CN114457007A - 一种基于微孔板的均一的单类器官模型及其制备方法 - Google Patents
一种基于微孔板的均一的单类器官模型及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114457007A CN114457007A CN202210187170.XA CN202210187170A CN114457007A CN 114457007 A CN114457007 A CN 114457007A CN 202210187170 A CN202210187170 A CN 202210187170A CN 114457007 A CN114457007 A CN 114457007A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- organoids
- organoid
- microplate
- culture
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 8
- 210000002220 organoid Anatomy 0.000 claims abstract description 219
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 39
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 45
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 16
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 13
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 9
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 claims description 3
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 claims description 3
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 claims description 3
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 28
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 10
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 239000012574 advanced DMEM Substances 0.000 description 6
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 6
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003075 superhydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000008570 general process Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000006461 physiological response Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/067—Hepatocytes
- C12N5/0671—Three-dimensional culture, tissue culture or organ culture; Encapsulated cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/10—Mineral substrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于微孔板的均一的单类器官模型及其制备方法,所述方法包括:将可传代培养的类器官消化成单个细胞;将所述单个细胞与含有5%~10%的基质胶的类器官培养基共混,获得含有细胞‑基质胶‑培养基的共混物;将所述共混物置于底部为低黏附或超低黏附的微孔板中,再加入类器官培养基进行常规培养,然后离心以使细胞聚集于所述微孔板底部,获得基于微孔板的均一的单类器官模型。本发明培养的类器官具有高度的单一性,几乎可以确定每孔仅有一个类器官。本发明重复性高且操作可控性强等优势,对于普通实验室和批量生产均有较好的优势。
Description
技术领域
本发明涉及细胞和组织工程技术领域,特别涉及一种基于微孔板的均一的单类器官模型及其制备方法。
背景技术
类器官是器官特异性细胞的集合,这些细胞从干细胞或器官祖细胞发育而来,并能以与人体内相似的方式经细胞分序和空间限制性的系别分化而实现自我组建。简而言之,类器官是一种基于三维(Three-dimensional,3D)体外细胞培养系统,可复制出已分化组织的复杂空间形态,并能够表现出细胞与细胞之间,细胞与其周围基质之间的相互作用和空间位置形态。类器官能做到与人体内分化的组织具有相似的生理反应,与人体来源组织具有极高的相似性。与传统二维(Two-dimensional,2D)细胞培养模式相比,类器官具有实质性的改进。类器官包含多种细胞类型,突破了细胞间单纯的物理接触联系,形成了更加紧密的细胞间、细胞与基质间高度相互作用,形成具有功能的“微器官”,能更好地用于模拟器官组织的发生过程及生理病理状态,在基础研究以及临床诊疗方面具有广阔的应用前景和商业价值。
目前,类器官的培养方法以基于Matrigel的基质胶滴法为主。其大致流程是将干细胞、干细胞分化的细胞及成体组织分散成小细胞团或者是单个细胞包裹在Matrigel中用特殊的培养基培养一段时候后得到类器官。目前,胶滴法培养类器官技术相对成熟,构建类器官的成功率达90%以上,适合于大多数类器官的培养。利用基质胶滴法得到的类器官表现出极大的异质性,例如类器官形成所用的时间差别较大、在最终形态上也具备较大的差异、类器官所具备的功能也在某些方面上无法保持一致,这严重影响了类器官培养的质量可控性。此外,在基质胶中培养的过程中,单个胶滴中含有多个类器官、类器官之间的相对位置随机,并且分布在不同焦平面,难以定位观察、个体差异化明显。上述局限性导致了类器官实验中难以进行定量,限制了类器官在基础研究和临床前药物开发的应用。
因此,有必要开发一种均一的单类器官模型,以用于基础研究和临床前药物开发中。
发明内容
本发明目的是提供一种基于微孔板的均一的单类器官模型及其制备方法,本发明培养的类器官具有高度的单一性,几乎可以确定每孔仅有一个类器官。本发明重复性高且操作可控性强等优势,对于普通实验室和批量生产均有较好的优势。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
在本发明的第一方面,提供了一种基于微孔板的均一的单类器官模型的制备方法,所述方法包括:
将可传代培养的类器官消化成单个细胞;
将所述单个细胞与类器官培养基和体积比5%~10%的基质胶共混,获得共混物;
将所述共混物置于底部为疏水或超疏水的微孔板中,后离心以使细胞聚集于所述微孔板底部,再加入类器官培养基进行常规培养,获得基于微孔板的均一的单类器官模型。
进一步地,所述离心中,离心力为100g~400g,离心时间为3min~5min。
进一步地,所述微孔板为96孔板、384孔板和1536孔板中的一种。
进一步地,所述微孔板的底部为U形底或V形底。
进一步地,所述常规培养的时间为1~6d。
进一步地,所述可传代培养的类器官包括成体干细胞、正常组织、肿瘤组织来源的类器官。例如肝脏类器官、小肠类器官、胰腺相关类器官、胃类器官、肺类器官、乳腺类器官、肺癌类器官、结直肠癌类器官、胃癌类器官、肝癌类器官、乳腺癌类器官、胰腺癌类器官、食管癌类器官、前列腺癌类器官、宫颈癌类器官等中的一种。
在本发明的第二方面,提供了所述方法制备得到的基于微孔板的均一的单类器官模型。
进一步地,所述微孔板中每个微孔仅含有一个类器官且在微孔的中心区域。
进一步地,所述基于微孔板的均一的单类器官模型及其制备方法中单个类器官的大小为50μm~500μm。
进一步地,所述基于微孔板的均一的单类器官模型及其制备方法中单个类器官的面积变异系数小于35%。
本发明实施例中的一个或多个技术方案,至少具有如下技术效果或优点:
本发明的基于微孔板的均一的单类器官模型与已有的被广泛采用的经典的胶滴法培养类器官对比具有明显的优势,具体表现在:经典的胶滴法培养的类器官在最终形态、体积大小、形成位置上都具有显著的异质性;形成类器官并使其聚集的时间在1~2周不等;类器官培养都依赖于50%~100%浓度的基质胶如Matrigel胶,但由于所用高浓度基质胶黏度高,用离心等其他手段无法使细胞高度聚集。以上这些问题都是影响类器官标准化的障碍。而本发明利用类器官融合的和细胞自组织的技术手段,通过将低浓度的Matrigel胶融入到类器官培养液中,再进一步通过离心使Matrigel胶和细胞下沉到微孔板中心达到了使细胞聚集并且使聚集的细胞包埋在高浓度Matrigel胶中,从而创造了一种标准化的类器官模型及其制备方法,制备方法的相关参数已被确定,类器官形成位置、形态、大小都具有高度的均一性,各个孔间的类器官面积变异系数小于35%。本发明创造的模型及制作方法对比传统的胶滴法具有无可比拟的优势,解决了十年来类器官培养具有显著异质性的难题。具有的优点具体有:
(1)本发明提供的一种基于微孔板的均一的单类器官模型的制备方法可以快速构建类器官,在短时间内培养出符合实验要求的产品。
(2)本发明培养的类器官具有高度的单一性,几乎可以确定每孔仅有一个类器官。
(3)本发明重复性高且操作可控性强等优势,对于普通实验室和批量生产均有较好的优势。
(4)本发明可以大批量构建均一性的成体干细胞来源的类器官、肿瘤类器官、组织来源类器官。
(5)本发明为类器官标准化提供了一个全新的解决方案,可极大地推动类器官在基础研究和临床转化研究中的应用,有望加速类器官质量标准化和市场化的发展。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为均一性的单一类器官培养流程示意图及预期培养效果图;
图2为不同细胞数量对类器官生长的影响效果图;图2A为类器官培养开始时及第六天的明场图,标尺分别为500μm、100μm;图2B为类器官培养第六天的直径量化统计;图2C为类器官培养第六天的直径变异系数量化统计;
图3为不同Matrigel浓度对类器官生长的影响效果图;图3A为类器官培养开始时及第六天的明场图,标尺分别为500μm、100μm;图3B为类器官培养第六天的直径量化统计;图3C为类器官培养第六天的直径变异系数量化统计;
图4为不同培养液添加时点对类器官生长的影响效果图;图4A为类器官培养开始时及第六天的明场图,标尺分别为500μm、100μm;图4B为类器官培养第六天的直径量化统计;图4C为类器官培养第六天的直径变异系数量化统计;
图5为不同离心力对类器官生长的影响效果图;图5A为类器官培养开始时及第六天的明场图,标尺分别为500μm、100μm;图5B为类器官培养第六天的直径量化统计;图5C为类器官培养第六天的直径变异系数量化统计;
图6为不同离心时间对类器官生长的影响效果图;图6A为类器官培养开始时及第六天的明场图,标尺分别为500μm、100μm;图6B为类器官培养第六天的直径量化统计;图6C为类器官培养第六天的直径变异系数量化统计;
图7为不同孔板规格对类器官生长的影响效果图;图7A为类器官培养开始时及第六天的明场图,标尺分别为500μm、100μm;图7B为类器官培养第六天的直径量化统计;图7C为类器官培养第六天的直径变异系数量化统计;
图8为不同孔板特性对类器官生长的影响效果图;图8A为类器官培养开始时及第六天的明场图,标尺分别为500μm、100μm;图8B为类器官培养第六天的直径量化统计;图8C为类器官培养第六天的直径变异系数量化统计;
图9为小鼠肝脏类器官培养至第6天特征性标记物表达情况。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例,具体阐述本发明,本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解,这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明,而非限制本发明。
在整个说明书中,除非另有特别说明,本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此,除非另有定义,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾,本说明书优先。
此外,在本申请的描述中,多个”、“若干个”的含义是两个或两个以上,除非另有明确具体的限定。
本申请的技术方案总体思路如下:
根据本发明的一种典型的实施方式,提供一种基于微孔板的均一的单类器官模型及其制备方法,所述方法包括:
步骤S1、将可传代培养的类器官消化成单个细胞;
所述可传代培养的类器官包括成体干细胞、正常组织、肿瘤组织来源的类器官。例如肝脏类器官、小肠类器官、胰腺相关类器官、胃类器官、肺类器官、乳腺类器官、肺癌类器官、结直肠癌类器官、胃癌类器官、肝癌类器官、乳腺癌类器官、胰腺癌类器官、食管癌类器官、前列腺癌类器官、宫颈癌类器官等中的一种。
步骤S2、将所述单个细胞与类器官培养基和5%~10%的基质胶共混,获得共混物;
所述基质胶胶包括但不限于Matrigel、Cultrex等适用于类器官培养的商品化及非商品化基质胶。
所述基质胶若未添加,则类器官无法生长;若大于10%有类器官极易分化的不利影响;
所述离心中,离心力为100g~400g,离心时间为3min~5min。
所述离心力若小于100g,有细胞无法聚集形成单一类器官的不利影响,若大于400g,有伤害细胞导致类器官生长缓慢,体积较小的不利影响;
步骤S3、将所述共混物置于底部为疏水或超疏水的微孔板中,再加入类器官培养基进行常规培养,后离心以使细胞聚集于所述微孔板底部,获得基于微孔板的均一的单类器官模型。
所述微孔板的底部为疏水或超疏水具体可采用商品化的底部为低黏附或超低黏附的微孔板,底部为低黏附或超低黏附的商品化微孔板可在市场上购买不同货号的均可。
所述微孔板为96孔板、384孔板和1536孔板中的一种。
所述微孔板的底部为U形底或V形底。所述微孔板的底部若为平底有类器官漂浮、分散生长的不利影响;
所述常规培养的时间为1~6d。
所述初始接种细胞数量为100~5000个/孔。若小于100个/孔有类器官体积过小的不利影响,若大于5000个/孔有类器官体积过大不利影响。
根据本发明另一种典型实施方式,提供了所述方法制备得到的基于微孔板的均一的单类器官模型。
所述微孔板中每个微孔仅含有一个类器官且在中心区域。
所述基于微孔板的均一的单类器官模型中单个类器官的大小为50μm~500μm。得到实验所需的类器官尺寸可以通过初始接种的细胞数量及培养时间调控。
所述基于微孔板的均一的单类器官模型中单个类器官的面积变异系数小于35%。
本发明针对传统类器官培养形式和方法的局限性问题,发明了一种利用微孔板(96、384、1536孔)的高通量且均一性的高度可控的新型类器官培养形式和构建方法及应用,其特点是每个微孔底部正中央有一个类器官、该类器官的大小为50μm~500μm,适合于高通量成像和定量分析,其构建方法通过调节初始播种细胞数量能够在1~6天内形成大小可控的类器官。本方法克服了高粘度基质胶中难以让细胞聚集成为单个细胞聚集体的困难,打破了原有类器官基质胶滴法形式中所必需的10%或以上的Matrigel胶浓度的培养需求,找到了最佳的细胞聚集方案以及培养基质和材料。
