CN116676313B - 一种多核苷酸序列、猪肠毒性大肠杆菌中和抗体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及基因工程的技术领域，具体公开了一种多核苷酸序列、猪肠毒性大肠杆菌中和抗体及其制备方法和应用。该多核苷酸序列包括依次连接的引导序列、编码肠毒性大肠杆菌F4+菌毛抗体的核苷酸序列、编码连接肽的核苷酸序列、编码肠毒性大肠杆菌F4+菌毛抗体的核苷酸序列。本申请还公开了利用上述多核苷酸序列表达的猪肠毒性大肠杆菌中和抗体。本申请提供的猪肠毒性大肠杆菌中和抗体能够有效中和猪肠毒性大肠杆菌，降低由肠毒性大肠杆菌引起的腹泻发病率。
Description
技术领域
本申请涉及基因工程的技术领域，更具体地说，涉及一种多核苷酸序列、猪肠毒性大肠杆菌中和抗体及其制备方法和应用。
背景技术
肠毒性大肠杆菌可引起断奶仔猪腹泻，会造成仔猪体液损失，甚至可能造成仔猪死亡，是猪养殖过程中的主要危害之一。菌毛F4+的肠毒性大肠杆菌是仔猪腹泻的主要病原菌，目前，通用的治疗仔猪肠毒性大肠杆菌的方法是使用抗生素和氧化锌。
但是，随着近年来对抗生素使用的限制、对耐药性细菌的担忧以及对重金属污染的顾虑，上述两种治疗仔猪肠毒性大肠杆菌的方法受到越来越多的限制。因此，针对肠毒性大肠杆菌引起的仔猪腹泻，急需开发一种环境友好、生物安全的解决办法。
利用基因工程技术可生产针对特定病原的抗体，具有特异性和高效性的特点，可以用来生产自然界中原本不存在的或产量低的活性蛋白分子。
发明内容
本申请提供一种多核苷酸序列、猪肠毒性大肠杆菌中和抗体及其制备方法和应用。本申请提供的猪肠毒性大肠杆菌中和抗体能够有效中和猪肠毒性大肠杆菌，降低由肠毒性大肠杆菌引起的腹泻发病率。
第一方面，本申请提供一种引导序列，所述引导序列包含如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。
第二方面，本申请提供一种多核苷酸序列，采用如下的技术方案：
一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包括依次连接的上述引导序列、编码肠毒性大肠杆菌F4+菌毛抗体的核苷酸序列、编码连接肽的核苷酸序列、编码肠毒性大肠杆菌F4+菌毛抗体的核苷酸序列。
通过采用上述技术方案，本申请采用两段抗体序列通过linker耦联的方式实现了双价抗体的制备。利用本申请提供的猪肠毒性大肠杆菌中和抗体，能够有效中和猪肠毒性大肠杆菌，降低由肠毒性大肠杆菌引起的腹泻发病率。本申请提供的中和抗体能够有效促进仔猪粪便中ETEC F4+毒株的尽早消失。
本申请通过进一步优化引导序列，在利用优化后的引导序列制备的猪肠毒性大肠杆菌中和抗体，能够进一步中和猪肠毒性大肠杆菌，有效降低由肠毒性大肠杆菌引起的腹泻发病率。本申请提供的中和抗体利用了优化后的引导序列，能够有效促进仔猪粪便中ETEC F4+毒株的尽早消失。
优选地，所述编码肠毒性大肠杆菌F4+菌毛抗体的核苷酸序列包含如SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列。
通过采用上述技术方案，本申请通过进一步对肠毒性大肠杆菌F4+菌毛抗体进行了筛选。本申请提供的引导序列配合包含如SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列制备的双价抗体，能够有效中和猪肠毒性大肠杆菌，从而降低由肠毒性大肠杆菌引起的腹泻发病率。
优选地，所述多核苷酸序列包含如SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列。
进一步地，所述多核苷酸序列还包括6×His标签。
第三方面，本申请提供一种表达载体，该表达载体包括上述多核苷酸序列。
第四方面，本申请提供一种上述多核苷酸序列或上述表达载体表达的猪肠毒性大肠杆菌中和抗体。
第五方面，本申请提供一种细胞，该细胞表达上述猪肠毒性大肠杆菌中和抗体。
第六方面，本申请提供一种上述猪肠毒性大肠杆菌中和抗体的制备方法，具体包括以下步骤：
将所述多核苷酸序列插入质粒中，获得重组质粒；
将所述重组质粒导入感受态细胞中，获得重组工程细胞；
将所述重组工程细胞进行发酵、表达、纯化、干燥，获得猪肠毒性大肠杆菌中和抗体。
优选地，所述感受态细胞为真核细胞。
优选地，所述感受态细胞为感受态毕赤酵母细胞。
