CN108795872A - 体外肿瘤细胞3d集体侵袭模型及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种肿瘤3D集体侵袭模型及其构建方法,制备肿瘤多细胞类器官团,细胞中含有光转换荧光蛋白,将其包被于I型鼠尾胶中进行3D培养,体外模拟肿瘤细胞的生长状态、增殖方式和侵袭方式,该模型研究的是肿瘤多细胞球体类器官的集体侵袭作用,更能模拟肿瘤细胞在体内集体侵袭方式,采用激光共聚焦显微镜进行光漂白后,可以在缺乏特异性生物学标记物的情况下对集体侵袭细胞中的Leader Cells与Follower Cells进行区分,并可通过荧光流式分选获得目的区域的肿瘤细胞进行后续实验研究。
Description
技术领域
本发明涉及医药生物学领域,具体涉及一种体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型及其构建方法。
背景技术
传统的观察体外肿瘤细胞3D模型研究,一种是将单个肿瘤细胞包被入matrigelmatrix胶或者I型鼠尾胶原中进行培养及观察;另一种是将新鲜肿瘤组织标本剪碎处理后,把肿瘤组织小块包被入I型鼠尾胶原中进行培养及观察。
传统的单个肿瘤细胞体外3D生长模型能直观观察肿瘤细胞在胶内的生长增殖变化等,但无法观察细胞侵袭情况,难以模拟肿瘤细胞在体内集体侵袭方式;包被I型鼠尾胶原中的新鲜肿瘤组织块是多细胞组织块,虽可观察细胞侵袭生长,但组织块中除肿瘤细胞外还混有多种细胞成分(如血管内皮细胞、成纤维细胞、肌细胞等),发生侵袭的细胞不能直接判定是否为肿瘤细胞,且难以获得目的区域的肿瘤细胞,尤其是在缺乏特异性生物学标记的情况下,难以对集体侵袭细胞中的Leader Cells和Follower Cells进行区分,不利于对于肿瘤侵袭的后续深入研究。
发明内容
基于此,针对上述问题,本发明的其中一个目的在于提供一种构建体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型,该模型能够模拟肿瘤细胞集体侵袭过程、且易分离得到目的区域肿瘤细胞进行后续研究。
为实现上述目的,本发明提供了如下技术方案:
一种体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型的构建方法,包括以下步骤:
(1)培养得到肿瘤多细胞球体;所述肿瘤多细胞球体中的肿瘤细胞可表达光转换荧光蛋白;
(2)向激光共聚焦培养皿中加入所述肿瘤多细胞球体与I型鼠尾胶原的混合液;待凝固后,加入培养基、继续培养;
(3)所述肿瘤多细胞球体在I型鼠尾胶原内伸展侵袭生长,至出现明显的集体侵袭细胞群时,使用激光共聚焦显微镜对所需特定区域的肿瘤细胞进行漂白光转化,使肿瘤细胞中的光转换荧光蛋白由绿色荧光转换为红色荧光;
(4)加入胶原酶消化、离心、重悬,制得细胞悬液;
(5)流式细胞仪分选以获得所需特定区域的肿瘤细胞。
在其中一些实施例中,所述培养得到肿瘤多细胞球体,其步骤包括:
向肿瘤细胞中转染入可表达光转换荧光蛋白的质粒,利用超高速流式细胞分选系统分选出可进行光转换荧光肿瘤细胞;
采用悬滴培养法或微孔板培养法,将所述光转换荧光肿瘤细胞培养成肿瘤多细胞球体。
在其中一些实施例中,所述利用超高速流式细胞分选系统分选:分选至少两次,每次间隔大于7天。
在其中一些实施例中,所述微孔板培养法为:计数5000-10000个肿瘤细胞重悬液,将其加入96孔黑色圆底超低吸附球体培养微孔板。
在其中一些实施例中,所述步骤(2)为,先在激光共聚焦培养皿中均匀铺设一层I型鼠尾胶原,再向激光共聚焦培养皿中加入所述肿瘤多细胞球体与I型鼠尾胶原的混合液。
在其中一些实施例中,步骤(2)中所述待凝固为于(5±0.2)%的CO2、(37±0.5)℃条件下放置25~35min;和/或
所述的培养基为含有8%-12%胎牛血清的培养基;和/或
所述培养为:于(5±0.2)%的CO2、(37±0.5)℃条件下培养。
在其中一些实施例中,步骤(3)所述肿瘤多细胞球体在I型鼠尾胶原内伸展侵袭生长过程中,还包括利用激光共聚焦显微镜的时间序列拍摄方法,记录所述肿瘤多细胞球在I型鼠尾胶原内不同时间点伸展侵袭生长的形态。
在其中一些实施例中,步骤(3)所述激光漂白荧光蛋白光转化为:
选定所需转化的细胞,利用倒置激光共聚焦显微镜划定需要转化的范围;
使用波长为360~420nm或者460~500nm的激光进行荧光的连续激光漂白,至荧光蛋白的荧光颜色转变。
在其中一些实施例中,步骤(4)为所述制得细胞悬液为,加入胶原酶消化I型鼠尾胶原,于36.5~37.5℃,消化5~7min,800~1200rpm离心4~7min收集肿瘤细胞,以含2%胎牛血清的PBS重悬细胞。
本发明的另一个目的还在于提供一种体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型。
基于上述目的,具体技术方案如下:
一种体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型,由如上所述的体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型的构建方法构建得到。
基于上述技术方案,本发明具有以下有益效果:
本发明经过发明人创造性劳动,通过制备得到肿瘤多细胞球并特定配合I型鼠尾胶,构建肿瘤多细胞类器官团,将其包被于I型鼠尾胶中进行3D培养,体外模拟肿瘤细胞的生长状态、侵袭方式,且该模型可于倒置激光共聚焦显微镜下观察到肿瘤多细胞球的侵袭生长状态,并能够识别肿瘤细胞集体侵袭过程中的Leader Cells与Follower Cells;而肿瘤细胞内转入可进行荧光转化的质粒,用倒置激光共聚焦显微镜激光漂白功能作用下对特定区域的肿瘤细胞进行荧光光转化,由原来的绿色荧光转变为红色荧光,利用流式细胞仪分选系统,对不同荧光的细胞进行分选,在无需特异性生物学标记物的情况下,即可对集体侵袭中的Leader Cells与Follower Cells进行区分,得到所需要的特定区域的肿瘤细胞,进行后续的进一步实验研究。
而且,本发明向肿瘤细胞中转染入可表达光转换荧光蛋白的质粒后,还利用流式细胞分选系统对转入可表达光转换荧光蛋白的质粒的肿瘤细胞进行分选至少两次,每次间隔一段时间,以保证肿瘤细胞表达光转换荧光蛋白的持久性及纯度。优选96孔黑色圆底超低吸附球体培养微孔板是因其具有细胞球中含有的数量的可控性,对于肿瘤研究中的量化指标有利。
另外,在激光共聚焦培养皿中先均匀铺设一层I型鼠尾胶原,再加入肿瘤多细胞球和I型鼠尾胶原的混合液,可使得肿瘤细胞球体与激光共聚焦培养皿玻璃底之间存在一定的I型鼠尾胶原形成的距离,确保肿瘤细胞球体不会贴壁生长,以保证侵袭模型模拟体内侵袭的相似程度。同时,向激光共聚焦培养皿中加入肿瘤细胞球体与I型鼠尾胶原的悬液后,放入5%CO2、37℃细胞培养箱中迅速使I型鼠尾胶原完全凝固。该培养模式目的为确保肿瘤细胞球体能完全悬浮于I型胶原当中,使肿瘤细胞完全处于3D的I型鼠尾胶原环境中伸展侵袭。
流式分选时重悬制得细胞悬液中,采用含有1.8~2.2%胎牛血清的PBS进行重悬的目的是为了提高细胞耐受性及活性,尽量减少细胞损伤影响细胞活性,从而影响模型与体内状态的相似性。
相比于传统的肿瘤研究模型,本发明研究肿瘤集体侵袭模型具有以下优势:
第一,该模型研究的是肿瘤多细胞球体类器官的集体侵袭作用,更能模拟肿瘤细胞在体内集体侵袭方式;
第二,该模型可以更直观的动态观察并记录肿瘤细胞集体侵袭的过程,使定向侵袭可视化;
第三,该模型可以在缺乏特异性生物学标记物的情况下对集体侵袭细胞中的Leader Cells与Follower Cells进行区分,并可通过荧光流式分选获得目的区域的肿瘤细胞进行后续实验研究。
附图说明
图1为结直肠癌细胞SW620转染光转化质粒流式分选后效率图;
图2为转染光转化质粒带绿色荧光的结直肠癌细胞SW620在96孔黑色圆底超低吸附球体培养微孔板内形成的紧密多细胞球体类器官;
图3为96孔黑色圆底超低吸附球体培养微孔板(Corning)结构示意图;
图4为在96孔黑色圆底超低吸附球体培养微孔板内形成的紧密多细胞球体的示意图;
图5和图6为其中一实施中通过体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型作用的激光共聚焦培养皿的结构示意图;
图7为结直肠癌肿瘤细胞HT29及SW620培养成肿瘤多细胞紧密球体后,不同时间段生长侵袭的激光共聚焦显微镜观察结果图;
图8为转染光转化质粒带绿色荧光的结直肠癌细胞SW620,转入激光共聚焦培养皿进行3D培养后应用蔡司倒置激光共聚焦显微镜激光漂白集体侵袭leader cells由绿色荧光转化为红色荧光的结果图;
图9为以Matrigel matrix胶构建肿瘤侵袭模型时肿瘤细胞生长情况观察结果;
图10为以Matrigel matrix胶与I型鼠尾胶原的混合胶构建肿瘤侵袭模型时肿瘤细胞生长情况观察结果。
具体实施方式
本发明提供了一种体外肿瘤细胞3D模型及其构建方法。为了能够更清楚地理解本发明的技术内容,特举以下实施例详细说明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂,均为市售产品。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1肿瘤多细胞球体的制备
取生长状况良好、贴壁生长的结直肠癌细胞用PBS漂洗后,经胰酶消化,Gibco胎牛血清与Hyclone1640培养基混合制成的含10%胎牛血清的培养基重悬,铺入6孔板。铺板时,细胞密度约覆盖孔板底部的50-60%左右。其中,分别选用SW620和HT29两个细胞系制备相应的两种肿瘤多细胞球体,以便于后续对照观察不同细胞系的不同侵袭能力及状态。
待细胞贴壁生长状态良好后,利用脂质体转染方法进行光转化质粒转染,将pDendra2-C Vector质粒转入细胞中,所述pDendra2-C Vector质粒带有绿色荧光;24小时后观察细胞荧光情况,SW620细胞系进行光转化质粒转染后,表达光转换荧光蛋白,荧光显微镜观察如图1所示。后期进行至少两次高速流式细胞分选,每两次分选间隔时,继续培养转入光转化质粒的细胞,其中,两次分选时间间隔时间为7天以上,可进行2~4次分选,以确保光转化质粒的在细胞中表达的稳定性及荧光细胞的纯度。
将转染光转化质粒带绿色荧光的结直肠癌细胞用PBS漂洗后,胰酶消化,Gibco胎牛血清与Hyclone1640培养基混合制成的含10%胎牛血清的培养基重悬,计数5000-10000个肿瘤细胞重悬液加入黑色圆底超低吸附96微孔细胞球体培养板(Corning),转入5%CO2、37℃细胞培养箱中进行培养,将肿瘤细胞培养成紧密的多细胞球体,SW620细胞系制备得到的多细胞球体如图2所示。
其中,如图3所示,培养板为96孔黑色圆底超低吸附球体培养微孔板,具有特殊处理的不粘附涂层。肿瘤细胞悬液加入培养板孔内,细胞不会贴壁生长,随着培养时间的延长,细胞慢慢聚集成紧密的多细胞球体,其示意图如图4。
实施例2
本实施例提供了一种体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型的构建方法,使用激光共聚焦培养皿作为体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型的研究装置。
为了保证肿瘤多细胞球体的生长侵袭完全在3D胶内而不是沿着激光共聚焦培养皿的玻璃底面进行,需要向激光共聚焦皿中间B区加入少量配制完成的I型鼠尾胶原,且保证肿瘤细胞球体与激光共聚焦培养皿玻璃底之间的距离平均大于100μm。
其中,I型鼠尾胶原的商品信息为:I型胶原,鼠尾。
I型鼠尾胶原的配制步骤如下,所有配胶操作步骤及试剂(I型鼠尾胶原、10×PBS、dH2O、1N NaOH)均应置于冰上进行:1N为克当量浓度,代表:1mol/L。
a.计算需要胶的终体积;
b.10×PBS体积(ml)=终体积/10;
c.I型鼠尾胶原体积(ml)=终体积×胶的终浓度(mg/ml)/胶的原浓度(mg/ml);
d.1N NaOH体积(ml)=I型鼠尾胶原体积(ml)×0.023;
e.dH2O体积(ml)=终体积-10×PBS体积-I型鼠尾胶原体积-1N NaOH体积;
f.以上所有试剂于冰上混匀;
g.测定配制完成的胶pH值必须大于等于7。
如图5-6所示为激光共聚焦实验专用培养皿示意图,向激光共聚焦培养皿B区加入如实施例1中制备得到的肿瘤多细胞球体与配制完成的I型胶原混合悬液,立即放入5%CO2、37℃细胞培养箱中迅速使I型鼠尾胶原凝固,半小时后向上述激光共聚焦皿内加入Gibco胎牛血清与Hyclone1640培养基混合制成的含10%胎牛血清的培养基,放入5%CO2、37℃细胞培养箱继续培养。其中,肿瘤多细胞球体与I型胶原混合悬液中,一般一个共聚焦培养皿内置入5~6个肿瘤细胞球体。
待肿瘤多细胞球体在I型胶原内稳定,开始伸展生长后使用蔡司倒置激光共聚焦显微镜时间序列方法观察肿瘤多细胞球体生长变化特点,如图7所示,结直肠癌肿瘤细胞HT29及SW620培养成肿瘤多细胞紧密球体后,转入激光共聚焦培养皿进行3D培养后应用倒置激光共聚焦显微镜时间序列的方法,拍摄的肿瘤多细胞球体生长侵袭的图片,可见两株细胞在I型鼠尾胶原3D胶内不同的侵袭生长能力及不同时间节点的侵袭状态。
待肿瘤多细胞球体侵袭生长到一定程度,出现明显的集体侵袭细胞群后,利用倒置激光共聚焦显微镜激光漂白功能对相应区域肿瘤细胞进行激光漂白荧光蛋白的光转化,包括以下步骤:
一.选定所需转化的细胞,利用卡尔蔡司(Carl Zeiss)倒置激光共聚焦显微镜(LSM 880 with Airyscan)划定需要转化的范围;
二.使用波长为405nm的激光进行荧光的连续激光漂白,激光漂白次数及时间根据细胞自身所带荧光蛋白强度来确定,一般一个范围内中等强度的荧光约需10-15分钟的完成;
三.荧光蛋白的光转化发生在激光漂白的过程中,细胞出现所带原有荧光蛋白的荧光强度逐渐减弱,转化后的荧光蛋白的荧光强度逐渐增强,直至转化后的荧光蛋白强度超过转化前的荧光蛋白强度,则终止转化。
在其他一些实施例中,进行荧光的连续激光漂白的激光可以是UV紫光(360–420nm)或者蓝光(460–500nm),本实施例中卡尔蔡司(Carl Zeiss)倒置激光共聚焦显微镜(LSM 880 with Airyscan),使用波长为405nm的激光。
如图8所示,转染光转化质粒带绿色荧光的结直肠癌细胞SW620,转入激光共聚焦培养皿进行3D培养后应用蔡司倒置激光共聚焦显微镜激光漂白集体侵袭Leader cells由绿色荧光转化为红色荧光拍摄的图片,可见黄色实线框内细胞完成了绿色荧光向红色荧光的转化。利用胶原酶,于37℃,消化5-7min,1000rpm离心5min收集肿瘤细胞,以含2%胎牛血清的PBS重悬细胞,筛网过滤,根据细胞荧光不同利用超速流式细胞分选系统获得相应区域肿瘤细胞,即红色荧光的为Leader Cells。
同理,另一个激光共聚焦皿中3D培养的肿瘤多细胞球体选取Follower Cells所在区域细胞进行荧光转化,根据细胞荧光不同利用超速流式细胞分选系统获得相应区域肿瘤细胞,即红色荧光的为Follower Cells。
因此本发明所述的肿瘤3D侵袭模型的构建方法构建得到的模型,可根据需要选取不同的肿瘤细胞进行后续研究。
其中,利用实施例1所述的黑色圆底超低吸附96微孔细胞球体培养板(Corning)制备得到的肿瘤多细胞球体,由于每孔种入细胞数量可根据需要进行调整,数值可控,更利于可控制制备得到肿瘤多细胞球体的大小,以使得肿瘤多细胞球体大小更合适于进行侵袭研究;同时避免肿瘤多细胞球体过大,导致球体中心的细胞坏死。
实施例3
本实施例提供了一种体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型的构建方法,使用激光共聚焦培养皿作为体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型的研究装置。其方法与实施例2基本相同,主要区别在于,本实施例3中所使用的肿瘤多细胞球体由悬滴培养法制备得到。
悬滴培养法制备得到的肿瘤多细胞球体与图2相似,但由于悬滴法制备得到肿瘤细胞球中的细胞数量较不易控制,该体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型可用于定性分析,但较难实现量化分析。
对比例1
本对比例提供了一种体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型的构建方法,其与实施例2主要步骤相同,使用激光共聚焦培养皿作为体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型的研究装置,与实施例2的主要区别在于:对比例1中将I型鼠尾胶原替换为Matrigel matrix胶(购自Corning),3D侵袭模型构建方法如下:
步骤一.标准浓度的Matrigel matrix(~8-11mg/mL)使用前置于冰箱4℃过夜融化,使用预冷的无血清培养基或者PBS稀释使用,稀释过程需要在冰上进行,且所有使用的枪头及使用的EP管均应先进行预冷处理;
步骤二.使用激光共聚焦培养皿(15mm)作为体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型的研究装置,为了保证肿瘤细胞球体侵袭完全在3D环境而不是沿着激光共聚焦培养皿的玻璃底面进行,首先需要向激光共聚焦皿中间的培养槽内先加入少量Matrigel matrix,保证肿瘤细胞球体与激光共聚焦培养皿玻璃底之间的距离平均大于100μm;
步骤三:向激光共聚焦培养皿中加入肿瘤多细胞球体与Matrigel matrix的混合液,然后立即放入5%CO2、37℃细胞培养箱中迅速使Matrigel matrix凝固,半小时后向上述激光共聚焦皿内加入Gibco胎牛血清与hyclone1640培养基混合制成的含10%胎牛血清的培养基,放入5%CO2、37℃细胞培养箱继续培养。
步骤四:待肿瘤多细胞球体在Matrigel matrix内稳定并开始伸展侵袭生长后,使用倒置激光共聚焦显微镜时间序列方法观察肿瘤多细胞球体生长变化情况,结果如图9所示。
对比例1
本对比例提供了一种体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型的构建方法,其与实施例2主要步骤相同,使用激光共聚焦培养皿作为体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型的研究装置,与实施例2的主要区别在于:对比例1中将I型鼠尾胶原部分替换为Matrigel matrix胶(购自Corning),即采用Matrigel matrix与I型鼠尾胶原的混合胶原,3D侵袭模型构建方法如下::
步骤一.标准浓度的Matrigel matrix(~8-11mg/mL)使用前置于冰箱4℃过夜融化,使用预冷的无血清培养基或者PBS稀释使用,稀释过程需要在冰上进行,且所有使用的枪头及使用的EP管均应先进行预冷处理。I型鼠尾胶原按照前面所述配制。两种胶原均单独配制完成后,在冰上操作,按等体积混匀后备用;
步骤二.使用激光共聚焦培养皿(15mm)作为体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型的研究装置,为了保证肿瘤细胞球体侵袭完全在3D环境而不是沿着激光共聚焦培养皿的玻璃底面进行,首先需要向激光共聚焦皿中间的培养槽内先加入少量Matrigel matrix与I型鼠尾胶原的混合胶原,保证肿瘤细胞球体与激光共聚焦培养皿玻璃底之间的距离平均大于100μm;
步骤三:向激光共聚焦培养皿中加入肿瘤多细胞球体与Matrigel matrix与I型鼠尾胶原的混合胶原的混合液,然后立即放入5%CO2、37℃细胞培养箱中迅速使Matrigelmatrix与I型鼠尾胶原的混合胶原凝固,半小时后向上述激光共聚焦皿内加入Gibco胎牛血清与hyclone1640培养基混合制成的含10%胎牛血清的培养基,放入5%CO2、37℃细胞培养箱继续培养。
步骤四:待肿瘤多细胞球体在Matrigel matrix与I型鼠尾胶原的混合胶原内稳定并开始伸展侵袭生长后,使用倒置激光共聚焦显微镜时间序列方法观察肿瘤多细胞球体生长变化情况,如图10所示。
对比例1-2所述的两种胶原培养肿瘤多细胞球体实验结果如图9-10所示,可见,对比例1-2所述的胶原无法实现使用I型鼠尾胶原单独培养时,肿瘤多细胞球那样的侵袭生长状态,难以区分出Follower Cells和Leader Cells,无法实现根据需要选取不同的肿瘤细胞进行后续研究的效果。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对以下实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)培养得到肿瘤多细胞球体;所述肿瘤多细胞球体中的肿瘤细胞可表达光转换荧光蛋白;
(2)向培养皿中加入I型鼠尾胶原与所述肿瘤多细胞球体的混合液;待凝固后,加入培养基、继续培养;
(3)所述肿瘤多细胞球体在I型鼠尾胶原内伸展侵袭生长,至出现明显的集体侵袭细胞群时,使用激光共聚焦显微镜对所需区域的肿瘤细胞进行激光漂白荧光蛋白光转化,使所需区域的肿瘤细胞中的光转换荧光蛋白由绿色荧光转换为红色荧光;
(4)加入胶原酶消化、离心、重悬,制得细胞悬液;
(5)流式细胞仪分选以获得所需区域的肿瘤细胞。
2.根据权利要求1所述的体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型的构建方法,其特征在于,所述培养得到肿瘤多细胞球体的步骤包括:
向肿瘤细胞中转染入可表达光转换荧光蛋白的质粒,利用超高速流式细胞分选系统分选出可进行光转换荧光肿瘤细胞;
采用悬滴培养法或微孔板培养法,将所述光转换荧光肿瘤细胞培养成肿瘤多细胞球体。
3.根据权利要求2所述的体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型的构建方法,其特征在于,所述利用超高速流式细胞分选系统分选为:分选至少两次,每次间隔大于7天。
4.根据权利要求2所述的体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型的构建方法,其特征在于,所述微孔板培养法为:计数5000-10000个肿瘤细胞重悬液,将其加入96孔黑色圆底超低吸附球体培养微孔板。
5.根据权利要求1所述的体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型的构建方法,其特征在于,所述步骤(2)为,先在激光共聚焦培养皿中均匀铺设一层I型鼠尾胶原,再向激光共聚焦培养皿中加入所述肿瘤多细胞球体与I型鼠尾胶原的混合液。
6.根据权利要求1-5任一项所述的体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型的构建方法,其特征在于,步骤(2)中所述待凝固为于(5±0.2)%的CO2、(37±0.5)℃条件下放置25~35min;和/或
所述的培养基为含有8%-12%胎牛血清的培养基;和/或
所述培养为:于(5±0.2)%的CO2、(37±0.5)℃条件下培养。
7.根据权利要求1-5任一项所述的体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型的构建方法,其特征在于,步骤(3)所述肿瘤多细胞球体在I型鼠尾胶原内伸展侵袭生长过程中,还包括利用激光共聚焦显微镜的时间序列拍摄方法,记录所述肿瘤多细胞球在I型鼠尾胶原内不同时间点伸展侵袭生长的形态。
8.根据权利要求1-5任一项所述的体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型的构建方法,其特征在于,步骤(3)所述激光漂白荧光蛋白光转化为:
选定所需转化的细胞,利用倒置激光共聚焦显微镜划定需要转化的范围;
使用波长为360~420nm或者460~500nm的激光进行荧光的连续激光漂白,至荧光蛋白的荧光颜色转变。
9.根据权利要求1-5任一项所述的体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型的构建方法,其特征在于,步骤(4)为所述制得细胞悬液为,加入胶原酶消化I型鼠尾胶原,于36.5~37.5℃,消化5~7min,800~1200rpm离心4~7min收集肿瘤细胞,以含2%胎牛血清的PBS重悬细胞。
10.一种体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型,其特征在于,由权利要求1-9任一项所述的体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型的构建方法构建得到。
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