領 域之人士，在像這種緩衝液之鹽濃度、溫度等條件以外， 可考量探針濃度、探針長声 ^ 又彳木針鹼基序列構成、反應時 間等其他條件予以設定條件。 錢趁f藥，可用於上堞本#明之筛選用套組之探針 或引子。該寡核苷酸作為 較佳為17b = 吏用之其長度通常為 “ 為叫3_。引子只要能將上述本發 明中之基因的職至少-部分放大即可，不特別限制。 、本，勺又明提供—種肝纖維化病症之治療或預防方 驟。匕3 :發明之藥劑對個體（例如，患者等）投予的步 療對象的個體’只要能發生肝纖 、、、：:乂 4勿即可，不特別限定，較佳為人類。 對個體的投予，一 .+ 所公知之方法，，又广，可利用該技術領域之人士 j如：動脈内注射、靜脈内注射、皮下注射

2125-8362-PF 67 200803897 等。投予量依照患者之體重或年齡、投予方式等而有所變 動，如果為該技術領域之人士（醫師、獸醫師、藥劑師等）， 可適當選擇適當的投予量。 再者，本發明關於本發明之藥劑於肝纖維化抑制劑製 造之使用。 又’本說明書中所有的先前技術文獻，引入於本說明 書中作為參考。 實施例 以下用實施例對本發明更具體地說明。惟，本發明之 技術範圍不限於該等實施例。 宜·^ 1:硫_酸軟骨素蛋白多糖 模_式中）表現的增加 於該實施例中，就慢性纖維化病症模式小鼠之典型 例’ ilMJi惠你磷（CC10所衍秦的小鼠肝填維症模式， 製作小鼠肝硬變模式，並以免疫組織學染色法檢查蛋白多 _糖的堆積狀態。該小鼠肝纖維病症模式的再現性優異，也 廣泛使用於肝硬變模式的實驗系（Sakaida L et al

Hepatology 40:1304-1311， 2004)。 首先，對C57BL/6JcL小鼠（雌，5〜6週齡，日本Clea 公司製），將四氯化碳（25/zl/l〇〇g體重；Sigma-Aldrich公 司製），每週2次共4週（8次）進行腹腔内注射，誘發肝纖 維症。再將四氯化碳以每週2次共2週追加投予（總計12 次），誘導肝硬變。將被誘導肝硬變的小鼠宰殺，並採取其 肝臟（肝硬化）。另一方面，於對照實驗，使用從未進行四

2125-8362-PF 68 200803897 氯化碳投予之同週齡C57BL/6JcL小鼠（雌，日本ciea公司 製）採取的肝臟（正常肝）。 將所採取肝臟之第2葉一部分包埋於冷凍用包埋劑 0CT組合物（Miles公司製），以液態氮製作冷凍塊體。以冷 凍組織切片機（Cryostat，Micr〇m公司製）從該冷凍塊體 製作厚度6//m的切片。 將知到的切片用丙酮（和光公司製）固定i 〇分鐘後，以 磷酸缓衝液清洗，再添加作為一次抗體之抗硫酸軟骨素蛋 白多糖（CSPG)抗體（選殖體CS56、小鼠單株抗體、1〇#g/mL; 生化學工業公司製）、抗軟骨素-4-硫酸蛋白多糖（C4SPG) 抗體（選殖體LY111、小鼠單株抗體、1〇// g/mL;生化學工 業公司製）、抗軟骨素-6-硫酸蛋白多糖（C6spG)抗體（選殖 體MC21C、小鼠單株抗體、1〇 " g/mL;生化學工業公司製）， 或抗硫釀乙醯肝素葦白多糖（HSPG)/Perl ecan抗尊（大鼠單 株抗體、10/zg/mL;大日本製藥公司製），於室溫使反應1 籲小犄。接著，使用 HistoFine mouse stain kitOiichirei 公司製；於對抗小鼠單株抗體而使用），或過氧化酶標記抗 大鼠IgG(Bi〇source公司製；1:200稀釋；對抗大鼠單株抗 體使用）進行二次抗體反應後，添加DAB基質么1 Θ 。以光學顯微鏡（Le i ka公司製）觀察試樣，確認有以 才示色"5虎可見化之抗體結合。 知到之肝組織的免疫染色像之例子如圖1所示。圖1 中’左侧的列表示正常肝、右側的列表示肝硬化。正常肝， 亦即未處置之同週齡小鼠的肝臟，在CSPG(最上排）、 2125-8362-PF 69 200803897 C4SPG(第：排），於肝f狀隙腦。⑷内被 認為有稍許的陽性信號，但於C6spG(第三排）為全未铺測 到另方面，肝硬化，亦即以四氯化碳誘導肝硬變狀之 纖雉化的肝臟，於CSPG(最上排）、C4spG(第二排）、C6sp(j(第 三排）皆在竇狀隙中心’與正f肝比較，顯示廣泛地有信號 強度顯著增強的陽性信號。關於抗硫酸乙醯肝素蛋白多糖 (HSPG)，於正常肝在竇狀隙中心偵測到強的陽性信號，但 是即使為肝硬化，信號強度或分布也不認為有大的差異。