通过采用上述技术方案，本申请提供的猪肠毒性大肠杆菌中和抗体的制备方法中所用的感受态细胞为真核细胞。典型的真核细胞代表为毕赤酵母细胞。重组毕赤酵母菌表达系统具有翻译后修饰系统，可保持目标蛋白的活性，实现目标蛋白的高密度培养，并促进蛋白分泌到胞外进行收集处理。相比原核细胞，不需要进行破壁操作。
第七方面，本申请提供一种上述猪肠毒性大肠杆菌中和抗体作为饲料添加剂在仔猪养殖中的应用。
第八方面，本申请提供一种饲料，该饲料中包括上述猪肠毒性大肠杆菌中和抗体。
优选地，所述猪肠毒性大肠杆菌中和抗体的添加比例为10-100g/t饲料。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1.本申请采用双序列耦合的方式，将两个抗体序列关联表达，提高了对肠毒性大肠杆菌的中和效率，降低由肠毒性大肠杆菌引起的腹泻发病率。
2.本申请提供的猪肠毒性大肠杆菌中和抗体属于新型生物活性物质，可针对性的中和含F4+菌毛的猪肠毒性大肠杆菌，降低由肠毒性大肠杆菌引起的腹泻发病率，从而减少对断奶仔猪的危害。
3.该猪肠毒性大肠杆菌中和抗体具有耐低pH、耐高温和抗蛋白酶降解的特点，可以通过口服的方式用于饲料添加。同时，本申请采用发酵、纯化的方式生产，和传统的生产方式相比，得率更高，生产更高效。
附图说明
图1为猪肠毒性大肠杆菌中和抗体电泳结果图（其中，泳道M表示蛋白质Marker，泳道R为猪肠毒性大肠杆菌中和抗体）。
具体实施方式
本申请提供了一种引导序列，所述引导序列包含如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。
本申请提供了一种多核苷酸序列。该多核苷酸序列包括依次连接的引导序列、编码肠毒性大肠杆菌F4+菌毛抗体的核苷酸序列、编码连接肽的核苷酸序列、编码肠毒性大肠杆菌F4+菌毛抗体的核苷酸序列、6×His标签。其中，引导序列包含如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；编码肠毒性大肠杆菌F4+菌毛抗体的核苷酸序列包含如SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列。另外，该多核苷酸序列的DNA包含如SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列。
本申请还提供了一种包含上述多核苷酸序列的表达载体。
本申请还提供了一种利用上述多核苷酸序列或上述表达载体表达的猪肠毒性大肠杆菌中和抗体。
本申请还提供了一种细胞。该细胞表达上述猪肠毒性大肠杆菌中和抗体。
本申请还提供了上述猪肠毒性大肠杆菌中和抗体的制备方法，具体包括以下步骤：
将所述多核苷酸序列插入质粒中，获得重组质粒；
将所述重组质粒导入感受态细胞中，获得重组工程细胞；
将所述重组工程细胞进行发酵、表达、纯化、干燥，获得猪肠毒性大肠杆菌中和抗体。
本申请还提供了上述猪肠毒性大肠杆菌中和抗体作为饲料添加剂在仔猪养殖中的应用。
本申请还提供了一种饲料。该饲料包含上述猪肠毒性大肠杆菌中和抗体。
优选地，该猪肠毒性大肠杆菌中和抗体在饲料中的添加比例为10-100g/t饲料。
以下结合附图对本申请作详细阐述。需要指出的是，以下具体实施方式仅用于对本申请做进一步解释说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，所属技术领域的技术人员可以根据上述发明内容对本申请做出非本质的改进和调整。
制备例
制备例1
本制备例提供了一种优化后的引导序列。优化后的引导序列包含如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。本制备例的优化后的引导序列是在如SEQ ID NO 5所示的核苷酸序列的基础上通过PCR介导的定点突变获得的。
制备例2
本制备例提供了一种编码肠毒性大肠杆菌F4+菌毛抗体的核苷酸序列。该编码肠毒性大肠杆菌F4+菌毛抗体的核苷酸序列包含如SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列，其在NCBI（National Center for Biotechnology Information）官网中GenBank的登记号为AJ810819。
制备例3
本制备例提供了一种linker序列。该linker序列的核苷酸序列为gauccc。
