CN116539862B - 一种基于类器官共生长平台测试肿瘤转移能力的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医学生物学领域，具体涉及一种基于类器官与类器官共生长平台测试肿瘤转移能力的方法及应用。所述方法包括构建肿瘤类器官与正常类器官共生长平台，基于所述平台评估肿瘤细胞在正常类器官中的侵袭和转移情况。本发明方法在基质胶体积一定的情况下，通过在控制细胞的绝对数量的前提下优化共培养类器官的比例，使正常类器官和肿瘤类器官长大之后距离足够近，实现类器官细胞在细胞尺度下的接近，进而发生细胞间的通信连接。

Description

一种基于类器官共生长平台测试肿瘤转移能力的方法
本申请要求2022年7月20提交的中国发明专利申请【2022108624101】“一种评价免疫工程细胞疗效有效性的方法”的优先权，该优先权发明专利申请以引用方式全文并入。
技术领域
本发明属于医学生物学领域，具体涉及一种基于类器官共生长平台测试肿瘤转移能力的方法。
背景技术
肿瘤转移是指肿瘤从原发部位经过血管、淋巴管或体腔等途径，到达其他正常组织部位继续生长的过程。肿瘤转移是造成肿瘤治疗后复发，治疗失败甚至患者死亡的主要原因。目前还缺少能够对患者肿瘤进行快速、精准测试的体外模型，也缺少对基础科研有利的评估各种基因改造方法或者小分子化合物对肿瘤转移能力的影响的体外模型。
现有的肿瘤转移模型，大多数还停留在细胞系划痕实验、穿孔实验，或者模式动物原位移植模型、基因鼠模型等阶段。
细胞系划痕和穿孔实验中，细胞系对肿瘤的表征程度很低，往往是肿瘤中的某一种细胞的高度富集，不具备肿瘤的异质性。由于细胞在永生化过程当中往往积累了很多与患者肿瘤不同的遗传突变，因此在平皿上的移动能力和在体内的实际转移能力相去甚远，因此达不到精准测试的效果。原位移植模型目前虽然是较为理想的肿瘤转移模型，但是原位移植手术难度大，周期长，对实验操作人员和操作要求均比较高。基因鼠模型培养周期长，如果想得到目的基因组合，往往需要长期的杂交。因此，上述现有的体外模型由于受限于原材料或技术壁垒，都不能有效模拟肿瘤本身的运动和性质，而体内模型不能对肿瘤细胞的转移能力进行快速测试。
综上所述，亟需提出一种新的体外测试肿瘤转移的方法，以缓解现有技术的不足。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于类器官共生长平台测试肿瘤转移能力的方法及模型。具体技术方案如下。
一种基于类器官与类器官共生长平台测试肿瘤细胞转移能力的方法，包括构建肿瘤类器官与正常类器官共生长平台，基于所述平台评估肿瘤细胞在正常类器官中的侵袭和转移情况，具体步骤如下：
步骤1)：获取肿瘤组织消化为细胞，加入肿瘤类器官培养基培养为原位肿瘤类器官；
步骤2)：获取正常组织消化为细胞，加入正常类器官培养基培养为正常类器官；
步骤3)：将所述肿瘤类器官或所述正常类器官中的一种先固定于基质胶中，然后吸取另一种类器官种入基质胶中，使两种类器官在细胞尺度上接近，所述肿瘤类器官与所述正常类器官的数量比例为5:1；
步骤4)：光镜或荧光显微镜下观察所述肿瘤类器官和所述正常类器官是否发生了融合以及肿瘤细胞是否对所述正常类器官发生了侵袭和转移。
进一步，步骤3)中将所述正常类器官先固定于基质胶中，以每30ul(微升)体积的基质胶固定2500-3500个细胞的正常类器官。
进一步，步骤4)中用荧光染料标记所述肿瘤类器官，显微镜下观察带有荧光的肿瘤类器官是否发生转移，进而评判肿瘤细胞是否发生侵袭和转移。
进一步，所述肿瘤类器官培养基包括Matrigel基质胶和细胞因子，所述细胞因子包括B27、EGF、FGF10、Y-27632、Glutamax、Gastrin、N-acetylcysteine、Noggin、A83-01、Nicotinamide或N2中的一种或多种。
优选地，所述细胞因子包括浓度为50X稀释的B27、50-100ng/ml的EGF、100-200ng/ml的FGF10、10-20uM的Y-27632、100X稀释的Glutamax、1-5nM的Gastrin、1-5mM的N-acetylcysteine、50-100ng/ml的Noggin、100-200nM的A83-01、5-10mM的Nicotinamide或100X稀释的N2中的一种或多种。
进一步，所述正常类器官培养基包括Matrigel基质胶和细胞因子，所述细胞因子包括B27、EGF、R-spondin 1、FGF10、Y-27632、Glutamax、Gastrin、N-acetylcysteine、Noggin、A83-01、Nicotinamide、WNT3a或N2中的一种或多种。
优选地，所述细胞因子包括浓度为50X稀释的B27、50-100ng/ml的EGF、150-250ng/ml的R-spondin 1、50-100ng/ml的FGF10、10-20uM的Y-27632、100X稀释的Glutamax、1-5nM的Gastrin、1-10mM的N-acetylcysteine、100-200ng/ml的Noggin、100-200nM的A83-01、10-20mM的Nicotinamide、25-30ng/ml的WNT3a或100X稀释的N2中的一种或多种。
上述方法在制备体外肿瘤转移检测模型中的应用，所述模型为类器官与类器官共生长模型。
进一步，所述方法制备的体外肿瘤转移检测模型可用于快速测试肿瘤细胞的转移能力。
进一步，所述方法制备的体外肿瘤转移检测模型可用于准确评估肿瘤细胞的转移能力。
可以理解的是，上述肿瘤转移检测模型还可以评估或检测包括不限于原位肿瘤的转移能力、肿瘤细胞的侵染能力、肿瘤细胞的融合能力等。
有益技术效果
1)本发明创新性地提出了一种利用体外构建的肿瘤类器官与正常类器官共生长平台，来测试肿瘤细胞是否对正常类器官发生转移和侵袭的方法及模型。具体来说，本发明将肿瘤类器官和正常类器官在细胞尺度下共培养，使两者在细胞尺度下足够接近。在该生物学尺度下，由于转移能力强的肿瘤类器官具备细胞解离和侵袭正常类器的能力，因此可以解决体外模型快速检测肿瘤细胞是否具有转移能力和是否会在目标器官定植的两个关键问题。本发明提供的这种基于类器官与类器官共生长平台，相较于类器官与单个细胞(例如，正常类器官与肿瘤细胞)共培养平台，其优势在于能够更真实的模拟和评估肿瘤组织(肿瘤类器官)对正常组织(正常类器官)的解离和侵袭，而单个肿瘤细胞不能实现这个技术目的。
2)在实际操作中，要将两个类器官放到足够接近的距离进行共培养具有非常大的难度，其原因在于细胞之前往往存在表面张力而导致很难在细胞尺度下相互接近，因此要进行类器官与类器官共培养的研究对实验人员的操作技能和经验水平要求很高。本发明方法打破了现有研发操作中对实验人员操作技能的高度依赖，创新性的提出在基质胶体积一定的情况下，通过在控制细胞的绝对数量的前提下优化共培养类器官的比例，使正常类器官和肿瘤类器官长大之后距离足够近，从而实现类器官细胞在细胞尺度下接近，进一步发生细胞间的通信连接。当细胞数量过少时，例如当细胞比例为1:1-1:4时，长成的类器官之间相距较远，发生接触和侵袭的几率较低。而当细胞数量太多时，例如当细胞比例为1:6、1:7或者更多，将会导致在一定的基质胶体积里，正常类器官数量过少，进而很难观察到侵袭现象的发生。简而言之，本发明创新的提出了类器官与类器官共生长平台，并解决了传统共培养方法下细胞之间由于表面张力等因素不能足够接近，进而无法建立通信连接的难题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为类器官共生长平台体外检测肿瘤转移能力的示意图；
图2为单独小鼠正常肺类器官培养图；
图3为小鼠正常肺类器官共生长培养情况图；
图4为本发明细胞尺度下共生长培养和传统混合共培养示意图；
图5为传统混合类器官混合共培养结果图；