本发明适用于不同细胞来源或者是不同组织类型的高通量的均一、可控的类器官的构建。尤其适合于肿瘤组织来源、正常组织来源和成体来源的每个单元一个类器官的构建。本发明为类器官标准化提供了一个全新的解决方案,找到了适合单个类器官形成的微孔板表面特性。可极大地推动类器官在基础研究和临床转化研究中的商业化应用,有望加速类器官质量标准化和市场化的发展。
下面将结合附图对本申请的一种基于微孔板的均一的单类器官模型和培养方法进行详细说明。
实施例1、一种基于微孔板的均一的单类器官模型及其制备方法
1.传代扩增:
1)吸除原培养液,用2mL/孔的预冷Advanced DMEM/F-12溶解1个胶滴,吹打20次以使小鼠肝祖类器官碎片化,然后将混合液全部收集至15mL EP管中;
2)300g离心5min,尽量去除上清;
3)加入100μL预冷的完全HepatiCultTM类器官生长培养基(小鼠)重悬类器官,混匀;
4)用预冷枪头加入100μL Matrigel,轻柔混匀。
5)用预冷枪头吸取50μL混合液加入24孔板中,传代比例为1:4。静置5min后放入37℃的培养箱中放置30min。
6)待Matrigel胶滴凝固后,每孔加入500μL完全HepatiCultTM类器官生长培养基(小鼠),继续于37℃培养箱中常规培养。
7)培养至第三天时换液。
2.小鼠肝祖类器官消化
1)吸除原培养液,用2mL的预冷Advanced DMEM/F-12溶解1个胶滴,吹打20次以使小鼠肝祖类器官碎片化,然后将混合液全部收集至15mL EP管中;
2)300g离心5min,尽量去除上清;
3)加入1ml TrypLETM,37℃珠浴10min;
4)加入4ml Advanced DMEM/F-12终止消化,吹打混匀并计数;
3.小鼠肝祖类器官接种于孔板中
配制含有5%的Matrigel和完全HepatiCultTM类器官生长培养基(小鼠)混合液,与一定数量细胞混合,加入孔板中,每组设置4个复孔,每组的理论细胞数量设定为500个细胞/孔。每孔先加50μL的混合液,再加150μL的完全HepatiCultTM类器官生长培养基(小鼠),100g、4℃度条件下离心3min以使细胞入孔,37度静置30min后,拍照后常规培养。每两天明场拍照观察并计数每孔类器官数量及面积。
实施例2
本发明实施例中,初始接种细胞数量为2000个/孔,其他操作同实施例1。
实施例3
本发明实施例中,
1.传代扩增(P12小鼠肝祖类器官):
1)吸除原培养液,用2mL的预冷Advanced DMEM/F-12溶解1个胶滴,吹打20次以使小鼠肝祖类器官碎片化,然后将混合液全部收集至15mL EP管中;
2)300g离心5min,尽量去除上清;
3)加入100μL预冷的完全HepatiCultTM类器官生长培养基(小鼠)重悬类器官,混匀;
4)用预冷枪头加入100μL Matrigel,轻柔混匀。
5)用预冷枪头吸取50μL混合液加入24孔板中,传代比例为1:4。静置5min后放入37℃的培养箱中放置30min。
6)待Matrigel胶滴凝固后后每孔加入500μL完全HepatiCultTM类器官生长培养基(小鼠),继续于37℃培养箱培养。
7)培养至第三天时换液。
2.小鼠肝祖类器官消化
1)吸除原培养液,用2mL的预冷Advanced DMEM/F-12溶解1个胶滴,吹打20次以使小鼠肝祖类器官碎片化,然后将混合液全部收集至15mL EP管中;
2)300g离心5min,尽量去除上清;
3)加入1mL TrypLETM,37℃珠浴10min;
4)加入4mL Advanced DMEM/F-12终止消化,吹打混匀并计数;
3.小鼠肝祖类器官接种于孔板中
离心后加培养基组:配制含有5%的Matrigel和完全HepatiCultTM类器官生长培养基(小鼠)混合液,与一定数量细胞混合,加入孔板中,每组设置4个复孔,每组的理论细胞数量设定为500个。每孔先加50μL的混合液,100g、4℃条件下离心3min以使细胞入孔,37℃静置30min后,再加150μL的完全HepatiCultTM类器官生长培养基(小鼠),拍照后常规培养。每两天明场拍照观察并计数每孔类器官数量及面积。
实施例4
本发明实施例中,离心力为200g,其他步骤均同实施例1。
实施例5
本发明实施例中,离心时间为5min,其他步骤均同实施例1。
实施例6
本发明实施例中,Matrigel胶浓度为10%,其他步骤均同实施例1。
实施例7
本发明实施例中,初始接种细胞数量为100个/孔,其他步骤均同实施例1。
实施例8
本发明实施例中,初始接种细胞数量为5000/孔,其他步骤均同实施例1。
实施例9
本发明实施例中,离心力为400g,其他步骤均同实施例1。
对比例1
该对比例1使用平底、粘附性好的96孔板,其他步骤均同实施例1。
对比例2
该对比例中,离心时间为1min,其他步骤均同实施例1。
对比例3
该对比例中,不加入Matrigel胶,其他步骤均同实施例1。
对比例4
该对比例中,使用平底、超低粘附的96孔板,其他步骤均同实施例1。
对比例5
该对比例中,使用U形底、粘附性好的96孔板,其他步骤均同实施例1。
对比例6
该对比例中,使用平底、粘附性好的384孔板,其他步骤均同实施例1。
对比例7
该对比例中,使用平底、超低粘附的384孔板,其他步骤均同实施例1。
对比例8
该对比例中,使用平底、粘附性好的1536孔板,其他步骤均同实施例1。
对比例9
该对比例中,Matrigel胶浓度为50%,其他步骤均同实施例1。
实验例1
对上述实施例1-10和对比例1-8的每两天明场拍照观察并计数每孔类器官数量及面积进行统计,如表1所示,其中面积的标准差变异系数的计算方法为:变异系数C·V=(标准偏差SD/平均值Mean)×100%;长出率是指第6天时有类器官长出的孔数与总的孔数的比值;长出个数为第6天统计;
表1
由表1的数据可知:
对比例1中,采用平底且黏附性好的微孔板,长出个数为39个,无法得到单一的均一性类器官;
对比例2中,离心时间为1min,小于本发明实施例3~5min的范围,长出个数为64个,无法得到单一的均一性类器官;
对比例3中,不加入Matrigel胶,类器官无法正常生长;
对比例4中,微孔板的底部为平底,长出个数为20个,无法得到单一的均一性类器官;
对比例5中,采用U形底且黏附性好的96微孔板,长出个数为52个,无法得到单一的均一性类器官;
对比例6中,采用平底且黏附性好的384微孔板,长出个数为36个,无法得到单一的均一性类器官;
对比例7中,微孔板的底部为平底,长出个数为41个,无法得到单一的均一性类器官;
对比例8中,采用平底且黏附性好的1536微孔板,长出个数为58个,无法得到单一的均一性类器官。
对比例9中,Matrigel胶浓度为50%,大于本发明实施例5%~10%的范围,长出率仅为25%,大概率无法得到类器官。
本发明实施例1-实施例9获得的类器官具有高度的单一性,几乎可以确定每孔仅有一个类器官。
最后,还需要说明的是,术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含,从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素,而且还包括没有明确列出的其他要素,或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例,但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念,则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以,所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然,本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样,倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内,则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.一种基于微孔板的均一的单类器官模型的制备方法,其特征在于,所述方法包括:
将可传代培养的类器官消化成单细胞;
将所述单细胞与含有体积比5%~10%基质胶的类器官培养基共混,获得共混物;
将所述共混物置于底部为低粘附或超低粘附的微孔板中,然后离心以使细胞和Matrigel胶聚集于所述微孔板底部,再加入类器官培养基进行常规培养或分化培养,获得一种基于微孔板的均一性的单类器官模型。
2.根据权利要求1所述基于微孔板的均一的单类器官模型的制备方法,其特征在于,所述离心中,离心力为100g~400g,离心时间为3min~5min。
3.根据权利要求1所述基于微孔板的均一的单类器官模型的制备方法,其特征在于,所述微孔板为96孔板、384孔板和1536孔板中的一种。
4.根据权利要求1所述基于微孔板的均一的单类器官模型的制备方法,其特征在于,所述微孔板的底部为U形底或V形底。
5.根据权利要求1所述基于微孔板的均一的单类器官模型的制备方法,其特征在于,所述得到单个类器官的常规培养的时间为1~6d。
6.根据权利要求1所述基于微孔板的均一的单类器官模型的制备方法,其特征在于,所述可传代培养的类器官包括成体干细胞、正常组织、肿瘤组织来源的类器官。例如肝脏类器官、小肠类器官、胰腺相关类器官、胃类器官、肺类器官、乳腺类器官、肺癌类器官、结直肠癌类器官、胃癌类器官、肝癌类器官、乳腺癌类器官、胰腺癌类器官、食管癌类器官、前列腺癌类器官、宫颈癌类器官等中的一种。
7.一种采用权利要求1-6任一项所述方法制备得到的基于微孔板的均一的单类器官模型。
8.根据权利要求7所述的基于微孔板的均一的单类器官模型,其特征在于,所述微孔板中每个微孔仅含有一个类器官且在微孔的中心区域。
9.根据权利要求7所述的基于微孔板的均一的单类器官模型,其特征在于,所述基于微孔板的均一的单类器官模型中单个类器官的大小为50μm~500μm。
10.根据权利要求7所述的基于微孔板的均一的单类器官模型,其特征在于,所述基于微孔板的均一的单类器官模型中各孔间类器官面积变异系数小于35%。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210187170.XA CN114457007B (zh) | 2022-02-28 | 2022-02-28 | 一种基于微孔板的均一的单类器官模型及其制备方法 |
PCT/CN2023/078352 WO2023160687A1 (zh) | 2022-02-28 | 2023-02-27 | 一种基于微孔板的均一的单类器官模型及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210187170.XA CN114457007B (zh) | 2022-02-28 | 2022-02-28 | 一种基于微孔板的均一的单类器官模型及其制备方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN114457007A true CN114457007A (zh) | 2022-05-10 |
CN114457007B CN114457007B (zh) | 2024-05-28 |
Family
ID=81414819
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210187170.XA Active CN114457007B (zh) | 2022-02-28 | 2022-02-28 | 一种基于微孔板的均一的单类器官模型及其制备方法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN114457007B (zh) |
WO (1) | WO2023160687A1 (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115558633A (zh) * | 2022-06-17 | 2023-01-03 | 成都诺医德医学检验实验室有限公司 | 一种利用微基质胶球快速培养类器官的方法 |
WO2023160687A1 (zh) * | 2022-02-28 | 2023-08-31 | 武汉大学 | 一种基于微孔板的均一的单类器官模型及其制备方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110616185A (zh) * | 2019-09-25 | 2019-12-27 | 华东理工大学青岛创新研究院 | 一种多细胞肿瘤球及其高通量制备方法 |
US20210087533A1 (en) * | 2019-09-19 | 2021-03-25 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Canine epithelial organoids and methods of making, recovering, and use |
WO2021195279A2 (en) * | 2020-03-24 | 2021-09-30 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Small molecule inhibitors of oncogenic chd1l with preclinical activity against colorectal cancer |
CN113667603A (zh) * | 2021-08-13 | 2021-11-19 | 武汉大学 | 一种肝脏类器官培养芯片及其制备方法与应用 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2022500033A (ja) * | 2018-09-11 | 2022-01-04 | マックス−プランク−ゲゼルシャフト ツール フォーデルング デル ヴィッセンシャフテン エー.ヴェー. | オルガノイドの自動化された生成および分析 |
CN112553142B (zh) * | 2020-12-11 | 2023-02-07 | 山东大学 | 一种鼻黏膜上皮细胞3d类器官及其培养方法和应用 |
CN114457007B (zh) * | 2022-02-28 | 2024-05-28 | 合肥燃音生物科技有限公司 | 一种基于微孔板的均一的单类器官模型及其制备方法 |
-
2022
- 2022-02-28 CN CN202210187170.XA patent/CN114457007B/zh active Active
-
2023
- 2023-02-27 WO PCT/CN2023/078352 patent/WO2023160687A1/zh unknown
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20210087533A1 (en) * | 2019-09-19 | 2021-03-25 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Canine epithelial organoids and methods of making, recovering, and use |
CN110616185A (zh) * | 2019-09-25 | 2019-12-27 | 华东理工大学青岛创新研究院 | 一种多细胞肿瘤球及其高通量制备方法 |
WO2021195279A2 (en) * | 2020-03-24 | 2021-09-30 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Small molecule inhibitors of oncogenic chd1l with preclinical activity against colorectal cancer |
CN113667603A (zh) * | 2021-08-13 | 2021-11-19 | 武汉大学 | 一种肝脏类器官培养芯片及其制备方法与应用 |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023160687A1 (zh) * | 2022-02-28 | 2023-08-31 | 武汉大学 | 一种基于微孔板的均一的单类器官模型及其制备方法 |
CN115558633A (zh) * | 2022-06-17 | 2023-01-03 | 成都诺医德医学检验实验室有限公司 | 一种利用微基质胶球快速培养类器官的方法 |
CN115558633B (zh) * | 2022-06-17 | 2023-08-15 | 成都诺医德医学检验实验室有限公司 | 一种利用微基质胶球快速培养类器官的方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2023160687A1 (zh) | 2023-08-31 |
CN114457007B (zh) | 2024-05-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN114457007A (zh) | 一种基于微孔板的均一的单类器官模型及其制备方法 | |
CN108456659B (zh) | 3d大脑类器官的制备方法 | |
CN113106065B (zh) | 一种结直肠癌类器官与肝脏类器官共培养模型及其构建方法 | |
CN113667603A (zh) | 一种肝脏类器官培养芯片及其制备方法与应用 | |
US20210186881A1 (en) | Method of manufacturing spheroid having uniform size | |
CN108795872A (zh) | 体外肿瘤细胞3d集体侵袭模型及其构建方法 | |
CN105907721A (zh) | 一种稳定表达Cas9蛋白的猪肠道上皮细胞系 | |
CN114752565B (zh) | 带有免疫细胞的视网膜类器官及其构建方法 | |
CN211713118U (zh) | 一种用于类器官球体培养的孔板装置 | |
CN202945247U (zh) | 具有单培养、共培养及群培养优势的人胚胎培养皿 | |
CN115558633B (zh) | 一种利用微基质胶球快速培养类器官的方法 | |
CN109097274A (zh) | 一种标准化的高通量三维细胞制备装置及其应用 | |
CN101484574A (zh) | 供培养的细胞三维生长的底物 | |
CN115449504A (zh) | 一种猪小肠类器官2d培养模型的建立方法 | |
CN116478925A (zh) | 一种体外快速制备肿瘤细胞球的方法 | |
US10301442B2 (en) | Method for preparing a cellulose sponge and mixed solution thereof | |
CN115322947A (zh) | 一种采用成体肾前体细胞经悬浮分化培养构建肾微器官的方法和应用 | |
JP6721868B2 (ja) | スフェロイドの作製方法及び該方法に用いる培地 | |
CN112501119A (zh) | 一种垂体腺瘤类器官培养基及其应用 | |
CN104673875A (zh) | 基于骨软骨细胞的骨科药物快速筛选方法 | |
CN104774903A (zh) | 立体化培养细胞在骨科药物筛选中的应用 | |
CN117511876A (zh) | 一种利用注射法构建三维培养系统的方法及其应用 | |
CN116731859B (zh) | 一种环形大脑类器官模型及其构建方法与应用 | |
WO2023226884A1 (en) | High-throughput selection and fabrication of biomaterial-encapsulated cell mass and uses thereof | |
KR20180045664A (ko) | 섬유상 입자를 이용한 3차원 세포 구상체의 제조방법 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20230308 Address after: Room 401, Building A1, Zhong'an Chuanggu Science Park, No. 900, Wangjiang West Road, High-tech Zone, Hefei, Anhui Province, 230088 Applicant after: Hefei Runyin Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 430072 Hubei Province, Wuhan city Wuchang District of Wuhan University Luojiashan Applicant before: WUHAN University |
|
TA01 | Transfer of patent application right | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |