CN116785309A - 环状rna在制备用于预防和/或治疗缺血性卒中药物中的应用 - Google Patents
环状rna在制备用于预防和/或治疗缺血性卒中药物中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116785309A CN116785309A CN202310549766.4A CN202310549766A CN116785309A CN 116785309 A CN116785309 A CN 116785309A CN 202310549766 A CN202310549766 A CN 202310549766A CN 116785309 A CN116785309 A CN 116785309A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- circle
- ischemic stroke
- hsa
- treatment
- circ
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108091028075 Circular RNA Proteins 0.000 title claims abstract description 33
- 208000032382 Ischaemic stroke Diseases 0.000 title claims abstract description 30
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 23
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 5
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims abstract description 19
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 claims abstract description 16
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 30
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 29
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 22
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 20
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 20
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 15
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 12
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 9
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 6
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 4
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims description 3
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 claims description 3
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims description 2
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 claims 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 abstract description 38
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 abstract description 34
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 abstract description 32
- 201000006474 Brain Ischemia Diseases 0.000 abstract description 29
- 206010008120 Cerebral ischaemia Diseases 0.000 abstract description 29
- 230000006378 damage Effects 0.000 abstract description 14
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 abstract description 7
- 208000014674 injury Diseases 0.000 abstract description 7
- 230000007774 longterm Effects 0.000 abstract description 6
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 abstract description 6
- 230000009692 acute damage Effects 0.000 abstract description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 101001012229 Escherichia coli (strain K12) Insertion element IS1 5 protein InsA Proteins 0.000 description 22
- 101000852829 Escherichia coli (strain K12) Insertion element IS1 5 protein InsB Proteins 0.000 description 22
