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PATENTANSPRÜCHE
1. Vakzine gegen Ferkel-Colibacillose, enthaltend eine wirksame Menge Progenoid des Vibrio cholerae Toxins.
2. Vakzine nach Anspruch 1, enthaltend eine wirksame Menge an Progenoid des gereinigten Vibrio cholerae Toxins und ein Ajuvans.
3. Vakzine nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Progenoid ein Extrakt des Vibrio cholerae ist.
4. Vakzine nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie das Progenoid des Vibrio cholerae Toxins des Stammes Vibrio cholerae 569 B Inaba enthält.
5. Vakzine nach den Ansprüchen I bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Adjuvans ein öliges Adjuvans oder eine gelförmige Aluminiumverbindung ist.
6. Verfahren zur Herstellung der Vakzinen nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man aus dem Kulturüberstand einer, hitzelabiles Choleratoxin produzierenden Vibrio cholerae Kultur, das hitzelabile Choleratoxin isoliert, daraus das Progenoid gewinnt und mit einem Adjuvans vermischt.
Die neonatale Coliruhr des Schweins ist eine wichtige Todesursache bei Saugferkeln. Es sind bereifs zahlreiche Versuche unternommen worden, um diese Krankheit durch aktives Immunisieren des Muttertieres gegen Escherichia coli entweder durch Tot- oder Lebendvakzine oder durch Verabreichen von E. coli-Antiserum an die Schweine zu be kämpfen.
Die aktive Immunisierung der Mutterschweine ist durch parenterale Verabreichung von E. coli-Vakzinen vorgenommen worden. Da jedoch der bzw. die zur Immunisierung verwendeten E. coli-Stämme nur spezifische Antikörper hervorrufen, während mit einem bestimmten Ausbruch der Krankheit Stämme unterschiedlichen Serotyps verbunden sein können, haben diese Versuche zur Vorbeugung auf Basis einer antibakteriellen Immunität widersprechende und im allgemeinen unbefriedigende Resultate ergeben. Selbst wenn in einigen Fällen ein guter Schutz erhalten wurde, war er nur auf die in der Vakzine enthaltenen Serotypen von E. coli beschränkt.
Die Verabreichung von Antiserum kann keine praktikable Vorbeugung gegen Colibacillose gewährleisten, da der dadurch erreichbare Schutz tatsächlich von kurzer Dauer ist und eine kontinuierliche Verabreichung an die Ferkel erfordert.
Verschiedene Stämme von Fibrin cholerae bilden unabhängig von ihrem Serotyp immunologisch identische Exo Enterotoxine, auch Choleragen bzw. Choleratoxin genannt.
Dieses Toxin besteht aus zwei Arten nur durch Nebenvalenzen aneinander geknüpfte Untereinheiten, der Untereinheit A (MG ungefähr 28 000) und fünf Untereinheiten B (MG ungefähre 11 000). Die Untereinheiten B sind für die Bindung des intakten Toxins an die Zellmembran verantwortlich, aber sind nicht an der nachgeschaltenen Aktivierung der Adenylatcyclase und dem dadurch induzierten Einströmen von Flüssigkeit (Durchfall) in das Darmlumen beteiligt.
Die Untereinheit A ist essentiell für die Toxizität. Die zwei Untereinheiten des Choleratoxins sind immunologisch nicht verwandt.
Die Untereinheiten unterscheiden sich auch merklich in ihrer Immunogenität. Eine Immunisierung mit intaktem Toxin gibt immer Anlass für die Bildung eines Antiserums, das stark mit der Untereinheit B und etwas schwächer mit der Untereinheit A reagiert.
Das Progenoid kann nach bekannten Vorschriften aus gereinigtem Toxin hergestellt werden. Eine Immunisierung mit einem solchen Präparat führt immer zur Bildung von Antikörpern, die sowohl mit dem Progenoid, dem intakten Choleratoxin, seinen Untereinheiten als auch mit den hitzelabilen Enterotoxinen von E. coli unterschiedlichen Serotyps reagieren.