因此，本肝硬變模式，解明肝臟内CSPG量之增加，比起 HSPG為顯著的。 小鼠肝廍化姥，砧夂, 軟骨素的切斷能力 本貝施例，探时各楂形式的軟骨素酶對於肝硬化組織 切片中嚴墓魏.熬骨意（ς就g)的切斷能力。如以下所示，將 肝硬化的組織切片以軟骨素酶處理，於該酵素反應結束 _後，將殘存於組織切片的CSPG，亦即以軟骨素酶處理未切 斷部分的CSPG，以免疫染色法偵測。 首先，對C57BL/6JcL小鼠（雌，5〜6週齡，日本Clea 公司製），將四氯化碳（25/z l/100g體重；Sigma—Aldrich公 司製）’母週2次共4週（8次）進行腹腔内注射，誘發肝纖 維症。再將四氯化碳以每週2次共2週追加投予（總計12 次），誘導肝硬變。將被誘導肝硬變的小鼠宰殺，並採取其 肝臟（肝硬化）。 將所採取肝臟之弟2葉一部分包埋於冷束用包埋劑 2125-8362-PF 70 200803897 OCT組合物（M i 1 es公司製），以液態氮製作冷柬塊體。以冷 /東組織切片機（Cryostat，Microm公司製）從該冷凍塊體 製作厚度6 /z m的切片。 將得到的切片用丙酮（和光公司製）固定〗〇分鐘後，以 磷酸緩衝液清洗，接著，於Tris-HCL緩衝液（2〇mM，pH8. 〇) 中，於3 7 C溫育15分鐘後，對每一切片添加1 〇 〇 # l軟骨 素酶ABC溶液（生化學工業公司製；5u/mL)、軟骨素酶AC溶 _液（生化學工業公司製；5U/mL)、軟骨素酶β溶液（生化學工 業公司製；5U/mL)或僅有緩衝液（軟骨素酶（―））而將切片覆 蓋，再於37°C溫育1小時。 酵素反應結束後，添加抗CSPG抗體（選殖體CS56、小 鼠單株抗體、10# g/mL;生化學工業公司製），於室溫反應 1 小％ 後，使用 HistoFine mouse stain kit(Nichirei 么、 7義）鹿展赛’再添加D AB棊質（N i ch i r e i公47農）。以光 學顯微鏡（Leika公司製）觀察試樣，確認有以棕色信號可 見化之抗體結合。 結果如圖2所示（倍率200倍）。僅以緩衝液處理的切 片（亦即未進行酵素處理的切片），cspG陽性信號（棕色）於 廣泛範圍以與圖丨之肝硬化為同程度之顯著高強度被偵測 到（圖2;最左；軟骨素酶（_))。另一方面，以軟骨素酶ac 處理的切片，與軟骨素酶（-)的切片比較，CSPG陽性信號 減弱，陽性面積也減少（圖2;左起算第2圖；軟骨素酶 AO。此表示軟骨素酶AC確實能將堆積於肝硬化組織中的 CSPG切斷。但是，以軟骨素酶仏處理之該切片，仍偵測

