JP4339978B2 - ワクチンの製造のための細菌の使用 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はワクチンの製造のための細菌の使用に関する。
【０００２】
【従来技術】
ワクチン接種は多種多様の細菌に起因する疾病の非常に有効な予防法であることが多年来認められている。ワクチンは例えば抗生物質や薬物化学療法と異なり、疾病を治療するよりもむしろ予防するという利点がある。例えば畜産分野をはじめとする多くの分野でワクチン接種は標準常法である。通常、予防措置として疾病を予防するために群の全動物にワクチン接種するが、実際にはワクチンを接種しなくても少数の動物しか感染しないことが多い。このため、一般に使用されている大半のワクチンではワクチン接種による有害局所反応が問題となり、少数の（軽度）疾病を予防するために多数の動物に（重度の）肉体的ストレスを生じるのは問題である。
【０００３】
しかし、大半のワクチン、特に殆どの場合に不活化ワクチンよりも好ましいとされる生ワクチンには、免疫系の十分に強力なトリガーとワクチン投与部位における許容可能な局所反応の間に微妙なバランスがある。一般に、最良の生ワクチンは最も重度の局所反応を生じ、従って、効果的防御を必要とする場合には局所反応を避けられないことが多い。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、生ワクチンをさほど弱毒化せずに生ワクチンの局所反応の問題を緩和する手段を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
驚くべきことに、生きた弱毒細菌を使用して粘膜下組織投与用ワクチンを製造し、こうして得られたワクチンを粘膜下投与すると、良好な防御と局所反応の軽減が得られることが今般判明した。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明は全身用ワクチンの製造分野で広く適用可能である。本発明は特定細菌又は特定疾病に限定されない。本発明では、全身用弱毒生ワクチンの製造に利用可能な生きた弱毒細菌の実質的に全てを等しく利用できる。全身投与はワクチンを粘膜に投与しない全用途を含む（粘膜投与は例えば経口及び鼻腔内ワクチン接種を含む）。全身投与経路は例えば筋肉内投与（ＩＭ）、皮下投与（ＳＣ）、皮内ワクチン接種（ＩＤ）、静脈内ワクチン接種（ＩＶ）及び腹膜組織内ワクチン接種（ＩＰ）を含む。
【０００７】
これらの経路のうちでは、筋肉内ワクチン接種が多くの場合に好ましい投与経路である。これは、場合によりアジュバントと混合しているワクチンが注射部位からゆっくりとしか放出されないためである。従って、免疫系は比較的長時間にわたって連続的に免疫原用量のワクチンでトリガーされる。この投与経路は十分な免疫応答を確保する。しかし、多くの細菌ワクチンはＩＭ投与すると注射部位に大きな膿瘍を生じるという欠点がある。これらの膿瘍は数日から数カ月間持続する可能性がある。生きた弱毒細菌が十分な免疫応答を誘発するために比較的毒性に作用する必要がある場合には、細菌は膿瘍が破裂する段階まで注射部位で増殖することが多い。大きな筋肉内又は皮膚膿瘍は生きた弱毒細菌株によるワクチン接種の明らかに許容できない副作用であるが、あまり弱毒化すると細菌の免疫原能を損なう場合には避けることができない。その結果、上記ジレンマが生まれ、本発明はその解決方法を提案するものである。
【０００８】
粘膜下組織のような易損性軟組織に生きた弱毒（場合によっては殆ど弱毒していない）細菌ワクチンを投与することができ、しかも、
ａ）皮内又は筋肉内投与に見られる許容不能な膿瘍を生じることなく、
ｂ）同時に十分な免疫応答を誘発できるとは全く予想外である。多くの比較的毒性の弱毒細菌をＩＤ又はＩＭ投与した場合にその宿主に生じる損傷のレベルを考慮すると、これは一層予想外である。このような細菌を皮内又は筋肉内ワクチン接種すると、膿瘍の形成に加え、注射部位に重度の病変を生じることが多い。注射部位の周囲の組織は完全に崩壊し、大きな瘢痕を残すことが多い。
【０００９】
本発明による使用ではこれらの全欠点が殆ど又は全く見られない。
【００１０】
従って、本発明のこの態様は、粘膜下投与用ワクチンの製造のための生きた弱毒細菌の使用に関する。粘膜組織は例えば口、鼻、腸管裏層、眼、陰門及び唇に存在する。
【００１１】
粘膜下投与とは、粘膜の上層を通して粘膜下組織に投与することである。粘膜下組織は当技術分野でそれ自体公知の明確に定義された層である。原則として、ワクチン接種を粘膜下組織に行う限り、ワクチン接種を実施する深さ（即ち針の先端の深さ）は限定しない。しかし、一般には粘膜の表面から約５ｍｍを越える深さには投与しないほうがよいと思われる。一般に、粘膜と注射部位の間の距離が短いほど、局所作用は小さくなる。非常に適切な深さは粘膜下２〜４ｍｍの粘膜下組織である。
【００１２】
別の有用な投与手段は所謂無針注射器の使用である。これらの注射器の使用は皮内投与から公知であるが、これらの注射器は粘膜下投与にも同様に利用できる。粘膜組織は軟質であるため、無針注射器でワクチンを投与すると、粘膜をまっすぐに通り、粘膜下組織で止まる。ワクチン接種の深さは投与中に加える力のみに依存する。
【００１３】
原則として、全粘膜下組織に粘膜下投与することができる。しかし、実際には唇の粘膜下組織と雌動物の陰門が非常に実用的な投与部位である。特にウマ、イヌ及びウシでは、唇の粘膜下組織が好ましい投与部位である。
【００１４】
従って、好ましい態様では、唇の粘膜下組織投与用ワクチンの製造に生きた弱毒細菌を使用する。
【００１５】
