CH645270A5

CH645270A5 - Vaccine against coli bacillosis of piglets and process for its preparation

Info

Publication number: CH645270A5
Application number: CH917879A
Authority: CH
Inventors: Rene Prof Dr Germanier; Emil Dr Fuerer
Original assignee: Schweiz Serum & Impfinst
Priority date: 1979-10-11
Filing date: 1979-10-11
Publication date: 1984-09-28

Description

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PATENTANSPRÜCHE
1. Vakzine gegen Ferkel-Colibacillose, enthaltend eine wirksame Menge Progenoid des Vibrio cholerae Toxins.

2. Vakzine nach Anspruch 1, enthaltend eine wirksame Menge an Progenoid des gereinigten Vibrio cholerae Toxins und ein Ajuvans.

3. Vakzine nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Progenoid ein Extrakt des Vibrio cholerae ist.

4. Vakzine nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie das Progenoid des Vibrio cholerae Toxins des Stammes Vibrio cholerae 569 B Inaba enthält.

5. Vakzine nach den Ansprüchen I bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Adjuvans ein öliges Adjuvans oder eine gelförmige Aluminiumverbindung ist.

6. Verfahren zur Herstellung der Vakzinen nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man aus dem Kulturüberstand einer, hitzelabiles Choleratoxin produzierenden Vibrio cholerae Kultur, das hitzelabile Choleratoxin isoliert, daraus das Progenoid gewinnt und mit einem Adjuvans vermischt.

Die neonatale Coliruhr des Schweins ist eine wichtige Todesursache bei Saugferkeln. Es sind bereifs zahlreiche Versuche unternommen worden, um diese Krankheit durch aktives Immunisieren des Muttertieres gegen Escherichia coli entweder durch Tot- oder Lebendvakzine oder durch Verabreichen von E. coli-Antiserum an die Schweine zu be kämpfen.

Die aktive Immunisierung der Mutterschweine ist durch parenterale Verabreichung von E. coli-Vakzinen vorgenommen worden. Da jedoch der bzw. die zur Immunisierung verwendeten E. coli-Stämme nur spezifische Antikörper hervorrufen, während mit einem bestimmten Ausbruch der Krankheit Stämme unterschiedlichen Serotyps verbunden sein können, haben diese Versuche zur Vorbeugung auf Basis einer antibakteriellen Immunität widersprechende und im allgemeinen unbefriedigende Resultate ergeben. Selbst wenn in einigen Fällen ein guter Schutz erhalten wurde, war er nur auf die in der Vakzine enthaltenen Serotypen von E. coli beschränkt.

Die Verabreichung von Antiserum kann keine praktikable Vorbeugung gegen Colibacillose gewährleisten, da der dadurch erreichbare Schutz tatsächlich von kurzer Dauer ist und eine kontinuierliche Verabreichung an die Ferkel erfordert.

Verschiedene Stämme von Fibrin cholerae bilden unabhängig von ihrem Serotyp immunologisch identische Exo Enterotoxine, auch Choleragen bzw. Choleratoxin genannt.

Dieses Toxin besteht aus zwei Arten nur durch Nebenvalenzen aneinander geknüpfte Untereinheiten, der Untereinheit A (MG ungefähr 28 000) und fünf Untereinheiten B (MG ungefähre 11 000). Die Untereinheiten B sind für die Bindung des intakten Toxins an die Zellmembran verantwortlich, aber sind nicht an der nachgeschaltenen Aktivierung der Adenylatcyclase und dem dadurch induzierten Einströmen von Flüssigkeit (Durchfall) in das Darmlumen beteiligt.

Die Untereinheit A ist essentiell für die Toxizität. Die zwei Untereinheiten des Choleratoxins sind immunologisch nicht verwandt.

Die Untereinheiten unterscheiden sich auch merklich in ihrer Immunogenität. Eine Immunisierung mit intaktem Toxin gibt immer Anlass für die Bildung eines Antiserums, das stark mit der Untereinheit B und etwas schwächer mit der Untereinheit A reagiert.

Das Progenoid kann nach bekannten Vorschriften aus gereinigtem Toxin hergestellt werden. Eine Immunisierung mit einem solchen Präparat führt immer zur Bildung von Antikörpern, die sowohl mit dem Progenoid, dem intakten Choleratoxin, seinen Untereinheiten als auch mit den hitzelabilen Enterotoxinen von E. coli unterschiedlichen Serotyps reagieren.

Es wurde nun gefunden, dass bei Verabreichung von Progenoid mit einem Adjuvans an trächtige Mutterschweinen 2 und 5 Wochen vor dem Ferkeln die geimpften Mutterschweine nicht nur Antikörper gegen das Progenoid in ihrem Kolostnun, in ihrer Milch und im Serum entwickeln, son dem dadurch auch die Ferkel gegen die Wirkung der E. coli Keime geschützt werden. Der Schutz erstreckt sich gegen die Wirkung von Enterotoxinen, die durch E. coli-Serotypen gebildet werden.

Aufgabe der Erfindung war es daher, neue Vakzinen gegen Ferkel-Colibacillose zur Verfügung zu stellen, mit denen diese Krankheit zuverlässig bekämpft werden können.

Gegenstand der Erfindung sind somit Vakzinen gegen Ferkel-Colibacillose, die eine gewisse Menge an Progenoid, gewonnen aus dem Vibrio cholerae-Enterotoxin, enthalten.

Die Verhütung der Ferkel-Colibacillose durch subkutane Verabreichung des erfindungsgemässen Progenoid-Präparates wurde nachgewiesen, indem man einen Teil der Mutterschweine in Betrieben mit starkem Colibacillose-Befall zwei und fünfWochen vor dem Ferkeln impft. Die nicht geimpften Muttertiere dienten als Kontrollen. Die Colibacillose wurde mikrobiologisch eindeutig nachgewiesen. Als Erreger wurde in allen Fällen E. coli 0149: K91, K88 a,c nachgewiesen. Die klinische Entwicklung der Ferkel wird fachgerecht verfolgt, wobei auf das Auftreten typischer Symptome der Colibacillose geachtet wird. In der Tabelle I sind die Ergebnisse dieser Versuche zusammengefasst.

Das Progenoid kann durch chemische und physikochemische Behandlung des Vibrio cholerae-Enterotoxins, das aus verschiedenen Vibrio cholerae-Biotypen isoliert werden kann, gewonnen werden. Ein bevorzugtes Beispiel eines solchen V. cholerae-Biotyps ist der Stamm 569 B Inaba. Der Stamm V. cholerae 569B war der Öffentlichkeit vor dem Anmeldedatum zugänglich. Der Stamm kann von der American Type Culture Collection, Rockville, MD. (Nr. 25870 im Katalog von 1978) bezogen werden. Der Stamm wurde beschrieben im Brit. J. Pharmacol. Chemother. 10: 153159 (1955). Die Darstellung des Progenoids ist bekannt.

Als Adjuvans, das die Aufgabe hat, eine starke Immunreaktion zu gewährleisten, kann erfindungsgemäss jedes Produkt oder Gemisch verwendet werden, von dem man weiss, dass es bei Vakzinen als Adjuvans wirkt. Spezielle Beispiele eines adäquaten Adjuvans sind gelförmig Aluminiumverbindungen, wie Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat und Alhydrogel (Warenzeichen eines von der SUPERFOS Export Company, Kopenhagen, hergestellten und.vertriebe- nen Aluminiumhydroxid-Gels), sowie Wasser-in-ÖI-Emul- sionen und komplettes Freunds'sches Adjuvans (eine Was ser-in-Ol-Emulsion von Paraffinöl, das mit Mannitmonooleat emulgiert ist und abgetötetes Mycobacterium tuberculosis enthält).

Das folgende Beispiel soll die Erfindung erläutern, ohne sie dadurch einzuschränken:
Herstellung des Toxins
Als Produktionsstamm für die Herstellung des Toxins wurde 569 B Inaba verwendet. Die Fermentierung erfolgt in

50, 200 Lt. oder grösseren Fermentern nach den Angaben von Finkelstein1 und Germanier2.

Die Isolierung und Reinigung des Toxins erfolgte in drei Schritten:
1. Konzentrierung des Kulturüberstandes mit Ultrafiltration oder mit einer geeigneten Fällung.

2. Absorption und Elution an einer Aluminiumhydroxid Kolonne.

3. Gelchromatographie an Sephadex G 75.

Herstellung des Progenoids
Choleratoxin hat die Eigenschaft, unter bestimmten Bedingungen bei Temperaturen über 55 C stabile Aggregate zu bilden.

Diese Eigenschaft wurde von Finkelstein3 entdeckt und die Aggregate von ihm als Procholeragenoide oder Progenoide bezeichnet.

Die Herstellung der Progenoide wurde im Tris-EDTA Puffer pH 7,5 bei einer Toxinkonzentration von 6 mglml bei 60 "C durchgeführt. Die Inkubationszeiten liegen zwischen 10-30 Min. Ein Liter sterile Tris-EDTA-Lösung enthält 6,06 g Tris (Hydroxy-Methyl)-Aminomethan, 11,7 g Natriumchlorid, 0,372 g EDTA, 0,195 g Natriumazid. Etwas langsamer verläuft die Bildung des Progenoids in PBS-Puffer pH 7,3. Bei einer Toxinkonzentration von 6 mg/mI und bei 60 "C liegen die Inkubationszeiten zwischen 20 und 40 Minuten. Die sterile phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung enthält: 14,24 g Na2HPO4 2 H2O, 1,36 g KH2PO4 und 22 g NaCl pro Liter.

Charakterisierung des Progenoids
Das Progenoid ist ein Gemisch von Aggregaten des Toxins mit unterschiedlichen Molekulargewichten. Die Molekulargewichte werden an Sepharose 4B/C1 bestimmt, wobei zwei Aggregattypen mit einem Molekulargewichtsbereich von 200 000-106 und 106-10.106 dalton vorherrschen. Das Verhältnis dieser Molekültypen hängt von der Inkubationsdauer bei 60 C ab.

Herstellung der Vakzine
Ein aliquoter Teil von 100 llg des gefriergetrockneten Präparates des Progenoids wird durch Zugabe von 5 ml sterilem Wasser rehydratisiert. Die so erhaltene Vakzine wird unter sterilen Bedingungen mit 5 ml sterilem, kompletten Freunds Adjuvans, d. h. mit einer mit Mannitmonooleat emulgierten und mit abgetötetem Mycobacterin tuberculosis versetzten Wasser-in-Öl-Emulsion von Paraffinöl, gründlich vermischt. Die so erhaltene, adjuvanshaltige Vakzine wird jp 5 ml-Ampullen verteilt, die entweder abgeschmolzen oder dicht verschlossen werden und eine Progenoidmenge entsprechend 50 ug gefriergetrocknetem Präparat pro Ampulle enthalten. Der Inhalt jeder Ampulle entspricht einer Vakzine-Dosiereinheit.

Die Vakzine wird trächtigen Mutterschweinen zwei und fünf Wochen vor dem Ferkeln intramus kul är oder subkutan verabreicht.

Die adjuvanshaltige Vakzine kann auch in grösseren Ampullen verteilt werden, wobei ganzzahlige Vielfache der Dosiereinheit und somit die entsprechenden Vielfach-Dosen Vakzinepräparate erhalten werden
Referenzen 1. Finkelstein, R.A., and J.J. Lo Spalluto (1970).

Production of highly purified choleragen and cholerage noid.

J. Infect. Dis. 121 (Suppl.) S. 63-72.

2. R. Germanier, E. Fürer, S. Varallyay and T. M. Inderbit zin (1976).

Preparation of a Purified Antigenic Cholera Toxoid.

Inf. and Immun. 13:1692-1698.

3. Finkelstein, R.A., K. Fujita and J.J. Lo Spalluto (1971).

Procholeragenoid and Aggregated Intermediate in the
Formation of Choleragenoid.

J. Immunol. 107: 1043-1051.

Claims

PATENTANSPRÜCHE 1. Vakzine gegen Ferkel-Colibacillose, enthaltend eine wirksame Menge Progenoid des Vibrio cholerae Toxins.
2. Vakzine nach Anspruch 1, enthaltend eine wirksame Menge an Progenoid des gereinigten Vibrio cholerae Toxins und ein Ajuvans.
3. Vakzine nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Progenoid ein Extrakt des Vibrio cholerae ist.
4. Vakzine nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie das Progenoid des Vibrio cholerae Toxins des Stammes Vibrio cholerae 569 B Inaba enthält.
5. Vakzine nach den Ansprüchen I bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Adjuvans ein öliges Adjuvans oder eine gelförmige Aluminiumverbindung ist.
6. Verfahren zur Herstellung der Vakzinen nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man aus dem Kulturüberstand einer, hitzelabiles Choleratoxin produzierenden Vibrio cholerae Kultur, das hitzelabile Choleratoxin isoliert, daraus das Progenoid gewinnt und mit einem Adjuvans vermischt.

Die neonatale Coliruhr des Schweins ist eine wichtige Todesursache bei Saugferkeln. Es sind bereifs zahlreiche Versuche unternommen worden, um diese Krankheit durch aktives Immunisieren des Muttertieres gegen Escherichia coli entweder durch Tot- oder Lebendvakzine oder durch Verabreichen von E. coli-Antiserum an die Schweine zu be kämpfen.

Die aktive Immunisierung der Mutterschweine ist durch parenterale Verabreichung von E. coli-Vakzinen vorgenommen worden. Da jedoch der bzw. die zur Immunisierung verwendeten E. coli-Stämme nur spezifische Antikörper hervorrufen, während mit einem bestimmten Ausbruch der Krankheit Stämme unterschiedlichen Serotyps verbunden sein können, haben diese Versuche zur Vorbeugung auf Basis einer antibakteriellen Immunität widersprechende und im allgemeinen unbefriedigende Resultate ergeben. Selbst wenn in einigen Fällen ein guter Schutz erhalten wurde, war er nur auf die in der Vakzine enthaltenen Serotypen von E. coli beschränkt.

Die Verabreichung von Antiserum kann keine praktikable Vorbeugung gegen Colibacillose gewährleisten, da der dadurch erreichbare Schutz tatsächlich von kurzer Dauer ist und eine kontinuierliche Verabreichung an die Ferkel erfordert.

Verschiedene Stämme von Fibrin cholerae bilden unabhängig von ihrem Serotyp immunologisch identische Exo Enterotoxine, auch Choleragen bzw. Choleratoxin genannt.

Dieses Toxin besteht aus zwei Arten nur durch Nebenvalenzen aneinander geknüpfte Untereinheiten, der Untereinheit A (MG ungefähr 28 000) und fünf Untereinheiten B (MG ungefähre 11 000). Die Untereinheiten B sind für die Bindung des intakten Toxins an die Zellmembran verantwortlich, aber sind nicht an der nachgeschaltenen Aktivierung der Adenylatcyclase und dem dadurch induzierten Einströmen von Flüssigkeit (Durchfall) in das Darmlumen beteiligt.

Die Untereinheit A ist essentiell für die Toxizität. Die zwei Untereinheiten des Choleratoxins sind immunologisch nicht verwandt.

Die Untereinheiten unterscheiden sich auch merklich in ihrer Immunogenität. Eine Immunisierung mit intaktem Toxin gibt immer Anlass für die Bildung eines Antiserums, das stark mit der Untereinheit B und etwas schwächer mit der Untereinheit A reagiert.

Das Progenoid kann nach bekannten Vorschriften aus gereinigtem Toxin hergestellt werden. Eine Immunisierung mit einem solchen Präparat führt immer zur Bildung von Antikörpern, die sowohl mit dem Progenoid, dem intakten Choleratoxin, seinen Untereinheiten als auch mit den hitzelabilen Enterotoxinen von E. coli unterschiedlichen Serotyps reagieren.

Es wurde nun gefunden, dass bei Verabreichung von Progenoid mit einem Adjuvans an trächtige Mutterschweinen 2 und 5 Wochen vor dem Ferkeln die geimpften Mutterschweine nicht nur Antikörper gegen das Progenoid in ihrem Kolostnun, in ihrer Milch und im Serum entwickeln, son dem dadurch auch die Ferkel gegen die Wirkung der E. coli Keime geschützt werden. Der Schutz erstreckt sich gegen die Wirkung von Enterotoxinen, die durch E. coli-Serotypen gebildet werden.

Aufgabe der Erfindung war es daher, neue Vakzinen gegen Ferkel-Colibacillose zur Verfügung zu stellen, mit denen diese Krankheit zuverlässig bekämpft werden können.

Gegenstand der Erfindung sind somit Vakzinen gegen Ferkel-Colibacillose, die eine gewisse Menge an Progenoid, gewonnen aus dem Vibrio cholerae-Enterotoxin, enthalten.

Die Verhütung der Ferkel-Colibacillose durch subkutane Verabreichung des erfindungsgemässen Progenoid-Präparates wurde nachgewiesen, indem man einen Teil der Mutterschweine in Betrieben mit starkem Colibacillose-Befall zwei und fünfWochen vor dem Ferkeln impft. Die nicht geimpften Muttertiere dienten als Kontrollen. Die Colibacillose wurde mikrobiologisch eindeutig nachgewiesen. Als Erreger wurde in allen Fällen E. coli 0149: K91, K88 a,c nachgewiesen. Die klinische Entwicklung der Ferkel wird fachgerecht verfolgt, wobei auf das Auftreten typischer Symptome der Colibacillose geachtet wird. In der Tabelle I sind die Ergebnisse dieser Versuche zusammengefasst.

Das Progenoid kann durch chemische und physikochemische Behandlung des Vibrio cholerae-Enterotoxins, das aus verschiedenen Vibrio cholerae-Biotypen isoliert werden kann, gewonnen werden. Ein bevorzugtes Beispiel eines solchen V. cholerae-Biotyps ist der Stamm 569 B Inaba. Der Stamm V. cholerae 569B war der Öffentlichkeit vor dem Anmeldedatum zugänglich. Der Stamm kann von der American Type Culture Collection, Rockville, MD. (Nr. 25870 im Katalog von 1978) bezogen werden. Der Stamm wurde beschrieben im Brit. J. Pharmacol. Chemother. 10: 153159 (1955). Die Darstellung des Progenoids ist bekannt.

Als Adjuvans, das die Aufgabe hat, eine starke Immunreaktion zu gewährleisten, kann erfindungsgemäss jedes Produkt oder Gemisch verwendet werden, von dem man weiss, dass es bei Vakzinen als Adjuvans wirkt. Spezielle Beispiele eines adäquaten Adjuvans sind gelförmig Aluminiumverbindungen, wie Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat und Alhydrogel (Warenzeichen eines von der SUPERFOS Export Company, Kopenhagen, hergestellten und.vertriebe- nen Aluminiumhydroxid-Gels), sowie Wasser-in-ÖI-Emul- sionen und komplettes Freunds'sches Adjuvans (eine Was ser-in-Ol-Emulsion von Paraffinöl, das mit Mannitmonooleat emulgiert ist und abgetötetes Mycobacterium tuberculosis enthält).

Das folgende Beispiel soll die Erfindung erläutern, ohne sie dadurch einzuschränken: Herstellung des Toxins Als Produktionsstamm für die Herstellung des Toxins wurde 569 B Inaba verwendet. Die Fermentierung erfolgt in **WARNUNG** Ende CLMS Feld konnte Anfang DESC uberlappen**.