ES2214217T3 - Utilizacion de bacterias vivas atenuadas para la preparacion de una vacuna de administracion por la submucosa. - Google Patents

Abstract

Uso de una bacteria viva atenuada seleccionada entre el grupo de bacterias compuesto por Streptococcus zooepidemicus, Rhodococcus equi, Corynebacterium pseudotuberculosis, Pseudomonas mallei, Actinobacillus equili, Pasteurella multocida, Actinomyces pyogenes, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis, Noccardia asteroides, Corynebacterium bovis, Mycoplasma bovis, Mycobacterium bovis, Escherichia coli, Pasteurella haemolytica, Brucella abortus, Salmonella Dublin, Salmonella typhimurium, Leptospira hardjo, Streptococcus suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Clostridium perfringens, Salmonella cholerasuis, Haemophilus parasuis, Erysipelothrix rhusiopathiae, Mycoplasma hyopneumoniae, Serpulina hyodysenteriae, Leptospira pomona, Streptococcus pneumoniae, Leptospira canicola o Leptospira icterohaemorrhagiae, para la fabricación de una vacuna para administración por vía submucosa.

Description

Utilización de bacterias vivas atenuadas para la preparación de una vacuna de administración por la submucosa.

La presente invención se refiere al uso de bacterias para la fabricación de vacunas. Con los años se ha comprobado que la vacunación es un método muy efectivo para la prevención de enfermedades provocadas por muchas bacterias diferentes. La vacunación tiene la ventaja, al contrario de, por ejemplo, las terapias con antibióticos o farmacoquímicas, que previenen la enfermedad más que curarla. En muchos campos, por ejemplo, en el campo de la ganadería, la vacunación es una rutina estándar. Normalmente, con el fin de prevenir la enfermedad, se vacunan todo los animales de un grupo como una medida de precaución, aunque en la práctica sólo unos pocos animales podrían llegar a infectarse si no se les hubiese administrado la vacuna. Esto explica porqué para las vacunas que se usan más habitualmente no son aceptables las reacciones locales adversas debidas a la vacunación: no es aceptable causar estrés físico (severo) en muchos animales para prevenir una enfermedad (leve) en algunos.

Sin embargo, para la mayoría de las vacunas, especialmente para las vacunas vivas que en la mayoría de los casos son preferibles a las vacunas inactivas, hay un equilibrio delicado entre, por un lado, una actividad desencadenante del sistema inmune suficientemente fuerte y, por otro lado, reacciones locales aceptables en el lugar de la administración. Por regla general, la mejor vacuna viva produce las reacciones locales más graves, y por lo tanto las reacciones locales son a menudo inevitables si se necesita protección eficaz.

Es un propósito de la presente memoria proporcionar vías para disminuir el problema de las reacciones locales de las vacunas vivas sin atenuar más las vacunas vivas.

Sorprendentemente, se ha encontrado ahora que cuando se usan bacterias vivas atenuadas para la preparación de una vacuna para administración en el tejido submucoso, la vacuna así obtenida proporciona buena protección y reacciones locales menores cuando se administra por vía submucosa.

La administración sistémica comprende todas las administraciones en las que la vacuna no se administra en el tejido mucoso (la administración al tejido mucoso comprende, entre otras, la vacunación oral e intranasal).

Las rutas de administración sistémica comprenden, entre otras, la administración por vía intramuscular (IM), administración por vía subcutánea (SC), vacunación intradérmica (ID), vacunación intravenosa (IV) y vacunación intraperitoneal (IP). Estas rutas de vacunación se han descrito, por ejemplo, en la solicitud de patente europea EP 0.786.518 para una vacuna viva atenuada basada en Streptococcus equi.

De estas rutas, en muchos casos la vacunación intramuscular es la ruta de administración preferida. Esto es debido al hecho de que la vacuna, posiblemente mezclada con un adyuvante, sólo se libera lentamente desde el sitio de la inyección. Así, el sistema inmune está continuamente activado durante un tiempo relativamente largo con una dosis inmunogénica de la vacuna. Esta vía de administración asegura una respuesta inmune adecuada. Sin embargo, el inconveniente es que muchas vacunas bacterianas administradas IM causan grandes abscesos en el sitio de la inyección. Estos abscesos pueden permanecer allí desde días a meses. En aquellos casos en los que una bacteria viva atenuada deba comportarse de forma relativamente virulenta con el fin de desencadenar una respuesta inmune adecuada, la bacteria a menudo se replica en el sitio de la inyección a un nivel tal que el absceso incluso revienta. Los grandes abscesos intramusculares o de piel son claramente unos efectos secundarios inaceptables de la vacunación con cepas de bacterias vivas atenuadas, pero inevitables si la atenuación adicional echa a perder el potencial inmunogénico de la bacteria. Esto provoca el dilema mencionado anteriormente, para el cual la invención ofrece una solución.