上述のように、本発明では全身用弱毒生ワクチンの製造に利用可能な生きた弱毒細菌の実質的に全てを利用できる。本発明による使用は、局所反応の重度が問題となる多数の重要な病原細菌の安全性を著しく改善する。下記細菌はいずれも筋肉内投与すると膿瘍形成を生じ、従って、重度組織損傷及び皮膚病変を生じることが知られている。これらの全細菌には、弱毒化後の免疫原能の低下と投与部位における局所反応の許容可能性の間に相互関係がある。本発明は例えば弱毒形態のウマ病原細菌である生きた弱毒細菌の使用に適用される。
【００１６】
以下の細菌は、確立されたウマ病原細菌の大きいファミリーの例である。
【００１７】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉは「腺疫（Ｓｔｒａｎｇｌｅｓ）」の原因である。この疾患は頭部及び頸部のリンパ節の膿瘍と全身感染を生じる。リンパ節腫張はウマを呼吸困難にする。有害局所反応のない確実なワクチンはこれまで知られていない。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓはウマに呼吸管感染と肺炎、日和見感染及び流産を生じる。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉは膿瘍を伴う気管支肺炎と腸管膿瘍を生じる。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓは胸部膿瘍と潰瘍性リンパ管炎を生じる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｌｌｅｉは肺の膿肉芽腫性炎症及び結節性病変と皮膚及び呼吸器粘膜の潰瘍性及び結節性病変を特徴とする疾病である「鼻疽（Ｇｌａｎｄｅｒｓ）」の原因である。Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｅｑｕｉｌｉは新生児死、雌馬流産、死産及び子馬敗血症の周知原因である。最後に、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａはウマに呼吸管感染を生じる。
【００１８】
ウマは多くの場合にその飼い主に感情的及び経済的両面で高い価値がある。特にサラブレッドの分野では、ワクチン接種後にウマに膿瘍を生じることは許容できない。
【００１９】
従って、本発明のより好ましい態様では、使用は生きた弱毒細菌が弱毒形態のウマ病原細菌である使用に関する。
【００２０】
更に好ましい態様では、生きた弱毒細菌はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｌｌｅｉ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｅｑｕｉｌｉ及びＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａを含む細菌群から選択される。
【００２１】
更に好ましい態様では、生きた弱毒細菌はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｌｉ及び／又はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓである。
【００２２】
本発明は弱毒形態のウシ病原細菌である生きた弱毒細菌にも同様に適用可能である。
【００２３】
ウシで多発する病原体の多数の例を以下に挙げる。
【００２４】
Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｂｅｒｉｓ、Ｎｏｃｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ及びＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓはいずれもウシ乳腺炎の確立された原因である。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉはウシ乳腺炎と下痢を生じる。Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａとＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａはいずれも肺炎と敗血症を生じる。Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓは流産を生じる。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｄｕｂｌｉｎとＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｎｉｕｍは下痢、肺炎及び全身感染を生じる。最後に、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈａｒｄｊｏは尿管感染を生じる。
【００２５】
本発明は弱毒形態のブタ病原細菌である生きた弱毒細菌にも適用される。
【００２６】
ブタ病原細菌の数例を以下に挙げる。
【００２７】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓは多発性漿膜炎を生じ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓは浸出性表皮炎を生じ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは胸膜肺炎を生じ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａは萎縮性鼻炎と肺炎を生じ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａも同様に萎縮性鼻炎と肺炎を生じ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉは下痢と浮腫病を生じ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓは下痢と敗血症の原因であり、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓも下痢の公知原因であり、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓも「グラッサー病（Ｇｌａｓｓｅｒｓ ｄｉｓｅａｓｅ）」の原因であることが知られており、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅは「丹毒（Ｅｒｙｓｉｐｅｌａｓ）」として知られる疾病の原因であり、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは肺炎を生じ、Ｓｅｒｐｕｌｉｎａ ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｎａｅは下痢の原因であり、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｐｏｍｏｎａは流産を生じる。
【００２８】
更に、本発明は弱毒形態のイヌ病原細菌である生きた弱毒細菌にも適用される。
【００２９】
このような細菌の例としては特に以下のイヌ病原細菌が挙げられる。
【００３０】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓは膿皮症を生じ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは敗血症を生じ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａは気管気管支炎を生じ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉは下痢を生じ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｃａｎｉｃｏｌａ及びｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅは全身及び尿管感染を生じる。
【００３１】
製造後のワクチンは少なくとも免疫原として有効な量の生きた弱毒細菌を含む。免疫原として有効とは、ワクチン接種時に投与した生きた弱毒細菌の量が細菌のビルレント形態に対して有効な免疫応答を宿主に誘導するために十分であることを意味する。
【００３２】
有用な投与量は年齢、体重及びワクチン接種しようとする哺乳動物と、ワクチン接種の対象となる病原体の種類によって異なる。ワクチンは免疫応答を誘発するために十分な任意用量の細菌を含むことができる。例えば細菌１０３〜１０１ ０個の用量が非常に適切な用量である。
【００３３】
上記免疫原として有効な量の生きた弱毒細菌に加え、製造後のワクチンは医薬的に許容可能なキャリヤーも含む。このようなキャリヤーは水のように単純なものでもよいし、例えば細菌を培養した培養液でもよい。別の利用可能なキャリヤーは例えば生理的塩類濃度の溶液である。本発明で有用な医薬的に許容可能なキャリヤー又は希釈剤の他の例としては安定剤（例えばＳＰＧＡ）、炭水化物（例えばソルビトール、マンニトール、澱粉、スクロース、グルコース、デキストラン）、タンパク質（例えばアルブミン又はカゼイン）、タンパク質含有物質（例えばウシ血清又は脱脂乳）及び緩衝液（例えばリン酸緩衝液）が挙げられる。
【００３４】
場合により、アジュバント活性をもつ１種以上の化合物をワクチンに加えてもよい。アジュバントは免疫系の非特異的刺激剤である。従って、アジュバントは侵襲病原体に対する宿主の免疫応答を強化する。当技術分野で公知のアジュバントの例はフロイント完全及び不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオン性ブロックポリマー、ムラミルジペプチド、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体、例えばヨーロッパ特許第ＥＰ１０９９４２号）、サポニン、鉱油、植物油及びカーボポール（ホモポリマー）である。他の利用可能なアジュバントは例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、酸化アルミニウム、オイルエマルション（例えばＢａｙｏｌ Ｆ（登録商標）又はＭａｒｃｏｌ ５２（登録商標））、サポニン又はビタミンＥソルビリゼートである。
【００３５】
実施例
実施例１：
２種の異なる弱毒Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ株の筋肉内及び粘膜下投与の安全性の比較
本実験では、生きたＳ．ｅｑｕｉ ＴＷ９２８欠失突然変異株ワクチンとＴＷ９２８／ｓｌｓ二重突然変異株ワクチンをＤｉｌｕｖａｃ Ｆｏｒｔｅ（登録商標）（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｉｎｔ．Ｂ．Ｖ．，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ ３１，５８３０ＡＡ Ｂｏｘｍｅｅｒ，オランダから入手可能）に加えていずれも唇に粘膜下投与し、安全性と有効性を試験した。同様に筋肉内ワクチン接種した場合の安全性と比較した。
【００３６】
２週間の馴化期間後、５頭のウマの唇にＴＷ９２８欠失突然変異株を粘膜下ワクチン接種した。ワクチン接種は上唇２カ所と下唇２カ所に行った。直径約１ｃｍのディスクを取り付けた針を使用し、ディスクは針に直角に装着し、針の先端から約２．５ｍｍに配置した。こうして、針の先端が粘膜下組織に約２ｍｍ以上侵入しないようにした。
【００３７】
細菌１０８．８個を含むワクチン２００μｌを各部位に接種した。他の３頭には、Ｄｉｌｕｖａｃ Ｆｏｒｔｅ中に細菌１０８．２個を含むＴＷ９２８／ｓｌｓ二重突然変異株を同様に皮下ワクチン接種した。３頭には同等用量のＴＷ９２８欠失突然変異株を頸部にＩＭ接種した。
【００３８】
２頭は対照として接種せずにおいた。
【００３９】
初回ワクチン接種から４週間後に同量の細菌を同様のワクチン接種部位に上述のようにブースター接種した。ブースター接種から２週間後に、全ウマに２ｍｌ容量中７．７×１０８ＣＦＵの攻撃株Ｓ．ｅｑｕｉ株Ａｒｎｉｃａを鼻腔内接種した。ワクチン接種後、ウマの全身又は局所反応を観察し、攻撃後、乳腺炎の臨床徴候又は他の異常についてウマを試験した。
【００４０】
結果：
頸部に筋肉内ワクチン接種したウマはワクチン接種後数週間以内に直径１０〜３０ｃｍに達する大きな膿瘍を生じた。これらの膿瘍はしつこく、破裂するまで増殖した。粘膜下ワクチン接種したウマは良好な状態であり、正常食欲を示し、付加的な有意全身反応は観察されなかった。９２８欠失突然変異株を粘膜下初回及びブースター接種後には、小さい一過性の局所反応しか検出されなかった。殆どの反応は初回ワクチン接種後３週間及びブースターワクチン接種後２週間に消えた。９２８／ｓｌｓ二重突然変異株を使用して両者接種を行った後には、更に低い程度で同様の弱い局所反応が観察された。
【００４１】
攻撃後、ＴＷ９２８欠失突然変異株を粘膜下ワクチン接種した５頭のウマは完全に防御されたと思われた。ＴＷ９２８欠失突然変異株を筋肉内ワクチン接種したウマでも完全防御が得られた。
【００４２】
従って、次のように結論することができる。
・投与部位に関係なく、筋肉内でも粘膜下でも適切なワクチン株で完全な防御が得られる。
・粘膜下投与部位には有害局所反応が殆ど認められないが、筋肉内投与では投与部位に大きくしつこい膿瘍が生じる。
【００４３】
実施例２：
ウマ病原細菌Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ株の粘膜下及び筋肉内投与の比較
本実験では、特に有害局所反応に関してＳｔｒｅｐ．ｚ．の粘膜下投与の安全性を筋肉内投与の安全性に比較した。
【００４４】
２頭のウマの唇に総容量０．２ｍｌ中７×１０７ＣＦＵのＳｔｒｅｐ．ｚ．を粘膜下ワクチン接種した。他の２頭には総容量を１ｍｌにして同一用量を頸部に筋肉内ワクチン接種した。
【００４５】
結果：
筋肉内ワクチン接種したウマはワクチン接種後４日目から大きい膿瘍を生じ、ワクチン接種から１０日後には直径約２０ｃｍの平均寸法にまで増殖した。これらの膿瘍はしつこかった。
【００４６】
粘膜下ワクチン接種したウマはワクチン接種後５日目から平均寸法２．５ｃｍの小さい膿瘍を生じた。膿瘍は６日後に完全に消え、瘢痕を残さなかった。
【００４７】
実施例３：
ウシ病原細菌Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのビルレント株の粘膜下及び筋肉内投与の比較
本実験では、特に有害局所反応に関してＡ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの粘膜下投与の安全性を筋肉内投与の安全性に比較した。
【００４８】
２頭のウシの陰門に総容量０．２ｍｌ中１．２×１０１０ＣＦＵを粘膜下ワクチン接種した。他の２頭には総容量を１ｍｌにして同一用量を頸部に筋肉内ワクチン接種した。
【００４９】
結果：
粘膜下ワクチン接種した動物は３日後に平均寸法は３．５ｃｍの小さい膿瘍を生じた。これらの膿瘍は数日後に寸法が小さくなった。
【００５０】
同一用量を頸部に筋肉内ワクチン接種した２頭では３日後に直径９〜１４ｃｍの大きくしつこい膿瘍を生じた。
【発明の属する技術分野】
本発明はワクチンの製造のための細菌の使用に関する。
【０００２】
【従来技術】
ワクチン接種は多種多様の細菌に起因する疾病の非常に有効な予防法であることが多年来認められている。ワクチンは例えば抗生物質や薬物化学療法と異なり、疾病を治療するよりもむしろ予防するという利点がある。例えば畜産分野をはじめとする多くの分野でワクチン接種は標準常法である。通常、予防措置として疾病を予防するために群の全動物にワクチン接種するが、実際にはワクチンを接種しなくても少数の動物しか感染しないことが多い。このため、一般に使用されている大半のワクチンではワクチン接種による有害局所反応が問題となり、少数の（軽度）疾病を予防するために多数の動物に（重度の）肉体的ストレスを生じるのは問題である。
【０００３】
しかし、大半のワクチン、特に殆どの場合に不活化ワクチンよりも好ましいとされる生ワクチンには、免疫系の十分に強力なトリガーとワクチン投与部位における許容可能な局所反応の間に微妙なバランスがある。一般に、最良の生ワクチンは最も重度の局所反応を生じ、従って、効果的防御を必要とする場合には局所反応を避けられないことが多い。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、生ワクチンをさほど弱毒化せずに生ワクチンの局所反応の問題を緩和する手段を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
驚くべきことに、生きた弱毒細菌を使用して粘膜下組織投与用ワクチンを製造し、こうして得られたワクチンを粘膜下投与すると、良好な防御と局所反応の軽減が得られることが今般判明した。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明は全身用ワクチンの製造分野で広く適用可能である。本発明は特定細菌又は特定疾病に限定されない。本発明では、全身用弱毒生ワクチンの製造に利用可能な生きた弱毒細菌の実質的に全てを等しく利用できる。全身投与はワクチンを粘膜に投与しない全用途を含む（粘膜投与は例えば経口及び鼻腔内ワクチン接種を含む）。全身投与経路は例えば筋肉内投与（ＩＭ）、皮下投与（ＳＣ）、皮内ワクチン接種（ＩＤ）、静脈内ワクチン接種（ＩＶ）及び腹膜組織内ワクチン接種（ＩＰ）を含む。