实施例
实施例1
本实施例提供了一种多核苷酸序列。该多核苷酸序列包括依次连接的引导序列、编码肠毒性大肠杆菌F4+菌毛抗体的核苷酸序列、linker序列、编码肠毒性大肠杆菌F4+菌毛抗体的核苷酸序列、6×His标签序列。其中，引导序列为制备例1提供的如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。编码肠毒性大肠杆菌F4+菌毛抗体的核苷酸序列为制备例2提供的如SEQ IDNO 2所示的核苷酸序列。linker序列为制备例3提供的核苷酸序列。
该多核苷酸序列的DNA全长序列委托北京擎科生物科技有限公司合成，如SEQ IDNO 4所示的核苷酸序列。
实施例2
本实施例提供了一种猪肠毒性大肠杆菌中和抗体。
上述猪肠毒性大肠杆菌中和抗体的构建方法，具体包括以下步骤：
（1）构建质粒
在实施例1提供的全长序列上游添加酶切位点BglII，下游添加酶切位点SalI，并将该全长序列插入毕赤酵母载体pGAPZα A（北京擎科生物科技有限公司），获得构建的质粒。
（2）构建工程菌
将步骤（1）构建的质粒电转入感受态毕赤酵母细胞（GS115感受态毕赤酵母细胞，货号：GT2505；厂家：北京华越洋生物科技有限公司），之后涂布于含50ug/mL博来霉素（Merck，CAS号：11056-06-7）的YPD固体平板培养基上（配方如下：酵母膏 1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，琼脂粉2%），30℃恒温培养48h，挑取长出的菌落对质粒进行测序。鉴定出阳性克隆，说明质粒构建成功。
（3）发酵、表达蛋白及纯化
取步骤（2）构建成功的重组细胞置于液体培养基（配方如下：酵母膏 1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%）中，30℃恒温培养，从培养的第10h开始检测残糖，当残糖低于6mmol/L时，开始流加葡萄糖。培养至OD600不再增加，将培养获得的培养液离心，并将离心获得的上清液通过Ni亲和柱（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号：N5289-01-1EA）进行层析，用洗脱液（25mM Tris，300mM NaCl，500mM 咪唑）洗脱并收集蛋白峰。将收集的洗脱液添加20%脱脂奶粉（内蒙古伊利实业集团股份有限公司）进行冻干，获得纯化后的蛋白，即为猪肠毒性大肠杆菌中和抗体。
将上述获得的纯化后的蛋白进行电泳。电泳结果如图1所示。
图1为猪肠毒性大肠杆菌中和抗体电泳结果图，其中，泳道M表示蛋白质Marker，泳道R为猪肠毒性大肠杆菌中和抗体。
电泳条件如下：5%浓缩胶，12%分离胶。浓缩胶恒压80V，分离胶恒压120V。
由图1可知，目标蛋白分子量大约为40KDa，符合理论预测的结果（由于糖基化等作用，实际表达的蛋白分子量一般会高于理论数值）。
对比例
对比例1
本对比例提供了一种多核苷酸序列。与实施例1的不同之处在于：本对比例仅有一段编码肠毒性大肠杆菌F4+菌毛抗体的核苷酸序列。该多核苷酸序列的DNA全长序列委托北京擎科生物科技有限公司合成，如SEQ ID NO 6所示的核苷酸序列。
本对比例还提供了利用上述核苷酸序列构建的抗体，构建方法与实施例2提供的构建方法相同。
对比例2
本对比例提供了一种多核苷酸序列。与实施例1的不同之处在于：编码肠毒性大肠杆菌F4+菌毛抗体的核苷酸序列包含如SEQ ID NO 7所示的核苷酸序列。该多核苷酸序列的DNA全长序列委托北京擎科生物科技有限公司合成，如SEQ ID NO 8所示的核苷酸序列。
本对比例还提供了利用上述核苷酸序列构建的抗体，构建方法与实施例2提供的构建方法相同。
对比例3
本对比例提供了一种多核苷酸序列。与实施例1的不同之处在于：编码肠毒性大肠杆菌F4+菌毛抗体的核苷酸序列包含如SEQ ID NO 9所示的核苷酸序列。该多核苷酸序列的DNA全长序列委托北京擎科生物科技有限公司合成，如SEQ ID NO 10所示的核苷酸序列。
本对比例还提供了利用上述核苷酸序列构建的抗体，构建方法与实施例2提供的构建方法相同。
对比例4
本对比例提供了一种多核苷酸序列。与实施例1的不同之处在于：引导序列包含如SEQ ID NO 5所示的核苷酸序列。该多核苷酸序列的DNA全长序列委托北京擎科生物科技有限公司合成，如SEQ ID NO 11所示的核苷酸序列。