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 8
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 8
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 8
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 8
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 7
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 7
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 6
- 206010063837 Reperfusion injury Diseases 0.000 description 5
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 5
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 4
- 230000007659 motor function Effects 0.000 description 4
- 208000020037 osteoglophonic dysplasia Diseases 0.000 description 4
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 3
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 3
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000006386 memory function Effects 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 3
- 230000002537 thrombolytic effect Effects 0.000 description 3
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 3
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 2
- 206010007559 Cardiac failure congestive Diseases 0.000 description 2
- 206010008088 Cerebral artery embolism Diseases 0.000 description 2
- 206010008190 Cerebrovascular accident Diseases 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 102220584028 Non-receptor tyrosine-protein kinase TYK2_R22E_mutation Human genes 0.000 description 2
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 2
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000009194 climbing Effects 0.000 description 2
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000007658 neurological function Effects 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 208000037816 tissue injury Diseases 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 206010056292 Androgen-Insensitivity Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000031104 Arterial Occlusive disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- 206010048554 Endothelial dysfunction Diseases 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 238000012347 Morris Water Maze Methods 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- 101710128237 Tubby-like protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101710147828 Tubby-related protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100029299 Tubby-related protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000010108 arterial embolization Effects 0.000 description 1
- 208000021328 arterial occlusion Diseases 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000008081 blood perfusion Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001149 cognitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 230000008497 endothelial barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010595 endothelial cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000009764 endothelial cell sprouting Effects 0.000 description 1