【０００７】
これらの経路のうちでは、筋肉内ワクチン接種が多くの場合に好ましい投与経路である。これは、場合によりアジュバントと混合しているワクチンが注射部位からゆっくりとしか放出されないためである。従って、免疫系は比較的長時間にわたって連続的に免疫原用量のワクチンでトリガーされる。この投与経路は十分な免疫応答を確保する。しかし、多くの細菌ワクチンはＩＭ投与すると注射部位に大きな膿瘍を生じるという欠点がある。これらの膿瘍は数日から数カ月間持続する可能性がある。生きた弱毒細菌が十分な免疫応答を誘発するために比較的毒性に作用する必要がある場合には、細菌は膿瘍が破裂する段階まで注射部位で増殖することが多い。大きな筋肉内又は皮膚膿瘍は生きた弱毒細菌株によるワクチン接種の明らかに許容できない副作用であるが、あまり弱毒化すると細菌の免疫原能を損なう場合には避けることができない。その結果、上記ジレンマが生まれ、本発明はその解決方法を提案するものである。
【０００８】
粘膜下組織のような易損性軟組織に生きた弱毒（場合によっては殆ど弱毒していない）細菌ワクチンを投与することができ、しかも、
ａ）皮内又は筋肉内投与に見られる許容不能な膿瘍を生じることなく、
ｂ）同時に十分な免疫応答を誘発できるとは全く予想外である。多くの比較的毒性の弱毒細菌をＩＤ又はＩＭ投与した場合にその宿主に生じる損傷のレベルを考慮すると、これは一層予想外である。このような細菌を皮内又は筋肉内ワクチン接種すると、膿瘍の形成に加え、注射部位に重度の病変を生じることが多い。注射部位の周囲の組織は完全に崩壊し、大きな瘢痕を残すことが多い。
【０００９】
本発明による使用ではこれらの全欠点が殆ど又は全く見られない。
【００１０】
従って、本発明のこの態様は、粘膜下投与用ワクチンの製造のための生きた弱毒細菌の使用に関する。粘膜組織は例えば口、鼻、腸管裏層、眼、陰門及び唇に存在する。
【００１１】
粘膜下投与とは、粘膜の上層を通して粘膜下組織に投与することである。粘膜下組織は当技術分野でそれ自体公知の明確に定義された層である。原則として、ワクチン接種を粘膜下組織に行う限り、ワクチン接種を実施する深さ（即ち針の先端の深さ）は限定しない。しかし、一般には粘膜の表面から約５ｍｍを越える深さには投与しないほうがよいと思われる。一般に、粘膜と注射部位の間の距離が短いほど、局所作用は小さくなる。非常に適切な深さは粘膜下２〜４ｍｍの粘膜下組織である。
【００１２】
別の有用な投与手段は所謂無針注射器の使用である。これらの注射器の使用は皮内投与から公知であるが、これらの注射器は粘膜下投与にも同様に利用できる。粘膜組織は軟質であるため、無針注射器でワクチンを投与すると、粘膜をまっすぐに通り、粘膜下組織で止まる。ワクチン接種の深さは投与中に加える力のみに依存する。
【００１３】
原則として、全粘膜下組織に粘膜下投与することができる。しかし、実際には唇の粘膜下組織と雌動物の陰門が非常に実用的な投与部位である。特にウマ、イヌ及びウシでは、唇の粘膜下組織が好ましい投与部位である。
【００１４】
従って、好ましい態様では、唇の粘膜下組織投与用ワクチンの製造に生きた弱毒細菌を使用する。
【００１５】
上述のように、本発明では全身用弱毒生ワクチンの製造に利用可能な生きた弱毒細菌の実質的に全てを利用できる。本発明による使用は、局所反応の重度が問題となる多数の重要な病原細菌の安全性を著しく改善する。下記細菌はいずれも筋肉内投与すると膿瘍形成を生じ、従って、重度組織損傷及び皮膚病変を生じることが知られている。これらの全細菌には、弱毒化後の免疫原能の低下と投与部位における局所反応の許容可能性の間に相互関係がある。本発明は例えば弱毒形態のウマ病原細菌である生きた弱毒細菌の使用に適用される。
【００１６】
以下の細菌は、確立されたウマ病原細菌の大きいファミリーの例である。
【００１７】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉは「腺疫（Ｓｔｒａｎｇｌｅｓ）」の原因である。この疾患は頭部及び頸部のリンパ節の膿瘍と全身感染を生じる。リンパ節腫張はウマを呼吸困難にする。有害局所反応のない確実なワクチンはこれまで知られていない。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓはウマに呼吸管感染と肺炎、日和見感染及び流産を生じる。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉは膿瘍を伴う気管支肺炎と腸管膿瘍を生じる。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓは胸部膿瘍と潰瘍性リンパ管炎を生じる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｌｌｅｉは肺の膿肉芽腫性炎症及び結節性病変と皮膚及び呼吸器粘膜の潰瘍性及び結節性病変を特徴とする疾病である「鼻疽（Ｇｌａｎｄｅｒｓ）」の原因である。Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｅｑｕｉｌｉは新生児死、雌馬流産、死産及び子馬敗血症の周知原因である。最後に、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａはウマに呼吸管感染を生じる。
【００１８】
ウマは多くの場合にその飼い主に感情的及び経済的両面で高い価値がある。特にサラブレッドの分野では、ワクチン接種後にウマに膿瘍を生じることは許容できない。
【００１９】
従って、本発明のより好ましい態様では、使用は生きた弱毒細菌が弱毒形態のウマ病原細菌である使用に関する。
【００２０】
更に好ましい態様では、生きた弱毒細菌はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｌｌｅｉ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｅｑｕｉｌｉ及びＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａを含む細菌群から選択される。
【００２１】
更に好ましい態様では、生きた弱毒細菌はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｌｉ及び／又はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓである。
【００２２】
本発明は弱毒形態のウシ病原細菌である生きた弱毒細菌にも同様に適用可能である。
【００２３】
ウシで多発する病原体の多数の例を以下に挙げる。
【００２４】
Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｂｅｒｉｓ、Ｎｏｃｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ及びＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓはいずれもウシ乳腺炎の確立された原因である。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉはウシ乳腺炎と下痢を生じる。Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａとＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａはいずれも肺炎と敗血症を生じる。Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓは流産を生じる。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｄｕｂｌｉｎとＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｎｉｕｍは下痢、肺炎及び全身感染を生じる。最後に、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈａｒｄｊｏは尿管感染を生じる。
【００２５】
本発明は弱毒形態のブタ病原細菌である生きた弱毒細菌にも適用される。
【００２６】
ブタ病原細菌の数例を以下に挙げる。
【００２７】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓは多発性漿膜炎を生じ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓは浸出性表皮炎を生じ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは胸膜肺炎を生じ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａは萎縮性鼻炎と肺炎を生じ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａも同様に萎縮性鼻炎と肺炎を生じ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉは下痢と浮腫病を生じ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓは下痢と敗血症の原因であり、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓも下痢の公知原因であり、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓも「グラッサー病（Ｇｌａｓｓｅｒｓ ｄｉｓｅａｓｅ）」の原因であることが知られており、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅは「丹毒（Ｅｒｙｓｉｐｅｌａｓ）」として知られる疾病の原因であり、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは肺炎を生じ、Ｓｅｒｐｕｌｉｎａ ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｎａｅは下痢の原因であり、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｐｏｍｏｎａは流産を生じる。
【００２８】
更に、本発明は弱毒形態のイヌ病原細菌である生きた弱毒細菌にも適用される。
【００２９】
このような細菌の例としては特に以下のイヌ病原細菌が挙げられる。
【００３０】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓは膿皮症を生じ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは敗血症を生じ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａは気管気管支炎を生じ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉは下痢を生じ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｃａｎｉｃｏｌａ及びｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅは全身及び尿管感染を生じる。
【００３１】
製造後のワクチンは少なくとも免疫原として有効な量の生きた弱毒細菌を含む。免疫原として有効とは、ワクチン接種時に投与した生きた弱毒細菌の量が細菌のビルレント形態に対して有効な免疫応答を宿主に誘導するために十分であることを意味する。
【００３２】
有用な投与量は年齢、体重及びワクチン接種しようとする哺乳動物と、ワクチン接種の対象となる病原体の種類によって異なる。ワクチンは免疫応答を誘発するために十分な任意用量の細菌を含むことができる。例えば細菌１０３〜１０１ ０個の用量が非常に適切な用量である。
【００３３】
上記免疫原として有効な量の生きた弱毒細菌に加え、製造後のワクチンは医薬的に許容可能なキャリヤーも含む。このようなキャリヤーは水のように単純なものでもよいし、例えば細菌を培養した培養液でもよい。別の利用可能なキャリヤーは例えば生理的塩類濃度の溶液である。本発明で有用な医薬的に許容可能なキャリヤー又は希釈剤の他の例としては安定剤（例えばＳＰＧＡ）、炭水化物（例えばソルビトール、マンニトール、澱粉、スクロース、グルコース、デキストラン）、タンパク質（例えばアルブミン又はカゼイン）、タンパク質含有物質（例えばウシ血清又は脱脂乳）及び緩衝液（例えばリン酸緩衝液）が挙げられる。
【００３４】
場合により、アジュバント活性をもつ１種以上の化合物をワクチンに加えてもよい。アジュバントは免疫系の非特異的刺激剤である。従って、アジュバントは侵襲病原体に対する宿主の免疫応答を強化する。当技術分野で公知のアジュバントの例はフロイント完全及び不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオン性ブロックポリマー、ムラミルジペプチド、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体、例えばヨーロッパ特許第ＥＰ１０９９４２号）、サポニン、鉱油、植物油及びカーボポール（ホモポリマー）である。他の利用可能なアジュバントは例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、酸化アルミニウム、オイルエマルション（例えばＢａｙｏｌ Ｆ（登録商標）又はＭａｒｃｏｌ ５２（登録商標））、サポニン又はビタミンＥソルビリゼートである。
【００３５】
実施例
実施例１：
２種の異なる弱毒Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ株の筋肉内及び粘膜下投与の安全性の比較
本実験では、生きたＳ．ｅｑｕｉ ＴＷ９２８欠失突然変異株ワクチンとＴＷ９２８／ｓｌｓ二重突然変異株ワクチンをＤｉｌｕｖａｃ Ｆｏｒｔｅ（登録商標）（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｉｎｔ．Ｂ．Ｖ．，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ ３１，５８３０ＡＡ Ｂｏｘｍｅｅｒ，オランダから入手可能）に加えていずれも唇に粘膜下投与し、安全性と有効性を試験した。同様に筋肉内ワクチン接種した場合の安全性と比較した。
【００３６】
２週間の馴化期間後、５頭のウマの唇にＴＷ９２８欠失突然変異株を粘膜下ワクチン接種した。ワクチン接種は上唇２カ所と下唇２カ所に行った。直径約１ｃｍのディスクを取り付けた針を使用し、ディスクは針に直角に装着し、針の先端から約２．５ｍｍに配置した。こうして、針の先端が粘膜下組織に約２ｍｍ以上侵入しないようにした。
【００３７】
細菌１０８．８個を含むワクチン２００μｌを各部位に接種した。他の３頭には、Ｄｉｌｕｖａｃ Ｆｏｒｔｅ中に細菌１０８．２個を含むＴＷ９２８／ｓｌｓ二重突然変異株を同様に皮下ワクチン接種した。３頭には同等用量のＴＷ９２８欠失突然変異株を頸部にＩＭ接種した。
【００３８】
２頭は対照として接種せずにおいた。
【００３９】
初回ワクチン接種から４週間後に同量の細菌を同様のワクチン接種部位に上述のようにブースター接種した。ブースター接種から２週間後に、全ウマに２ｍｌ容量中７．７×１０８ＣＦＵの攻撃株Ｓ．ｅｑｕｉ株Ａｒｎｉｃａを鼻腔内接種した。ワクチン接種後、ウマの全身又は局所反応を観察し、攻撃後、乳腺炎の臨床徴候又は他の異常についてウマを試験した。
【００４０】
結果：
頸部に筋肉内ワクチン接種したウマはワクチン接種後数週間以内に直径１０〜３０ｃｍに達する大きな膿瘍を生じた。これらの膿瘍はしつこく、破裂するまで増殖した。粘膜下ワクチン接種したウマは良好な状態であり、正常食欲を示し、付加的な有意全身反応は観察されなかった。９２８欠失突然変異株を粘膜下初回及びブースター接種後には、小さい一過性の局所反応しか検出されなかった。殆どの反応は初回ワクチン接種後３週間及びブースターワクチン接種後２週間に消えた。９２８／ｓｌｓ二重突然変異株を使用して両者接種を行った後には、更に低い程度で同様の弱い局所反応が観察された。
【００４１】
攻撃後、ＴＷ９２８欠失突然変異株を粘膜下ワクチン接種した５頭のウマは完全に防御されたと思われた。ＴＷ９２８欠失突然変異株を筋肉内ワクチン接種したウマでも完全防御が得られた。
【００４２】
従って、次のように結論することができる。
・投与部位に関係なく、筋肉内でも粘膜下でも適切なワクチン株で完全な防御が得られる。
・粘膜下投与部位には有害局所反応が殆ど認められないが、筋肉内投与では投与部位に大きくしつこい膿瘍が生じる。
【００４３】
実施例２：
ウマ病原細菌Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ株の粘膜下及び筋肉内投与の比較
本実験では、特に有害局所反応に関してＳｔｒｅｐ．ｚ．の粘膜下投与の安全性を筋肉内投与の安全性に比較した。
【００４４】
２頭のウマの唇に総容量０．２ｍｌ中７×１０７ＣＦＵのＳｔｒｅｐ．ｚ．を粘膜下ワクチン接種した。他の２頭には総容量を１ｍｌにして同一用量を頸部に筋肉内ワクチン接種した。
【００４５】
結果：
筋肉内ワクチン接種したウマはワクチン接種後４日目から大きい膿瘍を生じ、ワクチン接種から１０日後には直径約２０ｃｍの平均寸法にまで増殖した。これらの膿瘍はしつこかった。
【００４６】
粘膜下ワクチン接種したウマはワクチン接種後５日目から平均寸法２．５ｃｍの小さい膿瘍を生じた。膿瘍は６日後に完全に消え、瘢痕を残さなかった。
【００４７】
実施例３：
ウシ病原細菌Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのビルレント株の粘膜下及び筋肉内投与の比較
本実験では、特に有害局所反応に関してＡ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの粘膜下投与の安全性を筋肉内投与の安全性に比較した。
【００４８】
２頭のウシの陰門に総容量０．２ｍｌ中１．２×１０１０ＣＦＵを粘膜下ワクチン接種した。他の２頭には総容量を１ｍｌにして同一用量を頸部に筋肉内ワクチン接種した。
【００４９】
結果：
粘膜下ワクチン接種した動物は３日後に平均寸法は３．５ｃｍの小さい膿瘍を生じた。これらの膿瘍は数日後に寸法が小さくなった。
【００５０】
同一用量を頸部に筋肉内ワクチン接種した２頭では３日後に直径９〜１４ｃｍの大きくしつこい膿瘍を生じた。
Claims (4)
- Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ， Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ， Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ， Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｌｌｅｉ， Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｅｑｕｉｌｌ， Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ， Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ， Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ， Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｂｅｒｉｓ， Ｎｏｃｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ， Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ， Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ， Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ， Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ， Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ， Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ， Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｄｕｂｌｉｎ， Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ， Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈａｒｄｊｏ， Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ， Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ， Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ， Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ， Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ， Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ， Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ， Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ， Ｓｅｒｐｕｌｉｎａ ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ， Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｐｏｍｏｎａ， Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ， Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｃａｎｉｃｏｌａ 及び Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅから成る群より選択される生きた弱毒細菌を非ヒト動物の粘膜下にワクチンとして投与することを含む非ヒト動物感染症の予防又は治療方法。
- ワクチンを唇の粘膜下に投与する請求項１に記載の方法。
- 生きた弱毒細菌が弱毒形態のウマ病原細菌である請求項１又は２に記載の方法。
- 生きた弱毒細菌がＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ種である請求項３に記載の方法。
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