DE2434515A1

DE2434515A1 - Vakzine zum immunisieren von gefluegel gegen die marek'sche krankheit (leukose typ ii) sowie verfahren zur herstellung der vakzine und zum immunisieren von gefluegelherden

Info

Publication number: DE2434515A1
Application number: DE2434515A
Authority: DE
Inventors: Martin Dr Med Sevoian
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1973-07-19
Filing date: 1974-07-18
Publication date: 1975-03-27
Also published as: BE817865A; DK389574A; IE40159B1; IE40159L; FR2301268B1; DK137931C; AT346476B; FR2301268A1; NO742557L; DK137931B; SE7409411L; ES428370A1; AR201878A1; FI219974A; AU7096274A; IT1017330B; NL7409842A; ATA600274A; ZA743771B; GB1481847A

Description

Vakzine zum Immunisieren von Geflügel 2434515 gegen die Marek'sche Krankheit (Leukose Typ II) sov/ie Verfahren zur Herstellung der Vakzine und zum Immunisieren von Geflügelherden

Die Erfindung bezieht sich auf Vakzinen zur Immunisierung von Geflügel gegen die Marek'sche Krankheit (Leukose Typ II), insbesondere auf Vakzinen, die gegenüber der Marek¹sehen Krankheit inununogen und nicht-pathogen sind, sowie auf Verfahren zur Herstellung derartiger Vakzinen und zur immunisierung von Geflügelherden mit solchen Impfstoffen.

Geschwulstbildung ist eine der häufigsten pathologischen Veränderungen bei Geflügel. Die Histogenese der weitaus meisten Geflügeltumoren geht auf das Blutbildungssystem zurück und sind als Geflügelleukose-Komplex klassifiziert worden. Es können wenigsten zwei unterschiedliche Virustypen, nämlich ein RNA-Virus (gelegentlich RIF-Virus genannt) und ein DNA-Herpes-Virus (von dem das JM-Virus als erstes als ein Prototyp von Küken isoliert wurde) leukämische Tumoren verursachen. Die ätiologische Trennung und Identifizierung dieser Krankheiten hat zu den Bezeichnungen lymphoide Leukose oder lymphoide Leukose Typ I für die Tumoren des RNA-Virus und Marek'sche Krankheit oder lymphoide Leukose Typ II für die Tumoren des DNA-\'irus geführt.

Die auf natürliche Weise auftretendc-n Geflügeltumoren sind in der Mehrzahl vom Typ der Marek'sehen Krankheit. Die infolge von Tumoren bei Geflügel entstehenden Verluste werden in den USA gegenwärtig auf jährlich 200 Millionen Dollar geschätzt.

Infektionen durch Marek'sche Krankheit in Geflügelpopulationcn sind sowohl allgemein üblich als auch weit verbreitet. Fast alle Feldherden sind bis zu einem gewissen

- 2 509813/0971

Grad infiziert. Die meisten Küken werden schon sehr jung infiziert und bleiben dann chronisch infiziert. Obwohl der Infektionsgrad in den meisten Fällen eine Höhe von 100 % erreicht, treten Geschwülste infolge derartiger Infektionen in einigen Herden nur in Einzelfällen, in anderen Herden dagegen bis zu 50 % und mehr auf.

Die Forschung hat sich in starkem Maße mit der Entwicklung von Behandlungsverfahren und Vorbeugungsmaßnahmen befaßt, die sich gegen die Marek'sche Krankheit richten, jedoch war bis vor kurzem keine ausreichend wirksame-Vakzine vorhanden.

Das US Patent 3 642 574 beschreibt eine Vakzine, hergestellt aus einem Puten-Herpes-Virus (PHV), die in Küken nicht-pathogen ist und durch bisher ungeklärte Vorgänge geimpfte Küken gegen die Entstehung von Tumoren der Marek¹sehen Krankheit schützt.

Die in dem US Patent 3 642 574 beschriebene Vakzine fand infolge der Schwere der Krankheit und des Fehlens jeglicher anderen wirksamen Behandlung sofort weitverbreitete Aufnahme, sobald sie den Geflügelzüchtern zur Verfügung stand.

Jedoch hegt man seit kurzem Zweifel gegenüber der PHV-Vakzine als eine befriedigende Lösung des Problems der Marek¹sehen Krankheit, weil ihre Wirksamkeit zur Verhinderung der Bildung von Tumoren gegenwärtig in vielen Fällen geringer zu sein scheint als ursprünglich berichtet. Dies mag darauf zurückzuführen sein, daß die PHV-Vakzine keine schützenden oder neutralisierenden Antikörper gegen Feldinfektionen in signifikantem Maße erzeugt. Es ist festgestellt worden, daß eine Impfung von

50981 3/0971

Blatt - 3' -

Küken mit PHV-Vakzine zu einer chronischen Virämie führt, im Gegensatz zu einer Immunität, welche die Infektion verhindert oder beseitigt. Außerdem sind mit der PHV-Vakzine geimpfte Küken bei einer Super —Infektion mit dem Virus der Marek¹sehen Krankheit nicht immun, und der durch die PlJV-Vakzine gewährte Schutz ist mehr . "kosmetisch" als tatsächlich» Ferner sind ursprüngliche Berichte, daß PHV in Säugetierzellen nicht wächst, nunmehr in Frage gestellt worden.