本对比例还提供了利用上述核苷酸序列构建的抗体，构建方法与实施例2提供的构建方法相同。
对比例5
本对比例提供了一种多核苷酸序列。与实施例1的不同之处在于：本对比例提供的多核苷酸序列没有引导序列。该多核苷酸序列的DNA全长序列委托北京擎科生物科技有限公司合成，如SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列。
本对比例还提供了利用上述多核苷酸序列构建的抗体，构建方法与实施例2提供的构建方法的不同之处在于：本对比例所用的感受态细胞为原核细胞，具体为大肠杆菌E. coliBL21（DE3-1）。
构建方法具体如下：
（1）构建质粒
在对比例5提供的全长序列上游添加酶切位点XhoI，下游添加酶切位点NdeI，并将该全长序列插入大肠杆菌载体pET-22b（+）（北京擎科生物科技有限公司），获得构建的质粒。
（2）构建工程菌
将步骤（1）构建的质粒电转入感受态大肠杆菌细胞（赛默飞世尔科技（中国）有限公司，货号EC0114），之后涂布于含100ug/mL氨苄青霉素（阿拉丁试剂(上海)有限公司，CAS编号：7177-48-2）的LB固体平板培养基上（配方如下：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉2%），37℃恒温培养16h，挑取长出的菌落对质粒进行测序。鉴定出阳性克隆，说明质粒构建成功。
（3）发酵、表达蛋白及纯化
取步骤（2）构建成功的重组细胞置于液体培养基（配方如下：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L）中，37℃恒温培养，从培养的第10h开始检测残糖，当残糖低于6mmol/L时，开始流加葡萄糖。培养至OD600不再增加时停止。将培养液离心（8000r/min离心5min），然后用PBS溶液（8.0g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4，0.24g KH2PO4，纯水1000mL，用盐酸调整pH到7.4）重悬（比例为50g沉淀：1000mLPBS）。用20kHz频率、150W的功率，在冰浴中进行超声波破碎，每破碎60s，间隔60s，反复破碎三次。将破碎后的菌液通过Ni亲和柱（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号：N5289-01-1EA）进行层析，用洗脱液（25mM Tris，300mM NaCl, 500mM 咪唑）洗脱并收集蛋白峰。将收集的洗脱液添加20%脱脂奶粉（内蒙古伊利实业集团股份有限公司）进行冻干，获得纯化后的蛋白，即为猪肠毒性大肠杆菌中和抗体。
性能检测试验
利用实施例2制备的猪肠毒性大肠杆菌中和抗体以及对比例1-4制备的抗体对仔猪感染F4+肠毒性大肠杆菌的中和能力进行检测。
检测方法如下：
选取49头断奶仔猪（4周龄，平均体重6kg）用ETEC F4+株（Escherichia coliK88（F4），厂家：诺安基因科技(武汉)有限公司；分离于猪粪便，K88血清型；菌株编号：NA-JJ758297）进行攻毒实验（第1天1×109CFU/猪，第2天0.5×109CFU/猪），随机分成1个对照组和5个处理组，每组7头。处理组按100g重组抗体/t饲料使用重组抗体，对照组饲喂正常饲料。每天下午2点收集仔猪粪便进行检测。
检测结果如表1和表2所示。
表1仔猪粪便中的ETEC F4+含量（log10CFU每克粪便中的细菌数量）
表2 重组抗体对仔猪感染F4+肠毒性大肠杆菌的中和能力检测结果
由表1和表2可知，与对照组相比，处理组-实施例2仔猪粪便中ETEC F4+毒株的消失时间明显提前，第5天即在仔猪粪便中检测不到ETEC F4+毒株；而对照组中，在第10天仍有2头仔猪粪便中可检测到ETEC F4+毒株。实验结果表明，本申请提供的重组抗体可有效降低仔猪体内的ETEC F4+载量。
通过处理组-实施例2与处理组-对比例4相比较，处理组-实施例2仔猪粪便中ETECF4+毒株在第3天开始消失，在第5天全部消失；而处理组-对比例4在第6天才开始消失。说明相比对比例4提供的抗体，实施例2提供的猪肠毒性大肠杆菌中和抗体能够有效促进仔猪粪便中ETEC F4+毒株的消失。实施例2提供的中和抗体促进仔猪粪便中ETEC F4+毒株消失的时间明显早于对比例4提供的抗体促进仔猪粪便中ETEC F4+毒株消失的时间，说明利用不同的引导序列制备的抗体针对仔猪粪便中ETEC F4+毒株的消失作用明显不同。本申请提供的中和抗体利用了优化后的引导序列，能够有效促进仔猪粪便中ETEC F4+毒株的尽早消失。
通过处理组-实施例2与处理组-对比例2、处理组-对比例3相比较，处理组-实施例2仔猪粪便中ETEC F4+毒株在第3天开始消失，在第5天全部消失；而处理组-对比例2和处理组-对比例3在第6天才开始消失。说明相比对比例2、对比例3提供的抗体，实施例2提供的猪肠毒性大肠杆菌中和抗体能够有效促进仔猪粪便中ETEC F4+毒株的消失。实施例2提供的中和抗体促进仔猪粪便中ETEC F4+毒株消失的时间明显早于对比例2和对比例3提供的抗体促进仔猪粪便中ETEC F4+毒株消失的时间，说明利用不同的肠毒性大肠杆菌F4+菌毛抗体的核苷酸序列制备的抗体针对仔猪粪便中ETEC F4+毒株的消失作用明显不同。本申请提供的中和抗体能够有效促进仔猪粪便中ETEC F4+毒株的尽早消失。
通过处理组-实施例2与处理组-对比例1相比较，处理组-实施例2仔猪粪便中ETECF4+毒株在第3天开始消失，在第5天全部消失；而处理组-对比例1在第7天才开始消失。说明相比对比例1提供的抗体（仅对应一条编码肠毒性大肠杆菌F4+菌毛抗体的核苷酸序列），实施例2提供的猪肠毒性大肠杆菌中和抗体（对应两条编码肠毒性大肠杆菌F4+菌毛抗体的核苷酸序列）能够有效促进仔猪粪便中ETEC F4+毒株的消失，从而起到有效中和猪肠毒性大肠杆菌的作用，降低由肠毒性大肠杆菌引起的腹泻发病率。
通过处理组-实施例2与处理组-对比例5相比较，处理组-实施例2仔猪粪便中ETECF4+毒株在第3天开始消失，在第5天全部消失；而处理组-对比例5在第5天才开始消失。说明相比对比例5提供的抗体，实施例2提供的猪肠毒性大肠杆菌中和抗体能够有效促进仔猪粪便中ETEC F4+毒株的消失，从而起到有效中和猪肠毒性大肠杆菌的作用，降低由肠毒性大肠杆菌引起的腹泻发病率。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (8)
1.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包括依次连接的引导序列、编码肠毒性大肠杆菌F4+菌毛抗体的核苷酸序列、编码连接肽的核苷酸序列、编码肠毒性大肠杆菌F4+菌毛抗体的核苷酸序列；
所述多核苷酸包含如SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述编码肠毒性大肠杆菌F4+菌毛抗体的核苷酸序列包含如SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列。
3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括权利要求1-2中任一项所述的多核苷酸。
4.一种利用权利要求1-2中任一项所述的多核苷酸或权利要求3所述的表达载体表达的猪肠毒性大肠杆菌中和抗体。
5.一种细胞，其特征在于，所述细胞表达权利要求4所述的猪肠毒性大肠杆菌中和抗体。
6.一种权利要求4所述的猪肠毒性大肠杆菌中和抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括以下步骤：
将所述多核苷酸插入质粒中，获得重组质粒；
将所述重组质粒导入感受态细胞中，获得重组工程细胞；
将所述重组工程细胞进行发酵、表达、纯化、干燥，获得猪肠毒性大肠杆菌中和抗体。
7.一种权利要求4所述的猪肠毒性大肠杆菌中和抗体在制备饲料添加剂中的应用。
8.一种饲料，其特征在于，所述饲料中包括权利要求4所述的猪肠毒性大肠杆菌中和抗体；所述猪肠毒性大肠杆菌中和抗体在所述饲料中的添加比例为10-100g/t饲料。
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Also Published As
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| GR01 | Patent grant | ||
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