CN111304152A - 一种运用飞秒激光改善类器官体外3d培养微环境的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种运用飞秒激光改善类器官体外3D培养微环境的方法，包括如下步骤，S1：将动物源性类器官于载有基质胶的培养皿内培养3‑5天；S2：将S1培养皿固定于三维精密工作台上，并使飞秒激光的光束经过衰减片、偏振片及透镜，将焦点聚焦于基质胶内；通过控制三维精密工作台运动使飞秒激光束焦点在基质胶内部扫描构建三维多孔道结构；其中，透镜为20X或40X空气显微镜头；飞秒激光的光束不接触动物源性类器官。本发明运用飞秒激光改善类器官体外3D培养微环境的方法，在基质胶内部、类器官周围建立三维多孔道结构，改善类器官生长的微环境，通过三维多孔道网络模拟毛细血管，促进营养物质交换过程，有助于类器官的体外生长。
Description
技术领域
本发明涉及体外3D培养技术领域，尤其涉及一种运用飞秒激光改善类器官体外3D培养微环境的方法。
背景技术
类器官是由干细胞分化而来的细胞构成的三维组织器官类似物，该技术可在体外模拟体内3D生长环境，与传统二维培养系统相比，能够更加真实反映器官功能及体内的信号传导，并且与原发肿瘤灶基因突变类型高度一致。因此，类器官为研究疾病发生发展的病理机制及体外药物筛选提供了平台和依据。
2009年，荷兰Hubrecht研究所Hans Clevers实验室报道了体外培养小鼠肠道类器官的方法，开辟了体外3D细胞培养的技术(Sato T，Vries RG，Snippert HJ，et al，Nature，459，262-265，2009)。3D培养技术以胶原水凝胶为细胞外基质支架，使细胞能够在载体的三维立体空间中迁移、生长，能最大程度的模拟体内环境，又能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势。类器官周围基质胶的环境对类器官的生长有着直接的影响，然而目前尚无文献或者专利报道直接在类器官基质胶内部构造三维微流道模拟体内血管滋养的方法。对体外3D细胞培养中基质胶的改造，成为本领域技术人员研究的热点。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术问题，提供一种运用飞秒激光改善类器官体外3D培养微环境的方法，在基质胶中建立三维多孔道结构，改善类器官生长的微环境，促进营养物质交换过程，有助于类器官的体外生长。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
提供一种运用飞秒激光改善类器官体外3D培养微环境的方法，包括如下步骤：
S1：将动物源性类器官于载有基质胶的培养皿内培养3-5天；
S2：将S1所述培养皿固定于三维精密工作台上，并使飞秒激光的光束经过衰减片、偏振片及透镜，将焦点聚焦于所述基质胶内；通过控制三维精密工作台运动使飞秒激光束焦点在基质胶内部扫描构建三维多孔道结构；
其中，所述透镜为20X或40X空气显微镜头；所述飞秒激光的每个脉冲的功率为1-10nJ；
所述飞秒激光的光束不接触所述动物源性类器官。
进一步地，所述三维多孔道结构位于所述基质胶内部、所述动物源性类器官周围。
进一步地，所述飞秒激光光源的波长为800nm，重复频率为1KHz或80MHz，扫描速率为5-50um/s。
进一步地，所述基质胶为Matrigel。
进一步地，S2中，所述飞秒激光焦点作用于基质胶内部，基质胶组分在飞秒激光作用下直接通过气化和微爆作用形成空腔，并通过所述飞秒激光焦点的位置形成三维多孔道结构。
进一步地，所述三维精密工作台为精密三维机械可编程控制移动平台。
进一步地，所述飞秒激光是钛宝石或光纤飞秒激光器，提供飞秒脉冲激光。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术优点：
本发明运用飞秒激光改善类器官体外3D培养微环境的方法，在基质胶内部、类器官周围建立三维多孔道结构，改善类器官生长的微环境，通过三维多孔道网络模拟毛细血管，促进营养物质交换过程，有助于类器官的体外生长。
附图说明
图1是本发明实施例1中的动物源性类器及其周围基质胶的显微照片；
图2是本发明实施例2中的动物源性类器及其周围基质胶的显微照片。
具体实施方式
本发明提供一种运用飞秒激光改善类器官体外3D培养微环境的方法，包括如下步骤：
S1：将动物源性类器官于载有基质胶的培养皿内培养3-5天；
S2：将培养皿固定于三维精密工作台上，并使飞秒激光的光束经过衰减片、偏振片及透镜，将焦点聚焦于基质胶内；通过控制三维精密工作台运动使飞秒激光束焦点在基质胶内部扫描构建三维多孔道结构；飞秒激光焦点作用于基质胶内部，基质胶组分在飞秒激光作用下直接通过气化和微爆作用形成空腔，并通过所述飞秒激光焦点的位置形成三维多孔道结构；
其中，透镜为20X或40X空气显微镜头；飞秒激光的每个脉冲的功率为1-10nJ；飞秒激光的光束不接触所述类器官，三维多孔道结构位于所述基质胶内部，所述动物源性类器官周围。
本发明的方法，在基质胶内部、类器官周围建立三维多孔道结构，改善类器官生长的微环境，通过三维多孔道网络模拟毛细血管，促进营养物质交换过程，有助于类器官的体外生长。值得一说的是，随着动物源性类器官的生长，三维多孔道结构中的孔道可与类器官连通，更加能够促进营养物质的交换。
在本发明的一种实施方式中，飞秒激光光源的波长为800nm，重复频率为1KHz或80MHz，扫描速率为5-50um/s；飞秒激光是钛宝石或光纤飞秒激光器，提供飞秒脉冲激光，其脉宽在10-15s量级；三维精密工作台为精密三维机械可编程控制移动平台。
在本发明的一种实施方式中，基质胶为Matrigel。
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例1
动物源性类器官体外3D培养微环境的改善，包括如下步骤：
S1：将动物源性类器官于载有Matrigel基质胶的培养皿内培养3-5天；
S2：将培养皿固定于精密三维机械步进式移动PCI平台上，并使飞秒激光的光束经过衰减片、偏振片及透镜，将焦点聚焦于基质胶内；通过控制PCI平台运动使飞秒激光束焦点在基质胶内部构建三维多孔道结构；
构建过程中飞秒激光的光束不接触动物源性类器官，使三维多孔道结构位于基质胶内部、动物源性类器官周围。
其中，飞秒激光光源的波长为800nm，重复频率为1KHz，扫描速率为5-50um/s；透镜为20X空气显微镜头。
飞秒激光是钛宝石放大器提供的飞秒脉冲激光；飞秒激光的每个脉冲的功率为1-10nJ。
图1所示，本实施例中所构建的三维多孔道结构，每条孔道相互平行。
实施例2
动物源性类器官体外3D培养微环境的改善，包括如下步骤：
S1：将动物源性类器官于载有Matrigel基质胶的培养皿内培养3-5天；
S2：将培养皿固定于精密三维机械步进式移动PCI平台上，并使飞秒激光的光束经过衰减片、偏振片及透镜，将焦点聚焦于基质胶内；通过控制PCI平台运动使飞秒激光束焦点在基质胶内部构建三维多孔道结构；
构建过程中飞秒激光的光束不接触动物源性类器官，使三维多孔道结构位于基质胶内部、动物源性类器官周围。
其中，飞秒激光光源的波长为800nm，重复频率为80MHz，扫描速率为5-50um/s；透镜为40X空气显微镜头。
飞秒激光是通过镜色控制钛宝石振荡器提供的飞秒种子脉冲激光；飞秒激光的每个脉冲的功率为1-10nJ。
图2所示，本实施例中所构建的三维多孔道结构，每条相互交叉环绕于动物源性类器官周围。
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.一种运用飞秒激光改善类器官体外3D培养微环境的方法，在基质胶内构建三维多孔道结构，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将动物源性类器官于载有基质胶的培养皿内培养3-5天；
S2：将S1所述培养皿固定于三维精密工作台上，并使飞秒激光的光束经过衰减片、偏振片及透镜，将焦点聚焦于所述基质胶内；通过控制三维精密工作台运动使飞秒激光束焦点在基质胶内部扫描构建三维多孔道结构；
其中，所述透镜为20X或40X空气显微镜头；所述飞秒激光的每个脉冲的功率为1-10nJ；
所述飞秒激光的光束不接触所述动物源性类器官。
2.根据权利要求1所述的运用飞秒激光改善类器官体外3D培养微环境的方法，其特征在于，所述三维多孔道结构位于所述基质胶内部、所述动物源性类器官周围。
3.根据权利要求1所述的运用飞秒激光改善类器官体外3D培养微环境的方法，其特征在于，所述飞秒激光光源的波长为800nm，重复频率为1KHz或80MHz，扫描速率为5-50um/s。
4.根据权利要求1所述的运用飞秒激光改善类器官体外3D培养微环境的方法，其特征在于，所述基质胶为Matrigel。
5.根据权利要求1所述的运用飞秒激光改善类器官体外3D培养微环境的方法，其特征在于，S2中，所述飞秒激光焦点作用于基质胶内部，基质胶组分在飞秒激光作用下直接通过气化和微爆作用形成空腔，并通过所述飞秒激光焦点的位置形成三维多孔道结构。
6.根据权利要求1所述的运用飞秒激光改善类器官体外3D培养微环境的方法，其特征在于，所述三维精密工作台为精密三维机械可编程控制移动平台。
7.根据权利要求1所述的运用飞秒激光改善类器官体外3D培养微环境的方法，其特征在于，所述飞秒激光是钛宝石或光纤飞秒激光器，提供飞秒脉冲激光。
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