- 230000008694 endothelial dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 206010027175 memory impairment Diseases 0.000 description 1
- 210000003657 middle cerebral artery Anatomy 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009707 neogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000004766 neurogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000002610 neuroimaging Methods 0.000 description 1
- 230000007971 neurological deficit Effects 0.000 description 1
- 230000003961 neuronal insult Effects 0.000 description 1
- 230000001067 neuroprotector Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000013077 scoring method Methods 0.000 description 1
- 230000006886 spatial memory Effects 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960000103 thrombolytic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006444 vascular growth Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明公开了环状RNA在制备用于预防和/或治疗缺血性卒中药物中的应用，研究结果表明了环状RNA的过表达不仅可减轻脑缺血再灌注造成的急性损伤，还可改善小鼠脑缺血再灌注所致的长期神经功能损伤，并可促进脑缺血再灌后血管新生，此可为缺血性脑卒中及其脑血管疾病的治疗提供了新的思路与方向。
Description
技术领域
本发明涉及生物分子技术领域，尤其涉及环状RNA在制备用于预防和/或缺血性卒中药物中的应用。
背景技术
脑卒中(stroke)又叫卒中，是世界范围内导致死亡和残疾的主要原因。急性缺血性卒中(acute ischemic stroke，AIS)作为较常见的脑卒中类型，约占全部脑卒中比例的70％。缺血性卒中被定义为脑、脊髓或视网膜的梗死，其中动脉闭塞引起的缺血性卒中是主要原因，当前血管内取栓和静脉溶栓是治疗AIS较有效的措施，其中重组组织型纤维溶酶原激活剂TPA是获得美国食品和药物管理局(FDA)批准的治疗中风的唯一合适的溶栓药物，它可以分解脑血管中的血凝块，然后恢复患者脑血管血液再灌注，进而发挥及时的治疗效果。但溶栓药物的治疗时间窗一般受卒中发生时间、脑血管阻塞部位和阻塞程度、急性神经功能缺损的严重程度以及神经影像结果、血栓患者年龄、溶栓剂的特异性以及中和抗体的存在和半衰期，只有不到10％的中风患者符合TPA治疗条件，并且一部分病人恢复后继发的再灌注损伤，导致该疾病的治愈尚未取得突破性进展。其他降纤药物、神经保护剂等治疗方式尚未取得令人满意结果；高压氧、亚低温等缺乏高质量随机对照研究证实其可行性，但多是在患者抢救治疗后的康复保健治疗中作为辅助治疗的一种方式。缺血性卒中特点主要是内皮功能障碍和屏障破坏。缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)可诱导脑血管氧化应激和凋亡，造成血脑屏障(blood brain barrier，BBB)破坏，导致缺血性脑卒中的发生和发展。
目前针对缺血性脑卒中引起的脑组织损伤的机制原因众多，其中血管新生的研究是医学界寻求IS的治疗的又一重大突破。血管新生是指从预先存在的血管网络中形成血管。在发育、组织修复或疾病状态下的血管生长,包括内皮细胞的萌发、迁移和增殖，其受多种因素调控。脑缺血后的血管新生是对脑缺血反应的重要恢复和保护机制。最早缺血后12h出现在缺血边界区(IBZ)，在实验性脑缺血后可持续30天以上。当发生脑缺血时，梗死区及其周围的血管结构受到破坏，营养供应不足，进而导致梗死扩大。因此，保护梗死区血管结构的完整性，促进梗死区周围血管生成，对脑缺血的治疗具有重要意义。此外，维持更多功能性血管有利于缺血后血液灌注，促进血管新生和神经发生。
Mm9_circ_008009(ID:mmu_circ_0000723)的基因组位置是chr17：6137210-6139156，长度为1946bp，来源基因是Tulp4(Tubby-likeprotein4)，于2013年通过高通量RNA测序被发现。Mm9_circ_008009通过blast软件进行人的同源性比对，发现人与小鼠有100％同源性。有报告对Mm9_circ_008009进行研究，确证了mm9_circ_008009的表达与DCM发生呈负相关，心脏组织mm9_circ_008009表达下调促进了心肌重塑并引起慢性充血性心力衰竭(congestiveheartfailure，CHF)的发生与发展。且已有研究将mm9_circ_008009和hsa_circ_0131202命名为糖尿病诱导循环相关环状RNA(diabetes induced circulationrelated circRNA-junction sequence，DICAR)。据上，本发明尝试将糖尿病诱导循环相关环状RNA应用于对脑卒中的治疗。
发明内容
