CN101921763A - 抑制PAR-1基因表达的siRNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明根据siRNA设计原理，针对PAR-1基因的mRNA序列设计了8对siRNA，该8对siRNA可以用于抑制PAR-1基因表达的siRNA，由于PAR-1基因的表达水平与肝纤维化密切相关，抑制PAR-1基因的表达就能有效延缓甚至阻断肝纤维化的病理进程，达到治疗肝硬化的目的。上述8对siRNA序列可用于制备治疗肝纤维化的药物。

Description

抑制PAR-1基因表达的siRNA及其应用

技术领域

本发明涉及抑制PAR-1(蛋白酶激活受体-1)基因表达的siRNA(小分子干扰RNA)及其应用。

背景技术

几乎所有肝病均具有炎症坏死，而只要有炎症坏死，肝纤维化即发生。肝纤维化的不断发展，引起肝小叶结构改建和假小叶形成，导致肝硬化；纤维组织压迫血管，引起门脉高压和肝缺血，进而加剧肝细胞坏死和炎症，如此形成恶性循环。因此，阻断肝纤维化的发生和发展，对防治肝硬化具有重要意义。而且我国肝病发病率是比较高的国家之一，所以寻找有效途径抑制肝纤维化，有相当重要的意义。

肝纤维化和它导致的最后阶段的肝硬化，通常是由病毒感染，过度使用损害肝脏的药物，代谢系统疾病，和遗传因素引起的。肝纤维化的病理进程，实际上是正常的肝组织被疤痕类似的胶原蛋白代替，导致肝功能的丧失，过去认为这个过程是一个不可逆的过程，直到最近才认为这个过程在早期是可以挽救的。根据目前的研究，表明星状细胞在这个过程中起了关键作用。正常的肝脏中，星状细胞大约占肝体积的1.4％，相当于每100个肝细胞中大约有3.6-6个星状细胞。纤维化的过程实际上是来自于门静脉和窦周的α平滑肌细胞骨架阳性的肌纤维母细胞产生和增殖的过程。虽然这种细胞有不止一种的潜在来源，但被研究的最为清楚的就是肝星状细胞，在它们没有被活化成α平滑肌细胞骨架阳性表型的细胞之前，它们的主要功能是贮存维生素A，调节维甲酸的水平。可一旦被活化后，它们就成为肝纤维化中纤维胶原的主要来源，而且它们通过收缩和释放致炎和致纤维因子，潜在的调节窦间隙的血流量。活化的星状细胞还能产生基质金属蛋白酶组织抑制剂，导致基质金属蛋白酶降解肝细胞外基质的功能受损，从而使细胞外基质向胶原和纤维化转变。

随着RNAi作为制药技术的成熟，已有siRNA药物进入临床实验，siRNA药物具有如下优点：(1)、特异性强，碱基的顺序决定了它的特异性；(2)、设计便利，由于人类基因库已经完成，这为siRNA的设计带来了极大的便利，可以说几乎没有基因不能作为siRNA的靶标；(3)、临床研究便利，siRNA药物作为核酸类药物，不管何种siRNA都具有大致相同的药物代谢，药物分布，药物毒性，这为进入临床研究带来了极大的便利；(4)、由于RNAi一开始就已将特定基因作为靶标，所以siRNA分子药理学明确。

发明内容

本发明的目的在于利用RNAi(RNA干扰)技术，对候选的靶标基因进行效用、量效关系及特异性的评定，以提供能够抑制PAR-1(蛋白酶激活受体-1)基因表达的siRNA(小分子干扰RNA)，并进一步地提供该siRNA在临床上的应用。

按照本发明提供的技术方案，所述siRNA为下述PAR-1-01～PAR-1-08中的任意一种，PAR-1-01～PAR-1-08分别为：

PAR-1-01：

正义链序列SEQ ID NO.1为5′-AGGGCAGUCUACUUAAAUA-3′

反义链序列SEQ ID NO.2为5’-UAUUUAAGUAGACUGCCCU-3’

PAR-1-02：

正义链序列SEQ ID NO.3为5′-CGGCCGUGGUGUACAUGCU-3′

反义链序列SEQ ID NO.4为5′-AGCAUGUACACCACGGCCG-3′

PAR-1-03：

正义链序列SEQ ID NO.5为5′-CCUUCAAGAUCAGCUACUA-3′

反义链序列SEQ ID NO.6为5′-UAGUAGCUGAUCUUGAAGG-3′

PAR-1-04：

正义链序列SEQ ID NO.7为5′-ACAUGUACGCCUCCAUCAU-3′

反义链序列SEQ ID NO.8为5′-AUGAUGGAGGCGUACAUGU-3′

PAR-1-05：

正义链序列SEQ ID NO.9为5′-GCAUCUUCAUCGUCUGCUU-3′

反义链序列SEQ ID NO.10为5′-AAGCAGACGAUGAAGAUGC-3′

PAR-1-06：

正义链序列SEQ ID NO.11为5′-CCACCAACGUCCUCCUGAU-3′

反义链序列SEQ ID NO.12为5′-AUCAGGAGGACGUUGGUGG-3′

PAR-1-07：

正义链序列SEQ ID NO.13为5′-GCAGGGCAGUCUACUUAAA-3′

反义链序列SEQ ID NO.14为5′-UUUAAGUAGACUGCCCUGC-3′

PAR-1-08：

正义链序列SEQ ID NO.15为5′-GCUCUAGCCACCUGAAUAA-3′

反义链序列SEQ ID NO.16为5′-UUAUUCAGGUGGCUAGAGC-3′

上述的各siRNA序列的3′端垂悬两个dTdT，该垂悬不与mRNA序列互补，使正义链3′端更容易解链，从而增加其沉默效率。

上述的各siRNA序列可用于制备治疗肝纤维化的药物。

siRNA是RNAi途径中的中间产物，是RNAi发挥效应所必需的因子。siRNA的形成主要由Dicer和Rde-1调控完成。由于RNA病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列转录等原因，细胞中出现了dsRNA，Rde-1(RNAi缺陷基因-1)编码的蛋白质识别外源dsRNA，当dsRNA达到一定量的时候，Rde-1引导dsRNA与Rde-1编码的Dicer(Dicer是一种RNaseIII活性核酸内切酶，具有四个结构域：Argonaute家族的PAZ结构域，III型RNA酶活性区域，dsRNA结合区域以及DEAH/DEXHRNA解旋酶活性区)结合，形成酶-dsRNA复合体。在Dicer酶的作用下，细胞中的单链靶mRNA(与dsRNA具有同源序列)与dsRNA的正义链互换，原来dsRNA中的正义链被mRNA代替而从酶-dsRNA复合物中释放出来，然后，在ATP的参与下，细胞中存在的一种RNA诱导的沉默复合体RNA-induced silencing complex(RISC，由核酸内切酶、核酸外切酶、解旋酶等构成，作用是对靶mRNA进行识别和切割)利用结合在其上的核酸内切酶的活性来切割dsRNA上处于原来正义链位置的靶mRNA分子中与dsRNA反义链互补的区域，形成21-23nt的dsRNA小片段，这些小片段即为siRNA。RNAi干涉的关键步骤是组装RISC和合成介导特异性反应的siRNA蛋白。siRNA并入RISC中，然后与靶标基因编码区或UTR区完全配对，降解靶标基因，因此说siRNA只降解与其序列互补配对的mRNA。其调控的机制是通过互补配对而沉默相应靶位基因的表达，所以是一种典型的负调控机制。siRNA识别靶序列是有高度特异性的。而且它的合成非常简便，已经成为一项很成熟的技术。

本发明针对PAR-1基因设计合成了8对siRNA，该8对siRNA能够有效抑制PAR-1基因的表达；同时由于siRNA技术越来越成熟，也为治疗肝纤维化提供了可行的药物。

附图说明

图1为可见光源条件下的siRNA转染效率照片。

图2为荧光激发条件下的siRNA转染效率照片。

图3为荧光定量PCR检测转染不同siRNA的PAR-1基因表达水平图。

图中：MOCK是未转染任何siRNA的空白对照组；si-control是转染si-control的siRNA的无关对照组；PAR-1-01～PAR-1-08是转染PAR-1-01～PAR-1-08的siRNA组

图4为荧光定量PCR检测肝纤维化病理过程(天数)与PAR-1的mRNA的表达水平关系图。图中：天数用于衡量肝纤维化病理过程

图5为荧光定量PCR检测肝纤维化病理过程(天数)与TGF-beta1的mRNA的表达水平关系图。图中：天数用于衡量肝纤维化病理过程

图6为荧光定量PCR检测肝纤维化病理过程(天数)与Col1a1的mRNA的表达水平关系图。图中：天数用于衡量肝纤维化病理过程

图7为PAR-1-01的siRNA在不同浓度下的量效曲线。

图8为原代肝星型细胞体外培养不同时间的细胞形态图。

图9为荧光定量PCR检测转染PAR-1-01的siRNA的原代肝星型细胞(体外培养48小时)的PAR-1基因表达水平图。

图10为荧光定量PCR检测转染PAR-1-01的siRNA的原代肝星型细胞(体外培养48小时)的TGF-beta1、Col1a1基因表达水平图。

图11为荧光定量PCR检测转染不同浓度的PAR-1-01的siRNA的原代肝星型细胞(体外培养48小时)的TGF-beta1、Col1a1基因表达水平图。

图12为荧光定量PCR检测转染PAR-1-01的siRNA的原代肝星型细胞(体外培养5天)的PAR-1基因表达水平图。

图13为荧光定量PCR检测转染PAR-1-01的siRNA的原代肝星型细胞(体外培养5天)的TGF-beta1、Col1a1基因表达水平图。

图14为荧光定量PCR检测转染不同浓度的PAR-1-01的siRNA的原代肝星型细胞(体外培养5天)的TGF-beta1、Col1a1基因表达水平图。

具体实施方式

下面结合具体附图和实施例对本发明作进一步说明。

本发明利用PCR和Westernblot技术确定了HSC-T6肝星型细胞能够在RNA和蛋白水平大量表达PAR-1基因，所以本发明采用大鼠HSC-T6肝星型细胞系(来自于湘雅医学院细胞库)作为siRNA筛选细胞，该细胞常规培养在DMEM高糖培养剂(含10％体积比的胎牛血清中)，培养条件为37℃，5％体积比的二氧化碳，每三天传代一次。

1、siRNA的设计合成

根据siRNA设计原理，针对PAR-1基因的mRNA序列设计了8对siRNA(参见表1)。PAR-1-01～PAR-1-06设计成大小鼠同源的siRNA，目的主要是为了能够利用大鼠的HSC-T6细胞系进行siRNA的筛选，而不必从大鼠或小鼠的肝脏中分离肝星型细胞，同时在后续的动物实验中能够利用小鼠作为病理模型，由于小鼠体重较大鼠轻很多，所以给药剂量可以大大减少，可以大大减低siRNA合成费用。设计方法及步骤为：(1)利用NCBI的核苷酸数据库分别找到大鼠和小鼠PAR-1基因的RNA序列，它们在NCBI的Accession#分别为NM 012950.2和NM 010169.3；(2)利用CLUSTAL X(2.0)序列比对软件将两条序列进行比对并找到同源部分；(3)利用Whitehead Institute在其网站(网址为：http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/home.php)上发布的siRNA设计软件，针对同源部分进行设计；(4)利用NCBI的blastn的程序，调用数据库nt/nr进行分析，结果显示设计的这6对siRNA不会与大鼠、小鼠除PAR-1基因之外的其它基因的序列同源。PAR-1-07～PAR-1-08是仅针对大鼠PAR-1基因的siRNA设计，目的在于去除同源序列这个限制因素，使得siRNA的设计结果更加可靠。上述PAR-1-01～PAR-1-08的siRNA均由上海吉玛制药技术有限公司提供合成。为提高所述siRNA的基因沉默效率，所述PAR-1-01～PAR-1-08的siRNA的3′端垂悬有两个由脱氧核苷组成的碱基TT。

表1：根据Whitehead Institute的siRNA设计软件设计合成的8对siRNA序列。

2、HSC-T6细胞的分离培养及siRNA的转染。

HSC-T6细胞在转染前16小时，将浓度为0.6*10⁴PM的细胞悬液接种于标准12孔细胞培养板中，转染前更换新鲜培养剂。每孔加入10pmole的siRNA和7ul的siRNA转染试剂INTERFERin^TM(由Polyplus-transfection生产)，转染方法按照转染试剂生产商的试剂说明书进行，转染效率利用FAM标记阴性对照的siRNA检测，检测结果参见图1、图2。

3、提取及反转录

转染后24小时采用Trizol(invitrogen公司生产)提取细胞RNA，提取方法按照Trizol生产商invitrogen公司提供的试剂说明书进行；提取后的RNA经DnaseI(碧云天生物公司提供)在37℃下处理30分钟后，再经酚氯仿提取一次，取0.5ug的RNA在MMLV反转录酶(Promega公司)作用下，利用oligodt(15)(Invitrogen公司)作为引物，按照反转录试剂盒说明书进行，将RNA反转录成cDNA，备用。

4、荧光定量PCR检测

取步骤3制备的适量的cDNA做荧光定量PCR检测，。荧光定量PCR采用sybrgreen的方法，所用PCR试剂为

Premix Ex Taq^TM(宝生物工程大连有限公司生产)，所用的仪器为lightcycle480(罗氏(Roche)公司生产)；同时设置空白对照组MOCK和无关对照组si-control(上海吉玛制药技术有限公司提供)，si-control的序列参见表一；试剂盒采用

Premix Ex Taq^TM(宝生物工程大连有限公司生产)，PCR程序设置按照该试剂盒提供的说明书进行，PCR检测中使用Gapdh基因作为内参基因，进行相对定量分析PAR-1基因的表达水平。Gapdh基因所用引物中的左引物序列SEQ ID NO.19为5′-TCACCACCATGGAGAAGGC-3′，右引物序列SEQ ID NO.20为5′-GCTAAGCAGTTGGTGGTGCA-3′；si-control和PAR-1基因所用引物中的左引物序列SEQ ID NO.21为5′-GCCAGAAGCACCTTTACAGC-3′，右引物序列SEQ ID NO.22为5′-TTCAGGTGGCTAGAGCAGGT-3′；反应体系中的引物浓度为300nM。检测结果如图3所示，由图可见，PAR-1基因的表达水平明显受到siRNA的抑制而降低。

5、有效性验证

研究表明，肝纤维化病理过程(天数)的发生通常伴随着一些肝纤维化标志基因如PAR-1、TGF-beta1、Col1a1的mRNA的表达水平的升高，通过荧光定量PCR检测(检测结果如图4～6所示)可见，在肝星型细胞活化成为纤维化细胞的过程中，PAR-1、TGF-beta1、Col1a1的mRNA的表达水平随着肝纤维化的程度而逐渐增高。

(1)、选取PAR-1-01的siRNA做量效关系实验：

为验证PAR-1-01的siRNA能否呈现良好的量效关系，本发明通过变换PAR-1-01的siRNA的不同浓度，在HSC-T6细胞上观察PAR-1的抑制效率，得到了量效曲线和IC50的数据，结果如图7所示，由图可见，PAR-1基因的表达水平随着siRNA浓度的升高而逐渐降低。

(2)、选取PAR-1-01的siRNA做原代肝星型细胞的活化抑制实验：

(a)、原代肝星型细胞的分离培养

本发明从大鼠肝脏中分离了原代肝星型细胞，分离方法为成年Wistar大鼠术前禁食12～16h，自由饮水。用1％戊巴比妥钠40mg·kg-1腹腔内注射麻醉大鼠。胸腹部皮肤消毒，移入超净工作台中。沿腹部正中线剪开腹腔，分离下腔静脉及门静脉，在门静脉距肝外10mm处用眼科剪斜形剪一小口，迅速插入自制血管插管，结扎固定。接通恒流蠕动泵，灌注预热37℃的D.Hank′s肝脏灌流液，剪开下腔静脉，此时可见灌流液自下腔静脉流出，肝脏逐渐饱满，由紫红色逐渐变成淡黄白色。游离肝脏，保留下门静脉血管插管及下腔静脉的标志缝线。将游离的肝脏置于平皿中，灌注预热37℃的含酶Hank′s液I(含0.05％的胶原酶、0.1％链霉蛋白酶溶液)，并将灌注系统进液端放入平皿中，使流出的酶液可进行循环灌流，可见肝脏变软无弹性，肝包膜下出现小液泡。倒除灌流液，撕去肝脏外膜，撕碎或剪碎肝组织，加入预热37℃的含酶Hank′s液II(含0.05％的胶原酶、0.02％链霉蛋白酶、0.01％DNA酶I溶液)，再次消化20min。经200目滤网过滤，用磨锤轻轻研磨，并用4℃的Hank′s液冲冼。将烧杯内细胞悬液分装入2只50ml的刻度离心管，550r·min-1离心8min；吸除上清入2只50ml的刻度离心管，1750r·min-1离心8min。去上清，用4℃的Hank′s液冲冼重悬，2管合1定容至10ml。加入20ml的18％Nycodenz，将细胞悬液分装入6只10ml带盖的刻度离心管中，每管液面覆盖2～3ml的Hank′s液，3200r·min-1离心15min。吸取中间细胞悬液层入50ml刻度离心管，加入无血清DMEM培养液至50ml，550r·min-1离心8min，取沉淀。加入预热37℃的含血清的DMEM完全培养基至10ml。每5*106转移至10cm细胞培养皿中。刚分离的原代肝星型细胞呈扁圆形，经48小时体外培养，细胞呈星型细胞状。培养到7天时细胞逐渐开始融合、变长、分裂、增殖，形态向纤维样细胞发展，细胞形态如图8所示。

(b)、体外培养48小时后的原代肝星型细胞的活化抑制实验

体外培养原代肝星型细胞48小时后，按每孔1.2*10⁵细胞个数的细胞悬液接种于标准12孔细胞培养板中，培养3小时，更换新鲜DMEM完全培养剂。每孔加入10pmole的PAR-1-01的siRNA和7ul的siRNA转染试剂INTERFERin^TM(由Polyplus-transfection生产)，转染方法按照转染试剂生产商的试剂说明书进行；24小时后再采用上述相同方法转染一次；再经24小时，采用前述方法提取细胞RNA。利用前述的荧光定量PCR检测方法测定PAR-1、TGF-beta1、Col1a1的表达水平，同时设置空白对照组MOCK和无关对照组si-control(上海吉玛制药技术有限公司提供)。检测结果图9、图10所示，检测结果表明经PAR-1-01的siRNA处理的原代肝星型细胞的PAR-1、TGF-beta1、Col1a1的表达水平较未经处理的细胞表达大大降低。

改变PAR-1-01的siRNA的用量，采用前述的转染方法与检测方法进行处理与检测，结果如图11所示，由图可见，PAR-1-01的siRNA的用量能够影响TGF-beta1、Col1a1的表达水平的高低。

(c)、体外培养5天后的原代肝星型细胞的活化抑制实验。

体外培养的原代肝星型细胞5天后，按每孔1.2*10⁵细胞个数的细胞悬液接种于标准12孔细胞培养板中，培养3小时，更换新鲜DMEM完全培养剂。每孔加入10pmole的PAR-1-01的siRNA和7ul的siRNA转染试剂INTERFERin^TM(由Polyplus-transfection生产)，转染方法按照转染试剂生产商的试剂说明书进行；24小时后再采用上述相同方法转染一次；再经24小时，采用前述方法提取细胞RNA。利用前述的荧光定量PCR检测方法测定PAR-1、TGF-beta1、Col1a1的表达水平，同时设置空白对照组MOCK和无关对照组si-control(上海吉玛制药技术有限公司提供)。检测结果图12、图13所示，检测结果表明经PAR-1-01的siRNA处理的原代肝星型细胞的PAR-1、TGF-beta1、Col1a1的表达水平较未经处理的细胞表达大大降低。

改变PAR-1-01的siRNA的用量，采用前述的转染方法与检测方法进行处理与检测，结果如图14所示，由图可见，PAR-1-01的siRNA的用量能够影响TGF-beta1、Col1a1的表达水平的高低。

Claims (3)

1.抑制PAR-1基因表达的siRNA，其特征在于，所述siRNA为下述PAR-1-01～PAR-1-09中的任意一种，PAR-1-01～PAR-1-08分别为：

PAR-1-01：

正义链序列SEQ ID NO.1为5′-AGGGCAGUCUACUUAAAUA-3′

反义链序列SEQ ID NO.2为5’-UAUUUAAGUAGACUGCCCU-3’

PAR-1-02：

正义链序列SEQ ID NO.3为5′-CGGCCGUGGUGUACAUGCU-3′

反义链序列SEQ ID NO.4为5′-AGCAUGUACACCACGGCCG-3′

PAR-1-03：

正义链序列SEQ ID NO.5为5′-CCUUCAAGAUCAGCUACUA-3′

反义链序列SEQ ID NO.6为5′-UAGUAGCUGAUCUUGAAGG-3′

PAR-1-04：

正义链序列SEQ ID NO.7为5′-ACAUGUACGCCUCCAUCAU-3′

反义链序列SEQ ID NO.8为5′-AUGAUGGAGGCGUACAUGU-3′

PAR-1-05：

正义链序列SEQ ID NO.9为5′-GCAUCUUCAUCGUCUGCUU-3′

反义链序列SEQ ID NO.10为5′-AAGCAGACGAUGAAGAUGC-3′

PAR-1-06：

正义链序列SEQ ID NO.11为5′-CCACCAACGUCCUCCUGAU-3′

反义链序列SEQ ID NO.12为5′-AUCAGGAGGACGUUGGUGG-3′

PAR-1-07：

正义链序列SEQ ID NO.13为5′-GCAGGGCAGUCUACUUAAA-3′

反义链序列SEQ ID NO.14为5′-UUUAAGUAGACUGCCCUGC-3′

PAR-1-08：

正义链序列SEQ ID NO.15为5′-GCUCUAGCCACCUGAAUAA-3′

反义链序列SEQ ID NO.16为5′-UUAUUCAGGUGGCUAGAGC-3′。

2.如权利要求1所述的抑制PAR-1基因表达的siRNA，其特征还在于，所述siRNA的3′端垂悬有两个用于提高基因沉默效率的由脱氧核苷组成的悬挂碱基TT。

3.如权利要求1或2所述的抑制PAR-1基因表达的siRNA，其特征于，所述siRNA序列用于制备治疗肝纤维化的药物。

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