2125-8362-PF 71 200803897 到未完全切斷而殘存的CSPG。又，以軟骨素酶B處理之切 片，與以軟骨素酶Ac處理之切片比較，CSPG暢性信號更 為減弱，陽性面積也更減少。由此可知軟骨素酶B能將堆 牙貝於肝硬化組織中的CSPG切斷更多。但是以軟骨素酶B處 理之切片，沿著偽小葉構造仍能偵測到殘存的cspG。以上 所不，以权骨素酶AC或β處理，不能將沉澱於高度纖維化 之肝硬化中的CSPG完全切斷。 相對於泫等結果，經過軟骨素酶ABC處理的該切片， 幾乎未偵測到CSPG陽性信號（棕色），與軟骨素酶（_)之切 片比較’明顯地表示CSPG消失。亦艮p，軟骨素酶ABC，能 將沉澱於像肝硬變之高度纖維化病灶的CSPG以非常良好 的效率切斷。 於小鼠肝硬# 槿 式土 1 對C57BL/6JcL小鼠（雌，5〜6週齡，日本ciea公司製）， _將四氯化碳（25//1/1〇〇2體重；以2脱一八1(11^吮公司製），每 週2次共4週（8次）進行腹腔内注射，誘發肝纖維症。再 將四氯化碳以每週2次共2週追加投予（總計12次）。 於追加投予之前，對於小鼠，預先將已注入軟骨素酶 ABC(Chase ABC)(20U/mL;Sigma-Aidrich 公司製）、軟骨素 酶 AC(ChaSeAC)(20U/mL;Sigma-Aldrich 公司製）、軟骨素 酶 B(Chase B)(20U/mL;Sigma-Aidrich 公司製）或僅有 pBs 各150/z L·的Alzette滲透壓唧筒（MURACH〇u機器公司製）， 以手術埋在腹腔内。將進行了該處置的小鼠群，各命名為 2125-8362-PF 72 200803897

Chase ABC 群、Chase ΑΓ 淼 ru ^ dse札群、Chase B群及對照群。 該處置，各群皆為在接受2 q由 接又Z週期間之四氯化碳追加投 間，從埋在體内的哪筒一直注入定量的液體。 ^ 於四氯化碳之ϋ加投予結束後，將各群的各小 殺1採取肝臟，從採㈣肝臟，以與實調〗同樣的方 式製作冷凍切片的樣本，進行免疫組織學的解析。 該解析，係將作為-次抗體之兔抗小氣ΙΠ型膠原蛋 白抗體（1..25G稀釋；如心取公司製）添加於試樣，於室 ’皿使反應1小時。接著，添加作為二次抗體之驗性碟解酶 才不圮抗兔 IgG(l:2〇0 稀釋；jacks〇n immun〇Research 公司 製）於至溫再反應3 0分鐘後，添加鹼性磷解酶呈色基質 (Vector Red; Vector Laboratory 公司製）。以光學顯微鏡 (Leika公司製）觀察試樣，確認有紅色信號可見化的抗 舍。 所得到肝組織的免疫染色像之例如圖3所示。對照 群，以兔抗小鼠III型膠原蛋白抗體所偵測到的Ιπ型膠 原蛋白纖維，不僅在一般竇狀隙，還從中心靜脈連續延長 至門脈，一部分形成偽小葉（圖3之左部）。此為肝硬變的 典型影像。相對於此，Chase ABC酵素群，I π型膠原蛋白 的伸長很輕微（圖3之右部）。 基於上述進行的免疫組織學染色，將各試樣的肝纖維 化程度依照已知報告（Dai K, et al· World j Gactroenter〇1_ 31:4822-4826, 2005; Hillebrandt S, et al. Nature