Das US Patent 3 590 128 beschreibt eine Vakzine für die lyphoide Leukose Typ I, im Gegensatz zu einer Vakzine für die Marek'sehe Krankheit.

Das US Patent 3 674 861 beschreibt eine attenuierte Vakzine gegen die Marek¹sehe Krankheit, die durch Serienpassage von Feld-Virus der Marek'schen Krankheit, in aviären. Zellen hergestellt wurde.

Aus den obigen Ausführungen ist ersichtlich, daß ein dringender Bedarf an einer wirksamen Vakzine gegen die Hirek'sche Krankheit besteht, insbesondere an einer solchen Vakzine, die eine Infektion durch Marek¹sehe Krankheit bei einem vakzinierten Küken verhindert und/oder beseitigt.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Vakzine geschaffen, die nach richtiger Anwendung bei Geflügel, insbesonder3 bei Küken, immunisierend gegen die Marek¹sehe Krankheit wirkt und nicht-pathogen ist.

Durch sehr schnelles Passagieren eines JM-Virus in Küken über mehrere hundert Passagen wurde ein virulenter Stamm des Virus der Marek'schen Krankheit entwickelt, der als JM-V-Stamm oder -Agens identifiziert wurde.

^09813/0971

Dieser JM-V-Stamm ist bei Küken äußerst pathogen, und die 50 % tödliche Dosis liegt bei parenteraler Verabreichung als Ganzblutinokulum für die moisten genetischen Gcflügelherkünfte bei 10 pro ml, wobei die mit einer solchen Injektion behandelten Tiere innerhalb von drei bis sechs Tagen nach der Impfung einer Lymphzellenwucherung erlagen.

Es wurde beobachtet, daß Eintagsküken, welche eine große Dosis des JM-V-Stammes erhalten hatten, im allgemeinen eingingen. Wenn jedoch eine geringere Dosis des JM-V-Stammes gegeben wurde, überlebten einige Küken und entwickelten 1.000 bis 10.000 neutralisierende Antikörperdosen gegenüber dem JM-Virus. Diese überlebenden Küken mit hchen Antikörperspiegeln waren gegenüber späterer Einwirkung des JM-\^rirus relativ immun, jedoch wird die Verwendung des JM-V-Stammes nicht als ein annehmbares Verfahren zur Immunisierung angesehen, und zwar wegen der äußerst pathogenen Natur des JM-V-Stammes.

Eine befriedigende Vakzine sollte vor allem in Bezug auf das geimpfte Geflügel sicher sein. Sie sollte außerdem neutralisierende Antikörper in hohem Maße erzeugen, so daß die durch die Vakzination entstehende Virämie vorübergeuend ist, damit das geimpfte Geflügel beim Schlachten für Ernährungszwecke avirämisch ist.

Die Vakzine gemäß der vorliegenden Erfindung erfüllt die obengenannten Kriterien.

Es ist eine Probe des als JM-V-Agens oder -Stamm identifizierten virulenten Virusstammes der Marek¹sehen Krankheit als eine Kultur lebender Organismen beim

S09813/097 1

American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 unter der Bezeichnung No. VR-736 hinterlegt worden. Die Lebendkultur wird in: folgenden als Agens oder Stamm No. VR-736 bezeichnet. Wie bereits im vorhergehenden erwähnt, ist dieser Stamm für Geflügel immunisierend, jedoch äußerst pathogen.

Das Agens VR-736 wächst gut in aviären Embryonen. Ein Verfahren zur Abwandlung des Stammes gemäß dieser Erfindung ist die Durchführung von Serienpassagen des Agens im Dottersack aviärer Embryonen, so daß es für Küken nicht mehr pathogen ist. Ausgangsmaterial ist das Blut eines moribunden Kükens, das vorher mit VR-736 geimpft wurde. Etwa 0,1 ml dieses Blutes \tfird in den Dottersack eines vier bis sechs Tage alten aviären Embryos inokuliert. Ungefähr sieben Tage nach der Beimpfung wird 0,1 ml Dotter von dem infizierten Embryo entnommen und serienweise in einen irischen vier bis sechs Tage alten aviären Embryo weiterpassagiert. Dieses Verfahren wird über etwa 50 Passagen wiederholt. Die Ausbeuten an modifiziertem Material aus infizierten Embryonen fortgeschrittener Passagen sind hochgradig antigen, und erzeugen in Küken schützende Antikörper gegenüber dem Virus der Marek¹sehen Krankheit (JM-Stamm) und schützen Küken vor Feldinfektionen.

