JP2001523214A

JP2001523214A - Ｐｄｇｆアンタゴニストおよびヘパリンを使用する内膜過形成を抑制するための組成物

Info

Publication number: JP2001523214A
Application number: JP52108196A
Authority: JP
Inventors: ハート，チャールズ，イー．; ケナジー，リチャード，ディー．; クロウズ，アレキサンダー
Original assignee: University of Washington
Current assignee: University of Washington
Priority date: 1994-12-30
Filing date: 1995-12-20
Publication date: 2001-11-20
Also published as: US5976534A; GB2311463A; WO1996020718A2; CA2208673C; GB9713718D0; AU4741596A; CA2208673A1; DE69533069D1; EP0801572A2; ATE267016T1; AU692996B2; WO1996020718A3; DK0801572T3; EP0801572B1; GB2311463B; DE69533069T2; ES2220948T3

Abstract

(57)【要約】霊長類を包含する哺乳動物の脈管構造における内膜過形成を抑制する方法を開示する。前記方法は、哺乳動物にＰＤＧＦアンタゴニストおよびヘパリンを協調的に投与することを含んでなる。アンタゴニストは、非ペプチドのアンタゴニストまたは抗ＰＤＧＦレセプター抗体、例えば、抗ＰＤＧＦ−アルファレセプター抗体または抗ＰＤＧＦ−ベータレセプター抗体であることができる。前記方法は、例えば、血管形成術、動脈血管内膜切除術、縮小アテローム切除術または血管移植片の吻口から生ずる血管損傷による内膜過形成を減少するのに、有効である。

Description

【発明の詳細な説明】ＰＤＧＦアンタゴニストおよびヘパリンを使用する内膜過形成を抑制するための組成物政府の支持本発明は、アメリカ健康協会（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ）により認められた認可番号ＮＩＨＨＬ３０９４６下に、政府の支持によりなされた。政府は、本発明においてある種の権利を有する。技術分野本発明は、血管損傷後の哺乳動物における、再狭窄を包含する、内膜過形成を抑制する方法、およびそれらの方法において有用な組成物に関する。発明の背景血管壁における平滑筋細胞（ＳＭＣ）の増殖は、血管の再構成後に、または他の血管損傷に応答して、アテローム性動脈硬化症における血管の病変の形成において重要な事象である。例えば、アテローム性動脈硬化症の治療は、しばしば、血管形成術、動脈内膜切除術または縮小アテローム切除術（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎａｔｈｅｒｅｃｔｏｍｙ）によるか、またはバイパス移植、外科的処置による、ブロックされた血管のクリーニングを包含し、前記外科的処置において、アテローム性動脈硬化症の斑は圧縮されるか、またはカテーテル法（血管形成術）により除去され、切開（動脈内膜切除術）により動脈壁から剥がされるか、または天然または合成の移植片でバイパスされる。これらの手順は、血管の内皮を除去し、下に横たわる内膜層を障害し、内側のＳＭＣを死亡させる。この損傷に引き続いて内側ＳＭＣの増殖および内膜の中への移動が起こり、細胞外基質の過度の沈着を伴う。この病変の発生は、特徴的には、最初の数週間以内に、損傷後６カ月までに起こり、上に横たわる内皮層が再確立されたとき停止する。ヒトにおいて、これらの病変は約２０％の細胞および８０％の細胞外基質から構成されている。血管形成術、動脈内膜切除術またはバイパス移植片により治療された患者の約３０％またはそれ以上において、血栓および／または内膜におけるＳＭＣ増殖は血管の再閉塞を引き起こし、結局再構成外科を失敗させる。外科に引き続く血管のこの閉鎖は、再狭窄として知られている。ＳＭＣ増殖の同様なプロセスは、また、器官の移植片において観察され、そして移植片のアテローム性動脈硬化症および器官の不全に寄与することがある。このプロセスにおける内膜の厚さの増加は、移植された器官のみを含む。血小板の有糸分裂誘発因子、例えば、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）は、アテローム性動脈硬化症の斑の発生においてある役割を演ずることが仮定された（参照、Ｒｏｓｅｅｔａｌ．「Ｃｅｌｌ」４６：１５５−１６９、１９８６；Ｈａｒｋｅｒ「Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．」６０：２０Ｂ−２８Ｂ、１９８７）。斑の形成について１つの提案されたメカニズムは、ＳＭＣ増殖を刺激する成長因子の、内皮露出部位における、血小板による解放である（ＲｏｓｓおよびＧｌｏｍｓｅｔ「Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．」２９５：３６９−３７７、４２０ −４２５、１９７６；Ｒｏｓｓ「Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ」１：２９３−３１１、１９８１）。ムーア他（Ｍｏｏｒｅｅｔａｌ．「Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓ．（Ｓｔｕｔｔｇ．）」３５：７０、１９７６）およびフリードマン他（Ｆｒｉｅｄｍａｎｅｔａｌ．「Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．」６０：１１９１−１２０１、１９７７）は、留置カテーテル損傷モデルを使用して、抗血小板血清の投与により誘発された延長された血小板減少症により、ウサギ動脈の中に実験的に誘発された内膜病変の形成の抑制を報告した。また、ＳＭＣそれら自体は、オートクラインメカニズムにより病変の発生を刺激するＰＤＧＦを産生できることが仮定された（Ｒｏｓｓｅｔａｌ．、前掲；Ｗａｌｋｅｒｅｔａｌ．「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」８３：７３１１− ７３１５、１９８６）。フインガール他（Ｆｉｎｇｅｒｌｅｅｔａｌ．「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」８６：８４１２−８４１６、１９８９）は、血小板減少症のラットにおいて内膜の病変の形成を研究し、そして血小板がバルーン損傷後の初期のＳＭＣ増殖においてある役割を演じないが、内膜の中へのＳＭＣ移動を調節できると結論した。現在、血小板は、ＰＤＧＦ、表皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子アルファおよびベータ（ＴＧＦαおよびＴＧＦβ）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）および血小板誘導内皮細胞成長因子を包含する多数の成長因子、ならびにいくつかの化学誘因分子を放出することが知られている。ある種の研究は病変の発生に関連するプロセスにＰＤＧＦを関係づけるが、霊長類におけるこれらのプロセスにおけるＰＤＧＦの参加を示す研究は存在しない。血管形成術または動脈内膜切除術によるアテローム性動脈硬化症の斑の除去は効能が制限され、そして治療された血管の再狭窄またはバイパス移植片の狭窄に対する有効な治療は開発されてきていない。したがって、血管壁における血管損傷、例えば、バルーンカテーテ挿入、動脈内膜切除術または縮小アテローム切除術のための損傷、後の血管の狭窄を包含する、ならびに血管移植片、器官移植片およびカテーテルの配置における、ＳＭＣに富んだ病変の発生を減少し、または予防する方法が、この分野において要求されている。本発明は、このような方法を提供し、そして他の関係する要求を満足する。発明の開示本発明は、哺乳動物、特に霊長類の脈管構造における内膜過形成を抑制する方法および組成物を提供する。内膜過形成の例は、血管形成術、動脈内膜切除術またはアテローム性動脈硬化症の斑を血管から除去する他の処置後の再狭窄を包含する。本発明の方法は、一般に、有効量の抗成長因子レセプター抗体を哺乳動物に投与して内膜過形成を抑制することを含んでなる。適当な抗成長因子レセプター抗体は、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）レセプター、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）レセプター、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）レセプター、表皮成長因子（ＥＧＦ）レセプター、トロンビンレセプターおよび因子Ｘａレセプターに対する抗体を包含する。本発明の範囲内において、有糸分裂誘発および／または平滑筋細胞の移動を抑制するために十分な量において、抗血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）レセプター抗体を利用するすることが好ましい。抗ＰＤＧＦレセプター抗体は、単独で、他の抗ＰＤＧＦレセプター抗体と組み合わせて、他のレセプターに対する抗体と組み合わせて、またはヘパリンと組み合わせて投与することができる。本発明の１つの面の範囲内において、哺乳動物に有効量の抗ＰＤＧＦレセプター抗体、例えば、抗ＰＤＧＦ−アルファレセプター抗体、抗ＰＤＧＦ−ベータレセプター抗体、または１パネルの抗ＰＤＧＦレセプター抗体を投与することによって、内膜過形成は抑制される。１つの態様の範囲内において、前記パネルの抗体はＰＤＧＦレセプターへのＰＤＧＦのＡＡ、ＡＢおよびＢＢイソ型の結合を抑制することができる。￥本発明の他の面の範囲内において、哺乳動物において急性血管損傷の発生と同時に、またはその発生前の抗過形成的に有効な時間内に、抗ＰＤＧＦレセプター抗体を哺乳動物に投与する。急性血管損傷の例は、血管再構成処置、例えば、血管形成術、動脈内膜切除術、縮小アテローム切除術および血管移植片の吻口術を包含する。関係する面において、血管移植片または移植される器官の配置と同時に、または有効時間内に、抗体を投与する。他の態様の範囲内において、急性血管損傷の発生または血管移植片または移植される器官の配置後の抗過形成的に有効な時間内に、抗体を投与する。本発明の他の態様の範囲内において、血管移植片または移植された器官内で起こる内膜過形成を抑制するために、抗体を使用する。本発明の他の面の範囲内において、哺乳動物に、内膜過形成を抑制するために十分なそれぞれの量のＰＤＧＦアンタゴニストおよびヘパリンを組合わせにおいて協調的に投与することによって、哺乳動物の脈管構造における内膜過形成は抑制される。アンタゴニストおよびヘパリンは同時に投与されるか、または最初に投与されたアンタゴニストまたはヘパリンとともに順次に投与され、投与されなかった残りのアンタゴニストおよびヘパリンはその後有効時間内に投与される。１つの態様の範囲内において、ＰＤＧＦアンタゴニストは非ペプチドのＰＤＧＦアンタゴニストである。他の態様の範囲内において、ＰＤＧＦアンタゴニストは抗成長因子レセプター抗体、例えば、抗ＰＤＧＦレセプター抗体である。関係する態様の範囲内において、協調的に投与される抗体または他のＰＤＧＦアンタゴニストおよびヘパリンは組合わせにおいて血管平滑筋細胞の増殖、血管平滑筋細胞の移動、および／または細胞外基質の新内膜沈着の内膜過形成のプロセスの１または２以上を抑制する。他の態様の範囲内において、抗体は抗ＰＤＧＦ−アルファレセプター抗体、抗ＰＤＧＦ−ベータレセプター抗体、または１パネルの抗ＰＤＧＦレセプター抗体である。追加の態様の範囲内において、抗体または他のＰＤＧＦアンタゴニストは、成長因子レセプターのレセプターの機能、例えば、レセプターリガンドへのレセプターの結合、または成長因子レセプターの二量化を抑制する。他の範囲内において、ＰＤＧＦへのＰＤＧＦのＡＡ、ＡＢおよびＢＢイソ型の１または２以上の結合を抑制する抗ＰＤＧＦ抗体または他のＰＤＧＦアンタゴニストを投与する。他の範囲内において、ヘパリンはヘパリン硫酸、または減少した抗血栓活性により特徴づけられる低分子量ヘパリンを含んでなる。本発明の他の面範囲内において、哺乳動物において急性血管損傷の発生と同時に、またはその発生前の抗過形成的に有効な時間内に、抗ＰＤＧＦレセプター抗体または他のＰＤＧＦアンタゴニストおよびヘパリンを哺乳動物に協調的に投与する。急性血管損傷は、血管形成術、血管内ステンティング、動脈内膜切除術、血管内レーザー剥離、縮小アテローム切除術または血管移植片の吻口術を包含する、血管再構成から生ずる血管の損傷を包含する。関係する面において、血管移植片または移植された器官の配置と同時にまたは前であって治療上有効な時間内に、ＰＤＧＦアンタゴニストおよびヘパリンを投与する。他の態様においては、急性血管損傷の発生または血管移植片または移植される器官の配置後の抗過形成的に有効な時間内に、ＰＤＧＦアンタゴニストおよびヘパリンを投与する。本発明のなお他の面の範囲内において、哺乳動物における内膜過形成を治療する医薬キットが提供され、前記キットは薬理学的に適当な担体中にＰＤＧＦアンタゴニスト、例えば、抗ＰＤＧＦレセプター抗体または非ペプチドのＰＤＧＦアンタゴニストと、ヘパリンとを含む。１つの態様において、アンタゴニストおよびヘパリンを単一の担体中において前もって組合わせる。他の態様において、アンタゴニストおよびヘパリンは同時、別々、または順次の送出により投与可能である。本発明の範囲内の有用な抗体は、モノクローナル抗体および遺伝子操作された抗体を包含し、後者は一本鎖抗体、キメラ抗体、二価抗体および免疫複合体を包含する。本発明の範囲内の有用なヘパリン調製物は、ヘパリン硫酸を包含する、未分画のヘパリンまたは分画されたヘパリンおよびヘパリン様グリコサミノグリカンを包含する。また、低分子量ヘパリン、例えば、抗凝固剤および凝固剤の断片、およびヘパリンおよびヘパリン様グリコサミノグリカンの誘導体は有用である。本発明のこれらおよび他の面は、下記の詳細な説明および添付図面を参照すると明らかとなるであろう。図面の簡単な説明第１図は、組換えＰＤＧＦ−ベータレセプターを発現する細胞への抗ＰＤＧＦレセプターモノクローナル抗体の結合を示す。結果は、三重反復実験の決定について¹²⁵Ｉ−ウサギ抗マウスＩｇＧの平均ｃｐｍ結合として表されている。バーは標準偏差を示す。第２図は、組換えＰＤＧＦ−アルファレセプターを発現する細胞への抗ＰＤＧＦレセプターモノクローナル抗体の結合を示す。結果は、三重反復実験の決定について¹²⁵Ｉ−ウサギ抗マウスＩｇＧの平均ｃｐｍ結合として表されている。バーは標準偏差を示す。第３Ａ図〜第３Ｃ図は、抗ＰＤＧＦレセプターモノクローナル抗体によるヒト皮膚繊維芽細胞へのＰＤＧＦ有糸分裂誘発活性の抑制を示す。結果は、ＰＤＧＦリガンドの試験状態の各々についての［³Ｈ］チミジンの取込みの平均レベルとして表されている。標準偏差は、各バーの上部においてＴにより示されている。各パネルは、また、ＰＤＧＦリガンド単独についての標準曲線を示す。Ａ）ＰＤＧＦ−ＡＡの刺激、Ｂ）ＰＤＧＦ−ＡＢ刺激、Ｃ）ＰＤＧＦ−ＢＢの刺激。第４図は、抗ＰＤＧＦレセプターモノクローナル抗体によるヒヒ平滑筋細胞へのＰＤＧＦ−ＡＡ有糸分裂誘発活性の抑制を示す。リガンド単独についての標準曲線は、左側に示されている。結果は、［³Ｈ］チミジンの取込みの平均レベルとして表されている。標準偏差は、各バーの上部においてＴにより示されている。第５図は、抗ＰＤＧＦレセプターモノクローナル抗体によるヒヒ平滑筋細胞へのＰＤＧＦ−ＡＢ有糸分裂誘発活性の抑制を示す。リガンド単独についての標準曲線は、左側に示されている。結果は、第４図におけるように表されている。第６図は、抗ＰＤＧＦレセプターモノクローナル抗体によるヒヒ平滑筋細胞へのＰＤＧＦ−ＢＢ有糸分裂誘発活性の抑制を示す。リガンド単独についての標準曲線は、左側に示されている。結果は、第４図におけるように表されている。第７Ａ図および第７Ｂ図は、ヒヒ平滑筋細胞へのＰＤＧＦ−ＡＡの有糸分裂誘発活性を抑制する代表的なモノクローナル抗体の滴定を示す。結果は、ＰＤＧＦ −ＡＡの試験状態の各々についての［³Ｈ］チミジンの取込みの平均レベルとして表されている。標準偏差は、ＰＤＧＦ−ＡＡの標準曲線の試料においてＴにより示されている。（Ａ）ＰＤＧＦ−ＡＡ有糸分裂誘発活性の標準曲線。（Ｂ）［³ Ｈ］チミジンの取込みのレベルにおける減少により示される、ＰＤＧＦ−ＡＡ有糸分裂誘発活性についてのモノクローナル抗体１６９．１４および１６９．３１の抑制効力。第８図は、抗ＰＤＧＦレセプターモノクローナル抗体によるヒヒ血清有糸分裂誘発活性の抑制を示す。血清単独についての標準曲線は左側に示されている。結果は、［³Ｈ］チミジンの取込みの平均レベルとして表されている。標準偏差は、各バーの上部においてＴにより示されている。第９図は、ヒヒ平滑筋細胞への抗ＰＤＧＦ−アルファレセプターモノクローナル抗体１６９．３１の存在下の、ヒヒ血清の有糸分裂誘発活性を示す。発明の詳細な説明前述したように、血管の再狭窄は、血管形成、動脈内膜切除、またはバイパス移植を行った患者において普通の問題である。再狭窄は内膜過形成の１例であり、これは外科的処置により、ならびに細胞外基質の生成（沈着）により損傷された区域における血管平滑筋細胞の増殖（有糸分裂）および移動の双方を包含するプロセスを介して進行すると考えられる。参照、一般に、（Ｈａｒｋｅｒ「Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．」６０：２０Ｂ−２８Ｂ、１９８７；ＤｅＦｅｕｄｉｓ「ＤｒｕｇＮｅｗｓａｎｄＰｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ」５：４９−５１、１９９２）。この増殖プロセスは、また、血管移植片（自家および同種を包含する自然のもの、および合成のものの双方）の閉塞において、および移植された器官において発現される。この増殖プロセスは、平滑筋細胞に富んだ病変を発生させ、そして本明細書において内膜過形成と呼ばれる。本発明は、成長因子レセプター、好ましくはＰＤＧＦレセプターに対する抗体の使用、および他のＰＤＧＦアンタゴニスト、特に非ペプチドのＰＤＧＦアンタゴニストの使用により、ＳＭＣに富んだ病変の発生を抑制する方法を提供する。用語「非ペプチド」は、タンパク質または他のペプチド結合多量体以外の化合物を呼ぶ。このような病変は、内膜の肥厚（過形成）により血管の部分的または完全な遮断を生ずる。内膜過形成の抑制は、細胞の移動、細胞の増殖、および細胞外基質の形成を包含する１または２以上の過形成のプロセスを減少または防止することによって、増殖を妨害することを包含すると理解されるであろう。ＰＤＧＦおよびそのレセプターの相互作用の妨害により増殖および／または移動をブロックすることによって、ＳＭＣの増殖および引き続く基質の沈着を減少することができる。内膜過形成の減少は、急性血管損傷後の管腔体積の喪失の有意な減少として、臨床的に発現される。このような減少は、一般に、初期の損傷部位における再血管化処置（例えば、反復血管形成）の必要性を減少させるであろう。本発明の方法は、急性血管損傷による内膜過形成の治療において特に有用である。急性血管損傷は、生涯にわたって発生する慢性血管損傷（例えば、アテローム性動脈硬化症）と対照的に、急速に（数日ないし数カ月にわたって）起こる血管損傷である。急性血管損傷は、外科的処置、例えば、血管形成、動脈内膜切除、アテローム切除、血管移植片の配置などの技術が用いられる血管再構成からしばしば生ずる。また、過形成は、例えば、移植片の配置または器官の移植に応答した、遅延した応答として起こることがある。本発明は、哺乳動物の脈管構造における内膜過形成を抑制するためにＰＤＧＦアンタゴニストを利用する。ＰＤＧＦアンタゴニストは有利にはヘパリンと組み合わせて使用される。本発明の範囲内において有用なＰＤＧＦアンタゴニストは、非ペプチドのＰＤＧＦアンタゴニストおよびペプチドのＰＤＧＦアンタゴニスト、例えば、抗ＰＤＧＦレセプター抗体を包含する。非ペプチドのＰＤＧＦアンタゴニストの１つの特に好ましいグループは、ブレフェルジン（Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ）Ａ（１，６，７，８，９，１Ｉａ，１２，１３，１４，１４ａ−デカヒドロ−１，１３−ジヒドロキシ−６−メチル−４Ｈ− シクロペント［ｆ］オキサシクロトリデシン−４−オン）およびその誘導体を包含する。ブレフェルジンＡは、下記の構造式を有する：ブレフェルジンＡはヒヒ平滑筋細胞に対するＰＤＧＦの有糸分裂誘発活性を抑制することが見出され、その活性はヘパリンの存在下に増強される。本発明の範囲内において有用な抗体は、免疫化および精製の慣用手法により生産することができる。簡単に述べると、ＰＤＧＦレセプター、レセプター断片またはレセプターのポリペプチド（好ましくは精製された）を含んでなる融合タンパク質を、動物、例えば、マウス、ラット、ウサギまたはヤギに、免疫応答を引き起こすために十分な量において投与する。免疫応答を増強するために、成長因子レセプターをアジュバント、例えば、フロインドアジュバントと組み合わせて投与することが好ましい。アミンにおいて抗体の産生を誘発するために、抗体の単一の注射で十分であるが、大きい初期の注射に引き続いて、１または２以上のブースター注射を数週ないし数カ月の期間にわたって投与ことが一般に好ましい。参照、例えば、Ｈｕｒｒｅｌｌ、Ｊ．