Genetics 37:835-843，2005)，評價纖維化度數。纖維化 2125-8362-PF 73 200803897 度數之評價基準如下。〇度：正常、1度：中心靜脈起有少量 的膠原蛋白伸長、2度：中心靜脈起有明白的膠原蛋白伸 長，但為未包圍肝臟全體之程度、3度：中心靜脈起有明 白的膠原蛋白伸長，為包圍肝臟全體之程度、4度：肝臟全 體有瀰没性的膠原蛋白伸長，形成偽小葉。 結果如圖4 °各棒代表於各群之纖維化度數的平均值土 標準偏差。如圖4所示，對照群為5. 3i〇· 4(η = 6)，相對於 此，Chase ABC 酵素群（2· 〇土〇· 6(n=6)、Chase AC 酵素群 (2· 9i_0· 7(n=6)、Chase B 酵素群（2· 6±0· 5(n = 6)。如果與 對照群比較，Chase ABC酵素群（ρ=〇· 00018, t檢定）及Chase B酵素群（p=0. 00 29，t檢定）於統計學上纖維化顯著減輕。 尤其，Chase ABC酵素群，與chase AC酵素群（p = 〇. 〇〇19， t檢定）或Chase B酵素群（ρ = 〇· 018，t檢定）比較，在統計 士上.攀維化抑制效果顯著較咼。另一方面，μ酵章 群與Chase B酵素群比較，統計學上未認為有顯著差異 (Ρ = 〇· 15，t檢定）。又，對於從未投予四氯化碳的正常小 鼠採取的正常肝也進行同樣的免疫組織學解析，纖維化度 數為0。如上所述，軟骨素酶ABC之投予，顯示於臨床上 發揮優異的肝纖維化抑制效果。 實^例4:軟肝硬變掇 式土型膠原蛋白沉殿抑制效杲 型膠原蛋白量之增 要的因子。因此， 試樣，進行I型膠 於含有肝硬變之纖維化病症中，I 加，被認為是形成病變構成纖維中最重 對於實施例3製作的各群由來的肝組織

2125-8362-PF 74 200803897 原蛋白質免疫染色實驗。 於實施例3製作之對照群、Chase ABC酵素群、chase AC酵素群及Chase B酵素群由來之切片試樣，添加作為一 次抗體的兔抗小鼠I型膠原蛋白抗體（1:1〇〇稀 釋；8〇〇1^1&11(1公司製），於室溫使反應1小時。接著，於試 樣中添加作為二次抗體之鹼性磷解酶標記抗兔IgG(丨：2〇〇 稀釋·’ Jackson I_unoResearch公司製），於室溫再反應3〇 鲁分鐘後，添加鹼性磷解酶呈色基質（Vect〇r Red; Vect〇r Laboratory公司製）。於光學顯微鏡（Leika公司製）下觀察 試樣’確認有紅色信號可見化的抗體結合。 得到之肝組織的免疫染色像之例如圖5所示。如圖5， 對…、群&著偽小葉用構造明確地偵測到I型膠原蛋白，相 對於此，Chase ABC酵素群僅有稍許散見。 日基翁上述進m療組縳學染色，將丨型膠原蛋白的 陽性面積，使用WinROOF影像解析軟體（Win R〇〇F;三谷商 事（股）公司）計算。在橫跨肝臟切片上至少i5mm2之範圍進 行測量，結果以相對於肝臟面積之陽性面積率（％)表示。結 果如圖6所示。如圖6，1¾贩盾疋人1 « 1虫膠原蛋白的陽性面積率（％)， 於對照群為5· 16 + 0· 98%，相對於士 认 — 邳對於此，於Chase ABC酵素群 為 1 · 61土〇· 29%，Chase AC 酵幸雜盔 j Qnin 1Ωη

呼京群為 4. 30±_0. 18%，Chase B 酵素群為3.38 + 0· 50%。與對昭雜知LU > 一 〃 τ “、、鮮相比較，所有的酵素群中， I型膠原蛋白之陽性面積率 顯者差異減少（Chase ABC 酵素群：Ρ = 0· 0018、Chase AC酸参被 Λ 礼酵素群：Ρ = 〇·〇23、Chase Β酵 素群：Ρ = 0· 0059;皆為t檢定）。尤直 兀其，Chase ABC酵素群，

2125-8362-PF 75 200803897 與Chase AC酵素群及chase B酵素群比較，！ 的陽性面積率〇〇在統計學上顯著地減少（與ehaseA^ 群之顯者差異：Ρ=〇. _8、與Chase β酵素群 莫 異㈣，皆為t檢定），表示！型膠原蛋白沉殿抑= 果極商。另-方面，Chase AC酵素群及.奸B酵: 較，在統計學上不認為有顯著差異（㈣肩8，士檢定 對於從未投予四氯化碳之正常小鼠採取之正常肝也’ 樣的解析’ ί型膠原蛋白之陽性面積率為⑽。從該姓果° 表示藉由軟骨素酶ABC之投予，能顯著地抑制纖 I型膠原蛋白之沉澱。 r 酸軟骨素（CSPG)沉澱抑制汾早 為了確認藉由投予Chase ABC，使沉殿於纖維化肝之 琉魏氣囊急(爲跋)分磬，對於

Chase ABC酵素群的肝組織試樣’與實施例}以同樣''方式， 使用抗CSPG抗體、抗C4SPG抗體及抗C6SPG抗體作為一次 抗體’進行免疫組織學的解析。 得到之肝組織的免疫染色像的例子如圖7所示。圖7 中，左側列為對照群，右側列為Chase ABC酵素群。如圖 7對fl?、群，與貫施例1之肝硬化同樣，各對、C4SpG 及C6SPG，觀察到明顯的陽性信號。另一方面，chase ABC 酵素群與對照群比較，對CSPG、C4SPG及C6spG之信號明 白的減弱。尤其於C6SPG之染色像（最下排），於對照群°， 在沿著實施例4及5觀察到膠原蛋白伸長巧偽小葉周圍，

2125-8362-PF 76 200803897 偵測到明白的陽性信號，相對於此，於Chase ABC酵素群， 該信號幾乎完全消失。 由以上結果，實證了藉由投予軟骨素酶ABC，將沉澱 於纖維化肝的CSPG分解。 式中之纖維芽細胞累穑抑制啟旲 就促進纖維化之膠原蛋白產生細胞而言，係以活化纖 維芽細胞為主存在。纖維芽細胞之過度累積、固著及活化 被涊為使纖維化病變惡化。因此關於在肝硬變模式中之識 維芽細胞動態，進行免疫組織學的探討。 首先，於實施例3製作之對照群及Chase ABC酵素群 由來的切片试樣中，添加作為一次抗體的大鼠抗小鼠纖維 胞抗體（選瘦體ER-TR7;1:5〇〇稀釋；MA公司製），於 至1 Μ °基# ’麥加作蠢二欠挤薦^場氧化酶 標記抗大鼠IgG(l:200稀釋；Bi_rce公司製），於室溫 再反應30分鐘後，添加dab基質（Nichirei公司製）。於 光學顯微鏡（Le i ka公司製）下兹目&^ 辰）下觀察试樣’確s忍以掠色信號 可見化的抗體結合。又，斜认 對於從未投予四氯化碳之正常小 _之正常肝也進行同樣的免疫組織學解析。 得到之肝組織的免疫染色像的例子如圖8所示。圖8 中’最左排表示正常群（正赍 .t , 一 ^正吊肝）、中間列表示對照群、最 右排表示Chase ABC醢去被 % , 酵素群。上排為倍率1〇〇倍之影像， 下排表不倍率2 0 0倍之影推 A t. <〜像。於未處置之正常小鼠肝臟， 對抗纖維芽細胞之陽性作缺 虓強烈地分布在門脈周邊。又，

2125-8362-PF 77 200803897 對照群(肝硬化）’顯示纖維芽細胞明顯地沿著偽小葉累 積，但是，但是於Chase ABC群中，累積的程度極為輕微。 由此可知，纖維化肝中纖維芽細胞之過度累積或固著，藉 由Chase ABC投予，而顯著地被抑制。 再者，由於在本實施例中，偵測到肝硬化中纖維芽細 胞沿著偽小葉（纖維化層）累積，且前述實施例中，對照群 的肝硬化中也沿著偽小葉周圍偵測到明顯的cspg陽性信 號，故可認為肝臟之纖維化中以叩係提供纖維芽細胞之支 響架。 i施例素酶ABC (—Chase ABC)於]、鼠肝輝鑤样 式t之巨噬I累積抑制汾畢 產生使纖維芽細胞活化之因子的細胞，被認為主要是 巨嗤體。因此，對於肝硬變模式中巨嗤體之動態也進行免 綠耝織學的探討。 百先，於實施例3製作之對照群及Chase ABC酵素群 籲由來的切片減樣中，、添加作為一次抗體的大鼠抗+鼠巨嗟 體抗體（選殖體F4/8〇;1:5〇〇稀釋；BMA公司製），於室溫使 反應1小時。接著，添加作為二次抗體之過氧化酶標記抗 大队IgG( 1·2〇〇稀釋；Bi〇s〇urce公司製），於室溫再反應 3〇刀鐘後，添加DAB基質（Nichirei公司製）。於光學顯微 鏡（Leika么司製）下觀察試樣，確認以棕色信號可見化的 抗體、、、"口。又，對於從未投予四氣化碳之正常小鼠採取之 正$肝也進行同樣的免疫組織學解析。 侍到之肝組織的免疫染色像的例子如圖9所示。圖9

2125-8362-PF 78 200803897 中，隶左排表示正常群（正當 吊肝）、中間列表示對照群、# 右排表示Chase ABC酵|雜， 取 跸素群。如圖9所示，正常 信號廣泛分布於竇狀隙，可

S 了認為是星狀細胞（Kupffer，s ce 11)。另一方面，對照鮮 '群之肝硬化，明顯地巨噬體的數量 增加，於實施例4及5中_ R4々 丑旳数里 千嬈察有許多到包圍偽小荦 纖維側翼。另-方面，於㈤q … 、 e ABC酵素群，巨嗟體數量 較對照群，明顯地減少。亦即，Chas“Bc酵素群中，續 示肝硬化中的巨喔體累積受到抑制。由該結果可知，對昭 群（肝硬化）位於尚為進行性之纖維化病變形成過程，相對 於此，Chase胤酵素群之纖維化進行受到抑制。 模式之治疮 效果（纖維芽細胞浸潤之抑制） 小鼠四氯化碳誘發肝硬變模式，以與實施例ι同樣的 方I鐘景。又，泠參使用之ADAMTS-4肽序列，為 NH2-DRARSCAIVEDDGLQSAFTA-C00H(序爿、編號：67)(小鼠 ADAMTS 4之具有金屬蛋白酶活性的結構域，合成第 336-355號孓肽者；GeneW〇rld&司製，1//2/隻），對照群 使用vehi'le(PBS)。與四氯化碳之追加投予（第9次至第 1 2次，共4次）同樣，將肽或veh丨c ι e進行腹腔内投予共4 次。追加投予結束後，將兩群的小鼠宰殺，製作肝臟組織 切片，進行免疫組織學的探討。 就促進纖維化之膠原蛋白之產生細胞而言，係以活化 纖雄芽細胞為主存在。纖維芽細胞之過度累積、固著及活 化被認為使纖維化病變惡化。因此關於在肝硬變模式中之

2125-8362-PF 79 200803897 纖維芽細胞動態，進行免疫組織學的探討。 於對照群及ADAMTS-4治療群由來的切片試樣中，添加 作為一次抗體的大鼠抗小鼠纖維芽細胞抗體（選殖體 ER-TR7;1 :500稀釋；BMA公司製），於室溫使反應j小時。 接著，添加作為二次抗體之過氧化酶標記抗大鼠IgG(丨：2⑽ 稀釋；Bi〇source公司製），於室溫再反應3〇分鐘後，添加 MB基質（Nichirei公司製）。於光學顯微鏡（Leika公司製） _下觀察试樣’確認以標色信號可見化的抗體結合。 得到之肝組織的免疫染色像的例子如圖10所示。對照 群（肝硬化），顯示纖維芽細胞明顯地沿著偽小葉累積，但 是，於ADAMTS-4治療群中，累積的程度極為輕微。由此可 知’纖維化肝中纖維芽細胞之過度累積或固著，藉由 ADAMTS-4投予，而顯著地被抑制。 复爲、例一 9 : ADAMTS-4肽投予對小I肝硬# ι在之治瘙 致^1_1 II型膠原I白之抑制） φ 與實施例8以同樣方式，製作肝臟之冷凍切片試樣， 進行免疫組織學解析。添加作為一次抗體的兔抗小鼠j j j 型膠原蛋白抗體（1:250稀釋；Santa Cruz公司製）於試樣， 於至使反應1小時。接著，添加作為二次抗體之驗性填 解 if 標記抗兔 IgG(l: 200 稀釋；Jackson ImmunoResearch △司製）’於室溫再反應30分鐘後，添加驗性磷解酶呈色 基質（Vector Red; Vector Laboratory 公司製）。於光學 顯微鏡（Leika公司製）下觀察試樣，確認以棕色信號可見 化的抗體結合。

2125-8362-PF 80 200803897 得到之肝組織的免疫染色像之例如圖丨i。對照群中， 以兔抗小鼠in型膠原蛋白抗體偵測之Ιπ型膠原蛋白纖 維，不僅是竇狀隙，從中心靜脈相連伸長到門脈，一部分 形成偽小葉。此為肝硬變典型的影像。相對於此，adamts-4 群，幾乎未認為有111型膠原蛋白之伸長。 實施例1_Q.: ADAMTS^^^^^變模式之治 效果CM錐化度數之抑制、 依據實施例9進行之免疫組織學染色，將各試樣之肝 雩纖維化程度’依照先前報告(Dai K，et al. w〇rid】

Gactroenterol. 31:4822-4826, 2005, Hillebrandt S, et al. Nature Genetics 37:835_843, 2〇〇5)’ 評價纖維化度 數。纖維化度數之評價基準如下。〇度：正常、丨度：中心靜 脈起有少量的膠原蛋白伸長、2度：中心靜脈起有明白的膠 屢睪甴1:1，复1秦|亂肝臟倉鬆$察摩、3摩：中心攀 脈起有明白的膠原蛋白伸長，為包圍肝臟全體之程度、4 φ度：肸臟全體有瀰漫性的膠原蛋白伸長，形成偽小葉。 結果如圖12所不。各棒代表於各群之纖維化度數的平 均值土襟準偏差。對照群為3.9±〇·4(η=6)，相對於此， ADAMTS 4治療群》2. 3泣4(n = 6)。與對照群比較， ADAMTS 4冶療群（p<〇. 〇〇1，t檢定）於統計學上纖維化顯著 減•工由以上，顯示ADAMTS—4肽之投予於臨床上發揮優異 的肝纖維化抑制效果。 [產業之可利用性] 本1明之含有軟骨素酶ABC為有效成分的肝纖維化抑

2125-8362-PF 81 200803897 =之^抑制肝組織之纖維化，具有治療或預防伴隨肝 ……度纖維化之病症（肝纖維化病症）的效果。本發明 ΓιΓ::化抑制劑，由於在纖維化之肝組織中，具有抑制 处r原蛋白伸長之效能、抑制J型膠原蛋白沉澱之效 =⑽纖維芽細胞累積之效能、抑制巨_累積之效能 纖維化有關的各種症狀以多方面地抑制的效能，因 此在抑制肝臟纖維化方面㈣有用。本發明之藉由投予肝 纖維=抑制劑之肝纖維化病症的治療或預防方法，由於能 猎由藥劑療法有效地改善纖維化錢，能成為對患者生活 口口質（Q0L)提高有益之優異療法。 &本說明書中引用之所有刊物、專利及專利申請案係為 了參照全體而包含於本說明書中。 X麗農之J JL麗f j 圖1表不以四氯化碳所誘導之肝硬變模式小鼠中， CSPG、C4SPG、C6SPG及HSPG之偵測結果（棕色信號）的照 片。倍率100倍。括弧内表示偵測時使用的抗體株名。 圖2表不以四氣化碳所誘導之肝硬化中，以抑§(軟骨 素酶（-））、Chase AC、Chase B，Chase ABC 處理後之 CSPG 的偵測結果（棕色信號）的照片。倍率2〇〇倍。 圖3表不以四氯化碳所誘導之肝硬變模式小鼠中，投 予Chase ABC後之ΠΙ型膠原蛋白（棕色信號）的減少效果 的照片。倍率100倍。

圖4表示以四氯化碳所誘導之肝硬變模式小鼠中，投 2125-8362-PF 82 200803897 予 Chase ABC、Chase ΑΓ + γμ ^ , 札或Chase β後之纖維化指 *ρ<0_ 05、**ρ<0· 〇ί(卜檢定）。 數圖。 圖5表示以四氯化碳所誘導之肝硬變模式小鼠中 予Chase慰後之ί型膠原蛋白（棕色信號）的減 二 照片。倍率100倍。 禾的 圖6表示以四氯化碳所誘導之肝硬變模式小鼠 予 Chase ABC、ChaseAC 或 ChaseB 後，ΠΙ 型膠原蛋白= 性面積率（％)圖。*ρ<0.05、**ρ<〇〇1(卜檢定）。 圖7表示以四氯化碳所誘導之肝硬變模式小鼠中，浐 予Chase ABC後之CSPG、C4SPG、C6spG之檢驗結果（梓^ 信號）的照片。倍率200倍。 圖8表示以四氯化碳所誘導之肝硬變模式小鼠中，纖 維芽細胞之分布（棕色信號）及Chase八此投予後之分布變 化的照片。倍率100倍（上排）、2〇〇倍（下排）。 圖9表不以四氯化碳所誘導之肝硬變模式小鼠中，巨 鲁噬體之分布（棕色信號）及Chase ABC投予後之分布變化的 照片。倍率200倍。 圖10顯示投予ADAMTS-4功能性肽所致纖維芽細胞浸 潤的抑制的照片。於肝硬變模式肝組織中，ER_TR7染色影 像G不）。上排100倍。下排400倍。藉由投予ADAMTS_4功 能性肽，除抑制細胞浸潤以外，抑制偽小葉形成之影像。 圖11顯示投予ADAMTS-4功能性肽所致Η I型膠原蛋白增 生的抑制的照片。於肝硬變模式肝組織中，丨丨丨型膠原蛋 白木色影像（棕）。1〇〇倍。係藉由投予4功能性肽， 2125-8362-PF 83 200803897 抑制偽小葉形成之影像。 圖12顯示投予ADAMTS-4功能性肽，所致纖維化抑制 的照片。將111型膠原蛋白染色所見予以數值化，以作為 纖維化分數的圖。係藉由投予ADAMTS-4功能性肽，顯著地 抑制肝纖維化。 【主要元件符號說明】 益

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Claims (1)

1. 200803897 十、申請專利範圍： 纖維化抑制劑，其含有一抑制硫酸軟骨素蛋 成或堆籍夕I μ “ 1 . 白多糖生成或堆積之物質……一 其 中該物所Ιι專利範圍第1項所述之肝纖維化抑制劑 X "λ促進硫酸軟骨素蛋白多糖分解之作用。 其 中《質it利範圍第1項所述之肝纖維化抑制劑 4如’二抑制硫酸軟骨素蛋白多糖合成之作用

   中專利關帛1項所述之肝纖維化抑制劑，並 中該物皙岌目+ i ^ 所 ' 嶮酸軟骨素蛋白多糖脫硫酸化作用之物 貝0 5·如申請專利範 中，該物質為具有硫 物質。 圍第1項所述之肝纖維化抑制劑 酸軟骨素蛋白多糖硫酸化抑制作 ，其 用之 6·如申請專利範 化抑制劑，其係抑制 堆積。 圍第1至5項中任一項所述之肝纖維 肝臟中硫酸軟骨素蛋白多糖之產生或 中月專利规圍第1 i 6項中任-項所述之肝纖維 /剑，其係甩於肝纖維化病症之治療或預防。 8.如申請專利範圍第7項所述之肝纖維化抑制劑，直 中該肝纖維化病症為慢性肝病。 /、 ▲ 9·如中請專利範圍帛7項所述之肝纖維化抑制劑，其 中5亥肝纖維化病症為慢性肝炎、肝纖維症、肝硬化、肝衰 竭或肝癌。 ' 、 1〇· 一種肝纖維化抑制劑之篩選方法，其特徵在於··從 2125-8362-PF 85 200803897 党試樣本中， 積作用之物質 選擇具麵制硫酸軟骨素蛋白 多糖產生或堆 u.如申請專利範圍第10 括選擇具有以下（a) 師&方法，其中包 Cd)之令任一項作用之物夺 ⑷促進硫酸軟骨素蛋白多糖分解之作用、4·· (b)抑制硫酸軟骨素蛋白多糖合成之作用 (〇硫酸軟骨素蛋白多糖之脫硫酸化作用

   (d)硫酸軟骨素蛋白多糖之硫酸抑制化作用。 12.如申請專利範圍第1〇或n項所述之篩 中該纖維化抑制劑係用於肝纖維化病症之治療或預防，其 2125-8362-PF 86