Das von fortgeschrittenen Passagen geerntete Material kann mit- SPGA oder anderen geeigneten Stabilisatoren stabilisiert und bis kurz vor seinem Gebrauch in flüssigem Stickstoff eingefroren werden und wird dann mit einem pharmazeutisch geeigneten Trägerstoff gemäß dem Titer und der erwünschten Dosierung verdünnt. Das ge-, wonnene Material kann wahlweise auch durch bekannte übliche Verfahren lyophilisiert werden.

Das geerntete Material, welches von VR-736 abstammendes modifiziertes Virus entweder in gefrorenem oder lyophilisiertem Zustand - wie oben beschrieben - enthält,

50981 3/097 1

kann mit einem pharmazeutisch geeigneten Trägerstoff, wie z.B." phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder Tryptosephosphatbouillon, die Arlacel A, Bayal F, Freund¹s Adjuvans etc. enthalten kann, verdünnt werden, bevor es an Geflügel verabreicht wird. Das verdünnte Material kann je nach den erwünschten Ergebnissen und unter Berücksichtigung des Herdentyps in Küken vom T. Lebenstag bis zur Legereife entweder parenteral injiziert oder anderweitig verabreicht werden. Wie später noch ausführlich beschrieben wird, können erwachsene Hennen mit der Vakzine gemäß dieser Erfindung z.B. aktiv immunisiert werden, und sie werden ihrer Nachkommenschaft congenital schützende Antikörper mitgeben, so daß eine Einzelimpfung der Nachkommen nicht erforderlich ist, wenn sie als Broiler gehalten werden, die im Alter von etwa sieben Wochen zur Schlachtung kommen. Die angeborenen Antikörper sind nur drei bis fünf Wochen lang wirksam, jedoch die kurze Zeit zwischen dem Verlust der congenitalen Immunität und der Schlachtung ist nicht * ausreichend für eine signifikante Tumorentiiricklung.

Die Aufgabe dieser Erfindung besteht in der Umwandlung des hochgradig pathogenen Agens No. VR-756 zu einem nicht-pathogenen aber noch hochgradig immunisierenden Material durch Mehrfachpassage, beispielsweise durch die Döttersäcke aviärer Embryonen.

Diese Erfindung schafft eine wirksame Vakzine zum Schutz gegen die ffarek'sehe Krankheit bei Geflügel,

Diese Vakzine ist sicher (nicht-pathogen) un'd führt zu einem avirämischen Impfling.

5 O 9 8 1 3/0971

Daß diese Aufgabe durch die vorliegende Erfindung erfüllt und weitere Vorzüge und Merkmale erreicht werden, geht aus der folgenden ausführlichen Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung hervor.

Die Fig. 1-4 zeigen graphische Darstellungen von Testergebnissen zur Veranschaulichung der Antikörperreaktion infolge der Verwendung der Vakzine gemäß dieser Erfindung.

Das JM-V-Agens No. VR-736 wurde durch schnelle Passage des JM-Virus der Marek'sehen Krankheit in Eintagsküken gewonnen. Die für die anfänglichen Passagen dieser Art geivählten Gewebe waren beginnende Tumoren in der Leber, der Milz, den Nieren, den Keimdrüsen sowie Blut. Diese Organe wurden gewählt, weil es sich bei Ihnen um diejenigen Organe handelt, in denen bei Küken humorale Antikörper erzeugt werden. Nach den ersten wenigen Passagen wurde Blut verwendet.

Der entstehende JM-V-Stamm No. VR-736 ist hochgradig pathogen für Küken, wie in der folgenden Tabelle I dargestellt, die die fortschreitend abnehmende Zeitspanne bis zum Tod bei geimpften Küken nach den verschiedenen Anzahlen von Passagen zeigt. Es ist ersichtlich, daß nach 400 Passagen alle geimpften Küken innerhalb von fünf Tagen tot waren, \vas ein Zeichen für die äußerst starke letale Wirkung des Agens No. VR-736 ist.

Es wurde jedoch festgestellt, daß Küken, denen eine subletale, jedoch eine Infektion verursachende Dosis des Agens No. VR-736 gegeben wurde, und die überlebten, neutralisierende Antikörper gegenüber Fcldvirusartcn der Marek¹sehen Krankheit produzierten. Obwohl es sich

50981 3/097 1

O 33	cn	Passage-	Zahl
ss - Q	ο	Nr.	geimpft
	CO		Küken
Γ~	OD	1	16
2	-Jk
ω TI	Ca)	2	8
	O CO	3	10
ο	-4	4	20
	5	10
10	10

15	8

20	10
25	10
146	10
400	10

Tabelle I Wirksamkeit' Von schnell pas sanier tem' JM-Vi rus' bei' Küken

Tage nach der Impfung 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13' ' 14' 15' '16 ' 17 1« 30

Sterblichkeit

insgesamt

2 L+

Krankhafte Veränderungen, keine Mortalität Zur Weiterpassage benutzt.