Ｇ．Ｒ．編「ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＨｙｂｒｉｄｏｍａＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」ＣＲＣＰｒｅｓｓＩｎｃ．、ＢｏｃａＲａｔｏｎ、ＦＬ、１９８２（これは引用することによって本明細書の一部とされる）。次いで、血液を動物から集め、凝固させ、そして慣用技術、例えば、塩沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーまたは高性能液体クロマトグラフィーを使用して血清から抗体を単離する。本発明の１つの態様の範囲内において、モノクローナル抗体を使用する。モノクローナル抗体は、ポリクローナル抗体に比較して、生産が容易でありかつ治療の投与量がより低いという利点を提供する。なぜなら、所望の特異性を有する抗体のみを使用するからである。モノクローナル抗体を生産する方法はこの分野においてよく知られており、そして、例えば、コーラーおよびミルステイン（「Ｎａｔｕｒｅ」２５６：４９５、１９７５；「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」６：５１１−５１９、１９７６）により開示されている。Ｈｕｒｒｅｌｌ、Ｊ．Ｇ．Ｒ．編「ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＨｙｂｒｉｄｏｍａＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓａｎｄＡｐｐｌｃａｔｉｏｎｓ」ＣＲＣＰｒｅｓｓＩｎｃ．、ＢｏｃａＲａｔｏｎ、ＦＬ、１９８２、およびＨａｒｔ、米国特許第５，０９４，９４１号も参照。抗体断片、例えば、Ｆａｂ断片を使用することもできることは当業者に明らかであろう。一般に、患者と同系発生であるか、または同系発生の定常部を含有する抗体を使用することが好ましい。この理由で、ヒトのフレームワーク構造を含有する遺伝子操作された抗体がヒトの治療において一般に使用される。組換えヒト抗体またはヒト化抗体（すなわち、キメラ）抗体を生産する方法は、カビリー（Ｃａｂｉｌｌｙ）他（米国特許第４，８１６，５６７号）、ロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）他（ＷＯ８７／０２６７１）およびノイメアー（Ｎｅｕｍａｉｅｒ）（ＷＯ９０／００６１６）（これらは引用することによって本明細書の一部とされる）により開示された。簡単に述べると、ヒト定常部の遺伝子は、適当なヒトまたは非ヒトの可変領域の遺伝子に接合される。例えば、親ネズミのモノクローナル抗体の抗原結合部位（ＣＤＲｓ、または相補性決定領域）を表すアミノ酸配列は、ＤＮＡレベルにおいて、ヒト可変領域のフレームワーク配列上にグラフトされる。このプロセスは「ヒト化」として知られている。この技術の方法はこの分野において知られており、そして、例えば、ジョーンズ他（Ｊｏｎｅｓｅｔａｌ．「Ｎａｔｕｒｅ」３２６：５２２− ５２５、１９８６）、リーヒマン他（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎｅｔａｌ．「Ｎａｔｕｒｅ」３２２：３２３−３２７、１９８８）、およびクィーン他（Ｑｕｅｅｎｅｔａｌ．「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」８６：１００２９−１００３３、１９８９）に開示されている。次いで、接合遺伝子を宿主細胞の中に転移させ、宿主細胞を慣用手法に従い培養する。別の方法において、モノクローナル抗体産生細胞をクローニングしたヒト定常部の遺伝子でトランスフェクションし、そしてキメラ抗体を相同組換えにより発生させる。したがって、モノクローナル抗体をヒトである構造の有意な部分と集合させ、これによりヒトの患者への多数回の投与にいっそう適した抗体を生産することができる。また、可変重鎖配列に、典型的にはリンカーポリペプチドを介して、接合された可変軽鎖配列から一般に構成された組換えポリペプチドの発現により、一本鎖抗体を発生させることができる。一本鎖抗体を生産する方法はこの分野において知られており、そして、例えば、デイビス他（Ｄａｖｉｓｅｔａｌ．「ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」９：１６５−１６９、１９９１）により開示されている。２つのＰＤＧＦレセプターのポリペプチドが記載された。これらは「アルファレセプター」（Ｋｅｌｌｙｅｔａｌ．、ＷＯ９０／１４４２５；Ｋｅｌｌｙｅｔａｌ．、米国特許第５，３７１，２０５号；Ｃｌａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈｅｔａｌ．「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」８６：４９１７−４９２１、１９８９）および「ベータレセプター」（Ｃｌａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈｅｔａｌ．「Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．」８：３４７６ −３４８６。１９８８；Ｇｒｏｎｗａｌｄｅｔａｌ．「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」８５：３４３５−３４３９、１９８８）と命名された。ＰＤＧＦリガンドの存在において、レセプターのポリペプチドは二量体化する。こうして、３つのレセプターのサブタイプが可能である：αα、αβおよびββ。βレセプターはＰＤＧＦのＢ−鎖に対して特異的であるが、αレセプターはＡ−鎖およびＢ−鎖に結合する。結局、ＰＤＧＦに対する細胞の成長調節の応答はＰＤＧＦＡＡ、ＡＢおよびＢＢリガンドイソ型の入手可能性に依存するばかりでなく、かつまた異なるＰＤＧＦレセプターのサブタイプの発現および入手可能性に依存する（Ｈｅｌｄｉｎｅｔａｌ．「ＣｅｌｌＲｅｇｕｌ．」１：５５５−５５６、１９９０）。ヒト平滑筋細胞はαおよびβレセプターサブタイプの双方を発現する（Ｈｅｌｄｉｎｅｔａｌ．「Ｃｅ１１Ｒｅｇｕｌ．」１：５５５−５５６、１９９０）が、単一のレセプターサブタイプのみを発現する他の細胞型が知られている（Ｇｒｏｎｗａｌｄｅｔａｌ．「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２６４：８１２０−８１２５、１９８９）。本発明の範囲内において使用される抗ＰＤＧＦレセプター抗体は、好ましくは、すべての３つのＰＤＧＦレセプターのイソ型（αα、αβおよびββ）を抑制できる１パネルの抗体であろう。本明細書おいて使用するとき、用語「パネル」は２種またはそれ以上の異なる特異性を有する抗体の組み合わせを意味する。抗体は異なる抗原に対して、または単一の抗原上の異なるエピトープに対して特異的であることができる。モノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）は好ましい。前述したように、本発明の範囲内において使用する抗体は、ＰＤＧＦとそのレセプターとの相互作用を妨害する。本発明の好ましい態様において、ＰＤＧＦレセプターへのＰＤＧＦリガンドの結合を抑制する抗ＰＤＧＦレセプター抗体を使用するが、また、他のレセプター−リガンドの相互作用、例えば、レセプターの二量体化、を抑制する抗体を使用して本発明の利点を実現できることを当業者は認識するであろう。抗レセプターモノクローナル抗体は、また、治療上重要な化合物のデリバリーの標的剤として使用できる。このような化合物は下記のものを包含するが、これらに限定されない：トキシン、細胞増殖抑制化合物、またはプロ酵素（その潜在的機能は内因性プロ酵素を活性化すること、外性源から添加されたプロ酵素を活性化すること、またはプロドラッグ上の酵素切断部位を活性化することであることができる）。抗レセプター抗体は、また、造影剤として使用するための放射性ヌクレオチド、色素、蛍光性化合物またはその他で標識化することができる。この例は、血栓症の造影部位、または血管損傷部位（ここで、例えば、細胞表面のレセプターを発現する血管平滑筋細胞が暴露される）を包含する。モノクローナル抗体は、また、各免疫グロブリン分子上に２つの独立の抗原結合部位が存在する、二価抗体を発生させるために使用できる。この技術はこの分野において知られており、そして文献に開示された（「Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．Ｓｕｐｐｌ．」Ｘ：８３、１９９０）。さらに、二重特異性抗体を一本鎖抗体から構築することもできる。この技術はこの分野において知られており、そして、例えば、エー．ジョージ（Ａ．Ｇｅｏｒｇｅ「ＴｈｅＳｅｃｏｎｄＡｎｎｕａｌＩＢＣＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅｏｎＡｎｔｉｂｏｄｙＥｎｇｅｎｅｅｒｉｎｇ」Ｄｅｃ．１６−１８、１９９１、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）により開示された。本発明の範囲内において使用する抗体は、ｉｎｖｉｔｒｏ試験系において抗原の生物学的活性の有意な量をブロックすることができ、例えば、１または２以上のレセプターとの１または２以上のＰＤＧＦリガンドの相互作用をブロックする能力を有するであろう。適当なｉｎｖｉｔｒｏ試験系は、なかでも、有糸分裂誘発活性およびレセプター結合アッセイを包含する。例えば、２５μｇ／ｍｌの本明細書において記載するモノクローナル抗ＰＤＧＦ−アルファレセプタ−ＭＡｂは１０ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＡＡの有糸分裂誘発活性をブロックすることができる。当業者は理解するように、所定の量の抗原の活性を抑制するために必要な抗体の量は、抗体の特異性および親和性のような因子に依存する。創傷の治癒の応答のすべてが抑制されないように、血清有糸分裂誘発活性の１００％をブロックしないことが好ましい。抗体の投与量は、親和性および特異的活性を考慮して、後述するように計算される。抗ＰＤＧＦレセプター抗体または他のＰＤＧＦアンタゴニストの「抗過形成的に有効な量」は、血管、血管移植片または移植された器官の血管成分における内膜過形成を測定可能に減少または防止するために十分な量として定義される。さらに詳しくは、「内膜過形成の抑制」は、本明細書において、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の移動、ＶＳＭＣの増殖、および細胞外基質の新内膜沈着として、この分野において記載される内膜過形成プロセスの１または２以上の測定可能な抑制を包含すると定義される。これに関して、内膜過形成、または内膜過形成に関係する過形成プロセスの減少または防止は、この分野において知られているｉｎｖｉｔｒｏ、ｉｎｖｉｖｏおよびｅｘｖｉｖｏアッセイ系、特に霊長類アッセイ系（例えば、非ヒトまたはヒトの霊長類のＶＳＭＣ培養物または血管組織の外植体、または非ヒト霊長類のｉｎｖｉｖｏ試験）を使用して、容易に評価することができる。ｉｎｖｉｔｒｏ投与のデータを解釈するとき、異なる被験細胞および組織は異なるレベルおよび／または型のＰＤＧＦレセプターを発現することがあることが理解されるであろう。さらに、細胞培養の継代数（すなわち、血管組織源から解離または外植後に経過した細胞世代数）は、実験系において観察される有糸分裂誘発活性および他の増殖に関係する活性に重要な影響を潜在的に有するとして認識されるであろう。同様に、ヒトにおける抗体の抗過形成効果を推定するために、非ヒト系からのｉｎｖｉｖｏデータを推定するとき、多数の変数を考慮しなくてはならない。特に、ヒトについて実際の治療のプロトコールを決定するとき、モデルのデータを最良に利用するために、実験系と臨床系との間の血管損傷の特質および重症度の差を考慮することが重要である。同様に、モデルの応用と臨床の応用との間の関係を推定するとき、血管の解剖学および組織学における種間の差、および異なる種類の血管損傷により誘発された過形成プロセスにおける固有の差を操作しなくてはならない。それにもかかわらず、非ヒトおよびヒトの霊長類のモデル系を使用するｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏ研究を包含する、本明細書において記載するアッセイおよび方法は、ヒトを包含する哺乳動物の患者における内膜過形成の有望な治療のプロトコールを決定するために、必要な手引きのすべて、ならびに標準的臨床的試験手順を包含する既知の技術を提供する。抗過形成的に有効な量の抗体または他のアンタゴニストは、増殖（例えば、ｉｎｖｉｔｒｏ有糸分裂誘発アッセイにおいて決定されるような）および／または血管平滑筋細胞の移動を有意に抑制することが好ましい。「有意な」減少は、ｉｎｖｉｔｒｏアッセイにおける５０％またはそれより多い有糸分裂誘発または移動の減少である。実際の量は特定の抗体の特異性および結合親和性のような因子に一部分依存するであろうが、有効量はこの分野において知られておりかつ本明細書において開示するｉｎｖｉｔｒｏおよびｅｘｖｉｖｏの手法により実験的に決定することができる。一般に、治療に使用するＰＤＧＦアンタゴニストの量は、ｉｎｖｉｔｒ０またはｉｎｖｉｖｏにおいて有効であることが示された濃度に少なくとも等しい濃度を血流中に、または作用部位に提供するために十分な量であろう。しかしながら、１桁の増加までまたはそれを超える、より多い量をｉｎｖｉｖｏにおいて使用することが好ましい。したがって、モデル系において、適当なｉｎｖｉｔｒｏ試験において抗過形成的に有効であることが示された抗体濃度に相当する、一時的または持続する、局所的または全身的レベルの抗体を治療される哺乳動物に提供するという目的をもって、抗ＰＤＧＦレセプター抗体の投与量は選定される。本明細書において詳細に開示されるヒヒの血管損傷モデルは、ｉｎｖｉｖｏ試験のために特に重要である。このモデルは、閉塞された動脈を開くための種々のタイプの急性治療後に起こる、損傷の応答をまねるように設計された。血管の病変を発生するためのヒヒの血管形成の使用は、狭窄した冠状動脈において血流を再確立するために普通に使用され、そして治療された個体の３０〜４０％において再狭窄に導く手法を模擬する。したがって、このモデルは、抗ＰＤＧＦレセプター抗体または他のＰＤＧＦアンタゴニストを、単独でまたはヘパリンと組み合わせて、使用するときの試験に特によく適する。ＰＤＧＦアンタゴニストの治療の効能を試験する他の適当なモデルは、頸動脈内膜切除のヒヒのモデルである。このモデルにおいて、急性損傷は動脈の内側区域においてなされ、これは引き続いて内膜病変の発生をもたらす（Ｈａｎｓｏｎｅｔａｌ．「Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ」１８：１１７０−１１７６、１９９１）。このモデルは、進行したアテローム性動脈硬化症のために血流が減少したヒトにおける頸動脈を開くための頸動脈内膜切除の使用を模擬する。ＰＤＧＦアンタゴニストの治療の使用を試験する第３のモデルは、ヒヒ血管移植片の配置のモデルである。血管移植片の配置は、移植片部位における過形成の病変の発生をもたらすことが証明された（Ｋｒａｉｓｓｅｔａｌ．「Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．」９２：３３８−３４８、１９９３）。これらの病変は、ヒトの血管損傷部位における過形成の病変の特徴に類似する特徴を有する。ヒトにおけるＰＤＧＦアンタゴニストの治療の効能を試験するために、種々の型の分析を使用できる。これらの分析は、血管治療後３〜６カ月の期間における血管造影により平均管腔直径（ＭＬＤ）の喪失についての監視を包含する。効能を監視する別の方法は、血管内超音波、Ｂモード超音波および磁気共鳴映像法を包含する。また、抗ＰＤＧＦレセプター抗体の治療の効能を監視するために、臨床的相関を使用することができる。これらは、心筋梗塞および再発アンギナの減少、および反復再血管化の必要性を包含する。抗体投与レベルは、血液からの抗体のクリアランスを決定した後、抑制データから計算される。一般に、循環するＰＤＧＦ活性の１０％より大、好ましくは少なくとも２０〜５０％を抑制するために十分な抗体の循環レベルを維持することを目標として、投与量は選定される（例えば、レセプター−リガンドの結合、血管平滑筋細胞のＰＤＧＦ−または血清−刺激された有糸分裂誘発および／または移動、または内膜過形成プロセスのＰＤＧＦレセプターの機能および／または調節と相関する他の生物学的活性）。一般に、投与量は約０．１μｇ〜５００ｍｇまたはそれより多い抗体／患者の体重のｋｇ／日、好ましくは約２０μｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは約１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ／日である。前述したように、実際の投与量は一部分抗体の親和性および活性に依存する。単一の抗体を使用する場合より２またはそれより多い抗体を組合わせで投与する場合、多少より多い投与量が要求されることがある。抗体の生産コストを最小にしかつ投与した抗体の患者による免疫不耐性を制限するために、高い特異的抑制活性を有する、高い親和性の抗体を使用して、約１ｍｇ／ｋｇ／日またはそれより少ない投与量の使用を可能とすることが好ましい。非抗体のＰＤＧＦアンタゴニストの投与量は、同様な基準を使用して決定できる。抗ＰＤＧＦレセプター抗体療法、単独で、またはそれとヘパリンとの組み合わせで治療されたヒトにおいて、抗体は広い範囲の条件下に与えることができる。抗体は、再血管化処置の前に、ならびにその処置後多数回、ボーラス注射により与えることができる。抗体は処置前のボーラス注射（静脈内、筋肉内、腹腔内または皮下）および処置後の一定注入（移植されたポンプを介する注入を包含する）として与えることができる。多くの場合において、入院の間に１日量を投与し（注入による投与を包含する）次いで１〜２週またはそれより長い外来患者の治療期間の間におけるボーラス注射を少なくすることが好ましいであろう。治療は初期の損傷後６カ月まで続けることができる。抗体は、静脈内、筋肉内または皮下注射を包含する多数のルートを介して与えることができる。さらに、抗体は、灌流バルーンカテーテル、ステント上へのコーティング、またはゲルコーティングしたバルーン上の配置を使用して、血管損傷部位に局所的に送出すことができる。後者の場合において、抗体の投与量は、全身に与えるときより、実質的により少ないことが期待されるであろう。抗体は、また、遅延放出送出系、例えば、血管移植片またはステントの中に組込まれた系によるか、または灌流または二重バルーンカテーテルにより送出すことができる。血管移植片中の狭窄を抑制するために、抗ＰＤＧＦレセプター抗体は、それらの定常部を通して移植片に共有結合するか、または遅延放出性処方物中の移植片の中に組込むことができる。また、ポンプまたは他の既知の送出系を使用できる。いずれの場合においても、投与は所望の１日量を提供するように設計される（例えば、５ｍｇ／ｋｇ／日を提供する２５ｍｇ／ｋｇの５日のボーラス）。他のＰＤＧＦアンタゴニストの投与のモードおよびタイミングは、受け入れられた原理に従い特定のアンタゴニストおよび薬物速度論のデータから決定することができる。本発明の範囲内の使用のために、抗ＰＤＧＦレセプター抗体は慣用法に従い注入用組成物に処方され、そして無菌の容器の中に包装される。抗体は適当な希釈剤、例えば、無菌の生理食塩水または無菌の水と組合わせることができる。抗体組成物は、さらに、担体、安定剤および賦形剤、例えば、糖類（例えば、マンニトール）またはアルブミンを含有できる。別の方法において、抗体は凍結乾燥された形態で提供し、そして使用前に適当な希釈剤中で再構成することができる。これらの組成物は、単一または多数の投与形態で、例えば、密閉されたアンプルまたはバイアルで包装することができる。非ペプチドのＰＤＧＦアンタゴニストは、非経口的にまたは腸内に（例えば、経口的に）供給することができる。本発明の別の態様において、抗成長因子レセプター抗体または非抗体のＰＤＧＦアンタゴニストは、哺乳動物に、ヘパリンと協調的に、哺乳動物の脈管構造における内膜過形成を組合わせで抑制するために十分な抗体／アンタゴニストおよびヘパリンのそれぞれの単位投与量において投与される。これに関して、「協調的投与」は、抗体／アンタゴニストおよびヘパリンの同時、別々、または順次の投与を包含し、ここで抗体／アンタゴニストおよびヘパリンの双方は、互いに関して、制限された、組合わせで有効な時間内に投与される。「組合わせで有効な時間」は、抗体／アンタゴニストおよびヘパリンが過形成の抑制において組合わせで有効である、抗体／アンタゴニストの投与とヘパリンの投与との間の最大の介在時間である。次に、用語「組合わせで有効」は、内膜の肥厚または病変の形成、または過形成プロセスの測定可能な抑制を生成するとして定義され、この抑制は、そうでなければ匹敵する条件および投与量において、抗体／アンタゴニストまたはヘパリンの単独により独立に提供される抑制の最大レベルを超える。本明細書において使用するとき、用語「ヘパリン」は、反復するグルコサミンまたはグルクロン酸糖残基の構造により一般に特徴づけられる、構造的に複雑な、硫酸化グルコサミノグリカンのファミリーの１メンバーを意味する（Ｃａｓｕ「Ａｄｖ．Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｃｈｅｍ．ａｎｄＢｉｏｃｈｅｍ．」４７：５７８−５８３、１９８５）。最も広く知られているヘパリンは、ウシの肺またはブタの腸から製造された「未分画」または「商用」ヘパリンであり、ほぼ８，０００〜２０，０００ダルトンの分子量の範囲のヘパリン分子の異質混合物を包含する（Ｗｏｌｉｎｓｋｙｅｔａｌ．「Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．」１５：４７５−４８１、１９９０）。しかしながら、ヘパリンという用語は、また、広い範囲のいっそう異質のヘパリン調製物、ならびにヘパリン様分子、例えば、ヘパリン硫酸を包含する。これらの特定のヘパリンの例の中で、また、いっそう特定のヘパリンのサブタイプが知られている。例えば、内皮細胞（Ｃａｓｔｅｌｌｏｔｅｔａｌ．「Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．」９０：３７２−３７９、１９８１）および平滑筋細胞（Ｆｒｉｔｚｅｅｔａｌ．「Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．」１００：１０４１−１０４９、１９８５）により生産されるヘパリン硫酸成分が単離され、これらの成分は平滑筋細胞の増殖の抑制について未分画ヘパリンよりも４０倍まで活性であると報告された。さらに、天然に存在するヘパリンの大きさの変異型の中で、抗凝固活性または抗増殖活性を主として示す分画されたヘパリン種が単離された（Ｗｏｌｉｎｓｋｙｅｔａｌ．「Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．」１５：４７５−４８１、１９９０）。後者の活性は低分子量のヘパリン種、例えば、五糖類〜十糖類の範囲のヘパリンの中に存在する傾向があり、これらは、また、より大きい生物学利用能およびより長い半減期を有すると報告され（同上、Ｂａｃｈｅｒｅｔａｌ．「ＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓＲｅｓ．」７０：２９５−３０６，１９９３）、したがって、本発明の特定の態様範囲内において特に有用である。また、本発明を記載する目的のために、合成ヘパリンおよびヘパリン誘導体がヘパリンの定義の範囲内に含まれ、それらの種々のものは慣用の化学合成、変更および変性技術を使用して製造された（参照、例えば、Ｒｏｄｅｎ、Ｌ．「ＴｈｅＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆＧｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄＰｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ」（Ｌｅｎｎａｒｚ、Ｗ．Ｊ．編）ｐｐ．２６７−３７１、ＰｌｅｎｕｍＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｒｐ．、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９８０、引用することによって本明細書の一部とされる）。用語「抗血栓活性が減少した低分子量ヘパリン」は、未分画ヘパリンに比較して抗血栓活性が減少した（標準的アッセイにより決定して）低分子量の形態を示すために使用される。抗体／アンタゴニストおよびヘパリンの組合わせで有効な投与量を決定するために、および／またはＰＤＧＦアンタゴニストおよびヘパリンを別々にまたは順次に投与するための組合わせで有効な時間を評価するために、抗ＰＤＧＦレセプター抗体の抗過形成活性のアッセイ、および実験的応用と臨床的応用との間の推定について前述した方法と同一の一般的方法を使用する。これらの方法は、血管平滑筋細胞の培養物または血管組織の外植片を使用する有糸分裂誘発および移動のアッセイ、ならびに、なかでも、生存している被検者における内膜過形成の発生率または程度を測定する種々のｉｎｖｉｖｏアッセイを包含する。これらの方法から、抗体または他のアンタゴニストおよびヘパリンの協調的投与により達成される組合わせの抑制のレベルは、使用するアンタゴニストおよびヘパリンのそれぞれの種類および投与量、アンタゴニストおよびヘパリンの投与のタイミングおよびモード、および他の実験的および臨床的に関係する変数，例えば、処理する細胞または組織の種類、または血管損傷の特質および苛酷さに依存して変化することが証明されるか、または期待される。本発明の方法の範囲内において協調的投与法（例えば、ヘパリンおよびアンタゴニストの種類、投与量、および投与のモードまたはタイミング）を調節することによって、本発明の広い範囲の特定の応用を促進するために、内膜過形成の組合わせの抑制を最適化することができる。例えば、異なる抗体およびヘパリンの種類および投与量は異なる臨床的応用に望ましいことがある。血栓症に関係する合併症の高い危険にある患者について、ヘパリンの抗凝固型が臨床的に望ましいであろう。他の患者はヘパリンの抗凝固型の使用に関係する出血性合併症に特にかかりやすく、この場合において、抗血栓活性が減少した低分子量ヘパリンが適用されるであろう。これらおよび他の臨床的考慮は、当業者にとって明らかであろう。特定のヘパリンの種類または投与量の選定を受け入れるために、本発明の方法は、協調的に投与すべき抗体または他のアンタゴニストの形態、タイミングまたは投与量の共変動を可能とし、こうして抗体または他のアンタゴニストの投与法を協調的に調節して高いレベルの組合わせの抑制を維持することができる。他の場合において、アンタゴニストの形態または投与量、またはアンタゴニストの投与のタイミングまたはモードは外部の環境により付与されることがあり、この場合において、ヘパリンの投与法は協調的に調節することが必要であろう。例えば、延長した抗体治療法が望まれる場合、より少ない抗体投与量、またはより低い免疫原性の抗体の形態（例えば、マウス／ヒトキメラ抗体）を使用して、結果を最適化することができる。このような場合において、投与されるヘパリンの種類、投与量またはタイミングに関して協調的調節を行って、強い、組合わせの抗過形成効果を達成することができる。本発明の抗体およびヘパリンの協調的投与法を使用すると、抗体または他のアンタゴニストおよびヘパリンの投与量を特に広い範囲にわたって協調的に変化すると同時に、内膜過形成の高いレベルの組合わせの抑制を維持することができる。本発明のこの特徴は、低い投与量の一方または他方の抗過形成剤（すなわち、アンタゴニストまたはヘパリン）が望まれる、例えば、投与量が制限される毒性、アレルギーまたは他の合併症が存在する、臨床的適用に順応させるために、特に有用である。本発明の方法の範囲内において、協調的に投与された抗ＰＤＧＦレセプター抗体およびヘパリンは、０．００１：１〜１，０００：１、およびこれより広い範囲の抗体：ヘパリンの投与量比（すなわち、単位抗体投与量／単位ヘパリン投与量の重量比）において組合わせで有効であることが見出された。換言すると、単位投与量の抗体ならびに１／１，０００の投与量の協調的に投与されたヘパリンは組合わせの抑制効果を生じるが、協調的に投与されるヘパリンよりも１，０００倍の抗体の投与量も組合わせの効果を生ずる。この一般に逆比例する抗体およびヘパリンの投与量の共変動性は、２つの抗過形成剤を使用する、別の、協調的投与法を実行するために、極めて柔軟性を与える。同時に、０．０１：１〜１００：１、および０．０５：１〜２０：１の抗体：ヘパリンの投与量の比において具体化される、それほど極端ではない抗体およびヘパリンの共変動性も組合わせで有効であることが示され、そして、好ましくは、抗体およびヘパリンの双方の中程度ないし極端に低い投与量が臨床的に望まれる場合において、選択される。一般に、哺乳動物における内膜過形成を治療するために協調的に投与すべき抗体の投与量は、ほぼ０．１μｇ〜１００ｍｇの抗体／哺乳動物の体重のｋｇ／日の範囲であろう。好ましくは、投与量はほぼ５０μｇ〜２０ｍｇの抗体／ｋｇ／日であり、より好ましくは１ｍｇの抗体／ｋｇ／日より少なく、これにより高価な抗体のストックを保存しかつ副作用を制限すると同時に、満足すべき抑制レベルを達成するようにする。一般に、ヘパリンの投与量はほぼ１μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ／日であろう。好ましくは、ヘパリンの投与量は２０μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ／日であり、より好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ／日より少ない。さらに詳しくは、それぞれ、０．５μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、およびほぼ１μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の抗体およびヘパリンの協調的に投与される量は、双方の抗過形成剤の比較的少ない投与量において、強い組合わせの有効な結果を生ずる。抗体およびヘパリンのなおいっそう少ない投与量を望む場合、それぞれ、５μ ｇ〜２ｍｇ／ｋｇ／日、およびほぼ５０μｇ〜１ｍｇ／ｋｇ／日の抗体およびヘパリンの協調的に投与される量は好ましい。当業者は認識するように、実際の投与量は、患者のパラメーターおよび投与される１または２以上の抗体の特性（例えば、特異性、比活性、循環半減期）およびヘパリンの特性（例えば、抗血栓活性）を包含する、特定の場合を考慮して決定されるであろう。抗ＰＤＧＦレセプター抗体およびヘパリンは、好ましくは非経口的に、例えば、ボーラス注射または注入（静脈内、筋肉内、腹腔内または皮下）により手術の前に（一般に手術前の２４時間以内に）投与され、そして必要に応じて手術後に数時間〜数日の間隔で１〜２週またはそれより長い期間にわたって続ける。１つの態様の範囲内において、抗体はボーラス注射または注入として治療の第１日に、初期の３日の治療期間を通じて、ほぼ２０μｇ〜１ｍｇ／ｋｇ体重の最小の循環レベルの抗体を提供するために十分な量で投与される。これに関して、少なくとも１２時間、好ましくは少なくとも４日間、より好ましくは１４〜２１日間の循環半減期を有する抗体を使用することが好ましい。キメラ抗体およびヒト化抗体は、それぞれ、４日までおよび１４〜２１日までの循環半減期を有することが期待される。多くの場合において、入院の間に１日量を投与し、次いで外来患者の治療期間の間により少ない頻度のボーラス注射を投与であることが好ましい。また、抗体およびヘパリンは、遅延放出送出系、例えば、血管移植片またはステントの中に組込まれた系によるか、または灌流または二重バルーンカテーテルにより送出すことができる。ポンプおよび他の既知の送出系を連続的注入のために使用できる。投与の養生法を変更して、抗体およびヘパリンの薬物速度論に基づいてこれらの物質の所望の循環レベルを得ることができる。したがって、治療剤の所望の循環レベルが維持されるように、投与量は計算されるであろう。前述の１日量をより大きい、より少ない頻度のボーラス投与として投与して、投与期間にわたって平均した詳述した投与量を提供することができる。非ペプチドのＰＤＧＦアンタゴニストを腸内に投与できる。本発明の範囲内の使用のために、抗ＰＤＧＦレセプター抗体、他のＰＤＧＦアンタゴニスト、およびヘパリンを組合わせるか、または別々に配合して、慣用の手法に従い非経口（例えば、静脈内、末梢血管または経皮）、経口または経直腸投与のための組成物を調製し、そして無菌の容器に包装する。アンタゴニストおよびヘパリンは、一緒にまたは別々に適当な希釈剤、例えば、無菌の生理食塩水または無菌の水と組合わせることができる。アンタゴニスト、ヘパリンおよびアンタゴニスト／ヘパリンの組成物は、さらに、担体、安定剤および賦形剤、例えば、糖類（例えば、マンニトール）またはアルブミンを含有することができる。別の方法において、アンタゴニストおよびヘパリンは凍結乾燥された形態または他の安定な乾燥形態で提供し、そして使用前に適当な希釈剤（これはアンタゴニストおよびヘパリンとともに含めることができる）中で再構成することができる。これらの組成物は単一または多数の投与形態で、例えば、密閉したアンプルまたはバイアルの中に包装することができる。別の投与のモードのために、例えば、血管移植片における狭窄の抑制するための血管内投与のために、ＰＤＧＦアンタゴニストは持続放出性処方物中の移植片の中に組込むことができる。抗ＰＤＧＦレセプター抗体は、それらの定常部を通して移植片に共有結合することができる。下記の例により、本発明を例示する。これらの例は本発明を限定しない。例例１は、ＰＤＧＦレセプターのアルファおよびベータポリペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの製造を開示する。例２、３および４は、抗ＰＤＧＦ−ベータレセプターのモノクローナル抗体の同定および特性決定を開示する。例５は、抗ＰＤＧＦ−アルファレセプターのモノクローナル抗体の同定および特性決定を開示する。例６は、ある種の代表的なモノクローナル抗体の結合特異性の決定を開示する。例７は、抗ＰＤＧＦレセプターモノクローナル抗体を使用する、ヒト皮膚繊維芽細胞に対するＰＤＧＦ有糸分裂誘発活性を証明する。例８は、抗ＰＤＧＦレセプターモノクローナル抗体を使用する、ヒヒ平滑筋細胞に対するＰＤＧＦ有糸分裂誘発活性を証明する。例９および１０は、ヒヒ血清の有糸分裂誘発活性を抑制するための抗ＰＤＧＦレセプターモノクローナル抗体の使用を開示する。例１１は、抗ＰＤＧＦレセプターモノクローナル抗体によるヒヒ大動脈平滑筋細胞の移動の抑制を証明する。例１２は、リガンドがレセプターに結合した後、８時間までにＰＤＧＦ活性抑制する抗ＰＤＧＦレセプターモノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）の能力を証明する。例13は、抗ＰＤＧＦレセプターモノクローナル抗体によるヒト骨肉腫細胞からのレセプター結合ＰＤＧＦの変位を開示する。例１４は、単独でまたはヘパリンと協調的に投与された抗ＰＤＧＦレセプターモノクローナル抗体を使用する、血管平滑筋細胞に対するＰＤＧＦおよびヒヒ血清の有糸分裂誘発活性の抑制を証明する。例１５は、ヒヒ血管平滑筋細胞に対する血清の有糸分裂誘発活性を抑制するための、単独でまたは抗ＰＤＧＦレセプターモノクローナル抗体とともに協調的に投与された、ヘパリンの使用を開示する。例１６は、ヘパリン協調的に投与された抗ＰＤＧＦレセプターモノクローナル抗体を使用する、ヒヒ平滑筋細胞に対する血清の有糸分裂誘発活性の抑制を証明する他の研究を開示する。例１７および１８は、ヘパリンとともに協調的に投与された親ネズミおよびマウス／ヒトキメラ抗ＰＤＧＦ−アルファおよびベータレセプター抗体の抗有糸分裂誘発活性を比較する研究を開示する。例１９は、協調的に投与されたヘパリンおよび抗ＰＤＧＦレセプター抗体の血清の有糸分裂誘発活性に対する抑制活性をさらに記載する。例２０は、ヘパリンとともに協調的に投与された抗ＰＤＧＦレセプターモノクローナル抗体による、ヒヒ大動脈外植片からの平滑筋細胞の外への移動の抑制を証明する。例２１〜２３は、ＰＤＧＦとヘパリンとの間、および抗ＰＤＧＦレセプター抗体とヘパリンとの間の潜在的結合または活性相互作用を決定するための、ＰＤＧＦおよび抗ＰＤＧＦレセプター抗体の、組合わせにおける、ヘパリンの存在および不存在下の、結合の研究を開示する。例２４は、ヒヒの中への抗体の連続的注入後における抗ＰＤＧＦレセプター抗体の循環レベルを監視し、そして抗ＰＤＧＦレセプター抗体に対して発生したヒヒ抗体を測定する研究を記載する。例２５は、霊長類のモデルにおけるキメラ抗ＰＤＧＦレセプター抗体のｉｎｖｉｖｏ半減期を決定する研究を開示する。例２６は、抗過形成剤を試験する順次の動脈損傷のモデルおよび血管損傷後の治療を記載する。例２７は、急性血管損傷後の霊長類における内膜過形成を抑制するときの抗ＰＤＧＦレセプター抗体の役割を特性決定するとき有用な、ヒヒのモデルを記載する。組換えＰＤＧＦＡＡおよびＢＢは、米国特許第４，８８９，９１９号、米国特許第４，８４５，０７５号および米国特許第５，０３７，７４３号明細書（これらは引用することによって本明細書の一部とされる）に本質的に開示されているように、酵母中で産生され、そして濃縮された細胞培養培地から、カチオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過および（ＮＨ₄）２ＳＯ₄分画の組合わせにより精製された。ＰＤＧＦＡＢは、ハート他（Ｈａｒｔｅｔａｌ．「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」２９：１６６−１７２、１９９１）（これは引用することによって本明細書の一部とされる）により開示されているように、古くなったヒト血小板から調製した。ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＡＢおよびＢＢを以前に記載されたようにヨドビーズ〔Ｉｏｄｏｂｅａｄｓ（商標）、ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．、イリノイ州ロックフォード〕を使用して¹²⁵ Ｉで標識化した（Ｈａｒｔｅｔａｌ．、前掲）。ＢＢｔｙｒと命名されたＢ鎖の突然変異の形態（これは成熟コーディング配列の位置２３にフェニルアラニンの代わりにチロシン残基を有する）をＰＤＧＦ−ＢＢのヨウ素化のために使用した。ウサギ抗マウスＩｇＧおよびＭＡｂ１６３．３１を同様にヨドビーズ〔Ｉｏｄｏｂｅａｄｓ（商標）〕を使用して放射線標識化した。ＰＤＧＦ−アルファレセプターまたはＰＤＧＦ−ベータレセプターの細胞外ドメインに接合したヒトＩｇＧ重鎖および軽鎖を含んでなる融合タンパク質を、米国特許第５，１５５，０２７号、米国特許出願第０７／６３４，５１０号および欧州特許（ＥＰ）第３２５，２２４号明細書（これらは引用することによって本明細書の一部とされる）に本質的に開示されているように調製した。１つの場合において、マウス骨髄腫細胞を重鎖および軽鎖／ＰＤＧＦレセプターの細胞外ドメインの融合タンパク質の双方についてｃＤＮＡでトランスフェクションした。これらの細胞は、それらの培地の中に、２つの軽鎖および２つの重鎖の融合タンパク質から構成された分子を分泌する。この化合物をテトラマ−ＩｇＧ／ＰＤＧＦｒと表示する。他の場合において、軽鎖／ＰＤＧＦレセプターの細胞外ドメインの融合タンパク質のためのｃＤＮＡを細胞単独の中にトランスフェクションした。これらの細胞は、モノマーの軽鎖融合タンパク質を分泌し、この融合タンパク質をモノマーＩｇＧ／ＰＤＧＦｒと表示する。アルファーおよびベータ−レセプターの融合タンパク質を、それぞれ、ＩｇＧ／ＰＤＧＦｒ−アルファ（テトラマー）およびＩｇＧ／ＰＤＧＦｒ−ベータ（モノマーおよびテトラマー）と表示した。融合タンパク質を、抗ＰＤＧＦレセプターモノクローナル抗体を使用するイムノアフィニティー精製により精製するか、またはプロテインＡ−セファローズ〔Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）〕クロマトグラフィーにより精製した。例１ＰＤＧＦレセプターのモノクローナル抗体の製造ＰＤＧＦ−アルファレセプター（ＰＤＧＦｒ−アルファ）またはＰＤＧＦ−ベータレセプター（ＰＤＧＦｒ−ベータ）の細胞外ドメインに接合したＩｇＧ定常部を含んでなる融合タンパク質を、米国特許第５，１５５，０２７号明細書（これは引用することによって本明細書の一部とされる）に本質的に開示されているように製造した。アルファおよびベータレセプターの融合物を、それぞれ、ＩｇＧ／ＰＤＧＦｒ−アルファおよびＩｇＧ／ＰＤＧＦｒ−ベータと表示した。モノマーＩｇＧ／ＰＤＧＦｒ−ベータを、ヒトカッパ軽鎖定常部およびＰＤＧＦ−ベータレセプターの細胞外ドメインの融合物として発現させた。テトラマーＩｇＧ／ＰＤＧＦｒ−ベータは、モノマー構築物とヒトＩｇＧ重鎖の定常部＋細胞外ドメインに融合したヒンジ配列の共発現により製造した。アルファレセプターの融合物を同様な手段により製造した。８週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスを精製されたモノマーまたはテトラマーのＩｇＧ／ＰＤＧＦｒ−ベータまたは精製されたＩｇＧ／ＰＤＧＦｒ−アルファで免疫化した。完全フロインドアジュバントと混合したほぼ１０μｇの精製されたＩｇＧ／ＰＤＧＦｒを、マウスに腹腔内（ｉｐ）注射した。ほぼ２週の間隔において、完全フロインドアジュバントと混合したＩｇＧ／ＰＤＧＦｒ−ベータまたはＩｇＧ／ＰＤＧＦｒ−アルファを、マウスにさらにｉｐ注射した。ハイブリドーマを、免疫化されたマウスから、米国特許第５，０９４，９４１号明細書（これは引用することによって本明細書の一部とされる）に本質的に開示されているように製造した。簡単に述べると、脾細胞をマウスから分離し、洗浄した。蒸留水で溶解することによって、汚染する赤血球を除去し、そして脾細胞を洗浄した。残留する汚染する組織物質を遠心により除去した。ＮＳ−１マウス骨髄腫細胞系（ＡＴＣＣＴＩＢ１８）を融合のために使用した。融合効能を最適化するために、細胞を融合効能についてアッセイし、高い融合効能を有するクローンを選抜した。ＮＳ−１細胞をＮＳ−１培地（表１）中で３７℃、７％ＣＯ₂において増殖させた。赤ん坊マウスから得られた胸腺細胞をフィーダー層として使用して、培地を細胞融合のためにコンディショニングした。胸腺を３〜４週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスから取り、そして胸腺細胞を米国特許第５，０９４，９４１号明細書に開示されているように分離した。ＮＳ−１細胞を調製した免疫化マウス脾細胞に添加し、融合を米国特許第５，０９４，９４１号明細書に本質的に開示されているように実施した。細胞を１×ＨＡＴ（表１）および２．５×１０⁶胸腺細胞／ｍｌを含有するＮＳ−１培地中で培養した。ハイブリドーマを第９日と第１４日との間で特定の抗体の産生について試験した。細胞融合物を番号で表示した（例えば、１６２、１６３）。この緩衝液は１％または２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．、ミゾリー州セントルイス、から入手可能である）を使用して調製した。５または１０μｇＢＳＡ（それぞれ、１％または２％のＢＳＡについて）例２ＰＤＧＦベータレセプターに対する抗体を産生するハイブリドーマの同定および特性決定細胞融合物１６２からのハイブリドーマを、ＰＤＧＦ−ベータレセプターに対する抗体の産生について試験した。陽性のハイブリドーマの同定に使用したアッセイは、酵素結合イムノ収着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＩｇＧ／ＰＤＧＦｒ−ベータへの¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢの結合の抑制、およびヒト皮膚繊維芽細胞への¹ ²⁵ Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢの結合の抑制を包含した。ＥＬＩＳＡアッセイは、モノマーＩｇＧ／ＰＤＧＦｒ−ベータでコーティングされた９６ウェルのマイクロタイタープレート中で実施した。ウェルをコーティングするために、ＩｇＧ／ＰＤＧＦｒ−ベータＩｇＧ／ＰＤＧＦｒ−ベータをＥＬＩＳＡＡ緩衝液（表１）中で２００ｎｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌの溶液を各ウェルに添加した。プレートを３７℃において２時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをＥＬＩＳＡＣ緩衝液（表１）で洗浄した。次いでプレートを１５０μｌ／ウェルのＥＬＩＳＡＢ緩衝液（表１）と３７℃においてインキュベートして、非特異的結合部位をブロックした。緩衝液を除去し、ウェルをＥＬＩＳＡＣ緩衝液で洗浄した。被験ハイブリドーマの上清を２つのグループでプールし、１００μｌのプールした試料をマイクロタイターウェルの各々に添加した。プレートを３７℃において１時間インキュベートした。プレートをＥＬＩＳＡＣ緩衝液で洗浄し、次いで３７℃においてビオチン接合ウサギ抗マウスＩｇＧ（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓ、カリフォルニア州バーリンガム）と１．５時間インキュベートした。ウェルをＥＬＩＳＡＣ緩衝液で洗浄し、次いで３７℃において１００μｌ／ウェルのストレプアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＡｍｅｒｓｈａｍＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、英国アマーシャム）とに３０分間インキュベートした。ウェルをＥＬＩＳＡＣ緩衝液で洗浄し、次いで反応緩衝液（表１）とインキュベートした。１ＮＨ₂ＳＯ₄の添加により反応を停止させ、４９０ｎｍにおける吸収をモニターするフィルターを使用してダイナテク（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＤｙｎａｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）中でプレートを読んだ。０．２より大きいＡ₄₉₀読みを有するウェルを陽性として取った。陽性の候補を前述したようにＥＬＩＳＡにより再アッセイして、ＩｇＧ／ＰＤＧＦｒ−ベータに対する抗体を産生するハイブリドーマを含有する個々の培養ウェルを決定した。細胞融合物１６２からのハイブリドーマを、また、ＩｇＧ／ＰＤＧＦｒ−ベータへの¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢの結合の抑制についてスクリーニングした。ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＣａｐｐｅｌＬａｂｓ、ペンシルベニア州マルバーン）をＥＬＩＳＡＡ緩衝液で２μｇ／ｍｌの最終濃度に希釈した。次いでこの混合物を９６ウェルのマイクロタイタープレートに１００μｌ／ウェルで、添加し、プレートを３７℃において１．５時間インキュベートした。ウェルをＥＬＩＳＡＣ緩衝液で洗浄し、次いで２００μｌ／ウェルのＥＬＩＳＡＢ緩衝液とインキュベートして非特異的結合部位をブロックした。プレートをＥＬＩＳＡＣ緩衝液で洗浄し、次いでテトラマーＩｇＧ／ＰＤＧＦｒ−ベータと１．５時間インキュベートし、ＥＬＩＳＡＢ緩衝液中で２５ｎｇ／ｍｌの最終濃度に希釈した。ウェルをＥＬＩＳＡＣ緩衝液で洗浄して、未結合のＩｇＧ／ＰＤＧＦｒ−ベータを除去した。ハイブリドーマの上清を２つのグループでプールし、１００μｌのプールした試料をマイクロタイターウェルの各々に添加した。ウェルを３７℃において１時間インキュベートした。次いで各ウェルに、５０μｌの¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢ（ほぼ５０，０００ｃｐｍ／ウェル）を添加した。３７℃において１時間インキュベートした後、ウェルを結合培地（表１）で３回洗浄した。１００μｌの０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ２．５をウェルに室温において５分間添加し、溶液を収獲し、１２×７５ｍｍの管に移し、管をガンマカウンター中で計数して、¹²⁵ Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢの結合レベルを測定した。ＩｇＧ／ＰＤＧＦｒ−ベータに結合しそして¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢの結合をブロックした抗体を、培地単独に比較して、結合した¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢのレベルの減少により、検出した。ＩｇＧ／ＰＤＧＦｒ−ベータを中和する抗体について陽性であることが決定された培地のプールを、前述のものに類似するアッセイのフォーマットを使用して再スクリーニングして、中和性抗体を産生するハイブリドーマを含有する個々のウェルを同定した。ＥＬＩＳＡまたは¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢの結合の抑制により陽性である培養ウェルからの培地の試料を、引き続いてダウンレギュレーションアッセイのフォーマット（Ｈａｒｔｅｔａｌ．「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２６２：１０７８０−１０７８５、１９８７）において、ヒト皮膚繊維芽細胞上のＰＤＧＦ− ベータレセプターを認識する能力についてアッセイした。３７℃におけるＰＤＧＦ−ベータレセプターへのＰＤＧＦ−ＢＢの結合は、細胞表面からのレセプターのインターナリゼーションおよび引き続く細胞表面のレセプター数の減少、すなわち、ダウンレギュレーションと呼ぶ現象、に導く。繊維芽細胞を９６ウェルの培養皿の中に１０，０００細胞／ウェルにおいて入れ、使用する前に１〜２日間培地中で維持した。１組のウェルに、ＰＤＧＦ−ＢＢを細胞上の１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度において添加した。細胞を３７℃において１．５時間インキュベートした。培地を細胞から除去し、細胞をリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。次いでハイブリドーマ細胞からの被験培地を、ＰＤＧＦ−ＢＢ処理を受けた細胞または未処理のままであった細胞の二重反復実験のウェルに添加した。細胞を引き続いて４℃において２時間インキュベートし、次いでＰＢＳで洗浄した。１００μｌ／ウェルの¹²⁵Ｉ−ウサギ抗マウスＩｇＧ（１００，０００ｃｐｍ／ウェル）をウェルに添加し、細胞を４℃においてさらに１．５時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで室温において１００μｌ／ウェルの抽出緩衝液（表１）と５分間インキュベートした。抽出液を収獲し、１２×７５ｍｍの管に移し、ガンマカウンターで計数して、¹²⁵Ｉ−ウサギ抗マウスＩｇＧの結合レベルを測定した。ハイブリドーマ培養上清中に細胞表面のＰＤＧＦ−ベータレセプターを認識できる抗体が存在する場合、レセプターをダウンレギュレートするＰＤＧＦ−ＢＢで処理された細胞に結合する¹²⁵ Ｉ−ウサギ抗マウスＩｇＧのレベルの減少が存在するであろう。いくつかのハイブリドーマは、ＰＤＧＦ−ベータレセプターに対して抗体を作るとして、融合物１６２から同定された。同定されたハイブリドーマを限界希釈法により２回クローニングして、モノクローナル抗体を作る個々のクローンを得た。クローンを前述のアッセイにより抗体の産生についてスクリーニングした。１つのハイブリドーマ（１６２．６２と命名する）を、それ以上の特性決定のために選択した。例３抗ＰＤＧＦ−ベータレセプター抗体を産生するハイブリドーマの同定および特性決定細胞融合物１６３からのハイブリドーマを、組み合わせＥＬＩＳＡ／ＰＤＧＦ結合競合アッセイにより、ＰＤＧＦ−ベータレセプターに対する抗体の産生について試験した。これらのアッセイは９６ウェルのマイクロタイタープレート中で実施した。プレートを最初にＥＬＩＳＡＡ緩衝液中の２μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧで３７℃において２時間コーティングした。プレートをＥＬＩＳＡＣ緩衝液で洗浄し、次いで３７℃においてＥＬＩＳＡＢ緩衝液と１．５時間インキュベートして非特異的結合部位をブロックした。プレートをＥＬＩＳＡＣ緩衝液で洗浄し、次いで直ちに使用するか、または使用するまで４℃において１〜４日間放置した。アッセイの時において、プレートを１回ＥＬＩＳＡＣ緩衝液で洗浄し、次いで３７℃において結合培地中で２５ｎｇ／ｍｌに希釈したテトラマーＩｇＧ／ＰＤＧＦｒ−ベータと１．５時間インキュベートした。次いでプレートをＥＬＩＳＡＣ緩衝液で洗浄して、未結合のＩｇＧ／ＰＤＧＦｒ−ベータを除去した。ハイブリドーマの上清を２つのウェルのグループでプールし、１００μｌのプールした試料をマイクロタイターウェルの各々に添加した。プレートを３７℃において１時間インキュベートし、次いで結合培地を洗浄した。結合培地で１：１０００に希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ接合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｔａｇｏ、カリフォルニア州バーリンゲイム）をウェルに添加した。ウェルを３７ ℃において１時間インキュベートし、次いで結合培地で洗浄して、未結合のＨＲＰ接合ヤギ抗マウスＩｇＧを除去した。次いでほぼ２６，０００ｃｐｍ／ウェルの¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢをウェルに３７℃においてさらに１時間添加した。ウェルを結合培地で洗浄し、次いでＥＬＩＳＡの展開のために反応緩衝液とインキュベートした。１００μｌ／ウェルのＩＮＨ₂ＳＯ₄の添加により反応を停止させ、４９０ｎｍにおける吸収をモニターするフィルターを使用してダイナテクＥＬＩＳＡプレートリーダー中でプレートを読んだ。次いでウェルの内容物を１２×７５ｍｍの試験管に移し、試料をガンマカウンター中で計数して¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢの結合レベルを測定した。前述のアッセイは、ＥＬＩＳＡにより、ならびにテトラマーＩｇＧ／ＰＤＧＦｒ−ベータへの¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢの結合をブロックする能力により、テトラマーＩｇＧ／ＰＤＧＦｒ−ベータに対する抗体を産生するハイブリドーマの培養物を同定した。引き続いて、前述と同一のプロトコールを使用して、陽性であるプールした試料を再アッセイして、ＩｇＧ／ＰＤＧＦｒ−ベータに対する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を含有する個々の培養ウェルを決定した。ＩｇＧ／ＰＤＧＦｒ−ベータへの結合について陽性であることが見出された個々のウェルを、引き続いて、ヒト皮膚繊維芽細胞への¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢの結合を抑制する能力についてアッセイした。ヒト皮膚繊維芽細胞を２４ウェルの培養したの中にほぼ２０，０００細胞／ウェルにおいてプレートした。培地を細胞から除去し、０．５ｍｌ／ウェルのハイブリドーマ被験培地を二重反復実験ウェルに添加した。陰性の対照として、ＮＳ−１培地単独を１組のウェルに添加した。第２組のウェルに、ＮＳ−１培地中の２０ｎｇ／ｍｌの最終濃度においてＰＤＧＦ−ＢＢを添加して、¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢの非特異的結合を決定した。細胞を４℃において１時間インキュベートし、次いで１００μｌ／ウェル（ほぼ２６，０００ｃｐｍ）の¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢを各ウェルに添加した。細胞を４ ℃においてさらに１時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、次いで抽出緩衝液とインキュベートした。抽出液を１２×７５ｍｍの管に収獲し、ガンマカウンター中で計数した。ＮＳ−１培地試料に比較して¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢの結合を減少させた被験試料は、ヒト皮膚繊維芽細胞上の単層上の天然ＰＤＧＦ−ベータレセプターへのＰＤＧＦ−ＢＢの結合を抑制する能力について陽性であるとアッセイされた。いくつかのハイブリドーマは、ＰＤＧＦ−ベータレセプターに対して抗体を作るとして、融合物１６３から同定された。同定されたハイブリドーマを限界希釈法により２回クローニングして、モノクローナル抗体を作る個々のクローンを得た。クローンを前述のアッセイにより抗体の産生についてスクリーニングした。１つのハイブリドーマ（１６３．３１と命名する）を、それ以上の特性決定のために選択した。例４抗ＰＤＧＦ−ベータレセプターのモノクローナル抗体１６２．６２および１６３．３１の特性決定モノクローナル抗体（ＭＡｂ）１６２．６２および１６３．３１（それぞれ、ハイブリドーマのクローン１６２．６２および１６３．３１から産生された）を、テトラマーＩｇＧ／ＰＤＧＦｒ−ベータまたはヒト皮膚繊維芽細胞上のＰＤＧＦ−ベータレセプターに対する¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢの結合をブロックする能力について比較した。ＩｇＧ／ＰＤＧＦｒ−ベータへの¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢの結合の抑制は、融合物１６３の初期のスクリーニングについて本質的に前述したように試験した。コンディショニングされた培地を添加する代わりに、ＮＳ− １培地中で希釈した既知量の抗体を、¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢを同時に、ＩｇＧ／ＰＤＧＦｒ−ベータでコーティングされたウェルに添加した。ＮＳ−１培地単独を陰性の対照として使用した。ＮＳ−１培地への５００ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ −ＢＢの添加を使用して、¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢによる非特異的結合のレベルを測定した。ウェルを４℃において２．５時間インキュベートし、次いでＰＢＳで洗浄した。１００μｌの０．１Ｍのクエン酸塩ｐＨ２．５を各ウェルに添加して結合した¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢを除去し、試料を１２×７５ｍｍの管に移し、次いで管をガンマカウンター中で計数した。ヒト皮膚繊維芽細胞への結合をアッセイするために、繊維芽細胞をほぼ２０，０００細胞／ウェルにおいて２４ウェルの培養皿中にプレートした。細胞をプレート後２〜７日にアッセイのために使用した。抗体を結合培地中で表２に示す濃度に希釈し、次いで¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢと混合し、０．５ｍｌのアリコートを繊維芽細胞の二重反復実験ウェルに添加した。結合培地単独を陰性の対照として使用し、５００ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢの添加を使用して、¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢについて非特異的結合を決定した。細胞を４℃において２．５時間インキュベートし、次いで結合培地で洗浄して未結合のリガンドを除去した。次いで細胞を抽出緩衝液とインキュベートし、抽出液を収獲し、ガンマカウンター中で計数した。結合の研究の結果を表２に示す。データは¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢについて結合した比ｃｐｍとして表されている。５００ｍｇ／ｍｌの非標識化ＰＤＧＦ−ＢＢの添加により決定された非特異的結合は、ＩｇＧ／ＰＤＧＦｒ−ベータのウェルについて２６０ｃｐｍ、ヒト皮膚繊維芽細胞について１０５ｃｐｍであり、そして提示されたデータから減じられている。ＣＢ％＝対照の結合％。これらの結果は、モノクローナル抗体１６２．６２および１６３．３１の双方がＩｇＧ／ＰＤＧＦｒ−ベータへのＰＤＧＦ−ＢＢの結合の有効なインヒビターであることを証明する。対照的に、モノクローナル抗体１６２．６２は、ヒト皮膚繊維芽細胞へのＰＤＧＦ−ＢＢの結合について、モノクローナル抗体１６３．３１よりもいっそう有効なインヒビターである。モノクローナル抗体１６２．６２を、また、ヒト皮膚繊維芽細胞の単層上のレセプターに結合した¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦを変位する能力について分析した。¹²⁵Ｉ− ＰＤＧＦ−ＢＢを、まず、２４ウェルの培養皿中でヒト皮膚繊維芽細胞の単層とインキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで４℃においてモノクローナル抗体１６２．６２、５μｇ／ｍｌ、または結合培地単独と１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、抽出緩衝液とインキュベートし、抽出液をガンマカウンター中で計数して¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢの結合レベルを測定した。非特異的結合を決定するために、最初のインキュベーション工程の間に、５００ｎｇ／ｍｌの非標識化ＰＤＧＦ−ＢＢを添加した。表３に提示する結果がを示すように、モノクローナル抗体１６２．６２の添加は前もって結合した¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢの４７％の変位に導いた。したがって、モノクローナル抗体１６２．６２はヒト皮膚繊維芽細胞の表面からレセプター結合ＰＤＧＦ−ＢＢを変位させることができる。ＩｇＧ／ＰＤＧＦｒ−ベータでコーティングしたウェルおよびサブクラス特異的二次抗体を使用するＥＬＩＳＡにより、モノクローナル抗体１６２．６２および１６３．３１のサブクラスを決定した。モノクローナル抗体１６２．６２はＩｇＧ２ｂイソ型であることが見出されたが、モノクローナル抗体１６３．３１はＩｇＧ１イソ型であることが見出された。例５抗ＰＤＧＦ−アルファレセプター抗体を産生するハイブリドーマの同定および特性決定細胞融合物１６９からのハイブリドーマを、組み合わせＥＬＩＳＡ／ＰＤＧＦ結合競合アッセイにより、ＰＤＧＦ−アルファレセプターに対する抗体の産生について試験した。これらのアッセイは９６ウェルのマイクロタイタープレート中で実施した。プレートを最初にＥＬＩＳＡＡ緩衝液中の２μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧで４℃において一夜コーティングした。プレートをＥＬＩＳＡＣ緩衝液で洗浄し、次いで３７℃においてＥＬＩＳＡＢ緩衝液とインキュベートして非特異的結合部位をブロックした。プレートをＥＬＩＳＡＣ緩衝液で洗浄し、次いで４℃において結合培地中で２５ｎｇ／ｍｌに希釈したテトラマーＩｇＧ／ＰＤＧＦｒ−アルファと一夜インキュベートした。次いでプレートをＥＬＩＳＡＣ緩衝液で洗浄して、未結合のＩｇＧ／ＰＤＧＦｒを除去した。ハイブリドーマの上清を２つのグループでプールし、７５μｌのプールした試料をマイクロタイターウェルの各々に添加した。プレートを３７℃において１時間インキュベートし、次いでＥＬＩＳＡＣ緩衝液で洗浄した。結合培地で１：１０００に希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ接合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｔａｇｏ）をウェルに添加した。ウェルを３７℃において１時間インキュベートし、次いでＥＬＩＳＡＣ緩衝液で洗浄して、未結合の抗体除去した。次いでほぼ２５，０００ｃｐｍ／ウェルの¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＡＡをウェルに３７℃においてさらに１時間添加した。ウェルを結合培地で洗浄し、次いでＥＬＩＳＡの展開のために反応緩衝液とインキュベートした。１００μｌ／ウェルの１ＮＨ₂ ＳＯ₄の添加により反応を停止させ、４９０ｎｍにおける吸収をモニターするフィルターを使用してダイナテクＥＬＩＳＡプレートリーダー中でプレートを読んだ。次いでウェルの内容物を１２×７５ｍｍの試験管に移し、試料をガンマカウンター中で計数して¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＡＡの結合レベルを測定した。前述のアッセイはＥＬＩＳＡによりＩｇＧ／ＰＤＧＦｒ−アルファに対する抗体を産生するハイブリドーマの培養物を同定し、そしてテトラマーＩｇＧ／ＰＤＧＦｒ−アルファへの¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＡＡの結合をブロックできる抗体について監視した。初期のアッセイにおいて陽性であったプールした試料を、前述のプロトコールと同一のプロトコールを使用して再アッセイして、ＩｇＧ／ＰＤＧＦｒ−アルファの抗体を産生するハイブリドーマ細胞を含有する個々の培養ウェルを決定した。いくつかのウェルをＩｇＧ／ＰＤＧＦｒ−アルファに対する抗体の存在について同定した。これらのうちで、２つ、すなわち、１６９．１４および１６９．３１をそれ以上の分析のために選択した。これらのウェルからのハイブリドーマを限界希釈法により２回クローニングして、ＰＤＧＦ−アルファレセプターに対するモノクローナル抗体を産生する単一のクローンを得た。本質的に前述したような組み合わせＥＬＩＳＡ／¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＡＡ結合競合アッセイを使用して、クローンをスクリーニングした。モノクローナル抗体１６９．１４および１６９．３１が哺乳動物細胞の単層上の天然ＰＤＧＦ−アルファレセプターを認識することを証明するために、２つの抗体をアルファＴ−７細胞への¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＡＡの結合をブロックする能力について分析した。これらの細胞はイヌ腎上皮細胞であり、ＰＤＧＦ−アルファレセプターを自然に発現しないが、全長のＰＤＧＦ−アルファレセプターをコードするｃＤＮＡでトランスフェクションされている（米国特許第５，３７１，５０５ｏ号、米国特許第５，３７１，２０５号；ＰＣＴ公開ＷＯ第９０／１４４２５号）。これらの細胞はほぼ１００，０００／細胞の組換えレセプターを発現する。アルカリ性ホスファターゼを９６ウェルのプレート中でほぼ９５％のコンフルエンシーに培養した。培地を除去し、モノクローナル抗体１６９．１４および１６９．３１の希釈物を細胞に添加した。対照はＮＳ−１培地であり、ＮＳ− １は¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＡＡについて非特異的結合成分を決定するために５００ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢを含有した。各ウェルに、１００μｌの被験試料＋１０μｌの¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＡＡ（ほぼ２２，０００ｃｐｍ／ウェル）を添加した。細胞を試料と４℃において２時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、次いで１００μｌ／ウェルの抽出緩衝液で抽出した。抽出液を収獲し、ガンマカウンター中で計数した。結果を表４に示す。これらの結果は、これらの２つのモノクローナル抗体がＩｇＧ／ＰＤＧＦｒ−アルファに加えて哺乳動物細胞中の膜結合ＰＤＧＦ−アルファレセプターを認識することを証明する。ＩｇＧ／ＰＤＧＦｒ−アルファでコーティングしたウェルおよびサブクラス特異的二次抗体を使用するＥＬＩＳＡにより、モノクローナル抗体１６９．１４および１６９．３１のサブクラスを決定した。モノクローナル抗体１６９．１４および１６９．３１の双方は、ＩｇＧ２ａイソ型について陽性であるとアッセイされた。例６抗ＰＤＧＦレセプターのモノクローナル抗体の結合特異性ＰＤＧＦレセプターのサブユニットの結合特異性を証明するために、モノクローナル抗体１６２．６２、１６３．３１、１６９．１４および１６９．３１をクローン８細胞およびアルファ１〜１０細胞への結合について分析した。クローン８細胞は、全長のヒトＰＤＧＦ−ベータレセプターをコードする遺伝子でトランスフェクションされたびＢＨＫ５７０（ＡＴＣＣＣＲＬ１０３１４）細胞である（Ｇｒｏｎｗａｌｄｅｔａｌ．「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」８５：３４３５−３４３９、１９８８）。これらの細胞は、ほぼ５００，０００／細胞のヒトＰＤＧＦ−ベータレセプターを発現する。アルファ１〜１０細胞は、全長のヒトＰＤＧＦ−アルファレセプターをコードするｃＤＮＡでトランスフェクションされたびＢＨＫ５７０細胞である（米国特許第５，３７１，２０５号；ＰＣＴ公開ＷＯ第９０／１４４２５号）。これらの細胞は、ほぼ１，０００，０００／細胞のヒトＰＤＧＦ−アルファレセプターを発現する。ＰＤＧＦ−アルファまたはベータレセプターについての結合特異性を証明するために、これらの２つの細胞系を使用して、抗ＰＤＧＦレセプターのモノクローナル抗体を使用する細胞表面の結合の研究を実施した。クローン８細胞およびアルファ１〜１０細胞の双方を２４ウェルの培養皿中でコンフルエンシーに培養した。ＰＤＧＦ−ＢＢ（２００ｎｇ／ｍｌ）を細胞の一方の半分に添加してＰＤＧＦレセプターのダウンレギュレーションを刺激し、ベヒクル対照（１０ｍｍ酢酸、０．２５％ウサギ血清アルブミン）を他方の半分に添加した。細胞を３７℃において１〜２時間インキュベートし、次いで４℃に冷却したＰＢＳで洗浄した。精製されたモノクローナル抗体１６２．６２、１６３．３１、１６９．１４および１６９．３１を結合培地中で５μｇ／ｍｌに希釈し、ＰＤＧＦ−ＢＢで処理された細胞および未処理の対照細胞の三重反復実験ウェルに添加した。細胞を氷上でほぼ２時間インキュベートし、冷却したＰＢＳで洗浄して未結合の抗体を除去した。次いで被験ウェルを氷上で¹²⁵Ｉ標識化ウサギ抗マウスＩｇＧと３０分間インキュベートし、結合培地中でほぼ４００，０００ｃｐｍ／ウェルに希釈した。ウェルをＰＢＳで洗浄し、次いで抽出緩衝液とインキュベートした。抽出液を収獲し、ガンマカウンター中で計数した。第１図に示す結果が明らかに示したように、未処理の対照と比較したとき、ＰＤＧＦ−ＢＢ処理されたクローン８細胞への結合の有意な減少により証明されるように、モノクローナル抗体１６２．６２および１６３．３１のみがＰＤＧＦ−ベータレセプターに特異的に結合した。モノクローナル抗体１６９．１４による結合の高いレベルは、この抗体による非特異的結合の増大したレベルのためであった。なぜなら、ＰＤＧＦ −ＢＢ処理された細胞への¹²⁵Ｉ−ウサギ抗マウスＩｇＧの結合の有意な減少は存在しなかったからである。対照的に、アルファ１〜１０細胞への特異的結合により証明されるように、モノクローナル抗体１６９．１４および１６９．３１のみがＰＤＧＦ−アルファレセプターへの結合を示した（第２図）。細胞表面のＰＤＧＦレセプターに結合する抗体の能力のために、これらの結果はこれらの抗体がＰＤＧＦレセプター上の細胞外エピトープを認識することを確証する。例７ヒト皮膚繊維芽細胞上のＰＤＧＦ有糸分裂誘発活性の中和ヒト皮膚繊維芽細胞を２４ウェルの培養皿中でほぼ２０，０００細胞／ウェルにおいてプレートし、２％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）中で休止状態まで増殖させた。細胞をＰＤＧＦ−ＡＡ、ＡＢまたはＢＢで刺激した。標準曲線を細胞上の５、１．２５、０．３１および０ｎｇ／ｍｌの最終濃度の濃度を使用して展開した。貯蔵ＰＤＧＦ希釈物を１０ｍＭの０．２５％ウサギ血清アルブミンを含有する酢酸を使用して調製し、５０μｌの貯蔵試料またはベヒクル単独を培養ウェルに所望の最終濃度に添加した。３つのＰＤＧＦリガンドの各々の有糸分裂誘発活性を中和するモノクローナル抗体１６２．６２および１６９．１４の能力を分析するために、５ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦをウェルに２０μｇ／ｍｌ（細胞上の最終濃度）のモノクローナル抗体１６２．６２および１６９．１４単独、または２０μｇ／ｍｌの２つの抗体のプールと一緒に添加した。細胞を被験試料と３７℃においてほぼ２０時間インキュベートした。培地を吸引し、次いで１ｍｌの５％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭと置換し、１μＣｉ／ｍｌの［³Ｈ］チミジンを補充した。細胞を３７℃において４時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、次いでトリプシンで収獲し、ワラック（Ｗａｌｌａｃ）（Ｔｕｒｋｕ、フィンランド国）ベータプレート〔Ｂｅｔａｐｌａｔｅ（商標）〕液体シンチレーションカウンターにより［³Ｈ］チミジンの取込みについて計数した。第３Ａ図に表す結果が明らかに示すように、ＰＤＧＦ−ＡＡの有糸分裂誘発活性がモノクローナル抗体１６９．１４ならびに抗体プールにより抑制されたが、モノクローナル抗体１６２．６２により抑制されなかった。ＰＤＧＦ−ＡＢの有糸分裂誘発活性はモノクローナル抗体１６２．６２によりほぼ８０％、そしてモノクローナル抗体１６９．１４または抗体プールにより９２％より多く抑制された（第３Ｂ図）。対照的に、ＰＤＧＦ−ＢＢの活性はモノクローナル抗体１６９．１４により最小にのみ抑制されたが、モノクローナル抗体１６２．６２によりほぼ８０％、そして抗体プールにより９２％より多く抑制された（第３Ｃ図）。これらの結果は、ＰＤＧＦリガンドの結合のモデルと一致し、このモデルはＰＤＧＦ−ＡＡがＰＤＧＦ−アルファ／アルファレセプター二量体に結合し、ＰＤＧＦ−ＡＢがＰＤＧＦ−アルファ／アルファおよび− アルファ／ベータレセプター二量体に結合し、そしてＰＤＧＦ−ＢＢがすべての３つのＰＤＧＦレセプター二量体；−アルファ／アルファ、−アルファ／ベータおよび−ベータ／ベータに結合することを記載している（Ｈａｒｔｅｔａｌ．「Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍ．」９４：５３５−５７５、１９９０において概観されている）。したがって、モノクローナル抗体１６９．１４がＰＤＧＦに結合し、そしてアルファレセプターへのＰＤＧＦの結合を抑制する場合、アルファレセプターの結合はこれらのリガンドの双方に要求されるので、ＰＤＧＦ−ＡＡおよびＡＢの有糸分裂誘発活性のほぼ１００％を抑制することが期待されるであろう。このモデルは前述の結果と一致する。次いで、モノクローナル抗体１６２．６２によるＰＤＧＦ−ベータレセプターへの結合およびＰＤＧＦ−ベータレセプターの抑制は、ＰＤＧＦ−ＡＡおよびＡＢの有糸分裂誘発活性の量をＰＤＧＦ−ＡＡと一致するレベルに制限することが期待されるであろう。なぜなら、ＡＢおよびＢＢはアルファ／アルファ二量体のみに結合できるからである。再び、これは前述の研究の発見と一致する。要約すると、抗ＰＤＧＦレセプターのモノクローナル抗体１６２．６２および１６９．１４は、３つのＰＤＧＦリガンドによるＰＤＧＦレセプターの結合に関する現在の仮説と一致する方法において、ＰＤＧＦの３つの形態の有糸分裂誘発活性を抑制することができる。さらに、２つの抗体を組み合わせて使用すると、ヒト皮膚繊維芽細胞上のＰＤＧＦの有糸分裂誘発活性の本質的に１００％を抑制することができる。例８ヒヒ平滑筋細胞に対するＰＤＧＦの有糸分裂誘発活性の抑制抗ＰＤＧＦレセプターのモノクローナル抗体を、ヒヒ平滑筋細胞上のＰＤＧＦの有糸分裂誘発活性を抑制する能力について分析した。ヒヒ血管平滑筋細胞（ＢＶＳＭＣｓ）について実行したすべての有糸分裂誘発アッセイは、培養において継代３〜７の間の細胞の一次培養物について実施した。初期の培養物は大動脈組織の外植体の成長（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）から確立された。１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ中のヒヒ平滑筋細胞を、ほぼ３０，０００細胞／ウェルにおいて、２４ウェルの培養皿の中にプレートした。使用前２日において、培地を除去し、１ｍｌのミト培地（表１)を各ウェルに添加して細胞を休止状態になるようにした。実験の時において、細胞をＰＤＧＦ−ＡＡ、ＡＢまたはＢＢで刺激した。第４図〜第６図に示す最終濃度を使用して、３つのリガンドの各々について標準曲線を展開した。１０ｍＭの０．２５％アルブミンを含有する酢酸中で希釈することによって、２０×貯蔵液をＰＤＧＦ濃度の各々について調製し、５０μ ｌのＰＤＧＦまたは希釈ベヒクルのみを培養ウェルに添加した。有糸分裂誘発アッセイのために、１０、２および１．２５ｎｇ／ｍｌの最終ＰＤＧＦ濃度を、それぞれ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＡＢおよびＢＢについて使用した。モノクローナル抗体１６３．３１および１６９．３１を、ＰＤＧＦを含有するウェルに２５μｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。２つの抗体のプールについて、細胞上の抗体の最終濃度は合計で２５μｇ／ｍｌであるか、またはモノクローナル抗体の各々について１２．５μｇ／ｍｌであった。細胞を３７℃において２０〜２４時間の間インキュベートした。ＰＤＧＦ−ＡＡおよびＡＢの研究のために、５０μｌの４０μＣｉ／ｍｌの［³Ｈ］チミジン溶液を各ウェルに添加した。ＰＤＧＦ−ＢＢの研究のために、培地を吸引し、次いで０．５ｍｌの５％ウシ胎児血清を含有し、２μＣｉ／ｍｌの［³Ｈ］チミジンを補充したＤＭＥＭで置換した。細胞を３７℃において２〜４時間の間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、次いでトリプシンで収獲し、ベータプレート〔Ｂｅｔａｐｌａｔｅ（商標）〕液体シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ）により［³Ｈ］チミジンの取込みについて計数した。第４図に示すように、ＰＤＧＦ−ＡＡの有糸分裂誘発活性はモノクローナル抗体１６９．３１ならびに抗体プールにより１００％抑制されたが、モノクローナル抗体１６３．３１により抑制されなかった。ＰＤＧＦ−ＡＢの有糸分裂誘発活性は、双方のモノクローナル抗体により個々に、ならびに抗体プールにより完全に抑制された（第５図）。興味あることには、モノクローナル抗体の存在下の［³Ｈ］チミジンの取込みのレベルはベヒクル対照のみを添加して得られたレベルより低いことが認められる。これは同様にＰＤＧＦ−ＡＡプレート上でモノクローナル抗体１６９．３１を使用して見られた（第４図）。ＰＤＧＦ−ＢＢで刺激された細胞について、モノクローナル抗体１６９．３１およびモノクローナル抗体１６３．３１は個々に５０％より低い抑制を与えたが、２つの抗体のプールはＰＤＧＦの有糸分裂誘発活性のほぼ７５％を抑制することができた（第６図）。ヒヒ平滑筋細胞上のＰＤＧＦの有糸分裂誘発活性を中和するこれらの抗体の抑制効力をさらに証明するために、２つの抗ＰＤＧＦ−アルファレセプターのモノクローナル抗体１６９．１４および１６９．３１を、ＰＤＧＦ−ＡＡの有糸分裂誘発活性を抑制する能力について分析した。ヒヒ血管平滑筋細胞（ＢＶＳＭＣｓ）を本質的に前述したようにプレートし、そして処理した。１組のウェルに、増加する濃度のＰＤＧＦ−ＡＡを添加して、ＰＤＧＦ−ＡＡの有糸分裂誘発活性の標準曲線を発生させた（第７Ａ図）。ＰＤＧＦ−ＡＡの試料は１０ｎｇ／ｍｌから０．３１ｎｇ／ｍｌまでの範囲であった。第２組のウェルに、ＰＤＧＦ−ＡＡの標準的希釈物を１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度に添加した。次いで、減少する濃度のモノクローナル抗体１６９．１４および１６９．３１をウェルに添加して、［³Ｈ］チミジンの取込みの程度の減少により測定されるように、モノクローナル抗体の各々についての抑制効力を監視した（第７Ｂ図）。これらの発見は、８ｎｇ／ｍｌの抗体においてさえ、ＰＤＧＦ−ＡＡの１０ｎｇ／ｍｌ溶液の９０％より大きい抑制が存在したことを証明する。例９ヒヒ平滑筋細胞に対するヒヒ血清の有糸分裂誘発活性の抑制抗ＰＤＧＦレセプターのモノクローナル抗体を、ヒヒ平滑筋細胞へのヒヒ血清の有糸分裂誘発活性を抑制能力について分析した。１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ中のヒヒ血管平滑筋細胞を、ほぼ３０，０００細胞／ウェルにおいて、２４ウェルの培養皿の中にプレートした。使用前３日において、培地を除去し、１ｍｌのミト培地（表１）を各ウェルに添加して細胞を休止状態になるようにした。実験の時において、細胞を変化する量のヒヒ血清で刺激した。標準曲線を血清試料について発生させた。２０×貯蔵液を血清濃度の各々について調製し、５０μｌの血清または希釈ベヒクル、ＰＢＳ、を培養ウェルに添加して、２．５％から０．１５％までの範囲の細胞上の最終血清濃度を得た。モノクローナル抗体１６９．３１および１６３．３１を、ヒヒ血清の有糸分裂誘発活性を抑制する能力について分析した。抗体の抑制の研究のために、２．５％の最終最終濃度を使用した。モノクローナル抗体１６９．３１および１６３．３１を、血清を含有するウェルに２５μｇ／ｍｌの最終濃度において添加した。２つの抗体のプールについて、細胞上の抗体の最終濃度は合計で２５μｇ／ｍｌであるか、またはモノクローナル抗体の各々について１２．５μｇ／ｍｌであった。細胞を３７℃において血清試料とほぼ２０時間インキュベートした。その時、培地を吸引し、次いで０．５ｍｌの５％ウシ胎児血清を含有し、２μＣｉ／ｍｌの［³Ｈ］チミジンを補充したＤＭＥＭで置換した。細胞を３７℃においてほぼ３時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、次いでトリプシンで収獲し、ベータプレート〔Ｂｅｔａｐｌａｔｅ（商標）〕液体シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ）により［^3H］チミジンの取込みについて計数した。第８図に表す結果が証明するように、ヒヒ血清の有糸分裂誘発活性はモノクローナル抗体１６９．３１により最小に抑制されたが、モノクローナル抗体１６３．３１により５０％より大きく抑制された。２つの抗体のプールは血清の有糸分裂誘発活性の７５％より大を抑制した。これらの結果が証明するように、ヒヒ平滑筋細胞に対してヒヒ血清中の有糸分裂誘発活性の大部分は、抗ＰＤＧＦレセプターのモノクローナル抗体の使用により抑制することができる。本発明により研究は、ヒヒ血小板中のＰＤＧＦの優勢を占める形態がＰＤＧＦ−ＢＢであることを示した。ヒヒ平滑筋細胞上のＰＤＧＦ−ベータレセプターの百分率は高いために、抗ＰＤＧＦ−ベータレセプターのモノクローナル抗体はヒヒ血清に対して最大の抑制活性を有することは確実である。例１０ヒヒ平滑筋細胞に対する循環するモノクローナル抗体１６９．３１の効果ヒヒに２５ｍｇのボーラス静脈内（ｉ．ｖ．）注射の投与後、モノクローナル抗体１６９．３１の循環レベルを監視するために、研究を実施した。抗体を注射した後、種々の間隔において血清を獲得し、循環する抗体のレベルを測定した。ＥＬＩＳＡ緩衝液Ａ中のヒツジ抗マウスＩｇＧを、９６ウェルのマイクロタイター皿に２μｇ／ｍｌの濃度において添加した。プレートを４℃において一夜インキュベートし、ＥＬＩＳＡＣ緩衝液で洗浄し、次いでＥＬＩＳＡＢ緩衝液とインキュベートして、非特異的結合部位をブロックした。プレートをＥＬＩＳＡＣ緩衝液で洗浄し、次いで１００μｌ／ウェルの被験試料とインキュベートした。モノクローナル抗体１６９．３１を含有するヒヒの血漿または血清をＥＬＩＳＡＢ緩衝液で１：１０００に希釈し、被験ウェルに添加した。対照ヒヒ血漿または血清の中にスパイクされた精製されたモノクローナル抗体１６９．３１から成る標準を、被験血漿／血清の試料と同様に、１：１０００にに希釈し、次いで被験ウェルに添加した。標準は被験ウェルにおいて１００ｎｇ／ｍｌ〜１．５６ｎｇ／ｍｌの最終濃度の範囲であった。血漿／血清の試料をウェル中で３７℃において１〜２時間インキュベートし、ウェルをＥＬＩＳＡＣ緩衝液で洗浄し、次いでセイヨウワサビペルオキシダーゼと接合したヤギ抗マウスＩｇＧを添加した。ウェルを３７℃において１時間インキュベートし、ＥＬＩＳＡＣ緩衝液で洗浄し、反応緩衝液とインキュベートした。反応を１ＮＨ₂ＳＯ₄の添加により停止させ、プレートをＥＬＩＳＡプレートリーダーにより４９０ｎｍにおいて読んだ。モノクローナル抗体１６９．３１の循環レベルについてのヒヒ血清試料をＥＬＩＳＡ分析すると、このネズミ抗体のｉｎｖｉｖｏ半減期はほぼ１５時間であることが示された。さらに、注射後１時間および１８時間において得られた血清試料の相対有糸分裂誘発効力を測定した。これらの時間において、ヒヒにおける抗体の循環レベルは、それぞれ、４６μｇ／ｍｌおよび２１μｇ／ｍｌであると測定された。次いで、１時間および８時間の血清試料を対照血清試料と相対有糸分裂誘発活性について比較した。上記において提示したヒヒ血清の研究において本質的に記載したように培養したヒヒ血管平滑筋細胞に、血清試料の希釈物を添加した。平滑筋細胞上の最終血清濃度は、１．２５％から０．１５％までの範囲であった。本質的に前述したように、有糸分裂誘発活性を測定する手段として、ヒヒ平滑筋細胞を［³Ｈ］チミジンの取込みのレベルについて監視した。第９図に表す結果が示すように、対照試料に比較して、１時間および１８時間の双方の血清試料について相対有糸分裂誘発効力が有意に減少し、１８時間の試料は対照試料と１時間の試料との間の中間の有糸分裂誘発活性を有した。１８時間の試料中に存在したモノクローナル抗体１６９．３１による中和レベルは、この抗体をｅｘｖｉｖｏで添加してヒヒ血清を抑制するとき得られた中和レベルと一致した（第８図）。したがって、これらの結果が証明するように、ヒヒ血液中で少なくとも１８時間循環するモノクローナル抗体１６９．３１は、ヒヒ平滑筋細胞に対する血清の有糸分裂誘発活性を抑制するための、その生物学的活性の本質的にすべてを保持する。例１１ヒヒ大動脈外植片からの細胞成長の抑制抗ＰＤＧＦレセプターの有糸分裂誘発活性を、ヒヒ大動脈組織の外植片からの平滑筋細胞の外方移動速度を減少する能力について試験した。ヒヒの胸大動脈の内側中膜を、１０ｍＭのＨｅｐｅｓを含有するＤＭＥＭ培地の中に切出した。大動脈組織を１ｍｍの正方形の切片に切り、外植片を組織培養フラスコ上に配置した。１０分間インキュベートして外植片がフラスコの付着する時間与えた後、ＤＭＥＭ＋６μ ｇ／ｍｌのインスリンおよび５μｇ／ｍｌのトランスフェリンを外植片に添加し、試料を３７℃において５％ＣＯ₂とともにインキュベートした。合計１５の外植片を各培養フラスコの中に配置した。外植片の確立後、種々の時間において、外植片を高倍率の顕微鏡下に検査して、培養皿上への可視の細胞の成長（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）を有する外植片の数を計数した。外植片を少なくとも７日間追跡した。実験＃１において、インスリンおよびトランスフェリンを補充し、下記の試料を含有するＤＭＥＭ培地中で外植片を培養した：１）抗ＰＤＧＦ−アルファレセプターのモノクローナル抗体（１６９．３１）、５０μｇ／ｍｌ；２）抗ＰＤＧＦ−ベータレセプターのモノクローナル抗体（１６３．３１）、５０μｇ／ｍｌ；または３）ＤＭＥＭ培地単独（対照）。実験＃２において、ＤＭＥＭ＋インスリンおよびトランスフェリン、および１）抗ＰＤＧＦ−アルファおよびベータレセプターのモノクローナル抗体のプール（１６９．３１および１６３．３１）、各々２５μｇ／ｍｌ；または２）ＤＭＥＭ単独（対照）の中で外植片を培養した。結果を各試験条件（表５）について細胞の成長＋／−ＳＥＭに対して陽性の外植片の平均百分率として表した。これらの結果が証明するように、抗ＰＤＧＦレセプターのモノクローナル抗体は、個々にならびにプールで、４または７日において測定したとき、ヒヒ大動脈外植片からの平滑筋細胞の成長レベルを減少させることができる。これらの発見から理解されるように、これらの抗体は固体の基質を通る細胞の移動に要求されるプロセス、例えば、現存する血管組織を通して内膜過形成部位に向かって細胞が移動するために要求されうるプロセス、を抑制することができる。例１２抗ＰＤＧＦレセプターのモノクローナル抗体の遅延添加によるヒト皮膚繊維芽細胞に対するＰＤＧＦの有糸分裂誘発活性の抑制ヒト皮膚繊維芽細胞をほぼ２０，０００細胞／ウェルにおいて２４ウェルの培養皿中でプレートし、２％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ中で休止まで増殖させた。細胞をＰＤＧＦ−ＡＡ、ＡＢまたはＢＢで刺激した。増加する濃度のＰＤＧＦリガンドの各々を細胞に添加して、３つのＰＤＧＦイソ型について有糸分裂誘発効力の標準曲線を発生させた。標準について使用した最終ＰＤＧＦ濃度は、５、２．５、１．２５、０．６２、０．３１、０．１５および０．０ｎｇ／ｍｌであった。ＰＤＧＦの５０×貯蔵液を、０．２５％ウサギ血清アルブミンを含有する１０ｍＭの酢酸中で調製した。貯蔵液の各々の２５μｌを三重反復実験の被験ウェルに添加した。モノクローナル抗体１６２．６２および１６９．１４による抑制活性を検査するために、繊維芽細胞を含有するウェルを５ｎｇ／ｍｌの最終濃度のＰＤＧＦとインキュベートした。ＰＤＧＦ試料の添加後、種々の時間間隔（１、２、４、６および８時間）において、モノクローナル抗体１６２．６２および１６９．１４のプールした試料を、各モノクローナル抗体について２５μｇ／ｍｌの最終濃度において、５ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦで処理された細胞の三重反復実験ウェルに添加した。ＰＤＧＦ試料の添加後９時間において、１％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ中の５０μｌの２０μＣｉ／ｍｌの［³Ｈ］チミジンを各ウェルに添加した。試料を３７℃においてさらに１３〜１５時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、次いでトリプシンで収獲し、ベータプレート〔Ｂｅｔａｐｌａｔｅ（商標）〕液体シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ）により計数した。表６に表される結果は、三重反復実験の測定について、取込まれた［³Ｈ］チミジンの平均ｃｐｍ＋／−標準偏差として与えられている。データは双方のＰＤＧＦ標準曲線、および抗体添加の時間過程について与えられている。結果が証明するように、ＰＤＧＦリガンドの添加後８時間程度に遅い時間において、抗ＰＤＧＦレセプター抗体を細胞に添加したとき、ＰＤＧＦ−ＡＡについて有糸分裂誘発活性が７５％減少した。ＰＤＧＦ−ＡＡおよびＢＢの双方について、ＰＤＧＦリガンドの添加後８時間における抗ＰＤＧＦレセプター抗体の添加は、ＰＤＧＦの有糸分裂誘発活性の９０％より大きい減少を引き起した。これらの研究から明らかなように、抗ＰＤＧＦレセプターモノクローナル抗体はＰＤＧＦリガンドの存在後の延長した時間において添加することができ、そしてなおＰＤＧＦ有糸分裂誘発活性に対して有効な中和作用を有することができる。例１３抗ＰＤＧＦレセプターモノクローナル抗体によるヒト骨肉腫細胞からのレセプター結合¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦの変位４つのモノクローナル抗体１６２．６２、１６３．３１、１６９．１４および１６９．３１を、ヒト骨肉腫細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１４２７）の単層上のＰＤＧＦレセプターに結合した¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＡＡおよび¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢを変位させる能力について分析した。このヒト骨肉腫細胞は、ほぼ等しい量のＰＤＧＦｒ−アルファおよびＰＤＧＦｒ−ベータを発現する。ヒト骨肉腫細胞の単層を２４ウェルの培養皿中で増殖させ、結合培地中で希釈した¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＡＡまたは¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢと４℃において１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで１ｍｌの結合培地単独、モノクローナル抗体１６９．１４、１６９．３１、１６２．６２、１６３．３１、または１６９．３１および１６２．６２のプールを各ウェルに添加した。抗体を結合培地中でに希釈し、細胞に５μｇ／ｍｌ、１ｍｌ／ウェルの濃度において添加した。細胞を４ ℃において１時間で洗浄し、次いでＰＢＳで洗浄し、、抽出緩衝液とインキュベートし、次いで収獲し、ガンマカウンター中で計数して¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦの結合レベルを監視した。１００ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢを¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＡＡおよび¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ −ＢＢを有する三重反復実験ウェルに添加して、非特異的結合のレベルを測定した。表７に表す結果は、列挙した被検化合物との第２のインキュベーション後の¹²⁵ Ｉ−ＰＤＧＦ−ＡＡおよび¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢについての結合した比ｃｐｍ（標準偏差）として示されている。結合培地単独のウェル中の結合ｃｐｍに対して被験試料の結合ｃｐｍを比較することによって、変位％値を決定した。結果が証明するように、抗ＰＤＧＦ−アルファレセプターモノクローナル抗体１６９．１４および１６９．３１は、前もって結合した¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＡＡのほぼ６３％を変位させることができた。対照的に、抗ＰＤＧＦ−ベータレセプターモノクローナル抗体１６２．６２および１６３．３１は、本質的に効果をもたず、計数の１０％より少なく変位させた。¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢの結合について、モノクローナル抗体１６９．１４および１６９．３１は前もって結合した計数の２２〜２５％を変位させることができたが、モノクローナル抗体１６２．６２は計数の３４％を変位させることができた。１６９．３１および１６２．６２のプールは、前もって結合した¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢの４４％を変位させた。これらの結果が示すように、抗ＰＤＧＦレセプターモノクローナル抗体は、ＰＤＧＦの結合をブロックすることができることに加えて、また、前もって結合したＰＤＧＦ−ＡＡおよびＢＢを細胞表面のレセプターから変位させることができる。例１４独立にまたはヘパリンと協調的に適用された抗ＰＤＧＦｒモノクローナル抗体によるヒヒ血清およびＰＤＧＦ−ＢＢ刺激平滑筋細胞の有糸分裂誘発の抑制抗ＰＤＧＦｒ−アルファモノクローナル抗体１６９．３１および抗ＰＤＧＦｒ−ベータモノクローナル抗体１６３．３１を、独立におよびヘパリンとの協調的投与アッセイにおいて分析して、ヒヒ血管平滑筋細胞に対するＰＤＧＦ−ＢＢおよびヒヒ血清の有糸分裂誘発活性を抑制する抗体の能力を測定した。２つの抗体単独の活性を評価し、かつヘパリンとともに協調的に投与された抗体の組合わせの抑制活性を評価するために、ヒヒ静脈平滑筋細胞を、成長後継代７において、１０％胎仔ウシ血清を補充したＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）中において２４ウェルの培養皿の中に３．０×１０⁴細胞／ウェルでプレートした。細胞をこの測定中で３７℃、５％ＣＯ₂雰囲気において３日間維持した。次いで培地を１ｍｌ／ウェルのミト培地と置換し、細胞をさらに２４時間培養した。第１組の実験において、ＰＤＧＦ−ＢＢを０．２５％ウサギ血清アルブミンを含有する１０ｍＭの酢酸で４０ｎｇ／ｍｌの濃度に希釈した。次いで５０μｌのこの貯蔵希釈物を各ウェルに添加して、細胞上の最終濃度を２ｎｇ／ｍｌとした。被験ウェルのあるものに、未分画ヘパリン（ＵＨ）（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．、ミゾリー州セントルイス）を単独でまたは１または２以上の抗ＰＤＧＦｒ抗体とともに協調的に添加した。これらの研究において使用したＵＨは多数の大きさのヘパリン種の混合物であり、標準的活性化部分的トロンボプラスチン時間（ＡｃｔｉｖａｔｅｄＰａｒｔｉａｌＴｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎＴｉｍｅ）（ＡＰＴＴ）アッセイにおいてほぼ１５０単位／ｍｇの比活性を有した。ヘパリンをＰＢＳ中で４００μｇ／ｍｌの貯蔵液濃度に希釈し、２５ μｌのこのヘパリン溶液を適当なウェルに細胞上の１０μｇ／ｍｌの最終ヘパリン濃度に添加することによって、細胞へのヘパリンの添加を実施した。抗ＰＤＧＦｒ抗体をＰＢＳで希釈して４０×貯蔵液濃度にし、次いで２５μｌの抗体希釈物を適当な被験ウェルに添加した。抗体またはヘパリンのみを独立に受け取るウェルに、緩衝液対照として２５μｌのＰＢＳを適用した。ウサギ血清アルブミンを含有する１０ｍＭの酢酸でＰＤＧＦを２倍に希釈し、５０μｌの貯蔵液を適当なウェルに添加して、細胞上の最終ＰＤＧＦ＝ＢＢ濃度を２、１および０．５ｎｇ／ｍｌとすることによって、ＰＤＧＦ−ＢＢ刺激についての投与量応答プロフィルを発生させた。処理物の添加後、細胞を３７℃において２０時間インキュベートした。ヒヒ血管平滑筋細胞の有糸分裂誘発刺激を［³Ｈ］チミジンの吸収により評価した。ＤＭＥＭ中で調製した５０μｌの２０μＣｉ／ｍｌの［³Ｈ］チミジン貯蔵液を、１μＣｉ／ウェルの最終濃度に細胞に直接添加した。細胞を３７℃において４時間インキュベートし、１回ＰＢＳで洗浄し、細胞が分離するまで０．２５ｍｌのトリプシンで処理し、細胞収獲器（ＬＫＢＷａｌｌａｃ）を使用してフィルター上に収獲した。フィルターをベータプレート〔Ｂｅｔａｐｌａｔｅ（商標）〕液体シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ）で計数した。ＰＤＧＦ−ＢＢ刺激の抗体および抗体／ヘパリンの抑制についてのデータを表８に示す。表８中のデータは、ＰＤＧＦ−ＢＢで刺激されたヒヒ平滑筋細胞により取込まれた［³Ｈ］チミジンの平均計数／分（ｃｐｍ）として表されている。抑制百分率の値は、［³Ｈ］チミジンの取込みの測定された減少から直接決定された。ＰＤＧＦ−ＢＢ有糸分裂誘発活性の投与量＝応答の表は、表８の中に含まれている。実験＃１において、ＰＤＧＦ−ＢＢで刺激された細胞に抗体１６９．３１を添加すると、１および０．１μｇ／ｍｌの抗体投与量において［³Ｈ］チミジンの取込みが顕著に抑制された。抗体１６９．３１と協調的にヘパリンを細胞に投与すると、組合わせで有効な抗有糸分裂誘発の結果が得られた、すなわち、［³Ｈ］チミジンの取込みは、単独で投与された抗体またはヘパリンについて測定したよりも、大きい程度に抑制された。実験＃１の抗体１６３．3１の分析において、抗体１６３．３１も２５μｇ／ｍｌの投与量において［³Ｈ］チミジンの取込みを抑制することができたが、そのレベルは抗体１６９．３１について観測されたレベルよりも非常に低いことが示された。ヘパリンを抗体１６３．３１と一緒に添加したとき、組合わせで有効な抑制がまた観察されたが、この効果はより高い抗体濃度において初めて見られた。抗体１６９．３１（１μｇ／ｍｌ）および１６３．３１（２５μｇ／ｍｌ）の協調的適用は、また、組み合わせで抗有糸分裂誘発性の結果を生じ、ここでヒヒ血管平滑筋細胞によるＰＤＧＦ−ＢＢ刺激された［³Ｈ］チミジンの取込みの抑制は、いずれかの抗体を単独で投与した後観測された抑制よりも大きかった。実験＃２において、抗体１６９．31および１６３．31を、個々の投与および互いとの協調的投与およびヘパリン(UH,，10μｇ／ｍｌ）との協調的投与のアッセイにおいて、さらに分析して、ヒヒ血管平滑筋細胞によるＰＤＧＦ−BB刺激［゜ H]チミジンの取込みに対する、これらの種々の処理の抗有糸分裂誘発活性を決定した。実験＃ｌの結果と同様に、２つの抗体の協調的投与は、いずれかの抗体の単独の投与よりも、いっそう有効なヒヒ血管平滑筋細胞に対する有糸分裂誘発活性の抑制を提供した。さらに、２つの抗体のプールとのヘパリンの協調的投与は、ヘパリンまたは抗体のプール単独により提供される抑制活性より大きい、組合わせで有効な抑制をもたらした。要約すると、これらのデータが証明するように、抗ＰＤＧＦ−アルファまたは抗ＰＤＧＦ−ベータ抗体のいずれかとの、または２つの抗体のプールとのヘパリンの協調的投与、ならびに抗体の互いとの協調的投与は、ヒヒ血管平滑筋細胞へのＰＤＧＦ＝ＢＢ有糸分裂誘発活性に対して組合わせで有効な処理を提供することができる。ヒヒ血清の有糸分裂誘発活性の抑制を、平行の組の実験において試験した。これらの実験は、本質的に前述したように、ＰＢＳで血清を１：４に希釈し、50μ １の希釈した血清を各ウェルに添加することによって、１．25％の最終濃度で被験ウェルに添加したヒヒ血清を用いて実施した。ＰＢＳ中でヒヒ血清を２倍に希釈し、５０μ１の適当な希釈物を添加して、細胞上の最終血清濃度をｌ．２５、０．62、Ｏ．31およびＯ．15％とすることによって、ヒヒ血清刺激についての投与量−応答のプロフィルを発生させた。ヒヒ血管平滑筋細胞に対する血清の有糸分裂誘発活性の抗体および抗体／ヘパリンの抑制についてのデータを、表９に表す。これらのデータが示すように、抗体１６９．31は、ｌ．25％のヒヒ血清により刺激された［゜H]チミジンの取込みに対して最小の抑制効果を、１μｇ／ｍｌまでの投与量において有した。ヘパリンを抗体１６９．31と一緒に細胞に協調的に投与したとき、観測された抑制レベルはヘパリン単独が示す抑制活性より大きくなかった。対照的に、モノクローナル抗体１６３．31を含むアッセイは、25μｇ／ｍｌの抗体濃度において［゜H]チミジンの取込みの有意な抑制を示した。そのうえ、ヘパリンを抗体１６３．31とともに協調的に投与したとき、［゜H]チミジンの取込みにより測定して、有糸分裂誘発活性の顕著な組合わせで有効な抑制、すなわち、抗体またはヘパリンの単独について観測された抗有糸分裂誘発効果よりもかなり高い抑制が存在した。この組合わせで有効な抑制は、0.２μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌの間のモノクローナル抗体１６３．３ｌ濃度において特に顕著であった。ｌ11ｇ／ｍｌの抗体１６９．31と、増加する投与量の抗体16３．31との協調的投与は、［゜H]チミジンの取込みの投与量に依存する抑制を示した。抗体１６９．31と抗体１６３．31との協調的投与も表９に示すように、血清の有糸分裂誘発活性の顕著な組合わせで有効な抑制を生じた。表９中のデータは、１．25％のヒヒ血清で剌激されたヒヒ平滑筋細胞により取込まれた［゜H]チミジンの平均計数／分（ｃｐｍ）として表されている。抑制百分率の値は、提示された血清投与量−応答のデータを使用して発生させた標準曲線から計算した。例１５単独で投与された、または抗ＰＤＧＦｒモノクローナル抗体とともに協調的に投与されたヘパリンによるヒヒ血管平滑筋細胞に対する血清の有糸分裂誘発活性の抑制未分画ヘパリン(UH) （Ｓｉｇｍａ、ミゾリ一州セントルイス）および低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）〔Ｌｏｇｉｐａｒｉｎ（商標）、ＮｏｖｏＮｏｒｄｉ sk、デンマーク国バグスベルド〕の双方を、ヒヒ血管平滑筋細胞に対するヒヒ血清の有糸分裂誘発活性を抑制するそれらの能力について評価した。各形態のヘパリンを、独立にまたは抗ＰＤＧＦｒモノクローナル抗体とともに協調的に投与した。これらの研究のために使用したＬＭＷＨは未分画ヘパリンのヘパリナーゼ処理により発生させ、そして５，５００ダルトンの平均分子量を有するヘパリン種から構成されている。ＬＭＷＨは、ＡＰＴＴアッセイにおいて未分画ヘパリンに比較して、約５０単位／ｍｇと推定される、減少した抗血栓活性を有する。協調的に投与された抗ＰＤＧＦｒ抗体を含む、および含まない、２つのヘパリン調製物の抗有糸分裂誘発活性を評価するために、大動脈外植片からのヒヒ血管平滑筋細胞（ＢＯ５４細胞と表示する）を、１０％胎仔ウシ血清を補充したＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）中において、２４ウェルの培養皿の中に２．５×１０⁴細胞／ウェルにおいてプレートした。細胞をこの培地中で３７℃において５％ＣＯ₂雰囲気の中で３日間維持した。次いで培地を１ｍｌ／ウェルのミト培地で置換し、細胞をこの培地中でさらに２４時間培養した。ヒヒ血清を被験ウェルに２．５％の最終濃度で添加した。これは血清をＰＢＳで１：１に希釈し、５０μｌの希釈した血清を各ウェルに添加することによって実施した。ヒヒ平滑筋細胞中のヒヒ血清で刺激したＤＮＡ合成の抑制についてヘパリン調製物を分析するために、ヘパリンを独立に、または２つの抗ＰＤＧＦｒモノクローナル抗体とともに協調的に細胞に添加した。ヘパリン試料をＰＢＳで４００μｇ／ｍｌの濃厚物に希釈し、次いで２５μｌの濃厚物を各被験ウェルに１０μｇ／ｍｌの最終ヘパリン濃度に添加した。対照ウェルにリン酸塩緩衝生理食塩水のみを添加した。抗ＰＤＧＦｒ−アルファモノクローナル抗体１６９．３１および抗ＰＤＧＦｒ−ベータモノクローナル抗体１６３．３１をＰＢＳで、それぞれ、４０μｇ／ｍｌおよび１ｍｇ／ｍｌに希釈し、２５μｌの希釈した抗体を適当な被験ウェルにモノクローナル抗体１６９．３１について１μｇ／ｍｌおよびモノクローナル抗体１６３．３１について２５μｇ／ｍｌの最終抗体濃度に添加した。処理物の添加後、細胞を３７℃において２０時間インキュベートした。例１４に開示されているように［³Ｈ］チミジンの細胞の取込みを測定することによって、平滑筋細胞の有糸分裂誘発刺激を評価した。この研究の結果を表１０に表す。ヘパリンまたは抗ＰＤＧＦｒモノクローナル抗体不存在においてのみ血清で処理された細胞は、３６，０３２ｃｐｍ／ウェルの［³Ｈ］チミジンの取込みの対照値を有した。協調的に投与された抗ＰＤＧＦｒ−アルファおよび抗ＰＤＧＦｒ−ベータモノクローナル抗体で細胞を処理すると、［³Ｈ］チミジンの取込みは２７，０００ｃｐｍに減少した（すなわち、血清刺激ＤＮＡ合成の２５％の抑制）。細胞をＵＨまたはＬＭＷＨのみで処理したとき、［³Ｈ］チミジンの取込みの有意な減少は存在しなかった。しかしながら、ＵＨまたはＬＭＷＨを細胞に抗ＰＤＧＦｒ抗体のプールとともに協調的に投与したとき、［³Ｈ］チミジンの取込みの有意な減少が観察された。データが証明するように、ＵＨおよびＬＭＷＨの双方は、抗ＰＤＧＦｒ−アルファおよび抗ＰＤＧＦｒ−ベータ抗体のプールとともに協調的に投与したとき、ヒヒ血管平滑筋細胞に対するオートロガス血清の有糸分裂誘発活性を組合わせで有効な方法において抑制する。ここで再び、達成された組合わせで有効な抑制の程度は、特定の試験した協調的に投与の方法において抗体とヘパリンとの間の相乗的または増強的関係を証明する。データは、２．５％のヒヒ血清で刺激されたヒヒ平滑筋細胞により取込まれた［³Ｈ］チミジンの計数／分（ＣＰＭ）についての平均＋／−標準偏差として表されている。添加したヘパリンおよび抗ＰＤＧＦＲ抗体の不存在における、対照値からの取込まれたｃｐｍの抑制百分率は、括弧内に表されている。抑制百分率の値は、血清刺激についての投与量−応答曲線に対する比較よりむしろ、［³Ｈ］チミジンの取込みの測定された減少から直接決定された。例１６未分画ヘパリンまたは低分子量ヘパリンとともに協調的に適用された抗ＰＤＧＦｒモノクローナル抗体によるヒヒ血管平滑筋細胞に対する血清の有糸分裂誘発活性の抑制の投与量−応答一定量の抗ＰＤＧＦｒアルファ抗体１６９．３１（１μｇ／ｍｌ）の存在における、抗ＰＤＧＦｒベータモノクローナル抗体１６３．３１の投与量−応答アッセイを実施して、ヒヒ血清により刺激されたヒヒ血管平滑筋細胞におけるＤＮＡ合成の抗ＰＤＧＦｒモノクローナル抗体の抑制の濃度依存性を評価した。この投与量−応答は、添加されたヘパリンの不存在において、ならびにＡＰＰＴアッセイにより約１５０単位／ｍｇの抗有糸分裂誘発活性を有する未分画ヘパリン（ＵＨ）（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．、ミゾリー州セントルイス）または低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）（ＬｏｇｉｐａｒｉｎＲ、ＡＰＰＴアッセイによりほぼ５０単位／ｍｇ）（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ、デンマーク国バグスベルド）の１０μｇ／ｍｌの存在において、評価された。これらの投与量−応答の研究のために、大動脈外植片からのヒヒ血管平滑筋細胞（ＢＯ５４細胞）を、１０％胎仔ウシ血清を補充したＤＭＥＭ中において、２４ウェルの培養皿の中に２．５×１０⁴細胞／ウェルにおいてプレートした。３日後、培地をミト培地と交換し、細胞をさらに２４時間培養した。ＰＢＳで１：１に希釈したヒヒ血清を５０μｌ／ウェルで添加して、細胞上の最終血清濃度を２．５％とすることによって、細胞を刺激して有糸分裂を行わせた。モノクローナル抗体１６３．３１をＰＢＳで希釈して４０×濃厚物にし、２５μｌの希釈した抗体を被験ウェルに添加して、細胞上の最終抗体濃度を２５μｇ／ｍｌ〜１．２５μｇ／ｍｌの範囲にした。２５μｌのモノクローナル抗体１６９．３１の４０μｇ／ｍｌ溶液をウェルに同時に添加して、１６３．３１処理したウェルのすべてにおいて最終抗体濃度を１μｇ／ｍｌとした。モノクローナル抗体１６３．３１および１６９．３１の組み合わせを、添加したヘパリンの不存在においておよび、また、UHまたはＬＭＷＨを使用する協調的投与アッセイにおいて、試験した。２つのヘパリン調製物をＰＢＳで４００μｇ／ｍｌの最終濃度にに希釈し、２５μｌの濃厚物を適当なウェルに添加して、細胞上の最終ヘパリン濃度を１０μｇ／ｍｌとした。ヘパリンを添加しない被験ウェルに、ＰＢＳのみを添加した。処理物を添加した後、細胞を３７℃において２０時間インキュベートした。例１４に開示されているように、［³Ｈ］チミジンの吸収を測定することによって、有糸分裂誘発活性を評価した。この研究の結果を表１１に表す。ヘパリンの不存在において、ヒヒ血管平滑筋細胞の有糸分裂誘発活性の有意な減少は、２５および１０μｇ／ｍｌの投与量のモノクローナル抗体１６３．３１を与えたウェルにおいてのみ観察された。しかしながら、ＵＨまたはＬＭＷＨのいずれかの存在において、試験したすべての濃度のモノクローナル抗体１６３．３１（モノクローナル抗体１６９．３１の存在において）は有意な組合わせで有効な抑制を提供し、２つのヘパリン調製物について本質的に同一の結果が得られた。ヘパリンの存在において、１．２５μｇ／ｍｌの投与量の１６３．３１は、ＤＮＡ合成の抑制において、ヘパリンの不存在における２５μｇ／ｍｌの投与量の１６３．３１よりも、いっそう有効であった。抗体に対して独立に投与されたＵＨまたはＬＭＷＨのいずれかの存在は、血清の有糸分裂誘発活性に対して最小の効果を有しただけである。例１７ネズミ抗ＰＤＧＦｒ−アルファモノクローナル抗体１６９．３１とマウス／ヒトキメラ抗ＰＤＧＦｒ−アルファ抗体との抗有糸分裂誘発活性の比較軽鎖および重鎖の可変ドメインをクローニングアウトするために、親抗体として抗ＰＤＧＦｒ−アルファモノクローナル抗体１６９．３１を使用して、マウス／ヒトキメラ抗体を発生させた。このマウス／ヒトキメラ抗体は、親ネズミモノクローナル抗体の可変ドメインと、ヒトＩｇＧ４重鎖およびヒトカッパ軽鎖のための定常ドメインとを含んでなる。この抗体の構築において、ＭｏｕｎｔａｉｎおよびＡｄａｉｒ「Ｂｉｏｔｅｃ．ａｎｄＧｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．」１０：１−１４２、１９９２；およびＡｄａｉｒ他「Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．」１３０：５−４０、１９９２、に記載されているような標準的技術を使用した。親ネズミ抗体およびマウス／ヒトキメラ抗体を、２％のヒヒ血清で刺激されたヒヒ血管平滑筋細胞（ＢＯ５４）のＤＮＡ合成を抑制する能力について直接比較した。親ネズミ抗体および化学抗ＰＤＧＦｒ−アルファ抗体を、１．０および０．１ μｇ／ｍｌにおいて、１０μｇ／ｍｌのネズミ抗ＰＤＧＦｒ−ベータ抗体１６３．３１および１０μｇ／ｍｌの未分画ヘパリンの存在下に分析した（Ｅｌｋｉｎｓ−Ｓｉｎｎ，Ｉｎｃ．、ニュージャージイ州チェリーヒル；比活性＝１５０単位／ｍｇ）。さらに、両抗ＰＤＧＦｒ−アルファ抗体（１μｇ／ｍｌ）を、１０ μｇ／ｍｌの化学抗ＰＤＧＦｒ−ベータ抗体（例１８を参照のこと）および１０ μｇ／ｍｌのヘパリンの存在下に、細胞に添加した。表１２に表す結果が証明するように、親ネズミモノクローナル抗体１６９．３１およびマウス／ヒトキメラ抗ＰＤＧＦｒ−アルファ抗体の両方は、親ネズミモノクローナル抗体１６３．３１またはマウス／ヒトキメラ抗ＰＤＧＦｒ−ベータ抗体のいずれかの存在下に、同様な抑制効力を有する。例１８ネズミ抗ＰＤＧＦｒベータモノクローナル抗体１６３．３１とマウス／ヒトキメラ抗ＰＤＧＦｒ−ベータ抗体との抗有糸分裂誘発活性の比較軽鎖および重鎖の可変ドメインをクローニングアウトするために、親抗体として抗ＰＤＧＦｒ−ベータモノクローナル抗体１６３．３１を使用して、マウス／ヒトキメラ抗体を発生させた。このマウス／ヒトキメラ抗体は、親ネズミモノクローナル抗体の可変ドメインと、ヒトＩｇＧ４重鎖およびヒトカッパ軽鎖の定常ドメインとを含んでなる。この抗体の構築において、キメラ抗ＰＤＧＦｒ−アルファ抗体について前述した技術（例１７）と同一のキメラ抗体の構築の標準的技術を使用した。親ネズミ抗体およびマウス／ヒトキメラ抗体を、２．０％のヒヒ血清で刺激されたヒヒ血管平滑筋細胞中のＤＮＡ合成を抑制する能力について直接比較した。ヒヒ血管平滑筋細胞（ＢＯ５４）を２４ウェルの培養プレート中で２×１０⁴ 細胞／ウェルの密度においてプレートし、３７℃において１０％胎仔ウシ血清を含有するＤＭＥＭ中でほぼ４８時間増殖させた。次いで細胞をミト培地中で２４時間インキュベートして、細胞を休止状態となるようにした。細胞の対照プレートを正常ヒヒ血清の２倍の希釈系列（２．０％〜０．１２５％）で刺激して、標準曲線を作成した。血清をＰＢＳ中で希釈し、５０μｌの２０×貯蔵液を三重反復実験においてウェルに直接添加した。抗ＰＤＧＦｒ−ベータモノクローナル抗体１６３．３１、またはキメラ抗ＰＤＧＦｒ−ベータ抗体の希釈系列を、適当な被験ウェルにおいて、抗ＰＤＧＦｒ− アルファモノクローナル抗体１６９．３１（１μｇ／ｍｌ）および未分画ヘパリン（２単位／ｍｌ）（Ｅｌｋｉｎｓ＝Ｓｉｎｎ，Ｉｎｃ．、ニュージャージイ州チェリーヒル）とともに協調的に投与して、２．０％のヒヒ血清により刺激されたヒヒ血管平滑筋細胞に対するこれらの処理の抑制効果を評価した。さらに、抗ＰＤＧＦｒ− ベータ親およびキメラ抗体を、独立の投与アッセイ、および抗体およびヘパリンを使用する協調的投与のアッセイにおいて分析した。２５μｌ／ウェルのＰＢＳ希釈４０×貯蔵液の抗体およびヘパリンを適当な被験ウェルに添加した。使用した抗体の濃度を表１３に示す。被験試料の投与後、細胞を３７℃において１８時間インキュベートした。［³ Ｈ］チミジンの吸収により、有糸分裂誘発活性を評価した。表１３に表す、抗ＰＤＧＦｒ−ベータモノクローナル抗体の投与量−応答の実験結果が証明するように、ヒヒ血清により誘発された有糸分裂誘発活性が２５μ ｇ／ｍｌの１６３．３１、１μｇ／ｍｌの１６９．３１および２単位／ｍｌのヘパリンの組み合わせによりほぼ８０％抑制された。キメラ抗ＰＤＧＦｒ−ベータモノクローナル抗体を使用して、同様な結果が得られた。ネズミおよびキメラの抗ＰＤＧＦｒ−ベータモノクローナル抗体の各々を、２５μｇ／ｍｌにおいて、抗ＰＤＧＦｒ−アルファモノクローナル抗体１６９．３１とともに協調的に投与すると、ヒヒ血清の有糸分裂誘発活性がほぼ３０％抑制された。ヘパリンとともに協調的に投与された抗ＰＤＧＦｒ−ベータモノクローナル抗体は、約４０％の抑制を生成した。抗有糸分裂誘発剤の各々は、独立に投与されたとき、ヒヒ血清の有糸分裂誘発活性の３０％より低い抑制を生じた。これらの結果が証明するように、マウス／ヒトキメラ抗ＰＤＧＦｒ−ベータ抗体は、親ネズミ抗ＰＤＧＦｒ−ベータ抗体のモノクローナル抗体１６３．３１の抑制活性と同様な抑制活性を有する。キメラ抗ＰＤＧＦｒ−ベータ抗体を抗ＰＤＧＦｒ−アルファモノクローナル抗体１６９．３１、ヘパリン、または抗ＰＤＧＦｒ−アルファモノクローナル抗体とヘパリンとの組み合わせのいずれかかとともに協調的に投与したとき、この活性はヒヒ血管平滑筋細胞に対する血清の有糸分裂誘発活性の組合わせで有効な抑制をもたらす。例１９独立にまたは抗ＰＤＧＦｒ抗体と協調的に投与されたヘパリンによるヒヒ血管平滑筋細胞以外血清の有糸分裂誘発活性の投与量−応答性抑制ヒヒ平滑筋細胞（ＢＯ５４）を２４ウェルの培養プレート中で２×１０⁴細胞／ウェルの密度においてプレートし、３７℃において１０％胎仔ウシ血清を含有するＤＭＥＭ中でほぼ７２時間増殖させた。次いでミト培地中で２４時間インキュベートすることによって、休止とさせた。未分画ヘパリン（ＵＨ；ほぼ１５０単位／ｍｇ）または低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ；ＬｏｇｉｐａｒｉｎＲ、ほぼ５０単位／ｍｇ）（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ、デンマーク国バグスバルド）の希釈系列を細胞に１５Ｕ／ｍｌ〜０．０６Ｕ／ｍｌの投与量範囲（細胞上の最終濃度）において添加することによって、２％のヒヒ血清による有糸分裂誘発の刺激をヘパリン単独で抑制する能力を試験した。両方のタイプのヘパリンについて同一希釈系列も、抗ＰＤＧＦｒ−ベータモノクローナル抗体１６３．３１（１０ μｇ／ｍｌ）および抗ＰＤＧＦｒ−アルファモノクローナル抗体１６９．３１（１μｇ／ｍｌ）の存在下に試験した。処理物の添加後、細胞を３７℃において１８時間インキュベートした。［³Ｈ］チミジンの吸収を測定することによって、血清の有糸分裂誘発活性を評価した。ヘパリンの投与量−応答の実験結果を表１４に表す。試験した最高の投与量においてヘパリン単独は、ヒヒ血管平滑筋細胞による［³Ｈ］チミジンの取込みに対して、中程度の抑制作用を有しただけであったが、抗ＰＤＧＦレセプター抗体とともに協調的に投与した同一投与量は血清の有糸分裂誘発活性の９０％までを組合わせで抑制した。Ｅｌｋｉｎｓ−Ｓｉｎｎの未分画ヘパリンについて１５０Ｕ／ｍｇ、そして低分子量ヘパリンについて５０Ｕ／ｍｇの比活性を仮定すると、２つのヘパリン調製物について使用する最高の投与量は、それぞれ、約１００および３００ μｇ／ｍｌであった。個々の投与のアッセイにおいて、これらの投与量は有糸分裂誘発活性の最小の抑制を与えただけであった。対照的に、１００倍低いヘパリンの投与量において、ヘパリンを抗ＰＤＧＦｒ抗体とともに協調的に投与したとき、抑制活性の組合わせの効果は有意に増加した。これらの結果が証明するように、有意に低い投与量のヘパリンを抗ＰＤＧＦｒ抗体とともに組合わせ的に有効な方法において使用して、抗体またはヘパリンの単独で達成される抑制レベルより、かなり高い抑制レベルを達成することができる。例２０抗ＰＤＧＦｒモノクローナル抗体およびヘパリンの協調的投与によるヒヒ大動脈外植片からの平滑筋細胞の移動の抑制抗ＰＤＧＦｒモノクローナル抗体を、ヘパリンの存在および不存在において、ヒヒ大動脈組織の外植片からのヒヒ血管平滑筋細胞の移動速度を減少する能力について、さらに試験した。ヒヒ大動脈外植片を例１１において本質的に記載したように構成した。インスリンおよびトランスフェリンを補充し、そして下記の被験試料を含有するＤＭＥＭ中で、外植片を培養した：１）抗ＰＤＧＦｒ−アルファモノクローナル抗体（１６９．３１）および抗ＰＤＧＦｒ−ベータモノクローナル抗体（１６３．３１）、各抗体の濃度は２５μｇ／ｍｌである、２）未分画ヘパリン（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．）（１００μｇ／ｍｌ）、３）抗ＰＤＧＦアルファレセプターモノクローナル抗体（１６９．３１）および抗ＰＤＧＦベータレセプターモノクローナル抗体（１６３．３１）（各々２５μｇ／ｍｌ）および未分画ヘパリン（１００μｇ／ｍｌ）、および４）ＤＭＥＭ（対照）。表１５に表すこれらの結果が証明するように、外植片の確立後７日において測定したとき、ヘパリン単独は平滑筋細胞の移動レベルを対照の８２％に減少したが、抗ＰＤＧＦレセプター抗体の組み合わせは移動を対照の６４％に減少した。抗ＰＤＧＦレセプター抗体およびヘパリンの双方の協調的投与は、移動レベルを対照の４２％にさらに減少した。したがって、ヘパリンおよび抗ＰＤＧＦレセプター抗体は、試験した協調的投与方法において、平滑筋細胞の移動を組合わせで抑制した。例２１ヘパリンの存在および不存在におけるＢ０５４細胞上のモノクローナル抗体１６３．３１の飽和結合の分析ヒヒ平滑筋細胞（Ｂ０５４）上の抗ＰＤＧＦｒ−ベータモノクローナル抗体１６３．３１の結合能力を、ヘパリンの存在および不存在において試験した。ヒヒ平滑筋細胞（ＢＯ５４）を２４ウェルの培養プレート中で２０，０００細胞／ウェルの密度においてプレートし、３７℃において１０％胎仔ウシ血清を含有するＤＭＥＭ中でほぼ４８時間増殖させた。細胞をミト培地中で２４時間インキュベートして休止状態にし、次いで４℃の結合培地（ＤＭＥＭ／ＨａｍｓＦ−１２、２５ｍＭＨｅｐｅｓ、０．１％ＢＳＡ）で１回洗浄した。ヘパリンの存在下に、４℃の結合培地中の¹² ⁵ Ｉ標識化モノクローナル抗体１６３．３１（¹²⁵Ｉ−１６３．３１）の４倍希釈物（２．１×１０⁶〜１×１０³ｃｐｍ／ｍｌの範囲）および１０μｇ／ｍｌのヘパリン（Ｅｌｋｉｎｓ−Ｓｉｎｎ，Ｉｎｃ．）を適当なウェルに三重反復実験において１ｍｌのアリコートで添加することによって、ＰＤＧＦｒ−ベータレセプター上のモノクローナル抗体１６３．３１の結合活性を分析した。別のプレート上で、¹²⁵Ｉ−１６３．３１の同一希釈系列をヘパリンの不存在において添加した。¹²⁵Ｉ−１６３．３１による特異的結合のレベルを決定するために、５．５ ×１０⁵ｃｐｍ／ウェルの¹²⁵Ｉ−１６３．３１＋２５μｇ／ｍｌの非標識化１６３．３１を含有する各プレート上で、ｌ組の三重反復実験ウェルを構成した。試料を添加する間、プレートを氷上に保持し、次いで回転式震盪培養機上で４℃において１．５時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞を抽出緩衝液（ＰＢＳ、１％ＮＰ−４０）とインキュベートし、抽出液を１２×７５ｍｍの管に収獲し、ガンマカウンター中で計数した。表１６に表す結合の研究の結果が証明するように、ヘパリンおよび抗体の協調的投与は抗体の結合に対して有意な効果をもたなかった。したがって、上記例に示されている、抗ＰＤＧＦｒ−ベータ抗体とともにヘパリンを協調的に投与する組合わせの有効性は、細胞表面のＰＤＧＦ−ベータレセプターへの抗体の結合のヘパリンによる刺激によるように思われない。例２２ヘパリンの存在および不存在におけるヒヒ血管平滑筋細胞上のＰＤＧＦ−ＢＢの飽和結合の分析ヒヒ血管平滑筋細胞上のＰＤＧＦ−ＢＢレセプターに結合するＰＤＧＦ−ＢＢの能力を、ヘパリンの存在および不存在において試験した。ヒヒ平滑筋細胞（ＢＯ５４）を２４ウェルの培養プレート中で２０，０００細胞／ウェルの密度においてプレートし、３７℃において１０％胎仔ウシ血清を含有するＤＭＥＭ中でほぼ４８時間増殖させた。次いで細胞をミト培地中で２４時間インキュベートして休止状態にし、次いで４℃の結合培地で１回洗浄した。ヘパリンの存在下に、４ ℃の１０μｇ／ｍｌのヘパリン（Ｅｌｋｉｎｓ−Ｓｉｎｎ，Ｉｎｃ．）を含有している結合培地中の¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢの２倍希釈物（２．１×１０⁵〜２．５×１０⁴ｃｐｍ／ｍｌの範囲）を適当なウェルに三重反復実験において１ｍｌのアリコートで添加することによって、ＰＤＧＦ−ＢＢレセプター上のＰＤＧＦ−ＢＢの結合活性を分析した。別のプレート上で、¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢの同一希釈系列をヘパリンの不存在において添加した。¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢによる非特異的結合のレベルを決定するために、各プレート上の１組の三重反復実験のウェルも２．０×１０⁵ｃｐｍ／ウェルの¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢ＋１μｇ／ｍｌの非標識化ＰＤＧＦ−ＢＢを含有した。試料を添加する間、プレートを氷上に保持し、次いで回転式震盪培養機上で４℃において１．５時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞を抽出緩衝液とインキュベートし、抽出液を１２×７５ｍｍの管に収獲し、ガンマカウンター中で計数した。表１７に表す結果は、ヘパリンの存在が¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢの結合に対して有意な効果をもたないことを証明する。したがって、上記例に示されている、抗ＰＤＧＦｒ抗体とともにヘパリンを協調的に投与する組合わせの有効性は、細胞表面のＰＤＧＦレセプターへのＰＤＧＦ−ＢＢの結合のヘパリンによる抑制によるように思われない。例２３ヘパリンの存在および不存在におけるモノクローナル抗体１６３．３１による平滑筋細胞へのＰＤＧＦ−ＢＢの結合の抑制ヘパリンの存在および不存在においてヒヒ血管平滑筋細胞上のＰＤＧＦベーターレセプターへの¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢの結合を抑制するモノクローナル抗体１６３．３１の能力を決定するために、実験を実施した。ヒヒ平滑筋細胞（ＢＯ５４）を２４ウェルの培養プレート中で２０，０００細胞／ウェルの密度においてプレートし、３７℃において１０％胎仔ウシ血清を含有するＤＭＥＭ中でほぼ４８時間増殖させた。細胞をミト培地中で２４時間インキュベートして休止状態にし、次いで４℃の結合培地で１回洗浄した。モノクローナル抗体１６３．３１を結合培地中で表１８に示す濃度に希釈し、次いで¹²⁵ Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢおよび１０μｇ／ｍｌ（Ｅｌｋｉｎｓ−Ｓｉｎｎ，Ｉｎｃ．）と混合し、混合物の１ｍｌのアリコートを三重反復実験においてＢＯ５４細胞のウェルに添加した。別のプレート上で、１６３．３１の同一希釈系列をヘパリンの不存在において¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢに添加した。¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢによる非特異的結合のレベルを決定するために、各プレート上の１組の三重反復実験のウェルは¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢ＋１μｇ／ｍｌの非標識化ＰＤＧＦ−ＢＢを含有した。試料を添加する間、プレートを氷上に保持し、次いで回転式震盪培養機上で４℃において１．５時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞を抽出緩衝液とインキュベートし、抽出液を１２×７５ｍｍの管に移し、ガンマカウンター中で計数した。表１８に表す結果は、ヘパリンの存在がヒヒ血管平滑筋細胞への¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢの結合に対してモノクローナル抗体１６３．３１の投与量依存的抑制活性に対して有意な効果をもたないことを証明する。したがって、上記例に示されている、抗ＰＤＧＦｒ抗体とともにヘパリンを協調的に投与する組合わせの有効性は、ＰＤＧＦ−ＢＢの結合に対する抗ＰＤＧＦｒ−ベータ抗体の抑制活性のパリンによる直接の刺激によるように思われない。例２４ヒヒの中へのモノクローナル抗体１６９．３１および１６３．３１の連続的静脈内注入およびヒヒ抗ネズミＩｇＧの応答の分析この研究は、静脈内または腹腔内への連続的注入後に、ネズミ抗ＰＤＧＦｒ抗体の循環レベルを監視するように計画された。それぞれ、３６および２２ｍｇ／ｍｌの概算濃度において２つの抗体を使用して、抗ＰＤＧＦｒモノクローナル抗体１６３．３１および１６９．３１のプールを調製した。抗体を１．５％のグリシン、０．２ＭのＮａＣｌ、および０．０１％のツイーン−２０の薬理学上許容される担体中で処方した。抗体のプールをアルゼット（Ａｌｚｅｔ）１４日の浸透圧ポンプの中に入れた。このポンプは２．１ｍｌの試料を含有し、そしてほぼ５μｌ／時の速度で送出す。２つのポンプを３匹の実験動物の各々の中に配置した。動物のうちの２匹は腹膜腔の中に腹腔内（ＩＰ）に配置されたポンプを有し、そして１匹の動物は皮下空間の中に配置されたポンプを有し、そして静脈系の中に配置されたサイラスティックカテーテルを使用して抗体を静脈内（ＩＶ）に送出した。血漿試料を実験動物からポンプ配置後１、７、１４、２１、および２８日において集めた。血漿試料をＥＬＩＳＡにより抗ＰＤＧＦｒ抗体の循環レベルについて分析した。さらに、血漿試料をネズミ抗体に対して向けられたヒヒ抗体の存在について分析した。ネズミ抗体について分析するために、９６ウェルのマイクロタイタープレートをヤギ抗マウスＩｇＧ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．）またはヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ、インジアナ州インジアナポリス）でＥＬＩＳＡＡ緩衝液中の１μｇ／ｍｌにおいてコーティングした。プレートを４℃においてインキュベートし、次いでＥＬＩＳＡＣ緩衝液で２回洗浄した。プレートをＥＬＩＳＡＢ緩衝液により３７℃において２時間ブロックし、次いでＥＬＩＳＡＣ緩衝液で２回洗浄した。ヒヒ血漿試料をＥＬＩＳＡＢ緩衝液で希釈し、次いで適当な被験ウェルに添加した。対照ヒヒ血漿中で希釈した、精製したモノクローナル抗体１６３．３１および１６９．３１の希釈物を１組の被験ウェルに添加して、ヒヒ血漿試料中の抗体レベルの定量において使用するための標準曲線を作成した。被験抗体試料を３７℃において２時間インキュベートし、次いでウェルをＥＬＩＳＡＣ緩衝液で２回洗浄した。次いでセイヨウワサビペルオキシダーゼと接合したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｔａｇｏ、カリフォルニア州バーリンゲイム）をウェルに添加し、プレートを３７℃においてさらに２時間インキュベートした。次いでウェルをＥＬＩＳＡＣ緩衝液で洗浄し、次いで反応緩衝液とほぼ１分間インキュベートした。反応を１ＮＨ₂ＳＯ₄の添加により停止させ、プレートを４９２ｎｍにおいてＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートリーダーにより読んだ。精製された抗体試料から得られた値を使用して、標準曲線を各抗体について作成し、ヒヒ血漿試料中の抗体濃度をこれらの曲線から決定した。表１９に表す結果が証明するように、静脈内（ｉ．ｖ．）注入動物においてポンプ配置後１日において循環抗体レベルのピークが存在したが、腹腔内注入動物においてピークの抗体レベルは第７日において見出された。第１４、２１および２８日において、循環抗体レベルは初期の時点において測定したピークレベルの１％より低かった。注入されたネズミ抗体に対して生じさせた有効なヒヒ抗体を測定する研究を、ＥＬＩＳＡを使用して実施した。１４日に測定された循環する抗体のレベルはネズミ抗体に対してヒヒにおいて生じた免疫応答のためであったことが、結果から示唆された。これらの発見が示唆するように、霊長類系において循環する抗ＰＤＧＦｒ抗体の持続するレベルを提供するためには、抗体の免疫原的可能性を最小にするように抗体を選択することは有用である。これは種々の好都合な手段により実施することができ、例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片を作るか、またはマウス／ヒトキメラ抗体または他の抗体断片または免疫原性が減少した構築物を構築することによって実施することができる。例２５カニクイザルにおけるキメラ抗ＰＤＧＦｒ−ベータ抗体の循環半減期の決定キメラ抗ＰＤＧＦｒ−ベータ抗体の代謝をカニクイザルにおいて決定した。これは¹²⁵Ｉ標識化抗体を使用して達成された。精製された抗体を、クロラミンＴ法により、¹²⁵Ｉでほぼ１０μＣｉ／μｇの抗体の比活性に標識化した。３匹の雄のカニクイザル（体重６．０〜６．６ｋｇ）を、この研究において使用した。実験の朝に、放射線標識化抗体を３ｍｌの注射器の中に吸引し、注入ポンプの中に入れた。サルをケタミンで麻酔し、ポリエチレン管に取付けられた２４ゲージの静脈内カテーテル（ＳＵＲＦＬＯ、ＴｅｒｕｍｏＭｅｄｉｃａｌＣｏｒｐ．、マリイランド州エルクトン）を伏在静脈にカニューレ挿入した。抗体を含有する注射器を管に取付け、注入を０．５ｍｌ／分の速度で開始し、次いで０．５ｍｌを生理食塩水でフラッシュした。各動物に３．１８ｍｇ／ｋｇ体重の抗体を投与した。注入直後に、血液のサンプリングを開始した。抗体の半減期を決定するために、試料をＥＤＴＡ含有バキュテイナー（ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）管の中に０、０．８０、０．２５、０．５、１、２、４、８、１２、２４、７２、１２０、１６８、２４０、３３６、５０４、および６７２時間において吸入した。血液を回転し、血漿をデカンテーションし、放射能をガンマカウンター中で測定した（８０％の効率）。¹²⁵Ｉについて崩壊速度を考慮して、血液中の計数を放射線標識化抗体の初期の比活性と比較することによって、血漿中の抗体濃度を決定した。血漿試料中の抗体濃度の分析は、抗体の半減期がほぼ５０時間であることを示した。例２６抗過形成剤を試験するためのヒヒにおける順次の動脈損傷モデルの発生および血管損傷後の治療霊長類において実験的に誘発させた内膜過形成を抑制する能力について抗ＰＤＧＦｒ抗体を試験できる、順次の動脈損傷の皮膚をヒヒにおいて生じさせた。このモデルは、２８日の間隔で誘発させた左右の動脈損傷を使用することによって、各動物がそれ自身の対照として作用できるように設計された。各々ほぼ１０ｋｇのヒヒをこの研究において使用した。初期の外科的処置は、ヒトのアテローム性動脈硬化症の治療するために臨床的応用において使用されているバルーン血管形成の血管再構成処置に密接に類似した。各動物について、初期のバルーン表皮剥離プルバック損傷（ｂｌｌｏｏｎｄｅｎｕｄａｔｉｏｎｐｕｌｌ−ｂａｃｋｉｎｊｕｒｙ）を伏在動脈に対して行った。第２８日に、動物に第２の外科的処置を行い、これにより初期の損傷した動脈を切除し、切除した動脈を１００ｍｍＨｇの圧力下に１０％ホルマリン溶液を使用して１時間ｅｘｖｉｖｏ灌流固定した。第１動脈の切除後、反対側の伏在動脈にバルーン表皮剥離損傷を行った。第２の２８日の期間後、第２の損傷した動脈を切除し、第１動脈と同様な方法においてｅｘｖｉｖｏ灌流固定した。双方の切除した動脈を多数の切片に分離し、パラフィンの中に埋め込んだ。切片を多数組織ブロックに切り、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、次いでコンピューター化画像分析システムを使用して形態測定分析により内膜病変の形成について分析した（Ｆｅｒｎｓｅｔａｌ．「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２５３：１１２９、１９９１）。表２０に表す研究結果が証明するように、初期の動脈損傷を２８日の間隔で行ってさえ、反対側の動脈についての内膜／中膜の比（Ｉ／Ｍ）は非常に類似した。これにより、初期の動脈損傷の存在、および引き続く損傷した動脈のセグメントの除去が第２の損傷した動脈の応答に影響を与えないことが示唆される。また、これらの結果が証明するように、内膜／中膜の比により測定した、動脈損傷の程度は、動物の間よりも動物内でいっそう類似する。これらの発見は順次の損傷のモデルの利用が可能であることを証明し、このモデルにおいて、ヒヒにおける内膜の病変の形成を抑制する治療化合物の効能を評価するために、各動物はそれ自身の対照として作用する。例２７霊長類における内膜過形成を抑制する抗ＰＤＧＦレセプター抗体／ヘパリンの療法の評価各々６〜１０ｋｇの体重のヒヒをを使用して、抗ＰＤＧＦｒモノクローナル抗体およびヘパリンの効能を研究した。各動物の１つの伏在動脈に対して２Ｆ塞栓切除用カテーテル（Ｆｏｇａｒｔｙ）を使用して、初期のバルーン表皮剥離プルバック損傷を実施した。損傷時において、大腿静脈カテーテルおよび皮下（ＳＱ）浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ）を挿入した（２８日ポンプ、２つのポンプ／動物）。ポンプは５μｌ／時の組合わせた速度を大腿静脈の中に送出した。第１の２８日の対照期間の間に、ポンプにプラシーボの生理食塩水に送入した。バルーン損傷後の２８日の期間の間に、動物に研究の第１、４、８、１５、および２２日にプラシーボの緩衝液をｉ．ｖ．注射した。研究の第２９日に、第２の外科的処置を行い、これにより前に損傷した動脈を切除し、１００ｍｍＨｇの圧力下に１０％ホルマリン溶液で１時間灌流固定した。次いで動脈をほぼ０．５ｃｍの長さの１０の切片に分割した。各組織片をパラフィンの中に埋め込み、ジアリー他（Ｇｅａｒｙｅｔａｌ．「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ」９１：２９７２、１９９５）により開示されたように、形態測定分析用切片を各組織ブロックから切断した。５μｍの厚さの切片を各ブロックから切り、ヴェルヘッフ−バンギエソン（Ｖｅｒｈｏｅｆｆ’ｓ−ｖａｎＧｉｅｓｏｎ’ｓ）染色法により染色した。断面を顕微鏡およびカメラルシダを有するコンピューター化ディジタル化パッド上に投影し、各断面の内膜および中膜の面積を測定した。各動脈について６〜８つの組織ブロックからの断面の測定値を平均することによって、各損傷動脈の平均値を決定した。大部分の端部組織のブロックをデータの分析から排除して、バルーン処置されなかった区域から切片を得ることを回避した。第１動脈の切除後、反対側の伏在動脈にバルーン表皮剥離損傷を行った。次いで、大腿静脈カテーテルおよびＳＱ浸透圧ポンプを挿入した。ポンプにブタのヘパリン、等級１１（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．、ミゾリー州セントルイス）を送入して、０．１３ｍｇ／ｋｇ／時の速度で送出した。ＭＬＡ（ニューヨーク州プレザントビレ）Ｅｌｅｃｔｒａ８００凝固機において商業的に入手可能なキット（ＨＥＰＴＥＳＴＡｓｓａｙ＃８０３、ＡｍｅｒｉｃａｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、コネチカット州グリーンウィッチ）を使用してＡＰＴＴ分析により、ヘパリンの循環レベルを監視した。研究において使用した投与量のヘパリンは、ＡＰＴＴのほぼ２倍の増加を生成した。研究の第１、４、８、１５、および２２日にマウス／ヒトキメラ抗ＰＤＧＦレセプター抗体（５０ｍＭの酢酸ナトリウム、１２５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０中の１０ｍｇ／ｍｌ）を動物に静脈内注射した。１０ｍｇ／ｋｇの投与量の抗ＰＤＧＦレセプター抗体を使用して、ほぼ５０μｇ／ｍｌの循環抗体レベルを得た。各抗体注射直前に血液を抜き取って、抗ＰＤＧＦレセプター抗体の循環レベルおよびヘパリンの循環レベルを測定した。循環抗体レベルはＥＬＩＳＡにより測定した。可溶性ＰＤＧＦベータレセプター／ＩｇＧ融合タンパク質を９６ウェルのマイクロタイタープレート上にコーティングした。プレートを０．１％ＢＳＡおよび０．０５％ツイーン２０を含有するＰＢＳでブロックして、非特異的結合を排除した。同一緩衝液中で調製したヒヒ血清の希釈物を、対照ヒヒ血清中で希釈した精製されたキメラ抗体の希釈系列と一緒に、ウェルに添加した。プレートを３７℃においてインキュベートし、次いで洗浄して未結合の抗体を除去した。次いで、セイヨウワサビペルオキシダーゼに接合したヤギ抗ヒトＩｇＧ₄（Ｚｙｍｅｄ、Ｓｏ．カリフォルニア州サンフランシスコ）を３７℃において１時間ウェルに添加した。ウェルを０．０５％ツイーン２０を含有するＰＢＳで洗浄し、次いでＯＰＤ基質溶液とインキュベートした。反応を１ＮＨ₂ＳＯ₄の添加により停止させ、プレートを４９０ｎｍにおいてダイナテクＥＬＩＳＡプレートリーダーで読んだ。データ点を標準曲線と比較することによって、循環抗体レベルを決定した。ヘパリンのレベルを前述したように決定した。さらに、セイヨウワサビペルオキシダーゼに接合したヤギ抗サルＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ、ノースカロライナ州ダーハム）を使用してＥＬＩＳＡにより、キメラ抗体に対して向けられたヒヒ抗体の応答について、動物を監視した。第２の２８日の期間後、第２の損傷動脈を切除し、第１動脈と同様な方法においてｅｘｖｉｖｏ灌流固定した。合計１５匹の動物を研究において記載した。順次の損傷モデルを使用する、上に開示した、予備的研究において、２８日間隔で損傷された動脈の間に低い変動性が存在することが証明された。予備的研究を分析すると、９５％の信頼限界で損傷の発生の５０％の減少を観測するために、ｎ＝１５が要求されることが示唆された。外科的処置を容易するために、動物を５匹の３グループに分割した。各動物についての第１処置の側をランダム化して、側面対側面の変動を排除した。前述したように、組織の切片を各被験動脈について得、各組織の切片について絶対的内膜および中膜の面積を決定した。次いで、各動脈について多数の切片のデータを平均して、内膜の面積、中膜の面積、および内膜／中膜の比について平均値を得た。血管形成部位において閉塞性血栓が存在するために、３匹の動物を研究から排除した。動脈断面の顕微鏡写真は、動脈処置した動脈に比較して、対照動脈において内膜の肥厚を示した。抗体処置した動物において、内膜過形成レベルについて左および右の足に有意差は認められなかった。データを表２１に要約する。動物の各々の循環抗体レベルを、処置前に、そして研究の第４、８、１５、２２、および２９日に測定した。一般に、抗体のレベルは研究日４および８において５０μｇ／ｍｌより大きかった。第１５日までに、動物のうちの３匹は５μｇ／ｍｌより低く低下した抗体レベルを有したが、残りの動物は１４〜７０μｇ／ｍｌの範囲のレベルを有した。第２２日までに、動物のうちの５匹だけは１７μ ｇ／ｋｇより大きい抗体レベルを有した。免疫応答についてのデータ（示されていない）は、循環するキメラ抗体レベルの低下が動物の免疫系による抗体のクリアランスの直接の結果であることを示唆した。循環する抗体のレベルと内膜病変の形成との間に相関が観察されず、これにより、最初に存在する抗体レベルは広範な内膜病変の発生を抑制するために十分であることが示唆され、そして、さらに、抗体投与のより短い期間は好適な結果を提供するであろうことが示唆される。前述のプロトコールを使用して、抗ＰＤＧＦレセプター抗体を、個々に、組合わせで、または種々の投与量のヘパリンの存在または不存在において、評価することができる。例えば、プールした抗ＰＤＧＦアルファレセプター（ＭＡｂ１６９．３．１）および抗ＰＤＧＦベータレセプター（ＭＡｂ１６３．３．１）抗体調製物、ならびに２つのキメラ抗体を個々に、評価するために使用することができる。内膜過形成の変化を探すための形態測定分析を使用することに加えて、病変の形成を監視するために使用できる追加の種類の分析は、血管造影、血管内超音波、および核磁気共鳴走査を包含する。さらに、組織試料は、縮小アテローム切除術による損傷の誘導後における多数の時点において、損傷部位から得ることができる。前述の発明を理解を明瞭とする目的で例示および例により多少詳細に説明したが、添付された請求の範囲の範囲内においてある種の変化および変更を行うことができることは明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 43/00 １１１Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ケナジー，リチャード，ディー. アメリカ合衆国，ワシントン 98125，シアトル，ノースイーストワンハンドレッドサードストリート，3018−ビー (72)発明者クロウズ，アレキサンダーアメリカ合衆国，ワシントン 98122，シアトル，フラートンアベニュ 702

Claims

【特許請求の範囲】１．哺乳動物にある量の血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）アンタゴニストおよびある量のヘパリンを協調的に投与することを含んでなり、前記協調的に投与されたアンタゴニストおよびヘパリンが組合わせにおいて内膜過形成を抑制するために有効である、哺乳動物の脈管構造における内膜過形成を抑制する方法。２．前記ＰＤＧＦアンタゴニストが非ペプチドのＰＤＧＦアンタゴニストである、請求項１に記載の方法。３．前記アンタゴニストが抗ＰＤＧＦレセプター抗体である、請求項１に記載の方法。４．前記アンタゴニストおよびヘパリンが、組合わせにおいて、血管平滑筋細胞の増殖、血管平滑筋細胞の移動、および細胞外基質の新内膜沈着から成る群より選択される内膜過形成プロセスを、血管損傷部位において、抑制するために有効である、請求項１に記載の方法。５．血管の過増殖性疾患を治療するためにヘパリンと一緒に投与すべき薬剤を製造するためのＰＤＧＦアンタゴニストの使用。６．前記ＰＤＧＦアンタゴニストが非ペプチドのＰＤＧＦアンタゴニストである、請求項５記載の使用。７．前記ＰＤＧＦアンタゴニストが抗ＰＤＧＦレセプター抗体である、請求項５記載の使用。８．前記抗体がモノクローナル抗ＰＤＧＦレセプター抗体である、請求項７記載の使用。９．前記抗体が抗ＰＤＧＦ−アルファレセプター抗体である、請求項７記載の使用。１０．前記抗体が抗ＰＤＧＦ−ベータレセプター抗体である、請求項７記載の使用。１１．前記抗体がヒト化抗体である、請求項７記載の使用。１２．前記抗体が一本鎖抗体である、請求項７記載の使用。１３．前記抗体がキメラ抗体である、請求項７記載の使用。１４．前記抗体がヒト−マウスキメラ抗体である、請求項１３記載の使用。１５．前記キメラ抗体がヒトの定常ドメインに作用可能に連鎖されたマウスの可変ドメインを含んでなる、請求項１４に記載の使用。１６．血管の過増殖性疾患を治療するために同時に、別々に、または順次に使用するための、組合わされた製剤として、ヘパリンと、ＰＤＧＦとを含有する製品。１７．前記ＰＤＧＦアンタゴニストが非ペプチドのＰＤＧＦアンタゴニストである、請求項１６に記載の製品。１８．前記ＰＤＧＦアンタゴニストが抗ＰＤＧＦレセプター抗体である、請求項１６に記載の製品。１９．前記抗体およびヘパリンをほぼ０．０１：１〜１００：１の抗体：ヘパリンの重量比で含んでいる、請求項１８に記載の製品。２０．前記比がほぼ０．０５〜２０：１である、請求項１９に記載の製品。２１．前記ヘパリンが抗血栓活性が減少した低分子量のヘパリンを含んでなる、請求項１６に記載の製品。２２．前記ヘパリンがヘパリン硫酸を含んでなる、請求項１６に記載の製品。２３．薬理学的に適当な担体中の抗血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）レセプター抗体と、薬理学的に適当な担体中のヘパリンとを含んでなる、哺乳動物の患者の脈管構造における内膜過形成の治療において使用するための医薬キット。２４．前記抗体および前記ヘパリンが単一の担体中で前もって組合わせられている、請求項２３に記載の医薬キット。２５．ヘパリンと、抗ＰＤＧＦレセプター抗体とを含んでなり、前記ヘパリンおよび前記抗体が哺乳動物の患者に同時、別々、または順次の送出しにより協調的に投与可能である、前記患者の脈管構造における内膜過形成の臨床的治療において使用するための医薬キット。