Es wurde nun gefunden, dass bei Verabreichung von Progenoid mit einem Adjuvans an trächtige Mutterschweinen 2 und 5 Wochen vor dem Ferkeln die geimpften Mutterschweine nicht nur Antikörper gegen das Progenoid in ihrem Kolostnun, in ihrer Milch und im Serum entwickeln, son dem dadurch auch die Ferkel gegen die Wirkung der E. coli Keime geschützt werden. Der Schutz erstreckt sich gegen die Wirkung von Enterotoxinen, die durch E. coli-Serotypen gebildet werden.
Aufgabe der Erfindung war es daher, neue Vakzinen gegen Ferkel-Colibacillose zur Verfügung zu stellen, mit denen diese Krankheit zuverlässig bekämpft werden können.
Gegenstand der Erfindung sind somit Vakzinen gegen Ferkel-Colibacillose, die eine gewisse Menge an Progenoid, gewonnen aus dem Vibrio cholerae-Enterotoxin, enthalten.
Die Verhütung der Ferkel-Colibacillose durch subkutane Verabreichung des erfindungsgemässen Progenoid-Präparates wurde nachgewiesen, indem man einen Teil der Mutterschweine in Betrieben mit starkem Colibacillose-Befall zwei und fünfWochen vor dem Ferkeln impft. Die nicht geimpften Muttertiere dienten als Kontrollen. Die Colibacillose wurde mikrobiologisch eindeutig nachgewiesen. Als Erreger wurde in allen Fällen E. coli 0149: K91, K88 a,c nachgewiesen. Die klinische Entwicklung der Ferkel wird fachgerecht verfolgt, wobei auf das Auftreten typischer Symptome der Colibacillose geachtet wird. In der Tabelle I sind die Ergebnisse dieser Versuche zusammengefasst.
Das Progenoid kann durch chemische und physikochemische Behandlung des Vibrio cholerae-Enterotoxins, das aus verschiedenen Vibrio cholerae-Biotypen isoliert werden kann, gewonnen werden. Ein bevorzugtes Beispiel eines solchen V. cholerae-Biotyps ist der Stamm 569 B Inaba. Der Stamm V. cholerae 569B war der Öffentlichkeit vor dem Anmeldedatum zugänglich. Der Stamm kann von der American Type Culture Collection, Rockville, MD. (Nr. 25870 im Katalog von 1978) bezogen werden. Der Stamm wurde beschrieben im Brit. J. Pharmacol. Chemother. 10: 153159 (1955). Die Darstellung des Progenoids ist bekannt.
Als Adjuvans, das die Aufgabe hat, eine starke Immunreaktion zu gewährleisten, kann erfindungsgemäss jedes Produkt oder Gemisch verwendet werden, von dem man weiss, dass es bei Vakzinen als Adjuvans wirkt. Spezielle Beispiele eines adäquaten Adjuvans sind gelförmig Aluminiumverbindungen, wie Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat und Alhydrogel (Warenzeichen eines von der SUPERFOS Export Company, Kopenhagen, hergestellten und.vertriebe- nen Aluminiumhydroxid-Gels), sowie Wasser-in-ÖI-Emul- sionen und komplettes Freunds'sches Adjuvans (eine Was ser-in-Ol-Emulsion von Paraffinöl, das mit Mannitmonooleat emulgiert ist und abgetötetes Mycobacterium tuberculosis enthält).
Das folgende Beispiel soll die Erfindung erläutern, ohne sie dadurch einzuschränken:
Herstellung des Toxins
Als Produktionsstamm für die Herstellung des Toxins wurde 569 B Inaba verwendet. Die Fermentierung erfolgt in
50, 200 Lt. oder grösseren Fermentern nach den Angaben von Finkelstein1 und Germanier2.
Die Isolierung und Reinigung des Toxins erfolgte in drei Schritten:
1. Konzentrierung des Kulturüberstandes mit Ultrafiltration oder mit einer geeigneten Fällung.
2. Absorption und Elution an einer Aluminiumhydroxid Kolonne.
3. Gelchromatographie an Sephadex G 75.
Herstellung des Progenoids
Choleratoxin hat die Eigenschaft, unter bestimmten Bedingungen bei Temperaturen über 55 C stabile Aggregate zu bilden.
Diese Eigenschaft wurde von Finkelstein3 entdeckt und die Aggregate von ihm als Procholeragenoide oder Progenoide bezeichnet.
Die Herstellung der Progenoide wurde im Tris-EDTA Puffer pH 7,5 bei einer Toxinkonzentration von 6 mglml bei 60 "C durchgeführt. Die Inkubationszeiten liegen zwischen 10-30 Min. Ein Liter sterile Tris-EDTA-Lösung enthält 6,06 g Tris (Hydroxy-Methyl)-Aminomethan, 11,7 g Natriumchlorid, 0,372 g EDTA, 0,195 g Natriumazid. Etwas langsamer verläuft die Bildung des Progenoids in PBS-Puffer pH 7,3. Bei einer Toxinkonzentration von 6 mg/mI und bei 60 "C liegen die Inkubationszeiten zwischen 20 und 40 Minuten. Die sterile phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung enthält: 14,24 g Na2HPO4 2 H2O, 1,36 g KH2PO4 und 22 g NaCl pro Liter.
Charakterisierung des Progenoids
Das Progenoid ist ein Gemisch von Aggregaten des Toxins mit unterschiedlichen Molekulargewichten. Die Molekulargewichte werden an Sepharose 4B/C1 bestimmt, wobei zwei Aggregattypen mit einem Molekulargewichtsbereich von 200 000-106 und 106-10.106 dalton vorherrschen. Das Verhältnis dieser Molekültypen hängt von der Inkubationsdauer bei 60 C ab.
Herstellung der Vakzine
Ein aliquoter Teil von 100 llg des gefriergetrockneten Präparates des Progenoids wird durch Zugabe von 5 ml sterilem Wasser rehydratisiert. Die so erhaltene Vakzine wird unter sterilen Bedingungen mit 5 ml sterilem, kompletten Freunds Adjuvans, d. h. mit einer mit Mannitmonooleat emulgierten und mit abgetötetem Mycobacterin tuberculosis versetzten Wasser-in-Öl-Emulsion von Paraffinöl, gründlich vermischt. Die so erhaltene, adjuvanshaltige Vakzine wird jp 5 ml-Ampullen verteilt, die entweder abgeschmolzen oder dicht verschlossen werden und eine Progenoidmenge entsprechend 50 ug gefriergetrocknetem Präparat pro Ampulle enthalten. Der Inhalt jeder Ampulle entspricht einer Vakzine-Dosiereinheit.
Die Vakzine wird trächtigen Mutterschweinen zwei und fünf Wochen vor dem Ferkeln intramus kul är oder subkutan verabreicht.
Die adjuvanshaltige Vakzine kann auch in grösseren Ampullen verteilt werden, wobei ganzzahlige Vielfache der Dosiereinheit und somit die entsprechenden Vielfach-Dosen Vakzinepräparate erhalten werden
Referenzen 1. Finkelstein, R.A., and J.J. Lo Spalluto (1970).
Production of highly purified choleragen and cholerage noid.
J. Infect. Dis. 121 (Suppl.) S. 63-72.
2. R. Germanier, E. Fürer, S. Varallyay and T. M. Inderbit zin (1976).
Preparation of a Purified Antigenic Cholera Toxoid.
Inf. and Immun. 13:1692-1698.
3. Finkelstein, R.A., K. Fujita and J.J. Lo Spalluto (1971).
Procholeragenoid and Aggregated Intermediate in the
Formation of Choleragenoid.
J. Immunol. 107: 1043-1051.
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PATENT CLAIMS
1. Vaccine against piglet colibacillose, containing an effective amount of Progenoid of Vibrio cholerae toxin.
2. Vaccine according to claim 1, containing an effective amount of progenoid of the purified Vibrio cholerae toxin and an adjuvant.
3. Vaccine according to claims 1 and 2, characterized in that the progenoid is an extract of Vibrio cholerae.
4. Vaccine according to claims 1 to 3, characterized in that it contains the progenoid of Vibrio cholerae toxin from the Vibrio cholerae 569 B Inaba strain.
5. Vaccine according to claims I to 4, characterized in that the adjuvant is an oily adjuvant or a gel-like aluminum compound.
6. Process for the preparation of the vaccines according to one of claims 2 to 5, characterized in that from the culture supernatant of a heat-labile cholera toxin producing Vibrio cholerae culture, which isolates heat-labile cholera toxin, the progenoid is obtained therefrom and mixed with an adjuvant.
The pig's neonatal coli clock is an important cause of death in suckling piglets. Numerous attempts have been made to combat this disease by actively immunizing the mother against Escherichia coli either by dead or live vaccine or by administering E. coli antiserum to the pigs.
The active immunization of the mother pigs was carried out by parenteral administration of E. coli vaccines. However, since the E. coli strains used for immunization only give rise to specific antibodies, while strains of different serotypes can be associated with a specific outbreak of the disease, these attempts at prevention based on antibacterial immunity have yielded contradicting and generally unsatisfactory results . Even if good protection was obtained in some cases, it was limited only to the serotypes of E. coli contained in the vaccine.
The administration of antiserum cannot guarantee a practical prevention against colibacillose, since the protection that can be achieved in this way is actually short-lived and requires continuous administration to the piglets.
Different strains of fibrin cholerae, regardless of their serotype, form immunologically identical exo enterotoxins, also known as cholera or cholera toxin.
This toxin consists of two types of subunits linked only by secondary valences, subunit A (MG approximately 28,000) and five subunits B (MG approximately 11,000). The subunits B are responsible for the binding of the intact toxin to the cell membrane, but are not involved in the subsequent activation of the adenylate cyclase and the consequent inflow of liquid (diarrhea) into the intestinal lumen.
Subunit A is essential for toxicity. The two subunits of cholera toxin are not immunologically related.
The subunits also differ markedly in their immunogenicity. Immunization with intact toxin always gives rise to the formation of an antiserum that reacts strongly with subunit B and somewhat weaker with subunit A.
The progenoid can be produced from purified toxin according to known regulations. Immunization with such a preparation always leads to the formation of antibodies which react both with the progenoid, the intact cholera toxin, its subunits and with the heat-labile enterotoxins of E. coli of different serotypes.
It has now been found that when progenoid is administered with an adjuvant to pregnant pigs 2 and 5 weeks before the piglet, the vaccinated pigs not only develop antibodies against the progenoid in their colostrum, in their milk and in serum, but also thereby the piglets protected against the action of E. coli germs. Protection extends against the action of enterotoxins produced by E. coli serotypes.
The object of the invention was therefore to provide new vaccines against piglet colibacillosis, with which this disease can be reliably controlled.
The invention thus relates to vaccines against piglet colibacillose which contain a certain amount of progenoid obtained from the Vibrio cholerae enterotoxin.
The prevention of piglet colibacillose by subcutaneous administration of the progenoid preparation according to the invention was demonstrated by vaccinating a part of the mother pigs in farms with severe colibacillose infection two and five weeks before the piglet. The unvaccinated dams served as controls. Colibacillose has been clearly demonstrated microbiologically. E. coli 0149: K91, K88 a, c was detected as the pathogen in all cases. The clinical development of the piglets is followed professionally, paying attention to the appearance of typical symptoms of colibacillosis. The results of these tests are summarized in Table I.
The progenoid can be obtained by chemical and physicochemical treatment of Vibrio cholerae enterotoxin, which can be isolated from different Vibrio cholerae biotypes. A preferred example of such a V. cholerae biotype is strain 569 B Inaba. The V. cholerae 569B strain was open to the public prior to the filing date. The strain can be obtained from the American Type Culture Collection, Rockville, MD. (No. 25870 in the 1978 catalog). The tribe was described in Brit. J. Pharmacol. Chemother. 10: 153159 (1955). The representation of the progenoid is known.
According to the invention, any product or mixture which is known to act as an adjuvant in vaccines can be used as an adjuvant which has the task of ensuring a strong immune reaction. Specific examples of an adequate adjuvant are gel-like aluminum compounds, such as aluminum hydroxide, aluminum phosphate and alhydrogel (trademark of an aluminum hydroxide gel manufactured and sold by the SUPERFOS Export Company, Copenhagen), as well as water-in-oil emulsions and a complete friend 'adjuvant (a water-in-oil emulsion of paraffin oil emulsified with mannitol monooleate and containing killed Mycobacterium tuberculosis).
The following example is intended to explain the invention without restricting it:
Production of the toxin
569 B Inaba was used as the production strain for the production of the toxin. The fermentation takes place in
50, 200 Lt. or larger fermenters according to Finkelstein1 and Germanier2.
The toxin was isolated and purified in three steps:
1. Concentrate the culture supernatant with ultrafiltration or with a suitable precipitation.
2. Absorption and elution on an aluminum hydroxide column.
3. Gel chromatography on Sephadex G 75.
Production of the progenoid
Cholera toxin has the property, under certain conditions, of forming stable aggregates at temperatures above 55 C.
This property was discovered by Finkelstein3 and he referred to the aggregates as procholeragenoids or progenoids.
Progenoids were prepared in the Tris-EDTA buffer pH 7.5 at a toxin concentration of 6 mg / ml at 60 "C. The incubation times are between 10-30 min. One liter of sterile Tris-EDTA solution contains 6.06 g Tris ( Hydroxy-methyl) -aminomethane, 11.7 g sodium chloride, 0.372 g EDTA, 0.195 g sodium azide. Progenoid formation in PBS buffer pH 7.3 is somewhat slower. At a toxin concentration of 6 mg / ml and at 60 "C. the incubation times are between 20 and 40 minutes. The sterile phosphate buffered physiological saline contains: 14.24 g Na2HPO4 2 H2O, 1.36 g KH2PO4 and 22 g NaCl per liter.
Characterization of the progenoid
The progenoid is a mixture of aggregates of the toxin with different molecular weights. The molecular weights are determined on Sepharose 4B / C1, with two types of aggregates with a molecular weight range of 200,000-106 and 106-10,106 daltons predominating. The ratio of these types of molecules depends on the incubation period at 60 ° C.
Production of the vaccine
An aliquot of 100 μg of the freeze-dried preparation of the progenoid is rehydrated by adding 5 ml of sterile water. The vaccine thus obtained is sterile with 5 ml of sterile, complete Freund's adjuvant, i.e. H. with a water-in-oil emulsion of paraffin oil, emulsified with mannitol monooleate and mixed with killed Mycobacterin tuberculosis, thoroughly mixed. The adjuvant-containing vaccine thus obtained is distributed per 5 ml ampoules, which are either melted or sealed and contain a quantity of progenoid corresponding to 50 μg of freeze-dried preparation per ampoule. The content of each ampoule corresponds to a vaccine dosing unit.
The vaccine is administered intramuscularly or subcutaneously to pregnant mother pigs two and five weeks before farrowing.
The adjuvant-containing vaccine can also be distributed in larger ampoules, whereby integer multiples of the dosing unit and thus the corresponding multiple doses of vaccine preparations are obtained
References 1. Finkelstein, R.A., and J.J. Lo Spalluto (1970).
Production of highly purified choleragen and cholerage noid.
J. Infect. Dis. 121 (Suppl.) Pp. 63-72.
2. R. Germanier, E. Fürer, S. Varallyay and T. M. Inderbit zin (1976).
Preparation of a Purified Antigenic Cholera Toxoid.
Inf. And Immune. 13: 1692-1698.
3. Finkelstein, R.A., K. Fujita and J.J. Lo Spalluto (1971).
Procholeragenoid and Aggregated Intermediate in the
Formation of choleragenoid.
J. Immunol. 107: 1043-1051.