因此，基于以上背景，本发明将糖尿病诱导循环相关环状RNA(DICAR)应用于对脑卒中的治疗进行研究，研究结果表明了糖尿病诱导循环相关环状RNA(DICAR)的过表达不仅可减轻脑缺血再灌注造成的急性损伤，还可改善小鼠脑缺血再灌注所致的长期神经功能损伤，并可促进脑缺血再灌后血管新生。
因此本发明提供了下技术方案：
本发明的目标之一提供了：
环状RNA在制备用于预防和/或治疗缺血性卒中药物中的应用，所述环状RNA为mm9_circ_008009和hsa_circ_0131202；
其中mm9_circ_008009的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示或反向互补序列；所述hsa_circ_0131202的核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示或反向互补序列。
进一步地，所述环状RNA可通过mm9_circ_008009和hsa_circ_0131202过表达促进血管新生实现缺血性卒中治疗。
本发明的目的之二提供了：
一种用于预防和/或治疗缺血性卒中的药物，其包括有效量的促环状RNA表达的试剂，所述环状RNA为mm9_circ_008009和hsa_circ_0131202；
其中mm9_circ_008009的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示或反向互补序列；所述hsa_circ_0131202的核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示或反向互补序列。
进一步地，所述促环状RNA表达的试剂为构建体或重组宿主细胞。
进一步地，所述构建体或重组细胞含有所述环状RNA。
进一步地，所述构建体的载体为非致病性病毒载体。
进一步地，所述非致病性病毒载体为腺病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体。
本发明的目的之三提供了：
环状RNA在制备用于预防和/或治疗脑血管疾病药物中的应用，所述环状RNA为mm9_circ_008009和hsa_circ_0131202；
其中mm9_circ_008009的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示或反向互补序列；所述hsa_circ_0131202的核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示或反向互补序列。
进一步地，其包括有效量的促环状RNA表达的试剂；
所述环状RNA为mm9_circ_008009和hsa_circ_0131202；
其中mm9_circ_008009的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示或反向互补序列；所述hsa_circ_0131202的核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示或反向互补序列。
本发明的目的之四是提供了：
一种用于预防和/或治疗脑血管疾病的药物，其包括有效量的促环状RNA表达的试剂；
所述环状RNA为mm9_circ_008009和hsa_circ_0131202；
其中mm9_circ_008009的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示或反向互补序列；所述hsa_circ_0131202的核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示或反向互补序列。
进一步地，所述促环状RNA表达的试剂为构建体或重组宿主细胞。
本发明的优点在于：
本发明通过将糖尿病诱导循环相关环状RNA(DICAR，包括mm9_circ_008009和hsa_circ_0131202)应用于对缺血性卒中的治疗，研究表明了mm9_circ_008009和hsa_circ_0131202的过表达不仅可对可减轻脑缺血再灌注造成的急性损伤，还可改善小鼠脑缺血再灌注所致的长期神经功能损伤，并可促进脑缺血再灌后血管新生，此为糖尿病诱导循环相关环状RNA应用于对缺血性脑卒中及其脑血管疾病的预防和治疗提供了依据基础，并且为缺血性脑卒中及其脑血管疾病的预防和治疗提供了新的思路与方向。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2的DICAR在小鼠脑缺血再灌注损伤后体内表达的时间依赖性结果；
图2为本发明实施例2的DICAR过表达对鼠脑缺血再灌注急性损伤的作用；
其中图2A和图2D为小鼠解剖脑梗死照片；图2B和图2E为小鼠脑梗面积统计；图2C和图2F为神经功能损伤评分结果；
图3为本发明实施例2的DICAR过表达对脑缺血再灌注损伤后小鼠神经功能的影响作用，其中图3A为小鼠的逃逸潜伏期统计结果；图3B为小鼠跨平台次数的统计结果；图3C为小鼠移动至杆底的总时间统计结果；图3D为小鼠的游泳时间的时间统计结果；
图4为本发明实施例2的DICAR过表达促进脑缺血再灌后血管新生验证照片；其中图4A和图4C为切片200倍视野下的照片；图4B和图4D为血管数的统计结果；
图5为本发明实施例2的DICAR过表达时VEGFR-2表达结果；
图6为本发明实施例2的hCMEC/D3细胞缺氧缺糖损伤结果统计；
图7为本发明的实施例2的DICAR-JP对血管内皮生长因子影响结果；
图8为本发明实施例2的细胞转染hCMEC/D3后的毛细血管图片(图8A)和节点及其血管密度的统计结果(图8B和图8C)。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：一种用于预防和/或治疗缺血性卒中的药物，其包括有效量的促环状RNA表达的试剂，所述环状RNA为mm9_circ_008009和hsa_circ_0131202；
其中mm9_circ_008009的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示或反向互补序列；所述hsa_circ_0131202的核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示或反向互补序列。
需要说明的是，对于本文中所提及的核酸分子，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外，本申请中的核酸序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。