Ciertamente, es inesperado que un tejido tan blando y vulnerable como el tejido submucoso permita la administración de vacunas de bacterias vivas atenuadas (a veces incluso apenas atenuadas):

a)

sin producir los abscesos inaceptables que se ven con la administración por vía intradérmica o intramuscular, aunque

b)

permitiendo al mismo tiempo que se desarrolle una respuesta inmune suficiente.

Esto es incluso más inesperado si se considera el nivel de daño que muchas bacterias atenuadas relativamente virulentas causan a su huésped cuando se administran ID o IM.

La vacunación intradérmica o intramuscular con tales bacterias a menudo causan, a continuación de la formación de abscesos, lesiones severas en el sitio de la inyección. El tejido alrededor del sitio de la inyección con frecuencia se desintegra completamente, dejando grandes cicatrices.

Todas estas desventajas no se ven o apenas lo hacen con los usos según la invención.

Se ha descrito la administración por vía submucosa de la vacuna de Streptococcus equi viva atenuada en el documento EP 0.894.500 que se presentó antes, pero que se publicó después de la fecha de prioridad de la presente invención. Esta solicitud no menciona, ni sugiere, que la administración por vía submucosa pudiera ser beneficiosa para otras cepas de bacterias.

Por lo tanto, la invención se refiere al uso de bacterias vivas atenuadas del grupo de bacterias específicamente mencionadas más adelante, y aparte de Streptococcus equi, para la fabricación de una vacuna para la administración por vía submucosa. El tejido mucoso se encuentra, entre otros, en la boca, la nariz, el recubrimiento del intestino, el ojo, la vulva y los labios.

La administración por vía submucosa se entiende que es la administración a través de la capa superior de la mucosa, y dentro de la submucosa. La submucosa es una capa bien definida, conocida como tal en la técnica. En principio, no hay límite a la profundidad a la cual se produce la vacunación (por ejemplo, la profundidad de la punta de la aguja), por supuesto con la condición de que la vacunación se produzca en la submucosa. Sin embargo, en la práctica probablemente la vacuna no se debería aplicar a mayor profundidad de aproximadamente 5 milímetros desde la superficie de la mucosa. Generalmente hablando, distancias menores entre la mucosa y el sitio de la inyección producen menores efectos locales. Una profundidad muy adecuada sería en la submucosa entre dos y cuatro milímetros por debajo de la mucosa.

Otra atractiva vía de administración es usando un, así llamado, inyector sin aguja. El uso de estos inyectores se conoce de las administraciones por vía intradérmica, pero estos inyectores son igualmente adecuados para administraciones por vía submucosa. Debido a lo blando del tejido mucoso, la vacuna, cuando se aplica a través de un inyector sin aguja, atraviesa directamente la mucosa y se detendrá en el tejido submucoso. La profundidad de la vacunación sólo depende de la potencia aplicada durante la administración.

En principio, todo tejido submucoso es adecuado para la administración por vía submucosa. Sin embargo en la práctica, el tejido submucoso de los labios y, en animales hembras, de la vulva son sitios muy prácticos de administración. Especialmente en caballos, perros y reses, el tejido submucoso de los labios sería el sitio preferido de administración.

Por lo tanto, en una forma preferida, las bacterias vivas atenuadas se usan para la fabricación de una vacuna para la administración en la submucosa de los labios.

Más adelante se presenta una lista de bacterias, todas conocidas por provocar la formación de abscesos, y de ese modo daños graves a los tejidos y lesiones de piel, cuando se administran intramuscularmente. Y para todas esas bacterias hay una relación reciproca entre, por un lado, el potencial inmunogénico reducido después de la atenuación y, por otro lado, la aceptabilidad de las reacciones locales en el sitio de la administración.

La invención se aplica al uso de las siguientes bacterias vivas atenuadas que son formas atenuadas de bacterias patógenas equinas.

Streptococcus zooepidemicus, que provoca infecciones del tracto respiratorio y neumonía, infecciones oportunistas y aborto en caballos, Rhodococcus equi, que provoca bronconeumonía con abscesos y abscesos intestinales, Corynebacterium pseudotuberculosis, que provoca abscesos pectorales y linfangitis ulcerosa, Pseudomonas mallei, que provoca: "Glanders", una enfermedad caracterizada por inflamaciones piogranulomatosas, lesiones nodulares en pulmón y lesiones ulcerosas y nodulares en mucosa cutánea y respiratoria, Actinobacillus equili, una causa bien conocida de muerte neonatal, aborto en yeguas, parto muerto y septicemia de potros y finalmente Pasteurella multocida, que provoca infecciones del tracto respiratorio en caballos.

En muchos casos, los caballos tienen tanto un alto valor emocional como económico para sus propietarios. Especialmente en el campo de los pura sangre, sería inaceptable tener a los caballos padeciendo de abscesos después de la vacunación.

Por lo tanto, en una forma más preferida de la invención, el uso se refiere a un uso en el que la bacteria viva atenuada se selecciona entre el grupo de bacterias que comprende Streptococcus zooepidemicus, Rhodococcus equi, Corynebacterium pseudotuberculosis, Pseudomonas mallei, Actinobacillus equili y Pasteurella multocida.

En una forma incluso todavía más preferida, la bacteria viva atenuada es de la especie Streptococcus zooepidemicus.

La invención es igualmente aplicable a las siguientes bacterias vivas atenuadas que están en una forma atenuada de una bacteria que es patógena para las reses.

Actinomyces pyogenes, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae y Streptococcus uberis, Noccardia asteroides, Corynebacterium bovis, Mycoplasma bovis, y Mycobacterium bovis, como causas bien establecidas de mastitis bobina, Escherichia coli, que provoca tanto mastitis como diarrea bovina, Pasteurella haemolytica y P. multocida, que provocan ambas neumonía y septicemia, Brucella abortus, que provoca aborto, Salmonella dublin y S. typhimurium, que provocan diarrea, neumonía e infecciones sistémicas y finalmente Leptospira hardjo como una causa de infecciones del tracto urinario.

La invención también se aplica a las siguientes bacterias vivas atenuadas que están en una forma atenuada de una bacteria que es patógena para los cerdos.

Streptococcus suis que provoca poliserositis, Staphylococcus aureus que provoca epidermitis exudativa, Actinobacillus pleuropneumoniae que provoca pleuroneumonía, Pasteurella multocida que provoca rinitis atrófica y neumonía, Bordetella bronchiseptica que también provoca rinitis atrófica y neumonía, Escherichia coli que provoca diarrea y edema, Clostridium perfringens como una causa de diarrea y septicemia, Salmonella cholerasuis una causa también conocida de diarrea, Haemophilus parasuis también conocida como la causa de la "enfermedad de Glasser", Erysipelothrix rhusiopathiae que provoca una enfermedad conocida como "Erisipela", Mycoplasma hyopneumoniae que provoca neumonía, Serpulina hyodysenteriae como una causa de diarrea y Leptospira pomona que produce aborto.

La invención también se aplica a las siguientes bacterias vivas atenuadas que están en una forma atenuada de una bacteria que es patógena para los perros.

Staphylococcus aureus, pioderma, Streptococcus pneumoniae, septicemia, Bordetella bronchiseptica, traqueobronquitis, Escherichia coli, diarrea, Leptospira canicola e icterohaemorrhagiae, infecciones generales y del tracto urinario.

La fabricación de vacunas comprende al menos una cantidad inmunogénicamente efectiva de una bacteria viva atenuada. Inmunogénicamente efectiva significa que la cantidad de bacteria viva atenuada administrada en la vacunación es suficiente para inducir en el huésped una respuesta inmune efectiva a las formas virulentas de la bacteria.

La dosis útil que se ha de administrar variará dependiendo de la edad, peso y mamífero que se ha de vacunar y del tipo de patógeno contra el que se busca la vacunación. La vacuna puede comprender cualquier dosis de bacteria suficiente para provocar una respuesta inmune. Las dosis de bacterias en el intervalo entre 10^{3} y 10^{10} son, por ejemplo, dosis muy adecuadas.

Además de una cantidad inmunogénicamente efectiva de la bacteria viva atenuada descrita anteriormente, la vacuna preparada también contiene un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tal vehículo puede ser tan simple como agua, pero también puede comprender, por ejemplo, fluido de cultivo en el que la bacteria se cultivó. Otro vehículo adecuado es, por ejemplo, una disolución de concentración salina fisiológica. Otros ejemplos de vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables útiles en la presente invención incluyen agentes estabilizantes tales como SPGA, carbohidratos (por ejemplo, sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, glucosa, dextrano), proteínas tales como albúmina o caseína, proteínas que contienen agentes tales como suero bovino o leche desnatada y tampones (por ejemplo, tampón de fosfato).

Opcionalmente, se pueden añadir a la vacuna uno o más compuestos que tengan actividad adyuvante. Los adyuvantes son estimuladores no específicos del sistema inmune. Aumentan la respuesta inmune del huésped hacia el patógeno invasor. Ejemplos de adyuvantes conocidos en la técnica son los adyuvantes completo e incompleto de Freund, vitamina E, polímeros de bloque no iónicos, muramil dipéptidos, ISCOMs (complejos inmuno estimulantes, confróntese, por ejemplo, la patente europea EP 109.942), saponinas, aceite mineral, aceite vegetal, y Carbopol (un homopolímero). Otros adyuvantes adecuados son, por ejemplo, hidróxido, fosfato u óxido de aluminio, emulsiones oleosas (por ejemplo, de Bayol F® o Marcol 52®), saponinas o solubilizado de vitamina E.

Ejemplos Ejemplo 1

En este experimento, se ensayó el principio de viabilidad de la administración por vía submucosa usando dos cepas diferentes de Streptococcus equi atenuadas. Este ejemplo simplemente se añade con el fin de mostrar el principio de la administración por vía submucosa y como orientación para otras cepas distintas de Streptococcus equi. Las cepas de Streptococcus equi no entran dentro del grupo de bacterias al que se refiere la presente invención.

En este experimento, se ensayaron la seguridad y eficacia de la vacuna viva de la cepa de S. equi mutante de deleción TW 928 y de la vacuna de la cepa doble mutante TW 928/sls en Diluvac Forte® (asequibles a través de Intervet Int. B.V., P.O. Box 31, 5830 AA Boxmeer, Países Bajos), ambas administradas por vía submucosa en el labio. Se ha hecho una comparación con la seguridad de una vacunación intramuscular similar.

Después de un periodo de aclimatación de dos semanas, se vacunaron cinco caballos submucosamente en el labio con la cepa mutante de deleción TW 928. La vacunación se hizo en dos puntos en el labio superior y en dos puntos en el labio inferior. Se usó una aguja que estaba provista con un disco de aproximadamente 1 centímetro de diámetro, sujeto en ángulos rectos a la aguja, y situado aproximadamente a 2,5 milímetros de la punta de la aguja. Esto impidió que la punta de la aguja penetrara en la submucosa más de aproximadamente 2 milímetros.

Se administró en cada punto un volumen de 200 \mul de la vacuna, que comprendía 6,3 x 10^{8} bacterias.

Otros tres caballos se vacunaron subcutáneamente de la misma forma, pero con una doble mutante: cepa TW 928/sls que comprendía 1,6 x 10^{8} bacterias en Diluvac Forte.

Tres caballos se vacunaron IM en el cuello con dosis comparables de la cepa mutante de deleción TW 928.

Dos caballos se dejaron como controles.

A las cuatro semanas después de la primera vacunación, se repitieron las vacunaciones como se describió anteriormente con la misma cantidad de bacterias en sitios de vacunación similares. A las dos semanas después de la vacunación de refuerzo, todos los caballos se infectaron por vía intranasal con 7,7 x 10^{8} CFU (unidades formadoras de colonias) en un volumen de 2 ml de una cepa de provocación de respuesta inmune de la cepa Arnica de S. equi. Después de la vacunación, se observaron los caballos para detectar cualquier reacción sistémica o local, y después de la infección, los caballos se examinaron para detectar signos clínicos de estrangulamiento o cualquier otra anorma-
lidad.

Resultados

Los caballos sujetos a vacunación intramuscular en el cuello desarrollaron grandes abscesos en un plazo de semanas después de la vacunación, que alcanzaron diámetros en el intervalo entre 10 y 30 centímetros. Estos abscesos fueron persistentes y continuaron creciendo hasta que reventaron.

Los caballos sujetos a vacunación en la submucosa presentaron un buen estado y tuvieron un apetito normal y no se observaron reacciones sistémicas significativas adicionales.

Después de la primera vacunación y de la de refuerzo en la submucosa con el mutante de deleción 928, sólo se encontraron reacciones locales pequeñas y transitorias. La mayoría de las reacciones habían desaparecido tres semanas después de la primera vacunación y dos semanas después de la vacunación de refuerzo. Se observaron las mismas reacciones locales menores, pero incluso en una menor medida, después de ambas vacunaciones con el doble mutante 928/sls.

Después de la infección, los cinco caballos vacunados submucosamente con el mutante de deleción TW 928 aparecieron completamente protegidos. También se obtuvo la protección total en los caballos vacunados intramuscularmente con el mutante de deleción TW 928.

Por lo tanto se puede concluir que

\bullet

se puede obtener la protección total con las cepas adecuadas de vacuna independientemente del sitio de la administración: intramuscularmente o submucosamente.

\bullet

se detectan poquísimas reacciones locales adversas en el sitio de la administración por vía submucosa, mientras que la administración por vía intramuscular provoca grandes abscesos persistentes en el sitio de la administración.

Ejemplo 2 Comparación de administración por vías submucosa e intramuscular de una cepa de la bacteria patógena equina Streptococcus zooepidemicus

En este experimento se comparó la seguridad de la administración por vía submucosa de Strep. z. con la administración por vía intramuscular, especialmente con respecto a las reacciones locales adversas.

Se vacunaron submucosamente dos caballos en el labio con 7 x 10^{7} CFU de Strep. z. en un volumen total de 0,2 ml. Otros dos caballos se vacunaron intramuscularmente en el cuello con la misma dosis, pero en un volumen total de 1 ml.

Resultados

Los caballos vacunados intramuscularmente desarrollaron grandes abscesos a partir del cuarto día después de la vacunación, que crecieron hasta un tamaño medio, a los diez días después de la vacunación, de aproximadamente 20 centímetros de diámetro. Estos abscesos fueron persistentes.

Los caballos vacunados submucosamente sólo desarrollaron abscesos menores con un tamaño medio de 2,5 centímetros, que comenzaron en el día 5 después de la vacunación. Estos abscesos desaparecieron completamente sin dejar trazas después de seis días.

Ejemplo 3 Comparación de administración por vías submucosa e intramuscular de una cepa virulenta de la bacteria patógena bovina Actinomyces pyogenes

En este experimento se comparó la seguridad de la administración por vía submucosa de A. pyogenes con la administración por vía intramuscular, especialmente con respecto a las reacciones locales adversas.

Se vacunaron submucosamente dos vacas en la vulva con 1,2 x 10^{10} CFU en un volumen total de 0,2 ml. Otras dos vacas se vacunaron intramuscularmente en el cuello con la misma dosis, pero en un volumen total de 1 ml.

Resultados

En los animales vacunados submucosamente, después de tres días se desarrollaron pequeños abscesos, que alcanzaron un tamaño medio de aproximadamente 3,5 centímetros de diámetro. Estos abscesos disminuyeron en tamaño después de algunos días.

En las dos vacas vacunadas intramuscularmente en el cuello con la misma dosis, después de tres días se desarrollaron abscesos grandes y más persistentes, que alcanzaron un diámetro entre 9 y 14 centímetros.

Claims (4)

1. Uso de una bacteria viva atenuada seleccionada entre el grupo de bacterias compuesto por Streptococcus zooepidemicus, Rhodococcus equi, Corynebacterium pseudotuberculosis, Pseudomonas mallei, Actinobacillus equili, Pasteurella multocida, Actinomyces pyogenes, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis, Noccardia asteroides, Corynebacterium bovis, Mycoplasma bovis, Mycobacterium bovis, Escherichia coli, Pasteurella haemolytica, Brucella abortus, Salmonella Dublin, Salmonella typhimurium, Leptospira hardjo, Streptococcus suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Clostridium perfringens, Salmonella cholerasuis, Haemophilus parasuis, Erysipelothrix rhusiopathiae, Mycoplasma hyopneumoniae, Serpulina hyodysenteriae, Leptospira pomona, Streptococcus pneumoniae, Leptospira canicola o Leptospira icterohaemorrhagiae, para la fabricación de una vacuna para administración por vía submucosa.

2. Uso según la reivindicación 1, caracterizado porque la vacuna es para administración en la submucosa de los labios.

3. Uso según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la bacteria viva atenuada es una forma atenuada de una bacteria patógena equina.

4. Uso según la reivindicación 3, caracterizado porque la bacteria viva atenuada es de la especie Streptococcus zooepidemicus.