图6为小鼠正常肺类器官与肿瘤类器官按不同比例共生长培养情况图(a.1:1、b.1:5)；
图7为小鼠肿瘤荧光白光示意图：A小鼠食管肿瘤原位白光照片，B小鼠食管肿瘤绿色荧光图片，图中绿色荧光是肿瘤，C小鼠肿瘤肠系膜淋巴结转移白光图片，D小鼠食管淋巴结绿色荧光图片，图中绿色荧光是肿瘤，E小鼠淋巴结和原位肿瘤活体荧光示意图；
图8为小鼠食管癌原位肿瘤培养成的类器官和正常肺组织类器官共培养图；
图9为小鼠食管癌淋巴结肿瘤培养成的类器官和肺组织类器官共培养用绿色荧光染料CFSE标记肿瘤类器官的荧光成像图；
图10为小鼠正常肺类器官与肿瘤类器官共培养HE染色图(a、b、c、d为不同视野下的染色图)；
图11为小鼠正常肺类器官与肿瘤类器官共培养免疫荧光染色图(其中a为DAPI标记细胞核，所有细胞都显示蓝色荧光；b为Cas9抗体标记肿瘤细胞，显示黄色荧光；c为两种类器官融合)。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。
如在本说明书中使用的，术语“大约”，典型地表示为所述值的+/-5％，更典型的是所述值的+/-4％，更典型的是所述值的+/-3％，更典型的是所述值的+/-2％，甚至更典型的是所述值的+/-1％，甚至更典型的是所述值的+/-0.5％。
在本说明书中，某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解，这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如，范围的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及此范围内的单独数字，例如1，2，3，4，5和6。无论该范围的广度如何，均适用以上规则。
本发明所述的“类器官与类器官共生长平台”是指在特定体积的同一基质胶中同时生长不同的类器官，并研究类器官之间的相互作用。
本发明所述的“共培养”是指在有限的时间里，让正常类器官和肿瘤类器官共存于同一个空间，使肿瘤类器官对正常类器官完成转移和侵袭的过程。
本发明所述的“细胞尺度”是指细胞之间足够接近以至发生通信连接，以细胞之间是否发生融合作为判断标准。
所述“融合”是指在细胞膜的特定区域，通过膜蛋白、细胞骨架蛋白或者胞外基质形成的细胞与细胞之间、细胞与胞外基质之间的连接结构。
实施例1
构建肿瘤类器官与正常类器官共生长平台，然后检测肿瘤细胞在正常类器官中的转移情况。检测示意图见图1。
步骤一：培养患有肿瘤小鼠的原位肿瘤类器官；
步骤二：培养小鼠源肺类器官(正常类器官)，具体操作如下。
1.在预冷的PBS中反复漂洗肿瘤组织/正常肺组织。
2.用剪刀剪碎肿瘤组织和正常肺组织。
3.用15ml Trypsin在50mlBD管中重悬组织，加入10ul DNaseI，于37度水浴锅中消化1小时，期间每十分钟取出上下颠倒。
4.用等体积的DMEM+10％FBS中和Trypsin。
5.将第六步中的组织悬液通过70um的滤网。
6.1500rpm 10mins离心。
7.去上清，用5ml ACK于冰上重悬细胞，静置3mins。
8.1500rpm 5mins离心。
9.去上清，加120ul Matrigel于冰上重悬细胞，种在48孔板中，30ul/孔。
10.于37度孵箱中凝固15mins。
11.每孔加150ul培养基(正常肺组织每孔加入150ul培养基及表1中的细胞因子或小分子化合物；肿瘤组织每孔加入150ul培养基及表2中的细胞因子或小分子化合物)，并在周围加上PBS，防止蒸干。
12.每天观察，培养基变黄再更换新的培养基或者传代。肿瘤类器官培养5天；正常类器官培养7天。
可以理解的是，由于肿瘤类器官和正常的类器官所需要的细胞因子不同，一般是不能共同培养的。因为如果都从单细胞开始生长，往往只有正常细胞能发育成类器官。因此本发明的目的也不是要将这两种类器官进行传统意义上的共同培养。
步骤三：将小鼠的肿瘤类器官和肺类器官在细胞尺度下构建共生长平台，具体操作如下。
1.分别吸去肿瘤类器官和肺类器官的培养基；
2.分别加入500ul TrypLE 37℃反应10min，镜下观察基质胶松散但是类器官结构完整即可终止消化，吸去TrypLE，加入少量对应的肿瘤类器官培养基和正常类器官培养基，吹打混匀；
3.在显微镜下用枪尖吸出含有约3000个细胞的正常类器官，滴在96孔板的中央。
4.用同样的方法吸出肿瘤类器官，所述肿瘤类器官与所述正常类器官的数量比例为5:1；
5.加入30ul基质胶，37℃孵育，等基质胶凝固，加入肿瘤类器官的培养基150ul。
步骤四：显微镜下观察所述肿瘤类器官的转移定植情况。
表1正常类器官培养细胞因子/小分子化合物
其中，所述Glutamax为GIBCO产品；所述N2为GIBCO产品：N-2Supplement；所述B27为GIBCO产品：B27Supplement serum free。
表2肿瘤类器官培养细胞因子/小分子化合物
细胞因子 浓度 细胞因子 浓度
B27 50X稀释 N-acetylcysteine 1-5mM
EGF 50-100ng/ml Noggin 50-100ng/ml
FGF10 100-200ng/ml A83-01 100-200nM
Y-27632 10-20uM Nicotinamide 5-10mM
Glutamax 100X稀释 N2 100X稀释
Gastrin 1-5nM / /
其中，所述Glutamax为GIBCO产品；所述N2为GIBCO产品：N-2Supplement；所述B27为GIBCO产品：B27Supplement serum free。
实验结果：见图2和图3。
实施例2
传统肿瘤类器官与正常类器官共培养方法
步骤一、步骤二与实施例1相同。
步骤三：将两种类器官消化后，按照正常类器官细胞数量：肿瘤类器官细胞数量为1:5的比例制成细胞悬液，混合吹匀，一起加入基质胶培养。结果显示，由于表面张力等因素，各类器官之间仍存在一定的距离，无法建立通信连接。见图4两种不同方法构建肿瘤类器官与正常类器官共生长平台示意图。
实验结果：见图5。
实施例3
按照实施例1的方法，分别培养小鼠食管癌肿瘤类器官和正常肺原类器官。分别以肺正常类器官细胞数量：肿瘤类器官细胞数量为1：1-1：5(包括1:1、1:2、1:3、1:4、1:5)进行共生长培养(肺正常类器官细胞数量为3000个左右)。
实验结果：见图6。实验发现在基质胶体积一定的情况下，按1：5的比例培养时肿瘤类器官可以与正常类器官足够接近并且肿瘤类器官可以对正常类器官进行侵袭。详见图6b。而当正常类器官和肿瘤类器官以1：1-1：4(包括1:1、1:2、1:3和1:4)培养时，肿瘤类器官和正常类器官相距较远，发生接触和侵袭的几率较低，见图6a。为更直观的显示正常类器官和肿瘤类器官相距较远的情形，图6a选取了共培养比例1:1情况下的实验图。因此，在基质胶体积固定的情况下，通过控制共培养类器官的比例，实现类器官细胞在细胞尺度下接近，进而发生通信连接。
实施例4
按照实施例1的方法，测试了正常组织类器官共培养在一起是否会发生融合，经过测试，正常组织的类器官不论共培养多久都不会发生融合。结果显示正常类器官的细胞没有转移能力详见图3。
实施例5
按照实施例1的方法，将小鼠食管癌原位肿瘤培养成类器官，和肺组织类器官共生长培养。结果显示原位肿瘤类器官不会侵染小鼠正常肺类器官，进而说明原位肿瘤类器官不具有转移能力或转移能力较弱，详见图8。
实施例6
按照实施例1的方法，将小鼠食管癌淋巴结肿瘤培养成类器官，和肺组织类器官共生长培养，发现淋巴结类器官会侵染肺组织类器官，详见图7。进一步，用绿色荧光染料CFSE标记肿瘤类器官，进行荧光成像，发现肺类器官中有绿色荧光。结果显示，淋巴结类器官的细胞侵染了肺类器官，详见图9。
实施例7
按照实施例1的方法，将小鼠食管癌肿瘤培养成类器官，和正常肺组织类器官共生长培养，两种类器官共生长培养十天后，进行HE染色，结果显示肿瘤类器官的细胞正在融合正常类器官。详见图10。
实施例8
按照实施例1的方法，将小鼠食管癌淋巴结肿瘤培养成类器官，和正常肺组织类器官共生长培养，显示肿瘤类器官会侵染肺组织类器官。进一步，进行免疫荧光染色，以Cas9抗体标记肿瘤细胞，进行荧光成像，发现带有黄色荧光的肿瘤细胞正在侵袭不带黄色荧光的正常类器官。详见图11。
上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (6)

1.一种非诊断目的的基于类器官与类器官共生长平台测试肿瘤细胞对正常类器官发生转移和侵袭的方法，其特征在于，构建肿瘤类器官与正常类器官共生长平台，基于所述平台评估肿瘤细胞在正常类器官中的侵袭和转移情况，所述肿瘤类器官为小鼠食管癌肿瘤类器官，所述正常类器官为正常肺原类器官，具体步骤如下：
1）获取肿瘤组织消化为细胞，加入肿瘤类器官培养基培养为原位肿瘤类器官；
2）获取正常组织消化为细胞，加入正常类器官培养基培养为正常类器官；
3）将所述正常类器官先固定于基质胶中，以每30ul体积的基质胶固定2500-3500个细胞的正常类器官，然后吸取肿瘤类器官种入基质胶中，使两种类器官在细胞尺度上接近，所述肿瘤类器官与所述正常类器官的数量比例为5:1；
4）用荧光染料标记所述肿瘤类器官，光镜或荧光显微镜下观察带有荧光的肿瘤类器官是否发生转移，进而评判肿瘤细胞是否对正常类器官发生侵袭和转移。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肿瘤类器官培养基包括Matrigel基质胶和细胞因子，所述细胞因子包括B27、EGF、FGF10、Y-27632、Glutamax、Gastrin、N-acetylcysteine、Noggin、A83-01、Nicotinamide或N2中的一种或多种。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细胞因子包括浓度为50X稀释的B27、50-100ng/ml 的EGF、100-200ng/ml 的FGF10、10-20uM 的Y-27632、100X稀释的Glutamax、1-5nM 的Gastrin、1-5mM 的N-acetylcysteine、50-100ng/ml 的Noggin、100-200nM 的A83-01、5-10mM 的Nicotinamide或100X稀释的N2中的一种或多种。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述正常类器官培养基包括Matrigel基质胶和细胞因子，所述细胞因子包括B27、EGF、R-spondin 1、FGF10、Y-27632、Glutamax、Gastrin、N-acetylcysteine、Noggin、A83-01、Nicotinamide、WNT3a或N2中的一种或多种。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述细胞因子包括浓度为50X稀释的B27、50-100ng/ml 的EGF、150-250ng/ml 的R-spondin 1、50-100ng/ml 的FGF10、10-20uM 的Y-27632、100X稀释的Glutamax、1-5nM 的Gastrin、1-10mM 的N-acetylcysteine、100-200ng/ml 的Noggin、100-200nM 的A83-01、10-20mM 的Nicotinamide、25-30ng/ml 的WNT3a或100X稀释的N2中的一种或多种。
6.权利要求1-5任一项所述的方法在制备非诊断目的的体外肿瘤转移检测模型中的应用，其特征在于，所述模型为肿瘤类器官与类器官共生长模型。
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