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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Bakterien
zur Herstellung von Impfstoffen. Die Impfung hat sich im Verlauf
der Jahre als äusserst
effizientes Verfahren zur Prävention von
durch viele verschiedene Bakterien verursachten Krankheiten erwiesen.
Impfstoffe haben im Gegensatz zu z.B. antibiotischen oder pharmakochemischen
Therapien den Vorteil, dass sie die Krankheiten verhüten anstatt
sie zu heilen. In vielen Gebieten, z.B. dem Gebiet der Viehwirtschaft,
ist die Impfung Standardroutine. Im allgemeinen werden alle Tiere
in einer Gruppe als vorbeugende Massnahme geimpft, um Krankheit
vorzubeugen, während
in Praxis oft nur wenige Tiere infiziert worden wären, wenn
kein Impfstoff verabreicht worden wäre. Dies erklärt, wieso
für die
meisten, kommerziell erhältlichen
Impfstoffe nachteilige, lokale Reaktionen aufgrund einer Impfung
inakzeptabel sind: es ist inakzeptabel (schweren) physikalischen
Stress in vielen Tieren hervorzurufen, um eine (milde) Krankheit
in wenigen zu verhüten.
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Nichtsdestotrotz
existiert für
die meisten Impfstoffe, insbesondere für die lebenden Impfstoffe, die
in den meisten Fällen
den inaktivierten Impfstoffen vorzuziehen sind, eine delikate Balance
zwischen einem genügend
starken Auslöser
des Immunsystems auf der einen Seite und akzeptablen, lokalen Reaktionen
an der Verabreichungsstelle des Impfstoffes auf der anderen Seite.
Als Faustregel ergibt der beste, lebende Impfstoff die schwersten,
lokalen Reaktionen und deshalb sind lokale Reaktionen oft unvermeidbar,
wenn effizienter Schutz benötigt
wird.
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Es
ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung Wege bereitzustellen, um
das Problem der lokalen Reaktionen von lebenden Impfstoffen zu reduzieren, ohne
die lebenden Impfstoffe weiter abzuschwächen. Es wurde jetzt überraschenderweise
gefunden, dass wenn lebende, abgeschwächte Bakterien zur Herstellung
eines Impfstoffes zur Verabreichung in submukösem Gewebe verwendet werden,
der so erhaltene Impfstoff, falls submukös angewendet, guten Schutz
und geringe, lokale Reaktionen ergibt.
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Eine
systemische Anwendung umfasst alle Anwendungen, in welchen der Impfstoff
nicht der Mukosa verabreicht wird (muköse Verabreichung umfasst u.a.
orale und intranasale Impfung). Systemische Anwendungsrouten umfassen
u.a. intramuskuläre
Anwendung (IM), subkutane Anwendung (SC), intradermale Impfung (ID),
intravenöse
Impfung (IV) und intraperitoneale Impfung (IP). Diese Impfungsrouten
wurden z.B. in der Europäischen
Patentanmeldung
EP 0 786 518 für einen
lebenden, abgeschwächten
Impfstoff basierend auf Streptococcus equi beschrieben.
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Von
diesen Routen ist in vielen Fällen
die intramuskuläre
Impfung die bevorzugte Anwendungsroute. Dies aufgrund der Tatsache,
dass der möglicherweise
mit einem Adjuvans vermischte Impfstoff nur langsam von der Injektionsstelle
freigesetzt wird. Demzufolge wird das Immunsystem ununterbrochen für eine relativ
lange Zeit mit einer immunogenen Dosis des Impfstoffes getriggert.
Diese Art von Verabreichung gewährleistet
eine adäquate
Immunantwort. Der Nachteil ist jedoch, dass viele bakteriellen, IM-verabreichten
Impfstoffe grosse Abszesse an der Injektionsstelle verursachen.
Diese Abszesse können
dort während
Tagen bis Monaten bestehen. In denjenigen Fällen, in denen sich ein lebendes,
abgeschwächtes
Bakterium relativ virulent verhalten muss, um eine adäquate Immunantwort
auszulösen, repliziert
das Bakterium an der Injektionsstelle oft zu einem derartigen Grad,
dass der Abszess sogar aufbricht. Grosse intramuskuläre oder
Haut-Abszesse sind eindeutig eine inakzeptable Nebenwirkung der Impfung
mit bakteriellen, lebenden, abgeschwächten Stämmen, jedoch unvermeidbar falls
eine weitere Abschwächung
das immunogene Potential des Bakteriums zerstört. Dies verursacht das obenerwähnte Dilemma,
für welches
die Erfindung eine Lösung
darbietet.
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Es
kam eindeutig unerwartet, dass solch weiches und verletzliches Gewebe
wie das submuköse Gewebe
die Verabreichung von (manchmal sogar kaum) abgeschwächten, lebenden
bakteriellen Impfstoffen erlaubt:
- a) ohne die
mit der intradermalen oder intramuskulären Anwendung beobachteten,
inakzeptablen Abszesse zu ergeben, und währenddem
- b) zur gleichen Zeit eine ausreichende Immunantwort aufbauen
zu lassen.
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Dies
ist umso mehr unerwartet wenn der Grad der Verletzung, die viele
relativ virulente, abgeschwächte
Bakterien in ihrem Wirt verursachen, wenn sie ID oder IM gegeben
werden, in Betracht gezogen wird. Intradermale oder intramuskuläre Impfung
mit solchen Bakterien verursacht oft, neben der Bildung von Abszessen,
schwere Läsionen
an der Injektionsstelle. Das Gewebe um die Injektionsstelle zerfällt oft
vollständig,
wodurch grosse Wunden hinterlassen werden.
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Alle
diese Nachteile sind bei den Verwendungen gemäss der Erfindung kaum oder
gar nicht zu sehen.
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Submuköse Anwendung
von lebendem, abgeschwächtem
Streptococcus equi Impfstoff wurde in
EP
0 894 500 beschrieben, welche vor dem Prioritätsdatum
der vorliegenden Erfindung angemeldet, aber nachher publiziert wurde.
Diese Anwendung weder erwähnt
noch legt sie nahe, dass submuköse Anwendung
für andere
bakteriellen Stämme
vorteilhaft wäre.
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Demzufolge
bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung von lebenden, abgeschwächten Bakterien
der Gruppe von Bakterien, die im Folgenden spezifisch erwähnt wird,
ausser Streptococcus equi, zur Herstellung eines Impfstoffes für submuköse Verabreichung.
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Muköses Gewebe
wird unter anderem im Mund, in der Nase, den Darmwänden, im
Auge, der Vulva und den Lippen vorgefunden.
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Unter
submuköser
Anwendung wird die Verabreichung durch die obere Schicht der Mukosa
und in die Submukosa verstanden. Die Submukosa ist eine wohl definierte
Schicht, die als solche in Fachkreisen bekannt ist. Prinzipiell
besteht keine Begrenzung der Tiefe, bei welcher die Impfung stattfindet (d.h.
die Tiefe der Nadelspitze), vorausgesetzt natürlich, dass die Impfung in
der Submukosa stattfindet. In Praxis wird der Impfstoff jedoch wahrscheinlich nicht
tiefer als ungefähr
5 Millimeter von der Oberfläche
der Mukosa angewendet werden. Im allgemeinen geben geringere Distanzen
zwischen der Mukosa und der Injektionsstelle geringere lokale Effekte. Eine äusserst
geeignete Tiefe läge
in der Submukosa zwischen zwei und vier Millimetern unter der Mukosa.
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Eine
andere, attraktive Anwendungsart ist durch die Verwendung eines
sogenannten nadellosen Injektors. Die Verwendung dieser Injektoren
ist von intradermalen Anwendungen bekannt, aber diese Injektoren
sind gleichermassen für
submuköse Anwendungen
geeignet. Aufgrund der Weichheit des mukösen Gewebes, dringt der Impfstoff
bei Anwendung durch einen nadellosen Injektor quer durch die Mukosa
und wird im submukösen
Gewebe enden. Die Tiefe der Impfung hängt nur von der während der Verabreichung
angewandten Kraft ab.
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Prinzipiell
ist jegliches submuköse
Gewebe für
eine submuköse
Anwendung geeignet. In Praxis ist jedoch das submuköse Gewebe
der Lippen und, in weiblichen Tieren, der Vulva eine äusserst
praktische Verabreichungsstelle. Insbesondere in Pferden, Hunden
und Rindern wäre
das submuköse
Gewebe der Lippen die bevorzugte Verabreichungsstelle.
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Demnach
werden in einer bevorzugten Variante die lebenden, abgeschwächten Bakterien
zur Herstellung eines Impfstoffes zur Verabreichung in der Submukosa
der Lippen verwendet.
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Im
Folgenden wird eine Liste der Bakterien präsentiert, die alle dafür bekannt
sind, dass sie die. Bildung von Abszessen und demzufolge schwerwiegenden
Gewebeschaden und Hautläsionen
verursachen, wenn sie intramuskulär verabreicht werden. Und für alle diese
Bakterien besteht eine reziproke Beziehung zwischen dem verminderten,
immunogenen Potential nach Abschwächung auf der einen Seite und
der Akzeptanz von lokalen Reaktionen an der Verabreichungsstelle
auf der anderen Seite. Die Erfindung betrifft die Verwendung der
folgenden, lebenden, abgeschwächten
Bakterien, die abgeschwächte Formen
von für
Pferde pathogenen Bakterien sind.
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Streptococcus
zooepidemicus, welches Atemwegsinfektionen und Lungenentzündung, opportunistische
Infektionen und Aborte in Pferden verursacht, Rhodococcus equi,
welches Bronchopneumonie mit Abszessen und intestinale Abszesse
hervorruft, Corynebacterium pseudotuberculosis, welches pektorale
Abszesse und ulzerative Lymphangitis hervorruft, Pseudomonas mallei,
welches:
"Glanders" verursacht, eine
Krankheit, die sich durch pyogranulomatöse Entzündungen, knotige Läsionen der
Lunge und ulzerative und knotige Läsionen der Haut und Atemwegsschleimhaut
auszeichnet, Actinobacillus equili, eine wohlbekannte Ursache für neonatalen
Tod, Aborte in Stuten, Totgeburt und Septikämie in Fohlen verursacht, und
schlussendlich Pasteurella multocida, welches Atemwegsinfektionen
in Pferden verursacht.
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Pferde
haben in vielen Fällen
sowohl einen hohen emotionalen wie auch ökonomischen Wert für ihre Besitzer.
Insbesondere auf dem Gebiet der Vollblütler wäre es unzumutbar, Pferde nach
der Impfung an Abszessen leiden zu lassen.
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Demnach
bezieht sich die Verwendung in einer noch bevorzugteren Variante
der Erfindung auf die Verwendung, worin das lebende, abgeschwächte Bakterium
ausgewählt
ist aus der Gruppe von Bakterien umfassend Streptococcus zooepidemicus,
Rhodococcus equi, Corynebacterium pseudotuberculosis, Pseudomonas
mallei, Actinobacillus equili and Pasteurella multocida.
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In
einer sogar noch bevorzugteren Variante ist das lebende, abgeschwächte Bakterium
von der Art des Streptococcus zooepidemicus.
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Die
Erfindung ist gleichermassen auf die folgenden, lebenden, abgeschwächten Bakterien
anwendbar, die in einer abgeschwächten
Form eines Bakteriums, das für
Rinder pathogen ist, vorliegen.
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Actinomyces
pyogenes, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae und Streptococcus uberis,
Noccardia asteroides, Corynebacterium bovis, Mycoplasma bovis, und
Mycobacterium bovis, die alle wohlbekannte Ursachen der Rindermastitis sind,
Escherichia coli, welches sowohl Rindermastitis wie auch Diarrhoe
verursacht, Pasteurella haemolytica und P. multocida, welche sowohl
Pneumonie wie auch Septikämie
verursachen, Brucella abortus, welches Aborte verursacht, Salmonella
Dublin und S. typhimurium, welche Diarrhoe, Pneumonie und systemische
Infektionen verursachen, und schliesslich Leptospira hardjo als
eine Ursache von Harnwegsinfektionen.
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Die
Erfindung betrifft ebenso lebende, abgeschwächte Bakterien, die in einer
abgeschwächten Form
eines Bakteriums, das für
Schweine pathogen ist, vorliegen.
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Streptococcus
suis, welches Polyserositis verursacht, Staphylococcus aureus, welches
exudative Epidermitis verursacht, Actinobacillus pleuropneumoniae,
welches Pleuropneumonie verursacht, Pasteurella multocida, welches
atrophische Rhinitis und Pneumonie verursacht, Bordetella bronchiseptica,
welches ebenso atrophische Rhinitis und Pneumonie verursacht, Escherichia
coli, welches Diarrhoe und Ödem-Krankheit
verursacht, Clostridium perfringens als eine Ursache von Diarrhoe
und Septikämie, Salmonella
cholerasuis, das ebenso eine bekannte Ursache für Diarrhoe ist, Haemophilus
parasuis, das ebenso als die Ursache für die "Glassers Krankheit" bekannt ist, Erysipelothrix rhusiopathiae, das
eine als "Erysipelas" bekannte Krankheit
verursacht, Mycoplasma hyopneumoniae, das Pneumonie verursacht, Serpulina
hyodysenteriae als eine Ursache von Diarrhoe und Leptospira pomona,
welches Aborte verursacht.
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Die
Erfindung bezieht sich ebenso auf lebende, abgeschwächte Bakterien,
die in einer abgeschwächten
Form eines Bakteriums, das für
Hunde pathogen ist, vorliegen.
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Staphylococcus
aureus, Pyoderma, Streptococcus pneumoniae, Septikämie, Bordetella
bronchiseptica, Tracheobronchitis, Escherichia coli, Diarrhoe, Leptospira
canicola und icterohaemorrhagiae, allgemeine und Harnwegsinfektionen.
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Die
hergestellten Impfstoffe umfassen mindestens eine immunogen effektive
Menge eines lebenden, abgeschwächten
Bakteriums. Immunogen effektiv bedeutet, dass die Menge des lebenden,
abgeschwächten
Bakteriums, das bei der Impfung verabreicht wird, ausreichend ist,
um im Wirt eine effektive Immunantwort zu virulenten Formen des
Bakteriums zu induzieren.
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Die
nützliche
Dosis, die verabreicht wird, wird in Abhängigkeit des Alters, Gewicht
und des zu impfenden Säugetiers
sowie des Typs des Pathogens, gegen welches eine Impfung gesucht
wird, variieren. Der Impfstoff kann jegliche Dosis von Bakterien
umfassen, die ausreichend ist, um eine Immunantwort hervorzurufen.
Dosen, die zwischen 103 und 1010 Bakterien
liegen, sind z.B. sehr geeignete Dosen.
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Zusätzlich zu
einer immunogen effektiven Menge des hierin zuvor beschriebenen,
lebenden, abgeschwächten
Bakteriums, enthält
der hergestellte Impfstoff ebenso einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Solch
ein Träger
kann so einfach wie Wasser sein, aber er kann z.B, auch Kulturflüssigkeit,
in der die Bakterien kultiviert wurden, umfassen. Ein anderer geeigneter
Träger
ist z.B. eine Lösung
von physiologischer Salzkonzentration. Andere Beispiele von pharmazeutisch
verträglichen
Trägern
oder Verdünnungsmitteln,
die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen Stabilisatoren,
wie zum Beispiel SPGA, Carbohydrate (z.B. Sorbitol, Mannitol, Stärke, Sukrose,
Glukose, Dextran), Proteine wie zum Beispiel Albumin oder Casein,
Protein enthaltende Stoffe wie zum Beispiel bovines Serum oder Magermilch und
Puffer (z.B. Phosphatpuffer).
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Gegebenenfalls
können
eine oder mehrere Verbindungen mit Adjuvansaktivität zum Impfstoff hinzugegeben
werden. Adjuvantien sind unspezifische Stimulatoren des Immunsystems.
Sie verstärken
die Immunantwort des Wirtes gegenüber dem eindringenden Pathogen.
Beispiele von Adjuvantien, die in Fachkreisen bekannt sind, sind
Freund's Komplette
oder Inkomplette Adjuvantien, Vitamin E, nicht-ionische Blockpolymere,
Muramyldipeptide, ISCOMs (Immunstimulierende Komplexe, siehe zum Beispiel
Europäisches
Patent
EP 109942 ), Saponine,
Mineralöl,
Pflanzenöl
und Carbopol (ein Homopolymer). Andere geeignete Adjuvantien sind
zum Beispiel Aluminiumhydroxid, -phosphat oder -oxid, Öl-Emulsionen
(z.B. von Bayol F
® oder Marcol 52
®), Saponine
oder Vitamin-E Solubilisate.
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BEISPIELE
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Beispiel 1:
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In
diesem Experiment wurde das Prinzip der Durchführbarkeit der submukösen Verabreichung
unter Verwendung zweier verschiedener, abgeschwächter Streptococcus equi Stämme getestet. Dieses
Beispiel wurde bloss hinzugefügt,
um das Prinzip von submuköser
Verabreichung zu zeigen und als Anleitung für andere nicht-Streptococcus equi
Stämme.
Streptococcus equi Stämme
fallen nicht unter die Gruppe der Bakterien, auf welche sich die
vorlegende Erfindung bezieht.
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In
diesem Experiment wurden die Sicherheit und Wirksamkeit des lebenden
S. equi Stamm TW 928 Deletionsmutanten-Impfstoff und des Stammes TW
928/sls Doppelmutanten-Impfstoff in Diluvac Forte® (erhältlich durch
Intervet Int. B.V., P.O.Box 31, 5830 AA Boxmeer, Niederlande) getestet,
wobei beide submukös
in die Lippe verabreicht wurden. Ein Vergleich mit der Sicherheit
einer ähnlichen,
intramuskulären
Impfung wurde gezogen.
Nach einer zweiwöchigen Akklimatisations-Periode, wurden
5 Pferde mit der Stamm TW 928 Deletionsmutante submukös in die
Lippe geimpft. Die Impfung wurde an zwei Stellen in der oberen Lippe
und zwei Stellen in der unteren Lippe vorgenommen. Eine Nadel wurde
verwendet, die versehen war mit einer Scheibe von ungefähr 1 Zentimeter
in Durchmesser, die in rechten Winkeln zur Nadel angebracht und
bei ungefähr
2.5 Millimetern von der Spitze der Nadel lokalisiert war. Dies verhinderte,
dass die Nadelspitze für
mehr als ungefähr
2 Millimeter in die Submukosa eindrang.
Ein Volumen von 200 μl Impfstoff
umfassend 6.3 × 108 Bakterien wurde bei jeder Stelle verabreicht.
Drei andere Pferde wurden subkutan auf dieselbe Weise geimpft, jedoch
mit einem Doppelmutanten: Stamm TW 928/sls umfassend 1.6 × 108 Bakterien in Diluvac Forte.
Drei Pferde
wurden mit vergleichbaren Dosen des TW 928 Deleti onsmutanten-Stammes
IM in den Nacken geimpft.
Zwei Pferde wurden als Kontrollen
belassen.
Vier Wochen nach der Vorimpfung (priming vaccination)
wurden die Geimpften wie hierin zuvor beschrieben mit dergleichen
Menge an Bakterien an ähnlichen
Impfungsstellen geboostet. Zwei Wochen nach der Boosterimpfung wurden
alle Pferde intranasal mit 7.7 × 108 CFU des Challenge-Stammes S. equi Stamm
Arnica in einem 2 ml Volumen einem Challenge unterzogen. Nach der
Impfung wurden die Pferde auf jegliche systemischen oder lokalen
Reaktionen beobachtet und nach dem Challenge wurden die Pferde auf
klinische Zeichen von Druse oder jeglichen anderen Abnormalitäten untersucht.
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Resultate:
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Die
Pferde, die einer intramuskulären
Impfung in den Nacken unterzogen wurden, entwickelten innerhalb
Wochen nach der Impfung grosse Abszesse, die Durchmesser von zwischen
10 und 30 Zentimetern erreichten. Diese Abszesse waren beständig und
wuchsen bis sie aufbrachen.
Pferde, die submuköser Impfung
unterzogen wurden, schienen in guter Kondition zu sein und hatten
einen normalen Appetit und keine bedeutenden, weiteren, systemischen
Reaktionen wurden beobachtet.
Nach dem submukösen Priming
und Boosting mit der 928 Deletionsmutante wurden nur kleine und
vorübergehende,
lokale Reaktionen gefunden. Die meisten Reaktionen verschwanden
3 Wochen nach der Vorimpfung und 2 Wochen nach der Booster-Impfung.
Dieselben geringfügigen,
lokalen Reaktionen, aber zu sogar einem geringeren Ausmass, wurden nach
beiden Impfungen mit der 928/sls Doppelmutante beobachtet.
Nach
dem Challenge schienen die fünf
Pferde, die submukös
mit der TW 928 Deletionsmutante geimpft wurden, vollständig geschützt. Vollständiger Schutz wurde
ebenso in den Pferden, die intramuskulär mit der TW 928 Deletionsmutante
geimpft wurden, erzielt.
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Demzufolge
kann geschlossen werden, dass
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Schutz mit geeigneten Impfstoff-Stämmen unabhängig von der Verabreichungsstelle
erhalten werden kann; intramuskulär oder submukös.
- • kaum
jegliche nachteilige, lokale Reaktionen bei der submukösen Verabreichungsstelle
gefunden wurden, während
intramuskuläre
Verabreichung grosse, beständige
Abszesse an der Verabreichungsstelle verursachten.
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Beispiel 2:
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Vergleich von submuköser und
intramuskulärer
Verabreichung eines Stammes des für das Pferd pathogenen Bakteriums
Streptococcus zooepidemicus
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In
diesem Experiment wurde die Sicherheit von submuköser Verabreichung
von Strep. z. mit der von intramuskulärer Verabreichung verglichen,
insbesondere in Bezug auf nachteilige, lokale Reaktionen.
Zwei
Pferde wurden submukös
mit 7 × 107 CFU Strep. z. in einem Gesamtvolumen von
0.2 ml in die Lippe geimpft. Zwei andere Pferde wurden intramuskulär mit derselben
Dosis aber in einem Gesamtvolumen von 1 ml in den Nacken geimpft.
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Resultate:
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Die
intramuskulär
geimpften Pferde entwickelten ab dem vierten Tag nach der Impfung
grosse Abszesse, die zehn Tage nach der Impfung zu einer durchschnittlichen
Grösse
von ungefähr
20 Zentimetern in Durchmesser heranwuchsen. Diese Abszesse waren
beständig.
Die
submukös
geimpften Pferde entwickelten nur geringfügige Abszesse mit einer durchschnittlichen Grösse von
2.5 Zentimetern, beginnend am fünften Tag
nach der Impfung. Die Abszesse verschwanden vollständig nach
sechs Tagen ohne jegliche Spuren zu hinterlassen.
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Beispiel 3:
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Vergleich von submuköser und
intramuskulärer
Verabreichung eines virulenten Stammes des für das Rind pathogenen Bakteriums
Actinomyces pyogenes
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In
diesem Experiment wurde die Sicherheit von submuköser Verabreichung
von A. pyogenes mit der von intramuskulärer Verabreichung verglichen, insbesondere
in Bezug auf nachteilige, lokale Reaktionen.
Zwei Kühe wurden
submukös
mit 1.2 × 1010 CFU in einem Gesamtvolumen von 0.2 ml
in die Vulva geimpft. Zwei andere Kühe wurden intramuskulär mit derselben
Dosis aber in einem Gesamtvolumen von 1 ml in den Nacken geimpft.
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Resultate:
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In
den submukös
geimpften Tieren entwickelten sich nach drei Tagen kleine Abszesse,
die eine Durchschnittsgrösse
von ungefähr
3.5 Zentimetern erreichten. Diese Abszesse nahmen nach ein paar
Tagen in Grösse
ab.
In den zwei Kühen,
die intramuskulär
mit derselben Dosis in den Nacken geimpft wurden, entwickelten sich
grosse und beständigere
Abszesse nach drei Tagen, die einen Durchmesser von zwischen 9 und
14 Zentimetern erreichten.