ES2685636T3 - Método de fijación y expresión de sustancia fisiológicamente activa - Google Patents

Abstract

ARNip para su uso en el tratamiento o la prevención de colitis, que es un ARNip de GalNAc4S-6ST desnudo de SEQ ID NO: 1 y/o 2 y va a inyectarse directamente en el tejido submucoso del tracto intestinal.

Description

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DESCRIPCION

Método de fijación y expresión de sustancia fisiológicamente activa Campo técnico

La presente invención se refiere a métodos para retener y expresar sustancias fisiológicamente activas de una manera específica de tejido diana, en los que las sustancias fisiológicamente activas se administran al tejido submucoso diana.

Técnica anterior

A nivel de experimentos no clínicos, ahora está volviéndose posible tratar animales de modelo de enfermedad usando técnicas de introducción de genes de interés, o a la inversa, supresión de la expresión de genes de interés mediante interferencia de ARN. En el caso de “agentes farmacéuticos de ácidos nucleicos” que usan tal gen o ARNip (generalmente denominado “ácido nucleico”), el ácido nucleico administrado al organismo vivo necesita producir de manera continua su efecto y retenerse a lo largo de un periodo prolongado. Un factor crítico en la obtención del efecto terapéutico de agentes farmacéuticos de ácidos nucleicos es cómo se diseña el sistema de administración de fármaco (DDS).

Mientras tanto, cuando se administran ácidos nucleicos al organismo tal cual, se degradan rápidamente y por tanto no logran funcionar. Por consiguiente, tales ácidos nucleicos se administran habitualmente usando un portador tal como un vector viral, liposoma o atelocolágeno como DDS.

Sin embargo, los agentes farmacéuticos de ácidos nucleicos presentan una grave desventaja en cuanto a que el propio portador puede inducir una respuesta inmunitaria adversa o similar en el organismo y por tanto debe evaluarse no sólo el ácido nucleico sino también el portador para determinar su influencia sobre el organismo. Por ejemplo, según un informe, el atelocolágeno, cuando se usa como portador, induce una reacción inmunitaria hipersensible frente al colágeno derivado de dermis de ternero; el manual de instrucciones (documento no de patente 1) adjunto al producto denominado implante de atelocolágeno Koken (tipo jeringa) describe que se encontraron clínicamente efectos adversos en 24 de un total de 1.192 pacientes.

Otro problema es que, aunque se use un portador, normalmente el ácido nucleico introducido sólo puede retenerse durante aproximadamente una semana.

Los documentos de la técnica anterior incluyen, por ejemplo, los documentos de patente 1 a 7 indicados a continuación. Sin embargo, todas estas invenciones usan portadores. Por tanto, los problemas anteriormente descritos todavía siguen sin resolverse.

[Documento de patente 1] Publicación de solicitud de patente japonesa Kohyo n.° (JP-A) 2003-516365 (publicación en fase nacional japonesa sin examinar correspondiente a una publicación internacional no japonesa)

[Documento de patente 2] Documento JP-A (Kohyo) 2005-538943

[Documento de patente 3] Documento JP-A (Kohyo) H09-505575

[Documento de patente 4] Publicación de solicitud de patente japonesa Saikohyo n.° (JP-A) WOO1-093856 (publicación en fase nacional japonesa sin examinar correspondiente a una publicación internacional japonesa)

[Documento de patente 5] Documento JP-A (Kohyo) 2005-503199

[Documento de patente 6] Publicación de solicitud de patente japonesa Kokai n.° (JP-A) 2007-119498 (solicitud de patente japonesa publicada sin examinar)

[Documento de patente 7] Patente japonesa n.° 4054352 (concedida/registrada)

[Documento no de patente 1] Manual de instrucciones adjunto al producto denominado implante de atelocolágeno Koken (tipo jeringa)

Cristofaro, P. et al. (19-24 de mayo de 2006) describen la administración intrarrectal de ARNip de A/C de lámina liposómica en un modelo de ratón de DSS de EII.

Divulgación de la invención

[Problemas que va a resolver la invención]

La presente invención proporciona métodos para retener y expresar localmente sustancias fisiológicamente activas en el sitio de administración. Específicamente, la presente invención proporciona métodos para retener y expresar sustancias fisiológicamente activas de una manera específica de tejido diana, en los que las sustancias fisiológicamente activas se administran a tejido submucoso diana.

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[Medios para resolver los problemas]

Los presentes inventores realizaron estudios dedicados para resolver las cuestiones anteriormente descritas. Específicamente, como método de resolución de los problemas anteriores, los presentes inventores evaluaron el establecimiento de un método novedoso que produce efectos de sustancias fisiológicamente activas sin usar portadores.

Específicamente, los presentes inventores realizaron un experimento de inyección de ácidos nucleicos, que son una realización de las sustancias fisiológicamente activas, en el tejido submucoso del intestino grueso en animales de experimentación tales como ratas, y evaluaron el efecto. El conocimiento común preveía que la disolución se perdería rápidamente debido a difusión o degradación. Sin embargo, los presentes inventores obtuvieron un resultado impredecible. Cuando los presentes inventores inyectaron realmente disoluciones que contenían ácidos nucleicos en tejidos submucosos, las disoluciones inyectadas se retuvieron en el sitio de administración sin difundir y produjeron efectos actuando como depósito. Esto sugiere que el microentorno submucoso es muy especial y el organismo vivo funciona como un portador usando su propio entorno. No se ha observado un fenómeno de este tipo con métodos de administración intramusculares, intravasculares o intramucosos anteriores, y por tanto es específico al microentorno submucoso. Específicamente, la presente invención descubrió que el propio organismo vivo tenía sitios que funcionan como un dDs. Por tanto, los presentes inventores lograron establecer el concepto novedoso de “DDS natural” y un método novedoso basado en el mismo.

Se ha mostrado que el tejido submucoso del tracto intestinal es mucho más eficaz que otras matrices, por ejemplo, cuando se cultivan islotes pancreáticos de Langerhans in vitro (Tian XH et al. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 4: 524, 2005). Incluso esto muestra que los tejidos submucosos tienen un microentorno muy especial. En particular, se supone que el pH, cadenas de azúcares y composición celular submucosos crean un entorno que es muy adecuado para mantener ácidos nucleicos.

Además, los presentes inventores inyectaron iopamidol, tinta china o ARNip, cada uno de los cuales es una realización de las sustancias fisiológicamente activas, en el tejido submucoso del intestino grueso en ratas y ratones. El resultado mostró que todas las sustancias se retuvieron de manera selectiva en los sitios de inyección en el tejido submucoso del intestino grueso.

Los presentes inventores descubrieron que, cuando se administró ARNip en el tejido submucoso de ratones de modelo de colitis, el aumento de la expresión del gen GalNAc4S-6ST en el intestino grueso se suprimió significativamente mientras que no tuvo ninguna influencia sobre otros órganos normales. Además, también se reveló que la supresión de la expresión del gen GalNAc4S-6ST en el intestino grueso dio como resultado la supresión de actividad inflamatoria y por tanto una fuerte supresión de la degeneración fibrótica intestinal. Además, también se demostró el efecto terapéutico histológico basándose en el hallazgo de que la administración suprime significativamente la alteración epitelial, infiltración de células inflamatorias en la lámina propia y submucosa, y el engrosamiento de la capa muscular en el tejido del intestino grueso.

Tal como se describió anteriormente, la presente invención demostró que, cuando se administran ácidos nucleicos por vía endoscópica en los tejidos submucosos del intestino grueso de sujetos, los ácidos nucleicos se retuvieron específicamente en el sitio de administración a lo largo de un periodo prolongado y pudieron producir de manera continua su efecto. La presente invención también permite que sustancias fisiológicamente activas produzcan sus efectos sin ayuda de un portador, y por tanto ha resuelto el problema anterior asociado con el uso de portadores.

La presente invención se refiere a un ARNip para su uso en el tratamiento o la prevención de colitis, que es un ARNip de GalNAc4S-6ST desnudo de SEQ Id NO: 1 y/o 2, y va a inyectarse directamente en el tejido submucoso del tracto intestinal, en el que la colitis es preferiblemente enfermedad inflamatoria del intestino o enfermedad de Crohn.

La divulgación se refiere a métodos para retener y expresar sustancias fisiológicamente activas de una manera específica de tejido, en los que las sustancias fisiológicamente activas se administran al tejido submucoso, y más específicamente,

[1] método para retener y expresar una sustancia fisiológicamente activa de una manera específica de tejido submucoso diana, en el que la sustancia fisiológicamente activa se administra en el tejido submucoso;

[2] método según [1], en el que la sustancia fisiológicamente activa se selecciona de ácidos nucleicos, proteínas, hidratos de carbono, lípidos o compuestos de bajo peso molecular;

[3] método según [2], en el que el ácido nucleico es un ARNip; y

[4] método según uno cualquiera de [1] a [3], en el que la sustancia fisiológicamente activa se administra en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.

La presente invención también proporciona:

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[5] método para tratar o prevenir una enfermedad, que comprende la etapa de retener y expresar una sustancia fisiológicamente activa de una manera específica de tejido submucoso, mediante administración de la sustancia fisiológicamente activa al tejido submucoso enfermo.

[Efectos de la invención]

La presente invención proporciona un sistema de administración de fármaco (DDS) para mantener una sustancia fisiológicamente activa (por ejemplo, un ácido nucleico, proteína, hidrato de carbono, lípido, compuesto de bajo peso molecular, etc.) en un tejido submucoso diana a lo largo de un periodo prolongado, para producir de manera continua una sustancia fisiológicamente activa útil para el organismo vivo, o para retirar de manera continua una sustancia fisiológicamente activa que es perjudicial para el organismo vivo. La presente invención permite una retención segura y eficaz de sustancias fisiológicamente activas en los sitios de administración a lo largo de periodos prolongados sin ayuda de un portador. Por tanto, pueden retenerse sustancias fisiológicamente activas sin tener en cuenta efectos secundarios de portadores como anteriormente. Esto aumenta significativamente la viabilidad clínica de agentes farmacéuticos que usan sustancias fisiológicamente activas (por ejemplo, agentes farmacéuticos de ácidos nucleicos). Además, los agentes farmacéuticos anteriormente descritos tienen muy pocos efectos secundarios sistémicos, ya que producen específicamente sus efectos en los sitios de inyección. Por tanto, los agentes farmacéuticos son mucho más seguros que los métodos convencionales.

La exploración endoscópica (del esófago, estómago e intestinos delgado y grueso) se lleva a cabo de manera rutinaria cuando se diagnostican enfermedades gastrointestinales. Por tanto, la presente invención tiene la ventaja de que pueden inyectarse (para tratamiento) sustancias fisiológicamente activas (por ejemplo, ácidos nucleicos) al mismo tiempo que el diagnóstico. También se espera que la presente invención sea aplicable a los tejidos submucosos de la nariz, el tejido subconjuntival, o similares, y por tanto permite el uso clínico real de productos farmacéuticos para enfermedades de pares craneales o enfermedades oftálmicas, en las que en el pasado ha sido difícil administrar sustancias fisiológicamente activas. Por tanto, los métodos de la presente invención tienen un efecto superior al de los métodos de administración local convencionales, específicamente, enemas, goteos nasales e instilaciones oculares.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra fotografías de imágenes histológicas 24 horas tras la inyección de ARNip marcado con FITC en los tejidos submucosos de intestinos gruesos de rata. Las imágenes muestran la retención del ARNip en los tejidos submucosos.

A: una imagen del tejido submucoso del intestino grueso; B: una imagen observada con un microscopio de fluorescencia tras la tinción con FITC; C: una imagen obtenida mediante superposición de A con B.

Figura 2: fotografías que muestran la retención de una sustancia administrada en el tejido submucoso del intestino grueso en ratas normales. Un hallazgo de rayos X mostró que iopamidol (blanco; dentro del círculo) se retenía en un sitio específico dentro del intestino grueso (izquierda). En esta figura, los paneles superiores muestran imágenes en vista lateral, y el panel inferior muestra una imagen aumentada. El hallazgo de ACT (derecha) mostró que iopamidol se retenía en el sitio de inyección en el lado ventral del intestino grueso (panel superior) pero no podía detectarse en el corte craneal (panel inferior).

La figura 3 es una fotografía que muestra la retención de una sustancia administrada en el tejido submucoso del intestino grueso en un ratón normal. Se retuvieron partículas de carbono (negro) dentro del tejido submucoso del intestino grueso.

La figura 4 muestra fotografías que representan la retención de un ácido nucleico administrado en el tejido submucoso del intestino grueso en un ratón normal. Se retuvo ARNip marcado con FITC (verde) en un sitio específico en el intestino grueso. Imágenes obtenidas con un microscopio estereoscópico de fluorescencia; el aumento es de 8,6, 39 ó 102 veces desde la izquierda.

La figura 5 es un gráfico que muestra la cinética de un ácido nucleico administrado en el tejido submucoso del intestino grueso en un ratón normal. El gráfico muestra las concentraciones de ARNip retenidas en el intestino grueso 0,5, 3, 6 y 24 horas tras la inyección en el tejido submucoso del intestino grueso. La barra más a la derecha (negro) es un control positivo, que indica la concentración de ARNip antes de la inyección.

La figura 6 muestra un resultado de electroforesis en gel de agarosa tras una prueba de estabilidad a 37°C. El panel superior muestra el patrón de ARNip de GalNAc4S-6ST solo; el panel central muestra el patrón de ARNip de GalNAc4S-6ST tratado con ribonucleasa; el panel inferior muestra ARNip de GalNAc4S-6ST incrustado en atelocolágeno tratado con ribonucleasa. El tiempo muestra la duración de la reacción a 37°C.

La figura 7 muestra gráficos que representan los resultados sobre el efecto de un ácido nucleico administrado en el tejido submucoso del intestino grueso en ratones de modelo de colitis inducida por sulfato sódico de dextrano (DSS). En el modelo de colitis por DSS, el ARNip inyectado en el tejido submucoso del intestino grueso suprimió la expresión potenciada de GalNAc4S-6ST en el intestino grueso. Mientras tanto, el ARNip no tuvo ningún efecto sobre

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el riñón.

La figura 8 muestra gráficos que representan un efecto de supresión de la actividad inflamatoria de un ácido nucleico administrado en el tejido submucoso del intestino grueso en ratones de modelo de colitis por DSS. El panel izquierdo muestra la consistencia de las deposiciones, mientras que el panel derecho muestra sangre oculta en heces. La administración de ARNip en el tejido submucoso del intestino grueso dio como resultado la supresión de actividad de enfermedad.

La figura 9 es un gráfico que muestra el efecto de mejora de la longitud del colon de un ácido nucleico administrado en el tejido submucoso del intestino grueso en ratones de modelo de colitis por DSS. La administración de ARNip en el tejido submucoso del intestino grueso suprimió significativamente la contracción del intestino grueso.

La figura 10 muestra fotografías que representan el efecto de mejora del tejido de un ácido nucleico administrado en el tejido submucoso del intestino grueso en ratones de modelo de colitis por DSS. La administración de ARNip en el tejido submucoso de intestino grueso suprimió significativamente la alteración epitelial, inflamación y fibrosis asociada con colitis. Tinción con HE; aumento de 100 veces.

Mejor modo de llevar a cabo la invención

Los presentes inventores descubrieron que administrando directamente sustancias fisiológicamente activas en tejidos submucosos, estas sustancias fisiológicamente activas se retienen en los sitios de administración a lo largo de un periodo prolongado sin pérdida o difusión, y ejercen efectos actuando como depósito.

La presente invención proporciona métodos para retener y expresar sustancias fisiológicamente activas de una manera específica de tejido diana, en los que las sustancias fisiológicamente activas se administran al tejido submucoso.

En el presente documento, “mucoso” (“mucosa”) se refiere más específicamente a la membrana macroscópica que cubre la superficie de la luz de órganos huecos tales como el tracto gastrointestinal, aparatos respiratorio y urogenital, incluyendo membranas que cubren la superficie de canales auditivos, la cavidad del oído medio que se conecta con las vías respiratorias, y las conjuntivas bulbar y palpebral. Normalmente, el epitelio es la capa más externa y la capa subyacente es la lámina propia de la membrana mucosa.

Tal como se usa en el presente documento, “tejido submucoso (capa submucosa)” se refiere al tejido bajo la lámina propia que soporta el epitelio. Sin embargo, en la práctica clínica real un “tejido submucoso” puede distinguirse dependiendo de la “impresión” de un médico, y por tanto puede interpretarse que el tejido subepitelial es “tejido intramucoso” y tejido más profundo entre la mucosa y el músculo puede identificarse como “tejido submucoso”.

En la presente invención, el “tejido submucoso” no está particularmente limitado, siempre que sus propiedades (pH, cadenas de azúcares, composición celular, etc.) sean apropiadas para mantener las sustancias fisiológicamente activas de la presente invención. Tales tejidos submucosos incluyen, por ejemplo, los del tracto intestinal, ojo, oído, nariz, útero, vejiga urinaria o cavidad bucal, tejidos subcutáneos, o similares, pero no se limitan a estos ejemplos.

En particular, se ha demostrado que los tejidos submucosos del tracto intestinal son mucho más eficaces que otras matrices cuando se cultivan islotes pancreáticos de Langerhans in vitro (Tian XH et al. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 4: 524, 2005). Esto también sugiere que los tejidos submucosos del tracto intestinal pueden tener un microentorno muy especial. Más específicamente, en una realización preferida de la presente invención, los tejidos submucosos incluyen aquellos del tracto intestinal.

Tales “tejidos submucosos del tracto intestinal” incluyen, por ejemplo, los de tractos intestinales tales como el esófago, estómago, duodeno, intestino delgado, apéndice, intestino grueso y recto. En una realización preferida de la presente invención, los tejidos submucosos del tracto intestinal incluyen tejido submucoso del intestino grueso.

En el presente documento, “sustancia fisiológicamente activa” es un nombre general para sustancias químicas que ejercen diversos efectos biológicos en organismos vivos, y no está particularmente limitada. En la presente invención, una sustancia fisiológicamente activa se selecciona preferiblemente, por ejemplo, de ácidos nucleicos, proteínas, hidratos de carbono, lípidos o compuestos de bajo peso molecular.

Los “ácidos nucleicos” dados a conocer en el presente documento se refieren tanto a ARN como a ADN. Análogos de ácidos nucleicos químicamente sintetizados, tales como los denominados “ANP” (ácidos nucleicos peptídicos) u oligómeros antisentido de morfolino, también quedan incluidos en los ácidos nucleicos de la presente divulgación.

Los ANP son ácidos nucleicos en los que la estructura principal fundamental de ácidos nucleicos, la estructura principal de pentosa-fosfato, se sustituye por una estructura principal de poliamida con unidades de glicina, y los oligómeros antisentido de morfolino son ácidos nucleicos en los que la estructura principal de pentosa-fosfato se sustituye por una estructura principal de morfolino. Los ANP y oligómeros antisentido de morfolino tienen una estructura tridimensional bastante similar a la de ácidos nucleicos.

Para suprimir la expresión de genes objetivo (diana), los ácidos nucleicos de la presente invención incluyen, por

ejemplo, ácidos nucleicos antisentido contra transcriptos de genes diana o partes de los mismos, ácidos nucleicos con la actividad ribozima de escindir específicamente transcriptos de genes diana, y ácidos nucleicos con la actividad de usar el efecto de iARN para inhibir la expresión de genes diana.

Los expertos en la técnica conocen bien métodos para suprimir la expresión de genes endógenos específicos 5 usando tecnología antisentido. Hay varias causas para la acción de ácidos nucleicos antisentido en la supresión de la expresión de genes diana, incluyendo:

inhibición del inicio de la transcripción mediante formación de tríplex;

inhibición de la transcripción mediante formación de híbridos en un sitio con una estructura de bucle abierto local generada mediante una ARN polimerasa;

10 inhibición de la transcripción mediante formación de híbridos con el ARN que está sintetizándose;

inhibición del corte y empalme mediante formación de híbridos en una unión intrón-exón;

inhibición del corte y empalme mediante formación de híbridos en el sitio de formación de empalmosoma;

inhibición del transporte desde el núcleo hasta el citoplasma mediante formación de híbridos con ARNm;

inhibición del inicio de la traducción mediante formación de híbridos en el sitio de ocupación de sitios activos o sitio 15 de adición de poli(A);

inhibición del inicio de la traducción mediante formación de híbridos en el sitio de unión a factor de inicio de la traducción;

inhibición de la traducción mediante formación de híbridos en el sitio de unión a ribosoma adyacente al codón de iniciación;

20 inhibición de la elongación de la cadena peptídica mediante formación de híbridos en la región de traducción de ARNm o en el sitio de unión a polisoma de ARNm; e

inhibición de la expresión génica mediante formación de híbridos en los sitios de interacción proteína-ácido nucleico (Hirashima e Inoue, Shin Seikagaku Jikken Koza 2 (New Courses in Experimental Biochemistry 2), Kakusan (Nucleic Acids) IV: “Idenshi no Fukusei to Hatsugen (Gene replication and expression)”, Ed. The Japanese Biochemical 25 Society, Tokyo Kagakudojin, 1993, págs. 319-347). Hay causas para la acción de ARN antisentido en la supresión de la expresión de genes diana que incluye la inhibición de la expresión génica mediante un efecto de iARN de la formación de ARN bicatenario mediante formación de híbridos con ARNm, y similares. Por tanto, los ácidos nucleicos antisentido inhiben la expresión de genes diana inhibiendo diversos procesos, tales como transcripción, corte y empalme, y traducción.

30 Los ácidos nucleicos antisentido pueden inhibir la expresión y/o función de genes diana, basándose en cualquiera de las acciones anteriormente descritas. En una realización, secuencias antisentido diseñadas para ser complementarias a una región no traducida adyacente al extremo 5' de un ARNm para un gen diana pueden ser eficaces para inhibir la traducción del gen. También pueden usarse secuencias complementarias a una región codificante o región no traducida en 3'. Por tanto, los ácidos nucleicos antisentido que van a usarse en la presente 35 invención incluyen no sólo ácidos nucleicos que comprenden secuencias antisentido con respecto a las regiones codificantes, sino también ácidos nucleicos que comprenden secuencias antisentido con respecto a regiones no traducidas de genes diana. Tales ácidos nucleicos antisentido que van a usarse se unen en sentido 3' de promotores adecuados y preferiblemente se unen con señales de terminación de la transcripción en el lado de 3'. Los ácidos nucleicos así preparados pueden introducirse en animales deseados (células) usando métodos conocidos. Las 40 secuencias de los ácidos nucleicos antisentido son preferiblemente complementarias a un gen diana o parte del mismo que es endógeno a los animales (células) que van a transformarse con los mismos. Sin embargo, no se necesita que las secuencias sean perfectamente complementarias, siempre que los ácidos nucleicos antisentido puedan suprimir eficazmente la expresión de un gen. Los ARN transcritos tienen preferiblemente el 90% o más, y lo más preferiblemente el 95% o más, de complementariedad con respecto al gen diana. Para inhibir eficazmente la 45 expresión de genes diana usando ácidos nucleicos antisentido, los ácidos nucleicos antisentido tienen preferiblemente al menos 15 nucleótidos de longitud y menos de 25 nucleótidos de longitud. Sin embargo, las longitudes de los ácidos nucleicos antisentido de la presente invención no están necesariamente limitadas a las longitudes mencionadas anteriormente, y pueden tener 100 nucleótidos o más, o 500 nucleótidos o más.

La expresión de los genes diana anteriormente mencionados también puede inhibirse usando ribozimas o ADN que 50 codifican para ribozimas. Las ribozimas se refieren a moléculas de ARN con actividad catalítica. Hay diversas ribozimas con diferentes actividades. Entre otros, estudios que se han centrado en ribozimas que funcionan como enzimas de escisión de ARN han permitido el diseño de ribozimas que escinden ARN de una manera específica del sitio. Algunas ribozimas tienen 400 o más nucleótidos, tales como ribozimas de tipo intrón de grupo I y ARN de M1, que está compuesto por ARNasa P, pero otras, denominadas ribozimas en cabeza de martillo y horquilla, tienen un

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dominio catalítico de aproximadamente 40 nucleótidos (Koizumi, M. y Otsuka, E., Tanpakushitsu Kakusan Koso (Proteína, ácido nucleico y enzima) 1990, 35, 2191).

Por ejemplo, el dominio autocatalítico de una ribozima en cabeza de martillo escinde la secuencia G13U14C15 en el lado de 3' de C15. Se ha mostrado que el apareamiento de bases entre U14 y A9 es esencial para esta actividad, y la secuencia puede escindirse cuando se sustituye C15 por A15 o U15 (Koizumi, M. et al., FEBS Lett. 1988, 239, 285; Koizumi, M. y Otsuka, E., Tanpakushitsu Kakusan Koso (Proteína, ácido nucleico y enzima) 1990, 35, 2191; y Koizumi, M. et al., Nucl. Acids Res. 1989, 17, 7059).

Además, las ribozimas en horquilla también son útiles. Tales ribozimas se encuentran, por ejemplo, en la cadena negativa de ARN satélite de virus de mosaico anular del tabaco (Buzayan, J.M., Nature 1986, 323, 349). Se ha mostrado que también pueden crearse ribozimas de escisión de ARN específicas de diana a partir de ribozimas en horquilla (Kikuchi, Y. y Sasaki, N., Nucl Acids Res. 1991, 19, 6751; y Kikuchi, Y. Kagaku to Seibutsu (Química y biología) 1992, 30, 112). Por tanto, la expresión de los genes diana anteriormente descritos puede inhibirse usando ribozimas para escindir específicamente los transcriptos génicos.

Los ácidos nucleicos de la presente invención incluyen ácidos nucleicos con la actividad de inhibición de usar el efecto de iARN (ARNip).

La expresión de genes diana puede suprimirse mediante interferencia de ARN (abreviado a continuación en el presente documento como “iARN”), usando ARN bicatenarios que comprenden una secuencia igual o similar a una secuencia de gen diana.

iARN es un fenómeno en el que se degrada un ARNm que comprende una secuencia de bases complementaria a un ARN bicatenario. iARN es un método basado en este fenómeno, en el que se suprime la expresión de un gen arbitrario introduciendo artificialmente un ARN bicatenario de 21 a 23 meros (ARN de interferencia pequeño; ARNip). En 1998, Fire et al. descubrieron usando C. elegans que ARN bicatenario silencia genes de una manera específica de secuencia (Fire, A. et al., Nature 1998, 391, 806-811). Tras esclarecer el mecanismo subyacente de la escisión de ARNm mediante ARN bicatenario procesado de 21 a 23 meros (Zamore PD. et al., Cell 2000, 101, 25-33), la identificación del complejo de silenciamiento inducido por ARN (RlSC) (Hammond, S.M. et al., Science 2001, 293, 1146-1150) y la clonación de Dicer (Bernstein, E. et al., Nature, 409, 363-366), Elbashir et al. demostraron en 2001 que el ARNip también podía suprimir la expresión de una manera específica de secuencia en células de mamífero (Elbashir SM. et al., Nature 2001, 411, 494-498). Por tanto, se espera la aplicación de iARN a la terapia génica.

Los ácidos nucleicos con actividad inhibitoria basados en el efecto de iARN se denominan generalmente ARNip o ARN en horquilla pequeños (ARNhp). La iARN es un fenómeno en el que, cuando en células o similares se introducen ARN bicatenarios pequeños (abreviados a continuación en el presente documento como “ARNbc”) que comprenden ARN sentido que comprenden secuencias homólogas a los ARNm de un gen diana, y ARN antisentido que comprenden secuencias homólogas a una secuencia complementaria a los mismos, los ARNbc se unen de manera específica y selectiva a los ARNm de gen diana, inducen su alteración, y escinden el transcripto génico, inhibiendo así eficazmente (suprimiendo) la expresión de genes diana. Por ejemplo, cuando se introducen ARNbc en células, se suprime la expresión de genes con secuencias homólogas a los ARN (se silencian los genes). Tal como se describió anteriormente, la iARN puede suprimir la expresión de genes diana, y por tanto está atrayendo atención como método aplicable a la terapia génica, o como método de desactivación génica sencillo que sustituye a métodos convencionales de alteración génica, que se basan en recombinación homóloga complicada e ineficaz. No es necesario que los ARN que van a usarse en iARN sean perfectamente idénticos a los genes diana o partes de los mismos; sin embargo, preferiblemente los ARN son perfectamente homólogos a los genes o partes de los mismos.

Las dianas de los ARNip que van a diseñarse no están particularmente limitadas, siempre que sean regiones de genes diana. Cualquier región del gen puede ser un candidato para una diana.

El ARN bicatenario anteriormente descrito también puede estar cerrado en un extremo con una estructura en horquilla (ARNhp). Los ARNhp son moléculas de ARN con una estructura de tallo-bucle, dado que una parte de la cadena sencilla constituye una cadena complementaria a otra parte. Por tanto, las moléculas que pueden formar un ARN bicatenario intramolecular también están incluidas en los ARNip.

Por ejemplo, incluso ARN bicatenarios con una estructura que tiene una deleción o adición de una o de un número pequeño de bases están incluidos en los ARNip de la presente invención, siempre que tengan la función de suprimir la expresión de genes diana mediante un efecto de íaRn.

Algunos detalles del mecanismo de iARN todavía no se entienden bien, pero se sabe que una enzima denominada “DICER” (un miembro de la familia de nucleasas de ARNasa III) se une a un ARN bicatenario y lo degrada para dar pequeños fragmentos, denominados “ARNip”. Los ARN bicatenarios de la presente invención que tienen un efecto de iARN incluyen tales ARN bicatenarios antes de degradarse mediante DICER. Específicamente, dado que incluso los ARN largos que no tienen ningún efecto de iARN cuando están intactos pueden degradarse para dar ARNip que tienen efecto de iARN en células, la longitud de los ARN bicatenarios de la presente invención no está particularmente limitada.

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Por ejemplo, ARN bicatenarios largos que cubren el ARNm de longitud completa o casi de longitud completa de un gen diana pueden digerirse previamente, por ejemplo, mediante DICER, y después también pueden usarse los productos de degradación. Se espera que estos productos de degradación contengan moléculas de ARN bicatenario con efecto de iARN. Con este método, no es necesario seleccionar específicamente las regiones que se espera que tengan efecto de iARN. Dicho de otro modo, no es necesario determinar con exactitud regiones con efecto de iARN en los ARNm de los genes anteriormente descritos.

Los ARNip dados a conocer en el presente documento no son necesariamente pares individuales de ARN bicatenarios dirigidos a secuencias diana, sino que pueden ser mezclas de múltiples ARN bicatenarios dirigidos a regiones que cubren la secuencia diana. Los ARNip de la presente invención incluyen los denominados “cócteles de ARNip”.

No se necesita necesariamente que todos los nucleótidos en los ARNip dados a conocer en el presente documento sean ribonucleótidos (ARN). Específicamente, uno o más de los ribonucleótidos que constituyen los ARNip de la presente invención pueden sustituirse por desoxirribonucleótidos correspondientes. El término “correspondiente” significa que, aunque los restos de azúcar son estructuralmente diferentes, los residuos de nucleótido (adenina, timina (uracilo), guanina o citosina) son los mismos. Por ejemplo, los desoxirribonucleótidos correspondientes a ribonucleótidos con adenina se refieren a desoxirribonucleótidos con adenina. El término “o más” descrito anteriormente no está particularmente limitado, pero preferiblemente se refiere a un número pequeño de aproximadamente dos a cinco ribonucleótidos.

Los ARNip de la presente invención son los ARNip de SEQ ID NO: 1 y/o 2.

En el presente documento también se dan a conocer ácidos nucleicos dirigidos a la supresión de la expresión de un gen diana que incluye microARN (miARN), aptámeros y ácidos nucleicos bloqueados (ANB) generados modificando oligonucleótidos.

Tales ácidos nucleicos no están limitados a los ejemplos descritos anteriormente, y es posible usar ácidos nucleicos que son apropiados para los fines.

Además, la “proteína” tal como se da a conocer en el presente documento se refiere a un polímero que comprende varios aminoácidos, e incluye no sólo polipéptidos sino también oligopéptidos. En el presente documento, los polipéptidos incluyen tanto polipéptidos que se producen de manera natural sin modificación como polipéptidos modificados. Tales modificaciones incluyen acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de resto(s) hemo, unión covalente de nucleótidos o derivados de nucleótidos, unión covalente de lípidos o derivados de lípidos, unión covalente de fosfatidilinositol, reticulación, ciclización, formación de puentes disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, y-carboxilación, glicosilación, formación de anclajes de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición de aminoácidos a proteínas mediada por ARN de transferencia tal como arginilación y ubiquitinación.

Para inhibir (suprimir) la función de una proteína (diana), las proteínas tal como se dan a conocer en el presente documento incluyen, por ejemplo, variantes de proteínas diana, que son dominantes negativos para la proteína diana, y anticuerpos que se unen a la proteína diana.

“Una variante de proteína diana que es dominante negativo para una proteína diana” se refiere a una proteína que, cuando se expresa un gen que codifica para la proteína, tiene la función de reducir o eliminar la actividad de la proteína silvestre endógena.

Además, pueden prepararse anticuerpos que se unen a la proteína diana mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Pueden obtenerse anticuerpos policlonales, por ejemplo, mediante el siguiente procedimiento: se inmunizan animales pequeños tales como conejos con una proteína diana natural o una proteína diana recombinante expresada en microorganismos tales como E. coli como proteína de fusión con GST, o un péptido parcial de la misma. Se obtienen sueros de estos animales y se purifican, por ejemplo, mediante precipitación con sulfato de amonio, columnas de proteína A o G, cromatografía de intercambio iónico con DEAE, columnas de afinidad acopladas con la proteína diana o un péptido sintético para preparar anticuerpos. Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales, por ejemplo, mediante el siguiente procedimiento: se inmunizan animales pequeños tales como ratones con una proteína diana o un péptido parcial de la misma. Se extirpan bazos de los ratones y se trituran para aislar células. Se fusionan las células con células de mieloma de ratón usando un reactivo tal como polietilenglicol. Se seleccionan clones que producen anticuerpos que se unen a una proteína diana de las células fusionadas resultantes (hibridomas). Después se trasplantan los hibridomas obtenidos en las cavidades peritoneales de ratones y se recogen ascitis. Los anticuerpos monoclonales obtenidos pueden purificarse, por ejemplo, mediante precipitación con sulfato de amonio, columnas de proteína A o G, cromatografía de intercambio iónico con DEAE, columnas de afinidad acopladas con la proteína diana o un péptido sintético.

Las formas de anticuerpos anteriormente descritos no están particularmente limitadas siempre que se unan a una proteína diana. Los anticuerpos de la presente invención pueden incluir anticuerpos humanos, anticuerpos

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humanizados creados mediante recombinación génica, fragmentos o productos modificados de tales anticuerpos, además de los anticuerpos policlonales y monoclonales descritos anteriormente.

Las proteínas diana usadas como antígenos de sensibilización para preparar anticuerpos no están limitadas en cuanto a la especie animal de la que se derivan las proteínas. Sin embargo, las proteínas se derivan preferiblemente de mamíferos, por ejemplo, ratones y seres humanos. Se prefieren particularmente proteínas derivadas de seres humanos. Las proteínas que van a usarse como antígenos de sensibilización pueden ser proteínas completas o péptidos parciales de las mismas. Tales péptidos parciales de las proteínas incluyen, por ejemplo, fragmentos amino (N)-terminales y fragmentos carboxilo (C)-terminales de las proteínas. En el presente documento, los “anticuerpos” se refieren a anticuerpos que reaccionan con una proteína de longitud completa o fragmento de la misma.

Además de inmunizar animales no humanos con antígenos para obtener los hibridomas anteriores, pueden sensibilizarse in vitro linfocitos humanos, por ejemplo, linfocitos humanos infectados por virus EB, con las proteínas o con células que expresan las proteínas, o con lisados de las mismas, y pueden fusionarse los linfocitos sensibilizados con células de mieloma derivadas de seres humanos con la capacidad de dividirse de manera permanente, por ejemplo, U266, para obtener hibridomas que producen anticuerpos humanos deseados con actividad de unión a las proteínas.

Cuando se usan los anticuerpos preparados para su administración a seres humanos (terapia con anticuerpos), los anticuerpos son preferiblemente anticuerpos humanos o humanizados con el fin de reducir la inmunogenicidad.

Las proteínas incluyen, por ejemplo, enzimas; y sus formas no están particularmente limitadas.

En el presente documento, los “hidratos de carbono” incluyen todos de monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos. Los hidratos de carbono de la presente invención también incluyen hidratos de carbono complejos en los que los sacáridos anteriores se unen covalentemente a proteínas o lípidos, y glicósidos en los que los grupos reductores de monosacáridos u oligosacáridos se unen a una aglicona tal como alcohol, fenol, saponina o un pigmento.

En el presente documento, los “lípidos” incluyen todos de lípidos simples, lípidos complejos y lípidos derivados.

En el presente documento, los “compuestos de bajo peso molecular” incluyen sustancias químicamente sintetizadas con un bajo peso molecular, que oscila normalmente entre aproximadamente varios cientos y miles. Para inhibir (suprimir) la función de una proteína diana, es posible usar, por ejemplo, sustancias de bajo peso molecular que se unen a la proteína diana. Tales sustancias de bajo peso molecular que se unen a una proteína diana pueden ser compuestos naturales o artificiales. En general, los compuestos pueden obtenerse o producirse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica.

Las sustancias fisiológicamente activas dadas a conocer en el presente documento incluyen, por ejemplo, compuestos individuales tales como compuestos naturales, compuestos orgánicos, compuestos inorgánicos; y bibliotecas de compuestos, productos de expresión de bibliotecas génicas, extractos celulares, sobrenadante de cultivo celular, productos de microorganismos de fermentación, extractos de organismos marinos y extractos vegetales. Cada una de las sustancias fisiológicamente activas anteriormente descritas puede usarse sola o en combinación con otras sustancias fisiológicamente activas.

Las sustancias fisiológicamente activas se usan (se administran) preferiblemente en una forma no modificada, no marcada (denominada ocasionalmente en el presente documento “forma desnuda”).

Las sustancias fisiológicamente activas pueden usarse después del marcaje, si se necesita. Tales marcadores incluyen, por ejemplo, marcadores de radioisótopos y marcadores fluorescentes. Los marcadores no están particularmente limitados, e incluyen marcadores de fosfatasa alcalina, marcadores de peroxidasa, enzimas marcadas con biotina/conjugadas con estreptavidina (fosfatasa alcalina, peroxidasa y similares), e isotiocianato de fluoresceína (FITC).

Además, las sustancias fisiológicamente activas pueden usarse en combinación con portadores farmacéuticamente aceptables. En el presente documento, los “portadores farmacéuticamente aceptables” incluyen, por ejemplo, vectores que se usan normalmente como vectores de terapia génica.

Los vectores anteriormente descritos incluyen, por ejemplo, vectores virales tales como vectores retrovirales, vectores adenovirales, y vectores virales adenoasociados, y vectores no virales tales como liposomas y atelocolágeno. Usando los vectores, las sustancias fisiológicamente activas de la presente invención pueden administrarse mediante métodos ex vivo e in vivo.

Aparte de los portadores descritos anteriormente, los portadores de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, agua, solución salina fisiológica, solución salina tamponada con fosfato, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, polímero de carboxivinilo, alginato de sodio, dextrano soluble en agua, pectina, goma xantana, goma arábiga, gelatina, agar, glicerina, propilenglicol, polietilenglicol, vaselina, parafina, alcohol estearílico, ácido esteárico, albúmina de suero humano, manitol, sorbitol y lactosa. Las sustancias fisiológicamente activas de la

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presente invención pueden comprender además aditivos tales como conservantes. Las sustancias fisiológicamente activas de la presente invención pueden comprender además otros componentes farmacológicos.

Tal como se da a conocer en el presente documento las sustancias fisiológicamente activas son preferiblemente preparaciones parenterales; se prefieren preparaciones líquidas tales como disoluciones y suspensiones, incluyendo, por ejemplo, inyecciones. Otras formas de dosificación preferidas incluyen, por ejemplo, linimentos y agentes de recubrimiento que se aplican sobre, o recubren, la superficie de dispositivos permanentes tales como balones y endoprótesis.

Las sustancias fisiológicamente activas pueden administrarse a sujetos (pacientes o similares) mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, tales como usar inyección en tejidos submucosos diana o aplicar o recubrir sobre la superficie de dispositivos permanentes tales como balones y endoprótesis. Si se necesita, pueden usarse dispositivos tales como endoscopios para administrar las sustancias fisiológicamente activas.

La dosis aplicada de una sustancia fisiológicamente activa varía dependiendo del peso corporal y la edad del sujeto (paciente o similar), método de administración, y similares; sin embargo, la dosis óptima pueden seleccionarla de manera apropiada los expertos en la técnica.

La presente invención también proporciona métodos para tratar o prevenir enfermedades, que comprenden la etapa de retener y expresar las sustancias fisiológicamente activas de una manera específica de tejido diana afectado por las enfermedades, mediante administración de las sustancias fisiológicamente activas a los tejidos submucosos con enfermedades.

Las “enfermedades” anteriormente descritas incluyen las asociadas con mucosa (específicamente, enfermedad inflamatoria del intestino y enfermedad de Crohn). Enfermedades adicionales dadas a conocer en el presente documento son enfermedades fibróticas, artritis (osteoartritis y artritis reumatoide), enfermedad de Alzheimer, toxicidad y rechazo a trasplante de órganos, caquexia, alergia, cáncer (por ejemplo, tumores/cánceres sólidos incluyendo de colon, mama, próstata y cerebro, y tumores hematopoyéticos malignos incluyendo leucemia y linfoma), ulceración tisular, reestenosis, enfermedades periodontales, epidermólisis bullosa, osteoporosis, aflojamiento de implantes de articulaciones artificiales, aterosclerosis (incluyendo divulsión de lesión de aterosclerosis), aneurisma aórtico (incluyendo aneurisma abdominal y aneurisma cerebral), insuficiencia cardiaca congestiva, infarto de miocardio, convulsión, isquemia cerebral, lesión cerebral, lesión de la médula espinal, trastornos neurodegenerativos (agudos y crónicos), enfermedades autoinmunitarias, corea de Huntington, enfermedad de Parkinson, migraña, depresión, neuropatía periférica, dolor, angiopatía amiloide cerebral, potenciación con nootrópicos o cognitiva, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, formación oftalmovascular, lesión de la córnea, degeneración macular, cicatrización anómala de lesión por traumatismo, y quemaduras; sin embargo, las enfermedades no se limitan a los ejemplos anteriores, e incluyen otras enfermedades siempre que los métodos dados a conocer puedan aplicarse a las mismas.

Sujetos preferidos a los que van a administrarse las sustancias fisiológicamente activas de la presente invención son mamíferos incluyendo seres humanos, y animales domésticos, mascotas y animales de experimentación. En particular, los mamíferos (pacientes) con una enfermedad descrita anteriormente son sujetos preferidos en la presente invención.

Ejemplos

A continuación en el presente documento, se describe específicamente la presente invención usando ejemplos; sin embargo, no debe interpretarse como que se limita a los mismos.

[Ejemplo 1]

Se indujo enteritis por DSS permitiendo a ratas Wistar macho de 12 semanas de edad beber libremente agua que contenía sulfato sódico de dextrano (DSS) al 3% (peso molecular; 50.000) (Okayasu I, Hatakeyama S, Ohkusa T, Inagaki Y, Nakaya R. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology 1990, 98: 694-702). Se insertó un endoscopio ultradelgado para seres humanos en los intestinos gruesos de ratas anestesiadas con Nembutal en el día 0 y 3 tras el inicio de la alimentación con agua con DSS. Tras la observación de la mucosa, se inyectó ARNip en el tejido submucoso en cuatro sitios equidistantes en la parte izquierda del colon. El endoscopio ultradelgado usado era un modelo de prototipo (diámetro externo del endoscopio, 5,6 mm) que tenía un canal de pinzas de trabajo (diámetro de canal, 2 mm) que se había desarrollado como endoscopio para el tracto gastrointestinal superior para seres humanos por OLYMPUS. Se usaron ratas sin tratar como control.

Se evaluó el efecto terapéutico basándose en: (1) índice de actividad de enfermedad clínica (CDAl) determinado en cuanto a los tres puntos: pérdida de peso, diarrea y melena; (2) longitud del intestino; y (3) análisis histopatológico de muestras teñidas con He preparadas usando una sección de intestino grueso, en los grupos tratado y de control.

[Ejemplo 2] Retención de sustancias fisiológicamente activas en el tejido submucoso de intestino grueso de rata

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A continuación, se analizó la retención de sustancias fisiológicamente activas en el tejido submucoso de ratas normales mediante obtención de imágenes de diagnóstico usando rayos X y TAC, que se usan de manera rutinaria en la clínica. Se anestesiaron ratas Wistar macho de doce semanas de edad con Nembutal, y después se insertó un endoscopio ultradelgado para seres humanos en los intestinos gruesos y se inyectaron de manera endoscópica 20 |il de iopamidol, un medio de contraste, solos en el tejido submucoso de la parte izquierda del colon usando una aguja de inyección local.

Iopamidol se refiere al compuesto denominado N,N'-bis[2-hidroxi-1-(hidroximetil)etil]-5-[(2S)-2- hidroxipropanoilamino]-2,4,6-triyodoisoftalamida (C17H22I3N308; peso molecular, 777,09) representado por la fórmula

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Se llevó a cabo la obtención de fotografías de rayos X y exploración CT por tras una hora. Los resultados se muestran en la figura 2. Las imágenes de rayos X mostraron que el iopamidol inyectado se retuvo en el tejido submucoso del colon sin fugas intraperitoneales ni transferencia a otras secciones. Las imágenes de TAC también mostraron que el iopamidol inyectado se retuvo específicamente en los sitios de inyección y no se extendió a otros cortes. Por tanto, el método de evaluación clínica también demostró que los métodos de la presente invención pueden retener sustancias fisiológicamente activas de manera muy específica dentro de tejidos submucosos diana.

[Ejemplo 3] Retención de sustancias fisiológicamente activas en el tejido submucoso de intestino grueso de ratón

A continuación, se evaluó la retención de sustancias fisiológicamente activas usando ratones, que son animales de experimentación más comunes. Se anestesiaron ratones C57BL/6J hembra de ocho semanas de edad con Nembutal y se sometieron a laparotomía para exponer la parte inferior de los intestinos gruesos. Se inyectaron por vía macroscópica 20 |il de partículas de carbono (tinta china), correspondientes a una sustancia fisiológicamente activa de la presente invención, solos en los tejidos submucosos. Después, se cerró el abdomen.

Cinco días después, se sacrificaron los ratones para preparar secciones tisulares del intestino grueso. Se observaron las secciones con un microscopio óptico. El resultado se muestra en la figura 3. Se encontró que las partículas de carbono inyectadas se retenían dentro del tejido submucoso sin difusión física ni fugas a otras partes.

[Ejemplo 4] Retención local de ácido nucleico dentro del intestino grueso de ratón

Se inyectaron 20 |il de ARNip marcado con FITC (20 |iM) de oligómero fluorescente BLOCK-iT (Invitrogen) en el tejido submucoso de intestino grueso de ratón mediante el mismo método que el descrito en los ejemplos 1 y 3. Se evaluó la retención del ARNip inyectado con un estereomicroscopio fluorescente (Leica) 24 horas tras la inyección.

Los resultados se muestran en la figura 4. El ARNip marcado con FITC se confinó al sitio de inyección en el intestino grueso. La figura 1 del ejemplo 1 es una imagen histológica obtenida inyectando el mismo ARNip marcado con FITC en el tejido submucoso de intestino grueso de rata. Basándose en los hallazgos descritos anteriormente, se predice que se obtendrá el mismo resultado cuando se inyecte el ARNip marcado en el tejido submucoso de intestino grueso de ratón.

A partir del resultado descrito anteriormente, desde todos los puntos de vista diferentes usando índices clínicos (rayos X y TAC), indicadores microscópicos en sujetos vivos e índices histológicos, se demostró que, cuando se inyectaron en el tejido submucoso de intestino grueso mediante el método de la presente invención, las sustancias fisiológicamente activas, incluyendo ARNip, se retuvieron de manera selectiva dentro del tejido submucoso.

[Ejemplo 5] Cinética de ácido nucleico en el tejido submucoso de intestino grueso de ratón

A continuación, con el fin de confirmar también la retención de ARNip inyectado en el tejido submucoso del intestino grueso mediante métodos bioquímicos, se determinó la concentración de ARNip en el intestino grueso usando el método de ELISA para cuantificación directa de ARNip según un informe publicado (Rosie Z et al. Analytical Biochem. 304: 19-25, 2002). A continuación se muestran las secuencias de nucleótidos de ARNip de GalNac 4S-

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6ST usadas en este ejemplo, pero las secuencias no se limitan al ejemplo mostrado en el presente documento.

[ARNip de GalNac4-6ST humano] (número de registro de Gene Bank NM_015892) (Hokkaido Sistema Science Co., Ltd.)

5'-ggagcagagcaagaugaauacaauc-ag-3' (SEQ ID NO: 1)

3 '-ua-ccucgucucguucuacuuauguuag-5' (SEQ ID NO: 2)

Se inyectó ARNip de GalNAc4S-6ST (0,3 jj.g/10 |il) en tres sitios en el tejido submucoso de intestino grueso en ratones C57BL/6J hembra de ocho semanas de edad mediante el mismo método descrito en el ejemplo 3. Se sacrificaron los ratones 0,5, 3, 6 ó 24 horas tras la inyección para preparar muestras histológicas del intestino grueso. Se determinaron las concentraciones de ARNip mediante los métodos de ELISA.

El resultado se muestra en la figura 5. Se usó 1 |ig/ml de ARNip antes de la inyección como control positivo sin ningún tratamiento adicional. En el punto de tiempo tras 0,5 horas, el ARNip se retenía a una concentración muy alta, mientras que la concentración disminuyó a la mitad tras tres horas. Sin embargo, el resultado muestra que el ARNip permanecía retenido de manera continua 24 horas después.

Por tanto, se demostró, no sólo mediante obtención de imágenes de diagnóstico e histología sino también mediante bioquímica, que las sustancias fisiológicamente activas se retienen eficazmente en los sitios de inyección mediante los métodos de la presente invención.

[Ejemplo 6] Prueba de estabilidad para ARNip de GalNAc4S-6ST

En este ejemplo, se evaluó ARNip de GalNAc4S-6ST, la misma sustancia usada en el ejemplo 5, para determinar su estabilidad. En primer lugar, se prepararon disoluciones de prueba añadiendo 1 |ig de ARNip de GalNAc4S-6ST a 200 |il de tampón de fosfato estéril o atelocolágeno al 0,1% y agitando las mezclas a 4°C durante 20 minutos. Se preparó atelocolágeno al 0,1% combinando atelocolágeno al 1% (Koken) con diez volúmenes de tampón de fosfato estéril y agitando la mezcla a 4°C durante 16 horas. Después, se añadieron 40 |ig de una ribonucleasa (ARNasa A; SIGMA) a las disoluciones de prueba preparadas de ARNip de GalNAc4S-6ST, y se incubaron las mezclas para reaccionar a 37°C. El tiempo de reacción fue de 5, 15, 30, 45 ó 60 minutos. Se añadieron 500 |il de ARN iso (Takara Bio) a las disoluciones de prueba tras la reacción. Se incubaron las mezclas sobre hielo durante cinco minutos, y se centrifugaron a 14.000 rpm durante 15 minutos. Se recogieron los sobrenadantes resultantes y se añadieron 500 |il de isopropanol y 1 |il de glicógeno (Invitrogen) a los mismos. Se incubaron las mezclas durante 15 minutos, y se centrifugaron a 14.000 rpm durante 15 minutos. Se descartaron los sobrenadantes, y se guardaron los sedimentos. Se añadió 1 ml de etanol al 75% a los sedimentos, y se centrifugaron las mezclas a 14.000 rpm durante 15 minutos. Tras repetirse esta etapa dos veces, se secaron los sedimentos y se disolvieron en 25 |il de disolvente de inyección (Otsuka Pharmaceutical). Se combinaron 10 |il de cada una de las disoluciones con 2 |il de tinte de carga (Invitrogen). Se preparó gel de agarosa al 3,5% usando agarosa UltraPure (Invitrogen), y se sometieron las muestras a electroforesis en un dispositivo Mupid-2 plus (ADVANCE) a 100 V durante 20 minutos. Tras la electroforesis, se agitó el gel durante 20 minutos en una disolución de tinción preparada diluyendo 10.000 veces bromuro de etidio (Invitrogen) con LoTE 1x (composición: Tris-HCI 3 mM (pH 7,5) (Invitrogen), EDTA 0,2 mM (pH 7,5) (Sigma Aldrich Japan)). Se obtuvieron fotografías del gel con el dispositivo Fluourchem (Innotech) y se analizaron.

Tal como se observa en la figura 6, en ausencia de ribonucleasa, el ARNip de GalNAc4S-6ST era relativamente estable incluso tras 60 minutos. Sin embargo, en presencia de ribonucleasa, se observó degradación de ARNip en el punto de tiempo tras 15 minutos y la banda desapareció tras 30 minutos. Por otro lado, cuando se incrustó ARNip de GalNAc4S-6ST en atelocolágeno, la banda era débil pero detectable incluso tras 30 minutos. Se ha notificado que ARN de cadena corta (ARNip) incrustado en atelocolágeno es resistente a ribonucleasa. Se obtuvo un resultado equivalente en este ejemplo. Además, la presente invención también sugiere que se obtiene el mismo resultado no sólo cuando se incrusta ARNip en atelocolágeno sino también en otras sustancias biológicas que tienen las mismas características.

[Ejemplo 7] Eficacia de inactivación génica mediante ARNip administrado en el tejido submucoso de intestino grueso en ratones de modelo de colitis

Se prepararon ratones de modelo de colitis permitiendo a ratones C57BL/6J (hembra, de seis semanas de edad; CLEa Japan Inc.) beber libremente agua con una alta concentración de cloro que contenía sulfato sódico de dextrano al 3% (DSS; Wako Pure Chemical Industries Inc.) durante cinco días. Este modelo de colitis inducida por DSS tiene una excelente reproducibilidad, y por tanto se usa ampliamente como modelo experimental habitual para enfermedades inflamatorias del intestino tales como colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn de ratón (Sasaki N, J Inflamm. 2005 2: 13; como revisión, Pucilowska JB et al. Am J Physiol Gastroenterol Liver Physiol. 279: G653-G659, 2000).

Se inyectó el mismo ARNip de GalNAc4S-6ST (0,3 |ig/cabeza) que el usado en el ejemplo 5 al tejido submucoso de intestino grueso de ratón, mientras se permitió a los ratones beber agua que contenía DSS al 3%. Los grupos de

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control usados fueron: un grupo al que se le inyectó ARNip reorganizado al azar (“oligómero fluorescente BLOCK-iT (Invitrogen)” en el ejemplo 4) y un grupo no tratado en el que sólo se permitió a los ratones beber agua con DSS. Se registraron el peso corporal y la puntuación de índice de actividad de enfermedad (DAI) (Kihara M, Gut. 2003 52: 713-9) durante cinco días mientras se permitió a los ratones beber agua que contenía DDS al 3%. Después, se sacrificaron los ratones en el quinto día.

Se añadió 1 ml de ARN iso (Takara Bio) a 50 mg cada uno de los órganos escindidos (intestino grueso y riñón). Se trituraron los órganos usando un homogeneizador eléctrico (DIGITAL HOMOGENIZER; AS ONE), después, se añadieron 200 |il de cloroformo (Sigma-Aldrich Japan) a la suspensión resultante. Se mezcló suavemente la mezcla y después se enfrió sobre hielo durante aproximadamente cinco minutos, y se centrifugó en una centrifugadora (centrifugadora 5417R; Eppendorf) a 12.000 rpm y 4°C durante 15 minutos. Tras la centrifugación, se transfirieron 500 |il del sobrenadante a un tubo Eppendorf nuevo, y se añadió un volumen igual de isopropanol (500 |il; Sigma- Aldrich Japan) al mismo. Se mezcló la disolución y después se añadió 1 |il de glicógeno (Invitrogen) a la misma. Se enfrió la mezcla sobre hielo durante 15 minutos, y después se centrifugó a 12.000 rpm y 4°C durante 15 minutos. A continuación, un precipitado de ARN obtenido tras lavar tres veces con 1.000 |il de etanol al 75% (Sigma-Aldrich Japan) se secó al aire durante de 30 minutos a una hora, y después se disolvió en agua destilada de Otsuka (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd). Se diluyó 100 veces la disolución con agua destilada de Otsuka. Se determinaron las concentraciones de ARN de muestras extraídas en placas de UV (Corning Costar) usando un lector de placas (POWER Wave XS; BIO-TEK).

A continuación, se realiza una reacción de transcripción inversa (síntesis de ADNc) mediante el siguiente procedimiento. Se ajustaron las concentraciones de las muestras de ARN obtenidas hasta 500 ng/20 |il. Se calentaron las muestras a 68°C durante tres minutos en un incubador de bloque (ASTEC), y se enfriaron sobre hielo durante diez minutos. Tras enfriar sobre hielo, se añadieron a las muestras 80 |il de disolución RT PreMix (composición: 18,64 |il de MgCh 25 mM (Invitrogen), 20 |il de tampón 5x (Invitrogen), 6,6 |il de DTT 0,1 M (Invitrogen), 10 |il de mezcla de dNTP 10 mM (Invitrogen), 2 |il de inhibidor de ARNasa (Invitrogen), 1,2 |il de transcriptasa inversa de MMLV (Invitrogen), 2 |il de cebador al azar (Invitrogen), y 19,56 |il de agua destilada estéril (agua destilada de Otsuka; Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.)), que se había preparado por adelantado. Se calentaron las mezclas en un incubador de bloque (ASTEC) a 42°C durante una hora y a 99°C durante cinco minutos, y después se enfriaron sobre hielo. Se prepararon 100 |il de ADNc deseados y se llevó a cabo una reacción de PCR cuantitativa usando los ADNc preparados en la siguiente composición. Para PCR cuantitativa, se usaron un kit de premezcla SYBR (TAKARA) y ciclador térmico de PCR en tiempo real DICE (TAKARA). Las condiciones de la reacción de PCR fueron: 95°C durante 10 segundos, 40 ciclos de 95°C durante 5 segundos y 60°C durante 30 segundos, finalmente, se realizó un análisis de curva de fusión. A continuación se describen las secuencias de nucleótidos de cebadores usados en la PCR cuantitativa.

[Secuencia de cebadores de PCR cuantitativa]

*GalNac4S-6ST de ratón (TAKARA)

directo: 5'-GTGAGTTCTGCTGCGGTCCA-3' (SEQ ID NO: 3) inverso: 5'-AGTCCATGCTGATGCCCAGAG-3' (SEQ ID NO: 4)

*GAPDH de ratón (TAKARA)

directo: 5'-CTGCCAAGTATGACATCA-3' (SEQ ID NO: 5) inverso: 5'-TACTCCTTGGAGGCCATGTAG-3' (SEQ ID NO: 6)

Los resultados se muestran en la figura 7. La expresión de GalNAc4S-6ST aumentó significativamente en el intestino grueso; sin embargo, el ARNip de GalNAc4S-6ST inyectado suprimió significativamente la expresión aumentada. Mientras tanto, en este modelo, la expresión de GalNAc4S-6ST no aumentó en el riñón, y permaneció inalterada incluso tras la inyección de ARNip de GalNAc4S-6ST. Además, en el grupo al que se le inyectó ARNip reorganizado al azar, no hubo ningún cambio significativo en la expresión de GalNAc4S-6ST. Por tanto, la presente invención demostró que ARNip de GalNAc4S-6ST inyectado al tejido submucoso de intestino grueso se retenía de manera selectiva en el intestino grueso. Además, desde el punto de vista funcional, se demostró que el ARNip de GalNAc4S-6ST suprimía significativamente el aumento de la expresión de GalNAc4S-6ST en el intestino grueso. El resultado descrito anteriormente sugiere que la presente invención es muy eficaz para la retención y función de las sustancias fisiológicamente activas inyectadas en los sitios de administración, y no produce ningún efecto secundario sobre otros órganos normales.

[Ejemplo 8] Modificación de características clínicas/patológicas mediante inactivación génica resultante de ARNip administrado al tejido submucoso de intestino grueso en ratones de modelo de colitis

Dado que se demostró la retención y función de ARNip, a continuación se evaluó su efecto terapéutico real. Se analizó el índice de actividad de colitis (DAI) mediante el mismo método descrito en el ejemplo 7.

Claims (2)

1. REIVINDICACIONES

   1. ARNip para su uso en el tratamiento o la prevención de colitis, que es un ARNip de GalNAc4S-6ST desnudo de SEQ ID NO: 1 y/o 2 y va a inyectarse directamente en el tejido submucoso del tracto intestinal.
2. 2. ARNip para su uso según la reivindicación 1, en el que la colitis es enfermedad inflamatoria del intestino o

   5 enfermedad de Crohn.