	1	5	1 +	1	1 +	1	2	2	3
		2	4+	2+		2	1
	3+	6		2+2			1	1
	3						1+ 1	1
				2
1			1
1
3 4+

TL+

1

1
1

1

υ/16

0/8

0/10

9/20

7/10

8/10

7/8

10/10

Ca» Ul Cn

zeigte, daß das virulente Agens VR-736 in hohem Maße neutralisierende Antikörper erzeugte, war doch offensichtlich, daß eine Abwandlung dieses virulenten Agens erforderlich war, um eine sichere Vakzine herzustellen.

Es Acurde auch ermittelt, daß zellfreies Material, welches durch Schallbehandlung von JM-V-infiziertem Vollblut mit anschließendem Zentrifugieren und Filtrieren durch ein feinporiges Filter von 0,45 Micron hergestellt wurde, neutralisierende Antikörper in Küken erzeugen konnte. Ein auf diese Weise hergestelltes zellfreies Material gab zwar überlebenden Tieren tatsächlich einen Schutz gegenüber einer späteren Testinfektion, ein erhebli- . eher Prozentsatz der mit diesem zellfreien Material geimpften Tiere starb jedoch infolge der Impfung, so daß zellfreies JM-V (nicht modifiziert) nicht als eine brauchbare Vakzine gegen die Marek'sche Krankheit angesehen werden konnte. Es war somit wiederum augenscheinlich, daß zur Erlangung einer annehmbaren und befriedigenden Vakzine eine Herabsetzung der Pathogenität des .""M-V-Agens nötig war.

Agens No. VR-736 (0.1 ml Vollblut von einem rioribunden Küken) wurde in die Dottersäcke von vier bis sieben Tage alten aviären Embryonen injiziert, dann sieben Tage nach der Impfung geerntet und in aviären Embryonen repassagiert. Nach einer genügenden Anzahl von Weiterpassagen wurde das Agens als in solchem Maße modifiziert befunden, daß es für Küken nicht mehr pathogen war. Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß das modifizierte nicht-pathogene Agens seinen hochgradig immunisierenden Charakter behielt, so daß das modifizierte Agens als Vakzine gegen die Marek'sche Krankheit äußerst nützlich ist. Ahnliche Ergebnisse lassen sich erzielen

b U 9 ü 1 3 / .0 9 7 1

wenn von einer Embryopassage eine Fibroblasten-Kultur angesetzt wird und das Material dieser Kultur dann in einem in vitro-Zellkulturmedium weiterpassagiert wird.

Die Anzahl Passagen, die erforderlich sind, um ein nicht-pathogenes modifiziertes Agens, abstammend von VR-73G zu erzeugen, ist nicht genau festgelegt, da der Wechsel von pathogen auf nicht-pathogen sowohl allmählich als auch ungenau ist. Nach zehn Passagen ist jedoch die Pathogen:tat erheblich vermindert und nach vierzig Passagen erscheint das Agens angemessen modifiziert. Für zusätzliche Sicherheit werden etwa fünfzig weitere Passagen empfohlen.

Die erforderliche Anzahl Passagen ist die Zahl, welche im Gegensatz zu dem pathogenen Aus gangsiaater ial (VR-736) eine nicht-pathogene Vakzine ergibt.

In einsr Herde von etwa 2000 Küken, welche mit dem über fünfzig Passagen in Kvkenembryonen erhaltenen modifizierten Agens geimpft und dann einer Testinfektion mit dem Virus der Mafek¹sehen Krankheit ausgesetzt wurden, traten unbedeutende Verluste durch Marek'sche Krankheit auf, während die Verluste bei mit PHV-Vakzine ■geimpften u:id einer ähnlichen Testinfektion ausgesetzten Küken erheblich Avaren.

Die obigen Ausführungen werden in der folgende Tabelle II näher erläutert, in der die Ausitfirkungen einer Testinfektion mit JM und JM-V (Agens No. VR-736) für getrennte Gruppen von Eintagsküken gezeigt sind, von denen eine Gruppe durch Injektion von 2000 plaquebildenden Einheiten der PHV-Vakzine geimpft und der anderer. Gruppe 10 CEID₅₀ der Vakzine gemäß dieser Erfindung injiziert wurde, gewonnen von 50 Passagen des Agens No. VR-736 in aviären Embryonen, was zu dem modifizierten nicht-pathogenen, jedoch hochgradig immunisierenden Material führt. Die

509 Ü 1 3/037 1

empfohlene Dosis für im Handel erhaltliche PHV-Vakzine ist 1000 plaquebildende Einheiten.

Tabelle II Behandlung Testinfektion 2 Wochen nach Vakzination

JM-V (1O⁵CLD) JM (1O³CID) befallen/gesamt befallen/gesamt

HVT-Vakz\ne 16/20 8/20

Modifizierte JM-V-

Vakzine

(50 Passagen in

aviären Embryonen) 0/20 1/20

Kontrollen 20/20 20/20

In der obigen Tabelle wurde ein Küken als "befallen" angesehen, wenn es entweder starb oder die krankhaften Veränderungen der Marek¹sehen Krankheit in Form von lymphoproliferativen Veränderungen zeigte. Die Bezeichnung CLD, CID und CEID bedeuten jeweils für'das Küken tödliche Dosis, Küken-Infektions-Dosis und Küken-Embryo-Infektions-Dosis.

Die Vakzine der vorliegenden Erfindung kam auch als Vakzine zum Impfen von Zuchttieren benutzt werden, und diese Tiere übertragen dann auf ihre Nachkommen eine angeborene Immunität, welche im Durchschnitt drei bis fünf Wochen lang anhält. Die Küken sind zu diesem Zeitpunkt immunologisch kompetent und so in der Lage, mit Feldinfektionen der Marek¹sehen Krankheit besser fertig zu werden. Da Broiler im allgemeinen im Alter von etwa sieben bis acht Wochen geschlachtet werden, reicht die Zeit vor der Schlachtung nicht aus, signifikante Tumoren zu entwickeln, selbst wenn die Küken nach dem Verlust

50981 3/0971 - 11 -

der angeborenen Immunität mit Marek'scher Krankheit infiziert worden sein sollten.

Ein bevorzugter Plan zur Immunisierung von Geflügelherden, die über ein Lebensalter von wenigen Wochen hinaus gehalten werden sollen, besteht darin, Muttertiere parenteral z.B. mit 100 CEID50 der Vakzine gemäß dieser Erfindung zu impfen, und ebenso die Nachzucht, wenn sie etwa einen Tag alt ist, zu vakzinieren, um nach dem Verlust der angeborenen Immunität eine bleibende Immunität zu gewährleisten. Eine zusätzliche Vakzinierung der Nachzucht im Alter von etwa drei Wochen oder etwas später verstärkt die Immunität. Die folgende Tabelle III zeigt die Auswirkungen passiver (maternaler) Antikörper gegenüber einer Testinfektion mit zellfreiem JM-Virus bei Nachkommen von mit 100 CEID50 zellfreien JM-V-Materials vakzinierten Muttertieren im Vergleich zu Küken von mit 5000 plaquebildenden Einheiten der im Handel erhältlichen PHV-Vakzine geimpften Muttertieren, und ebenso im Vergleich zu Küken von nicht \rakzinierten Muttertieren. Die Testinfektionen wurde in jedem--FaI-I mit 0,1 ml des JM- Virus (10^,8 CID50 per ml) in der angegebenen Verdünnung durchgeführt. Wie aus den im folgenden aufgeführten tabellarischen Daten ersichtlich, war das zellfreie JM-V-Material sehr viel wirksamer zur Ausbildung einer passiven Immunität bei der Nachzucht vakzinierter Muttertiere als die im Handel erhältliche PHV-Vakzine. Auch zeigten die Re-Isolierungen-des JM-Virus, daß die Virusmengen in Küken von mit dem zellfreien JM-V-Material vakzinierten Muttertieren im Vergleich zu der mit PHV vakzinierten Gruppe unbedeutend waren. Dieser Versuch zeigte eindrucksvoll die mit dem JM-V-Material erzielbare Antikörperreaktion. Wie bereits oben erörtert, ist jedoch das zellfreie JM-V- nicht vollständig sicher, und obwohl überlebende Tiere geschützt sind, erliegt doch ein bestimmter Prozentsatz der Marek¹sehen Krankheit

beim Impfen mit dem nichtmodifizierten-JM-V.

509813/097 1

U60/El860S

	y	Tabel	Testinfektion	Ie III	N	Re-Isolierungen/des	• N	JM-Virus	x10^ö Zellen+
Gruppe		Verdünnung des JM-Virus			Infiziert/Gesamt++	3/3	Plaques/2	N
			Befallen/Gesamt+	1/5	P	0/3	P	10
		10°	P	C/5	3/3	C/3	1.2	0
Parenteral	10 l\		■ 0/5 s-	0/3	0/3	0	0
vakziniert	¹⁰ -3	1/5	.0/5 '	0/3	0/3	0	0
τγ.ι- TOO CEID₅₀	¹⁰ -4	0/5	0/5 ..	* 0/3	. .0/3 . . .	0	0
zcllfreies JM-V	10 ⁴	C/5	• . .0/5	.„0/3 .,"	3/3	ο ··■	0
	nichtgeimpfte-Kontrolle. .	0/5 ;	3/5	.... 0/3	3/3	0	27
	loo	. 0/5 ...·	2/5	3/3	3/3	28	18
Parenteral	10-1	. . 0/5. . .	1/5	3/3 .	3/3	27	12
vakziniert mit	10-2	4/5	0/5	3/3	0/3	21	8 .
S.OCC PFU handelsübl	10-3	4/5	0/5	3/3	0/3	15	o 5
PI-Tv-Vakzine	10-4	3/5	0/5	1/3	0/3	1	0
	10"⁵	2/5	. 0/5 . .	0/3	3/3	0	0
	nicht-geimpfte-Kontrolle	1/5	3/5	. 0/3 . .	3/3	0	67
	loo	0/5	2/5	3/3	3/3	86	40
Nicht-vakzinierte		. . 0/5 .	·· 1/5	3/3	3/3	61	25
Kontrolle	!Ο"²	4/5	' 1/5	3/3	0/3	33	8
	10-3	3/5	0/5	3/3	0/3	14	0
10"⁴	4/5	0/5	2/3	0/3	3	0
ΙΟ"⁵	4/5	0/5	0/3		0	0
nichtnc impfte-Kontrolle	2/5		0/3	0
0/5
0/5

+ Die Tiere wurden durch Zerlegung auf makroskopische und/oder mikroskopische pathologische Verankerungen drei Wochen nach der Impfung untersucht

++ JM-Virusgcvinnung aus Kükennieren-Zellenkulturen drei Wochen nach der Impfung ■»·■>·+ Durchschnittliche plaques aller Proben . "''. .

Der Sicherheitsfaktor der Vakzine gemäß dieser Erfindung im Vergleich zu nichtmodifizicrtem zellfreicm JM-V-Material wird in der folgenden Tabelle IV wirkungsvoll erläutert, welche die Obcrlebenszahlcn für Küken zeigt, die im Alter von einem Tag mit nichtnodifizicrtem zellfreien JM-V vakziniert wurden, gefolgt nach drei Wochen von einer Verstärkungsvakzination mit demselben Material, im Vergleich zu den Überlebenszahlen für Küken, die mit der Vakzine gemäß dieser Erfindung vakziniert wurden, In jedem Falle wurden""100 CID50 der Vakzine je Küken für die erste und die Verstärkungsvak^ination benutzt. Die gestorbenen Tiere verendeten infolge der Vakzination und zeigen somit die Gefährlichkeit, die mit der Verwendung nichtmodifizierten Materials verbunden ist im Vergleich zu der Sicherheit bei der Anwendung embryopassagierten Materials gemäß dieser Erfindung.

Tabelle IV

Herkunft der Küken Vakzination am I.Tag Wiederholungsimpfung

nach 3 V/o ehe η

Zellfrei Embryopassa-Zellfrei Einbryo-

giert passajiert

K-Linie Nachzucht

von vakzinierten

Muttertieren 16/18 10/10 13/14 7/7 N-Linie Nachzucht

von nicht-vakzi-

nierten Muiter-

tieren . 7/9 iO/10 7/7 7/7

P-Linie Nachzucht

von vakzinierten

Muttertieren 13/15 15/15 10/11 12/12

P-Linie Nachzucht
von nicht-vakzinierten Muttertieren 13/18 15/15 10/11 12/12

Die obigen Zahlen zeigen für jede Gruppe die Zahl der überlebenden gegenüber dor Zahl der vakzinierten Tiere.

G098 1 3/i^ilJ7 1

Einige der Oberlebenden von den Impflingen beider Gruppen (geimpft mit zellfreiem JM-V bzw. mit embryopassagiertem Material vakziniert) sowie eine Gruppe von PHV-geimpften Tieren wurden anschließend einer Testinfektion mit 2000 LD₅₀ JM-V im Alter von sechs Wochen ausgesetzt. Wie aus der folgenden Tabelle V ersichtlich, bewirkten sowohl das zellfreie als auch das embryopassagierte Material vollständigen Schutz, während das PHV im Vergleich zu nicht?- geimpften Kontrollen einen signifikanten, jedoch keinen vollständigen Schutz ergab. In allen Fällen zeigen die Zahlen die überlebenden gegenüber den getesteten Tieren.

	Zellfrei JM-V.	Tabelle V	PHV	—	3/6
	6/6	Embryo- passagiertes Material	5/6	Natürliche Nicht- Ansteckung geinpfte an infizier-Kontroilen te Küken	2/6
N-Linie	6/6	6/6	5/6	3/6
P-Linie	6/6		1/6

Die Immunreaktion (Serumneutralisationstiter) der empfänglichen Küken der P-Linie, die im. Alter von einem Tag und im Alter von drei Wochen mit 2000 PFU handelsüblicher PHV-Vakzine oder 100 CEID₅₀ der Val'zine gemäß dieser Erfindung vakziniert wurden, oder auf natürliche Weise einer Marek'schen-Feldinfektion ausgesetzt wurden, ist in Fig. 1 gezeigt. Wie aus Eig. 1 ersichtlich, ist die Imnumreaktion infolge einer Impfung mit der Vakzine gemäß dieser Erfindung viel größer als bei nicht geimpften Tieren oder bei den mit de rPHV-Vakzine geimpften Tieren. Die Immunreaktion (Serumsneutralisationstiter) von Küken der empfänglichen P-Linie und der resistenten N-Linie mit hohem oder niedrigem passiven (matcrnalen) Antikörperspiegel, die im Alter von einem Tag und im Alter von drei Wochen mit 0,1 ml der aus Embryonen gewonnenen Vakzine geimpft wurden, ist in Fig. 2 aufgezeigt. Als Ausgangsmaterial für die Vakzine diente das

509813/0971

■'Π

Blut eines moribunden, vorher mit VR-736 geimpften Kükens, das nach 18 bzw, 21 Passagen in aviären Embryonen geerntct wurde. Es ist ersichtlich, daß die nicht geimpften Kontrolliere sowohl der N- als auch der P-Linie schnell den größten Teil ihrer anfänglichen Immunität verloren und nach drei Wochen nur noch sehr wenig Antikörper hatten.

Fig. 3 zeigt die Titer der indirekten fluoreszierenden Antikörper bei Küken der P-Linie und N-Linie mit hohen oder niedrigen passiven (maternalen) Antikörpermengen, die im Alter von einem Tag und im Alter von drei Wochen mit einer aus Embryonen ge\\^Tonnenen Vakzine geimpft wurden, die gemäß dieser Erfindung von VR-736 abgeleitet war." Wie ersichtlich, ist der Antikörpertiter bei den mit der Vakzine gemäß dieser Erfindung geimpften Tieren erheblich höher als bei nicht geimpften Tieren.

Fig. 4 zeigt den Grad und die Dauer der aktiven Immunreaktion, gemessen mittels Serumneutralisationstest gegen JM-Virus in vitro von 18 Monate alten Hühnern der P- und N-Linie, die intramuskulär durch Einspritzen von 100 CEID₅₀ einer als zellfreies JM-V-Material hergestellten Vakzine geimpft waren. Wie gezeigt, ist die Immunantwort sowohl bei Tieren der P- als auch der N-Linie nach der Vakzination erheblich höher, und es ist ersichtlich, daß die Immunität über eine lange Zeitdauer erhalten bleibt, was wiederum die Antikörperreaktion nach einer Impfung mit von JM-V abgeleiteten Material demonstriert.

Die Vakzine gemäß dieser Erfindung kann mittels bekannter Verfahren gehandhabt werden. Wie oben erwähnt, kann das geerntete Embryodotteisackmaterial nach zahlreichen Passagen, beginnend mit VR-736, unmittnihnr benutzt werden, z.B. durch Abziehen von 0,1 ml dos Materials und Einspritzen desselben in einen Impfling. Dieses Material. hat einen Titer in der Größenordnung \^rr<u 10·' CEJDr₁Q pro ril .

'•Ü9 8 1 3 / 097 1

Für den Handel würde das gewonnene Uottersackmaterial vorzugsweise mit irgendeiner der zahlreichen vorhandenen
stabilisierenden Verbindungen stabilisiert werden, z.B. mit einem gleichen Volumen eines Stabilisators bestehend aus 71 DMSO, 10Ifetalem Kälberserum und Medium 199. Die Tenperatur des stabilisierten, geernteten Materials
würde um 1° pro Minute auf -60° C gesenkt und das Material dann in flüssigem Stickstoff gelagert werden. Unmittelbar vor dem Gebrauch würde das gefrorene stabilisierte
Material in Wasser bei Raumtemperatur schnell aufgetaut und dann mit einem pharmazeutisch geeigneten Verdünnungsmittel, wie Tryptosephosphatbouillon von 1/4 Stärke,
oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit"einem pH-Wert von 7.2, verdünnt werden. Die Menge des Verdünnungsmittels beträgt kennzeichnenderweise das 100- bis 1000-fache des Volumens des aufgetauten Materials, je nach
dem Titer der Vakzine und der Art, in der sie zu verwenden ist.

Die Vakzine könnte zur leichteren Lagerung und Handhabung wahlweise auch lyophilisiert werden, und die
Vakzine in zellfreier Form läßt sich durch Aufbrechen der Zellen, z.B. durch Beschallen, Gefrieren-Auftauen etc. gewinnen.

Die Vakzine kann durch vielerlei Kethoden verabreicht werden, \\^rie durch subkutane, intramuskuläre oder intraabdominale Injektion, wobei etwa 10 bis 100 kükenembryo-•infektiose Dosen 501 (C]-ID50) empfohlen würden, oder, durch irgendeinen der natürlichen Infektionswege, wie oral durch die Atmungsorgane oder die Augen; in diesen letztgenannten Fällen könnten zur Hrzieltmg wirksamer Ergebnis ο 100 bis 1000 CKID₅₀ erforderlich sein. F.in besonders bequem anzuwendendes Verfahren besteht in der Herstellung eines die Vakzine enthaltenden Aeroso-Sprays, zu dessen Anwendung die zu vakzinierenden Tiere in

50981 3/097 1

BAD ORIGINAL

ti

einem geschlossenen Raum zu halten sind.

Ein besonders wichtiges Merkmal, der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß ein Agens (VR-736), das in der Lage ist, eine außergewöhnlich starke Antikörperreaktion in einem Wirtstier hervorzurufen, so lange bearbeitet wird, daß es seine pathogene Wirkung verliert, während es seine Fähigkeit,eine Antikörperreaktion in einem Wirtstier hervorzurufen, beibehält und dadurch eine Vakzine darstellt, die sowohl sicher als auch wirksam ist.

Die obige, ausführliche Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen dieser Erfindung -dient der Erläuterung der gegenwärtig bekannten besten. Versionen der Erfindung und ist nicht als Begrenzung der in den folgenden Ansprüchen festgelegten Erfindung anzusehen.

50 9813/0971

Claims

Patentansprüche: o/o/rir

Z4o4b

(T) Verfahren zur Herstellung einer immunisierenden und nicht-pathogcnen Vakzine zur Immunisierung von Geflügel gegen die Marek'sche Krankheit, gekennzeichnet durch Übertragung eines virulenten Agens, insbesondere ATCG iio.VR-756, in einen aviären Embryo, Ernten des embryonalen Materials nach einigen Tagen, serienweises Passagieren des geernteten Materials, bis das Agens für lebendes Geflügel nicht mehr pathogen ist, sowie Gewinnung des Materials, welches gegen d~e Marek'sche Krankheit des Geflügels immunirierend und nicht-pathogen ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das geerntete Material serienweise in aviären Embryonen passagiert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das geerntete Material serienweise in Zellkulturen in vitro passagiert wird.
4. Verfahren nach Anspruch.2, dadurch gekennzeichnet, daß das embryonale Material etwa nach einer Woche geerntet wird und für etwa eine Woche pro Passage im Dottersack aviärer Embryonen weiterpassagiert wird, bis ein Material gewonnen wird, welches für Eintagsküken nicht-pathogen ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das embryonale Material geerntet und über wenigstens vierzig Passagen weitcrpassagicrt wird.
6. Vakzine, gekennzeichnet durch ein Agens, welcher- gegen die Marek'sche Krankheit beim Geflügel iinminn sd orend

■ wirkt und nicht-pathogen ist und von einen durch ATCC No. VK-736 dargestellten Virus abgeleitet ist,

'i O 's :-■ ι -¹M ■■

BAD ORIGINAL

XO

sowie durch ein pharmazeutisch geeignetes Triigermedium.
7. Vakzine nach Anspruch 6', dadurch gekennzeichnet, daß das Zellmaterial dieser Vakzine aufgebrochen ist.
8. Vakzine nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Vakzine lyophilisiert worden ist.
eeeeee— durch die Verabreichung der Vakzine gemäß Anspruch/6 an das Geflügel in e:'.ner wirksamen Menge zur Erzeugung hoher Antikörpermengen in dem Geflügel uaü zur Verhinderung der Entwicklung der Marek'schejr Krankheit bei dem Geflügel.
10. Verfahren zur Behandlung von Geflügelterden nach Anspruch 9, gekennzeichnet durch die Verabreichung der Vakzine an erwachsene Muttertiere/ die dann in der Lage sind, ihren Nachkommen eine angeborene Immunität gegenüber der Marek'sehen/Krankheit, mitzugeben, sowie Verabreichung der Vakcine an die Nachkommen dieser Muttertiere in wirksamen Mengen, um die Nachkommen nach Ablauf der ,normalen Zeitdauer angeborener Immunität gegenüb/er der Marek'sehen Krankheit immun zu halten.
11. VeTfahven nach/Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Vakzine den Muttertieren und ihrer Nachkommen parenterna^r verabreicht wird.
12. Verfah/en nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Vakzine der Nachkommen als ein Aerosolspray s

ι nachträi'loh

5098 1 3/09.7 1
ORIGINAL INSPECTED