本发明中涉及到的核苷酸序列：
SEQ ID NO:1为：CAACCTCCGGGGCCACAATAGCGAGATTTGTAAGACTCCAGGGCCTCCCAG
SEQ ID NO:2为：CAACCTGCGAGGCCACAACAGTGAGAGTTGTAAGAGTCCATCCAGGACCTTC
本实施的药物的其中示范例，所述促环状RNA表达的试剂为构建体。
所述构建体的载体为非致病性病毒载体。所述非致病性病毒载体可为腺病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体。本实施例的构建体可采用常规方法制备，在此不进行赘述。
本实施例的药物中的促环状RNA表达的试剂还可采用重组宿主细胞，术语“重组宿主细胞”是指通过转化来实现的宿主细胞，包括导入环状RNA或重组表达载体后不同于亲本细胞的宿主细胞。所述宿主细胞包括原核细胞或真核细胞，或能够导入本发明的环状RNA或重组表达载体的细胞。
实施例2：
本实施例为了验证本发明的环状RNA对缺血性脑卒中及其脑血管疾病的治疗，进行如下实验。
采用CRISPR/CAS9基因编辑技术使DICAR在小鼠体内过表达，得到DICAR-Tg小鼠，然后用DICAR-Tg小鼠进行大脑中动脉栓塞手术，建立MCAO模型；
从上MCAO模型中选取10只小鼠，作为DICAR-Tg组；
再从上MCAO模型中选取20只小鼠，随机分为两个小组，进行缺血再灌注24h和7d两个时间点，分别为DICAR-Tg+IS1h/R24h、DICAR-Tg+IS1h/R7d；例如DICAR-Tg+IS1h/R24h小鼠即为在动脉栓塞手术1h后，取掉拴线后，24h后取小鼠脑组织，继续进行实验，其他组的再灌注操作同上。
从野生型小鼠中，选取10只，不进行任何处理，作为sham组(空白对照组)；
从野生型小鼠中，分别选取20只，随机分为两组小鼠，分别进行大脑中动脉栓塞手术后，进行再灌注24h和7d两个时间段，分别为IS1h/R24h组、IS1h/R7d组；
上1h/R24h为脑缺血1小时，再灌注24h。
(1)为了观察DICAR在脑I/R(脑缺血再灌注)损伤中的表达对时间的依赖性
本实验对野生型小鼠进行大脑中动脉栓塞手术后，进行生理盐水再灌注，采用RT-qPCR对不同再灌注时间小鼠体内的DICAR表达量进行检测；取野生型小鼠不进行处理，作为对照组。检测结果见图1。结果表明与对照组相比，再灌注时间48h时，DICAR表达量最高，再灌注时间为6h时其表达量最低，后随着时间的增长DICAR的表达量也逐渐上调，具有时间依赖性。
(2)为了在动物水平确定DICAR在脑I/R损伤中的作用，下实验取了两个不同的再灌注时间点分别为IS 1h/R24h和IS 1h/R 7d通过TTC染色评价脑组织损伤部位大小。结果显示，与sham组小鼠相比，IS组小鼠出现明显脑梗死，提示脑缺血再灌注损伤模型(IS组)构建成功。DICAR-Tg+IS的构建同上。
对不同分组的脑梗面积及其神经功能损伤评分进行评价，见图2。从图中可看出，DICAR-Tg+IS 1h/R24h和DICAR-Tg+IS 1h/R7d组分别同IS 1h/R24h和IS 1h/R24h组相比，其梗死面积显著减少，说明DICAR过表达可以减轻脑IS/R导致的脑神经元损伤。
采用Longa以及Bederson两种评分法对小鼠IS 1h/R 24h进行神经功能损伤评分。行为学评分结果显示，与sham组相比，IS/R小鼠出现不同程度神经损伤症状，损伤评分显著升高，而DICAR-Tg+IS/R组损伤评分较对照组相比显著降低。具有统计学意义。以上结果表明DICAR过表达可减轻脑脑缺血再灌注造成的急性损伤。
(3)为了进一步验证DICAR过表达对脑缺血再灌注损伤后小鼠神经功能的长期影响，本实验在脑缺血再灌注后第17天至第22天，通过Morris水迷宫隐蔽平台实验来评价小鼠的记忆功能，使用爬杆实验以及游泳速度评价小鼠的运动功能，使用探索实验穿台次数评价小鼠的空间参考记忆功能，结果见图3。结果表明各组小鼠的逃避潜伏期随训练经验耗时缩短。IS 1h/R 22d组小鼠在第22天的逃逸潜伏期与sham组相比，显著延长(P<0.01，图3A)。而与IS 1h/R 22d组相比，DICAR-Tg+IS 1h/R 22d组小鼠逃逸潜伏期缩短(P<0.05)，这提示小鼠记忆障碍得到部分缓解。爬杆实验结果显示IS 1h/R 22d组小鼠移动到杆底的总时间显著长于sham(P<0.001，图3C)，提示DICAR-Tg+IS 1h/R 22d与IS1h/R 22d组相比，移动到杆底的总时间明显缩短(P<0.05)。与IS 1h/R 22d组相比，DICAR-Tg+IS 1h/R 22d组的小鼠穿台次数增加以及游泳花费的时间减少，提示小鼠的空间记忆功能和运动功能有所恢复(图3D)；以上结果表明DICAR过表达可使IS小鼠运动功能得到改善，可改善小鼠脑缺血再灌注所致的长期神经功能损伤。
(4)DICAR过表达促进脑缺血再灌后血管新生验证
上实验中已经证明了DICAR过表达可以显著减少脑梗死体积，以及明显改善脑缺血再灌注22天后的认知记忆和运动功能，改善IS/R小鼠急性以及长期神经功能损伤。
为了进一步探索DICAR过表达能否促进缺血性卒中后血管的新生，采用免疫组化进一步验证。将相同数量的WT(野生型)小鼠和DICAR-Tg小鼠模型采用栓塞大脑中动脉致脑缺血后再灌注24h和7d后检测CD31的表达，最后使用分析软件Image进行结果分析。CD31结果按Weidner报道的方法进行：每张切片均在200倍视野下选取3个血管数目最多的视野，计数血管数，计算其平均数(MVD)，比较各组组织中的表达差异。结果如图4所示：IS1 h/R 24h组和IS 1h/R 7d组的血管密度较正常对照组明显减少，而DICAR-Tg+IS1h/R24h组和DICAR-Tg+IS1h/R7d组血管密度较IS 1h/R 24h组和IS 1h/R 7d组血管密度明显增多。
(5)DICAR过表达时的VEGFR-2表达
在形态学中已经证实DICAR过表达促进脑缺血再灌后血管新生，为了对这一结果进一步验证，使用Western blotting检测再灌注24h和再灌注7d VEGFR-2(血管内皮生长因子)蛋白的表达，结果见图5。结果表明与IS 1h/R 24h组和IS 1h/R 7d相比，DICAR-Tg+IS1h/R 24h组和DICAR-Tg+IS 1h/R 7d VEGFR-2蛋白表达水平明显较高，以上结果再一次验证了DICAR过表达可以促进脑缺血再灌后血管的新生.
(6)为了探讨DICAR对hCMEC/D3细胞的促血管新生作用机制，本实验建立OGD/R模型：从细胞培养箱中将细胞取出，吸弃去原有的细胞培养基，使用1×无菌的PBS仔细洗两遍后，每孔加入DMEM无糖无血清的培养基2ml，放到气体含量为95％N2-5％CO2混合气体的密封的透明盒子中。流速设置成1L/min，通气10min后，关闭混合气体罐，将缺氧盒进气管和出气管夹闭，缺氧2、4、6h后，换回正常的内皮细胞培养液，恢复氧气2h，筛选细胞损伤模型条件。丢弃去无糖无血清的培养液用1×PBS仔细小心清洗后，更换为正常的完全培养基，放回培养箱继续培养。收集复氧复糖0h、6h、12h、24h、48h的细胞样本用于后续RNA和蛋白的提取，进而完成qPCR、tube formation、划痕以及western blot实验。对照组除OGD/R处理步骤外，其余操作需要和模型组保持相同。
诱导hCMEC/D3细胞缺氧缺糖损伤，观察OGD2h/R2h、OGD4h/R2h、OGD6h/R2h对hCMEC/D3细胞损伤程度，结果见图6，与对照组比较，OGD2h/R2h、OGD4h/R2h、OGD6h/R2h细胞明显损伤(P＜0.01)；与OGD2h/R2h比较，OGD4h/R2h和OGD6h/R2h细胞明显损伤(P＜0.01)(见图6A)。通过对OGD损伤时间条件的摸索发现在缺氧4h后，再延长缺氧时间，细胞的损伤并不显著升高，故主要选择4h作为后续实验的缺氧时间。对DICAR在体外表达的时间依赖性进行检测,细胞水平检测(图6B)获得与动物水平相似趋势，在OGD4h/R 6h表达量最低，显著低于Ctrl组(p<0.05)，随再灌注时间延长，表达量逐渐上升，在OGD4h/R 24h表达量最高，与Ctrl组有统计学差异(p<0.01)。
(7)为了在体外实验进一步探索DICAR-JP在IS后对血管内皮生长因子的影响，本实验人工合成了人DICAR-JP(h DICAR-JP)按照不同的浓度分别转染到hCMEC/D3细胞中，结果见图7。结果显示(图7A)，在DICAR-JP(20nM)时，促VEGFR-2表达效果最好，将20nM的DICAR-JP用于后续实验。
(8)为了进一步检测血管新生的能力，在细胞转染hCMEC/D3 12h后进行OGD处理，将细胞接种到预涂有生长因子还原(GFR)基质的24孔板上。培养6小时后，在显微镜下5个区域随机拍摄毛细血管样结构，并使用ImageJ软件进行测量，结果见图8，结果显示经过hDICAR处理的分组血管密度以及节点对比OGD4h/R24h组较多，因此再一次证明，DICAR过表达可促进IS后血管的新生。
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，实施例中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.环状RNA在制备用于预防和/或治疗缺血性卒中药物中的应用，其特征在于，
所述环状RNA为mm9_circ_008009和hsa_circ_0131202；
其中mm9_circ_008009的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示或反向互补序列；所述hsa_circ_0131202的核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示或反向互补序列。
2.根据权利要求1所述的环状RNA在制备用于预防和/或治疗缺血性卒中药物中的应用，其特征在于，所述环状RNA可通过mm9_circ_008009和hsa_circ_0131202过表达促进血管新生实现缺血性卒中预防和/或治疗。
3.一种用于预防和/或治疗缺血性卒中的药物，其特征在于，其包括有效量的促环状RNA表达的试剂，所述环状RNA为mm9_circ_008009和hsa_circ_0131202；
其中mm9_circ_008009的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示或反向互补序列；所述hsa_circ_0131202的核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示或反向互补序列。
4.根据权利要求3所述的一种用于预防和/或治疗缺血性卒中的药物，其特征在于，所述促环状RNA表达的试剂为构建体或重组宿主细胞。
5.根据权利要求4所述的一种用于预防和/或治疗缺血性卒中的药物，其特征在于，所述构建体或重组宿主细胞含有所述环状RNA。
6.根据权利要求4所述的一种用于预防和/或治疗缺血性卒中的药物，其特征在于，所述构建体的载体为非致病性病毒载体。
7.根据权利要求6所述的一种用于预防和/或治疗缺血性卒中的药物，其特征在于，所述非致病性病毒载体为腺病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体。
8.环状RNA在制备用于预防和/或治疗脑血管疾病药物中的应用，其特征在于，
所述环状RNA为mm9_circ_008009和hsa_circ_0131202；
其中mm9_circ_008009的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示或反向互补序列；所述hsa_circ_0131202的核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示或反向互补序列。
9.一种用于预防和/或治疗脑血管疾病的药物，其特征在于，其包括有效量的促环状RNA表达的试剂；
所述环状RNA为mm9_circ_008009和hsa_circ_0131202；
其中mm9_circ_008009的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示或反向互补序列；所述hsa_circ_0131202的核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示或反向互补序列。
10.根据权利要求9所述的一种用于预防和/或治疗脑血管疾病的药物，其特征在于，所述促环状RNA表达的试剂为构建体或重组宿主细胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310549766.4A CN116785309A (zh) | 2023-05-16 | 2023-05-16 | 环状rna在制备用于预防和/或治疗缺血性卒中药物中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310549766.4A CN116785309A (zh) | 2023-05-16 | 2023-05-16 | 环状rna在制备用于预防和/或治疗缺血性卒中药物中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116785309A true CN116785309A (zh) | 2023-09-22 |
Family
ID=88047243
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310549766.4A Pending CN116785309A (zh) | 2023-05-16 | 2023-05-16 | 环状rna在制备用于预防和/或治疗缺血性卒中药物中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116785309A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117701563A (zh) * | 2023-11-23 | 2024-03-15 | 西南医科大学 | 一种小分子rna候选药物序列优化及其在糖尿病心肌病治疗中的应用 |
-
2023
- 2023-05-16 CN CN202310549766.4A patent/CN116785309A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117701563A (zh) * | 2023-11-23 | 2024-03-15 | 西南医科大学 | 一种小分子rna候选药物序列优化及其在糖尿病心肌病治疗中的应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Banin et al. | Molecular anthropology meets genetic medicine to treat blindness in the North African Jewish population: human gene therapy initiated in Israel | |
| Lutty et al. | Proceedings of the Third International Symposium on Retinopathy of Prematurity: an update on ROP from the lab to the nursery (November 2003, Anaheim, California) | |
| CN107921085A (zh) | 用于治疗衰老相关病症的方法和组合物 | |
| CN116785309A (zh) | 环状rna在制备用于预防和/或治疗缺血性卒中药物中的应用 | |
| CN105194651B (zh) | Creg蛋白用于保护心肌缺血再灌注损伤的医药用途 | |
| US11957705B2 (en) | Compositions for use in the treatment and prevention of cardiovascular disorders resulting from cerebrovascular injury | |
| JP5208135B2 (ja) | 組換え白血球阻害因子とヒルゲンのキメラタンパク質及びその薬物組成物 | |
| US20060031946A1 (en) | Gene therapy with chimeric oligonucleotides delivered by a method comprising a step of iontophoresis | |
| Binder et al. | Leptomeningeal collaterals regulate reperfusion in ischemic stroke and rescue the brain from futile recanalization | |
| CN110295227A (zh) | 基于hsa-miR-320a的糖尿病早期预警和/或诊断试剂盒的制备方法 | |
| CA2514971A1 (en) | Regeneration and neogenesis of retinal photoreceptor cell using otx2 gene | |
| CN110327363A (zh) | 基于hsa-miR-320a的防治糖尿病的药物及其筛选方法和制备方法 | |
| JP2016508036A5 (zh) | ||
| UA80396C2 (en) | Use of il-18 inhibitors for treating or traumatic head injury | |
| CN105050616A (zh) | 包含缺氧诱导因子-1α的组合物及其使用方法 | |
| CN110404053B (zh) | 短肽mpm在制备用于治疗肌肉细胞分化相关疾病的药物中的应用 | |
| CN1320929C (zh) | 脑血管疾病基因治疗剂 | |
| CN104288764B (zh) | Cd146作为预防和/或治疗缺血性眼部疾病的药物靶点的应用 | |
| RU2805082C2 (ru) | Способ стимулирования ангиогенеза, лечения нейродегенеративных заболеваний и регенерации скелетной мышцы с помощью плазмидных конструкций с генами ангиогенных и нейротрофических факторов | |
| CN104004066B (zh) | 预防或抑制炎症反应和血管新生的小分子多肽及其应用 | |
| US20220088139A1 (en) | Nerve growth factor mutant | |
| WO2024088156A1 (zh) | 重组人奥克纤溶酶在制备治疗脉络膜血管疾病药物中的用途 | |
| Nagayoshi et al. | PS-BPB06-7: NOVEL MOLECULAR MECHANISMS OF CARDIO-RENAL INTERACTION MEDIATED BY INCREASED SERUM MODIFIED NUCLEOSIDES ASSOCIATED WITH RENAL FAILURE | |
| Vissing et al. | O. 14B3GNT4 deficiency: a new α-dystroglycanopathy causing late-onset progressive brain atrophy and muscular dystrophy | |
| CN117660623A (zh) | DsbA-L作为延缓衰老和延长寿命的靶点及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |