JP2020006207A - 組織再生培養細胞シート、製造方法及びその利用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
軟骨組織由来の細胞の培養物から形成された軟骨修復用細胞シートであって、
前記細胞シートは2型コラーゲンに対する抗体を用いた免疫染色において陰性を示すものであり、
前記軟骨組織由来の細胞は、滑膜に由来するものでなく、且つ、
前記培養物は、FBSを含むDMEM/F12培地において前記軟骨組織由来の細胞を培養して得られたものであり、当該DMEM/F12培地は、TGF−βを含まない、
前記細胞シートを提供する。
また、本発明は、
軟骨組織由来の細胞の培養物から形成された軟骨修復用細胞シートであって、
前記細胞シートは2型コラーゲンに対する抗体を用いた免疫染色において陰性を示すものであり、
前記軟骨組織由来の細胞は、滑膜に由来するものでなく、
前記培養物は、FBSを含むDMEM/F12培地において前記軟骨組織由来の細胞を培養して得られたものであり、且つ、
当該細胞シートは、動物への移植後に、2型コラーゲンに対する免疫染色において陽性を示すものである、
前記細胞シートも提供する。
また、本発明は、
軟骨組織由来の細胞の培養物から形成された軟骨修復用細胞シートであって、
前記細胞シートは2型コラーゲンに対する抗体を用いた免疫染色において陰性を示すものであり、
前記軟骨組織由来の細胞は、滑膜に由来するものでなく、
前記培養物は、FBSを含むDMEM/F12培地において前記軟骨組織由来の細胞を培養して得られたものであり、当該DMEM/F12培地は、TGF−βを含まず、且つ、
当該細胞シートは、動物への移植後に、2型コラーゲンに対する免疫染色において陽性を示すものである、
前記細胞シートも提供する。
前記細胞シートは、1型コラーゲンに対する抗体を用いた免疫染色において陽性を示すものでありうる。
前記細胞シートは、サフラニンO染色に対して陰性を示すものでありうる。
前記細胞シートは、アグリカンに対する抗体を用いた免疫染色において陽性を示すものでありうる。
前記細胞シートにおいて、前記細胞は、多指症の動物の軟骨組織に由来するものでありうる。
前記細胞シートにおいて、前記細胞は、間葉系幹細胞を含むものでありうる。
軟骨組織由来の細胞の培養物から形成された軟骨修復用細胞シートの製造方法であって、
前記方法は、温度応答性ポリマーが固定化された面を有する膜の当該面上で、軟骨組織由来の細胞を培養して前記細胞シートを得ることを含み、
前記軟骨組織由来の細胞は、滑膜に由来するものでなく、
前記培養は、FBSを含むDMEM/F12培地において行われ、当該DMEM/F12培地は、TGF−βを含まず、且つ
前記培養は、前記細胞シートが、2型コラーゲンに対する抗体を用いた免疫染色において陽性を示す前に終了される、
前記製造方法も提供する。
また、本発明は、
軟骨組織由来の細胞の培養物から形成された軟骨修復用細胞シートの製造方法であって、
前記方法は、温度応答性ポリマーが固定化された面を有する膜の当該面上で、軟骨組織由来の細胞を培養して前記細胞シートを得ることを含み、
前記軟骨組織由来の細胞は、滑膜に由来するものでなく、
前記培養は、FBSを含むDMEM/F12培地において行われ、
前記培養は、前記細胞シートが、2型コラーゲンに対する抗体を用いた免疫染色において陽性を示す前に終了され、且つ
当該細胞シートは、動物への移植後に、2型コラーゲンに対する免疫染色において陽性を示すものである
前記製造方法も提供する。
また、本発明は、
軟骨組織由来の細胞の培養物から形成された軟骨修復用細胞シートの製造方法であって、
前記方法は、温度応答性ポリマーが固定化された面を有する膜の当該面上で、軟骨組織由来の細胞を培養して前記細胞シートを得ることを含み、
前記軟骨組織由来の細胞は、滑膜に由来するものでなく、
前記培養は、FBSを含むDMEM/F12培地において行われ、当該DMEM/F12培地は、TGF−βを含まず、
前記培養は、前記細胞シートが、2型コラーゲンに対する抗体を用いた免疫染色において陽性を示す前に終了され、且つ
当該細胞シートは、動物への移植後に、2型コラーゲンに対する免疫染色において陽性を示すものである
前記製造方法も提供する。
前記製造方法において、前記細胞シートは、前記培養終了時に1型コラーゲンに対する抗体を用いた免疫染色において陽性を示しうる。
前記製造方法において、前記培養は、前記細胞シートがアグリカンに対する抗体を用いた免疫染色において陽性を示すまで継続されうる。
前記製造方法において、前記培養は、サフラニンO染色に対して陽性を示す前に終了されうる。
前記製造方法において、前記面上の前記ポリマーの固定化量が0.3〜5.0μg/cm2でありうる。
前記製造方法において、前記膜が多孔膜であり、前記培養において、前記細胞は、前記多孔膜の上側の培地と接し、且つ、前記多孔膜の下側の培地と前記多孔膜の孔を介して接していてもよい。
前記製造方法において、前記培養は、セルカルチャーインサートを用いて行われてもよい。
本発明の細胞シートを患部へ施与する際に、生体内で使用可能な接着剤による接合又は縫合が行われてもよい。又は、当該接合又は縫合を行うことなく、当該細胞シートを単に患部に付着させるだけでもよい。
前記軟骨組織由来の細胞は、好ましくは、滑膜に由来するものでない。すなわち、本発明の細胞シートは、好ましくは、滑膜由来の細胞の培養物から形成されたものでなく、滑膜細胞の培養物から形成されたものでもない。
アウトグロース法は器材表面へ接する組織断片の面積が小さいほど効率的に細胞が採取出来るため、組織片の大きさは好ましくは5mm2以下、より好ましくは2mm2以下、さらにより好ましくは1mm2以下でありうる。また、細胞を得る為にアウトグロース法において用いた組織片を、再度アウトグロース法に用いることで、一つの組織片からより多くの細胞を採取することもできる。一つの組織片に対してアウトグロース法が行われる回数は、好ましくは5回以下、より好ましくは3回以下、さらにより好ましくは2回以下でありうる。一つの組織片に対してアウトグロース法が5回超行われると、得られる細胞、特には間葉系幹細胞、の生存率が低下し、製造された細胞シートによる軟骨の修復が効率的に行われない場合がある。
軟骨組織は2型コラーゲン陽性である。そのため、軟骨修復用移植片の開発において一般的には移植片が2型コラーゲン陽性であることが必要と考えられていた。本発明者らは、2型コラーゲンに対する抗体を用いた免疫染色において陰性を示す細胞シートが軟骨修復に適していることを発見した。本発明は、当該発見に基づくものである。本発明の細胞シートは、2型コラーゲン陰性であるにもかかわらず、軟骨の修復に適している。
軟骨組織はサフラニンO染色で陽性を示す。そのため、軟骨修復用移植片の開発において一般的には移植片がサフラニンO染色で陽性であることが必要と考えられていた。本発明の細胞シートは、サフラニンO染色で陰性を示すにもかかわらず、軟骨の修復に適している。
タンパク質分解酵素による処理は、細胞−細胞間のデスモソーム構造及び細胞−基材間の基底膜様タンパク質の分解をもたらし、その結果、剥離された細胞シート中の細胞が個々に分かれていることがある。一方、本発明の製造方法により得られた細胞シートは、タンパク質分解酵素により処理を行わずに、培地の温度を変化させることによって多孔膜から剥離されうる。その結果、上記デスモソーム構造が保持され、且つ、細胞シートの構造的欠陥が少なく、その強度はより高いものでありうる。また、本発明の製造方法により得られた細胞シートを培地の温度を変化させることによって多孔膜から剥離した場合は、上記基底膜様タンパク質も酵素により破壊されていない。そのため、移植時において患部組織とより良好に接着することができ、効率良い治療を実施することができる。
タンパク質分解酵素であるディスパーゼは、上記デスモソーム構造を10〜60%保持した状態で細胞シートを剥離させることができることで知られているが、上記基底膜様タンパク質を殆ど破壊してしまうため、得られる細胞シートの強度は弱い。
本発明の製造方法により製造された細胞シートは、上記デスモソーム構造及び上記基底膜様タンパク質をいずれも80%以上残存した状態で多孔膜から剥離されうる。
前記(メタ)アクリルアミド化合物は例えば、アクリルアミド又はメタクリルアミドでありうる。
前記N−アルキル置換(メタ)アクリルアミド誘導体は例えば、N−エチルアクリルアミド(単独重合体の下限臨界溶液温度72℃)、N−n−プロピルアクリルアミド(同21℃)、N−n−プロピルメタクリルアミド(同27℃)、N−イソプロピルアクリルアミド(同32℃)、N−イソプロピルメタクリルアミド(同43℃)、N−シクロプロピルアクリルアミド(同45℃)、N−シクロプロピルメタクリルアミド(同60℃)、N−エトキシエチルアクリルアミド(同約35℃)、N−エトキシエチルメタクリルアミド(同約45℃)、N−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド(同約28℃)、又はN−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド(同約35℃)でありうる。
前記N,N−ジアルキル置換(メタ)アクリルアミド誘導体は例えば、N,N−ジメチル(メタ)アクリルアミド、N,N−エチルメチルアクリルアミド(単独重合体の下限臨界溶液温度56℃)、又はN,N−ジエチルアクリルアミド(同32℃)でありうる。
前記ビニルエーテル誘導体は例えば、メチルビニルエーテル(単独重合体の下限臨界溶液温度35℃)でありうる。
本発明において、温度応答性ポリマーとして、上記モノマー以外のモノマーとの共重合体が用いられてもよく、重合体同士をグラフト重合若しくは共重合したもの、又は重合体若しくは共重合体の混合物を用いてもよい。また、重合体本来の性質を損なわない範囲で架橋が行われてもよい。
本発明における培養又は剥離により適した臨界溶解温度を有する温度応答性ポリマーを選択するために、又は、多孔膜と培養物との間の相互作用を調節するために、又は、多孔膜の面の親水性又は疎水性を調整するために、上記ポリマーが適宜選択されうる。
好ましい実施態様において、前記温度応答性ポリマーは、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)である。
前記化学的な反応によって結合させる方法において、例えば電子線照射(EB)、γ線照射、紫外線照射、可視光照射、LED照射、プラズマ処理、又はコロナ処理が行われうる。あるいは、ラジカル反応、アニオンラジカル反応、カチオンラジカル反応等の一般に用いられる有機反応により温度応答性ポリマーが多孔膜に固定化されてもよい。また、水不溶性ポリマーセグメントと温度応答性ポリマーセグメントが結合した構造をとるブロックコポリマーを基材表面に温度応答性ポリマー分として被覆してもよい。物理吸着やハイドロフォビックによる固定化をさせてもよい。
前記物理的な相互作用によって結合させる方法において、温度応答性ポリマー又は当該ポリマーと任意の媒体との混合物が多孔膜に塗布されうる。
また、本発明の製造方法において培地は無血清培地であってもよい。ITSなどの添加因子は、血清の機能を代替することができるので、当該添加因子を培地に含めることで、無血清培地において本発明の製造方法における培養が行われうる。また、無血清培地を用いることで、ヒトへの移植に際して生物原料資源を用いることのリスクが回避されうる。
前記状態における培養のために、例えばセルインサート(セルカルチャーインサートとも呼ばれる)又は同様の構造体を有する培養容器が用いられうる。例えば、多孔膜部分に温度応答性ポリマーを固定化したセルインサートを有する培養容器が、本発明の製造方法において用いられうる。当該多孔膜の温度応答性ポリマーを固定化した面上で前記細胞集団の培養が行われうる。
当該温度応答性ポリマーの固定化は当業者に既知の方法によって行われてよく、例えば、特開平2-211865号公報に記載の方法により行われてよい。また、温度応答性ポリマーが固定化されるセルインサートは市販入手可能なものが用いられてよく、例えば、Thermo Scientific(商標)Nunc(商標)CCインサート#140660、BD Falcon セルカルチャーインサート#353090、#353490、353102、#353091、#353092、#353093が用いられうる。
本発明の製造方法において、低酸素培養が採用されてもよい。例えば酸素濃度20%未満、好ましくは15%以下、より好ましくは10%以下、さらにより好ましくは5%以下、最も好ましくは2%以下の雰囲気下で培養が行われうる。但し、酸素濃度は0%超であることが必要である。低酸素濃度下で細胞を培養することによって、軟骨細胞増殖能が亢進し、より効率的に細胞シートが産生されうる。また、低酸素濃度下で細胞を培養することによって、細胞外基質、特には軟骨特異的基質がより効率よく合成されるとともに、軟骨組織又は骨組織の修復に寄与する液性因子及び/又はタンパク質の産生が促進されうる。
(1)培養液温度を上限臨界溶解温度以上または下限臨界溶解温度以下とし、
(2)キャリアとしての支持膜を細胞シートに重ね、好ましくは支持膜と細胞シートとを密着させ、
(3)細胞シートをキャリアと共に多孔膜から剥離する。
例えば上記した円形であり且つ中心部に穴の開いたPVDFシートをキャリアとして用いた場合、PVDFシートと細胞シートとを一緒に患部に施与した後に、例えばレーザー光によって当該細胞シートを切断することで、患部以外の部分への細胞シートの付着が回避されうる。
細胞シートがティシュー・テックO.C.T.コンパウンド(4583、サクラファインテックジャパン株式会社)に包埋され、そして、凍結切片が作製された。当該細胞シートの凍結切片は、図1に示されるとおり、温度応答性培養皿に接していた面に対して垂直に薄切された。図1において、矢印の方向が薄切の方向であり、及び、点線が切断面を示す。薄切された切片の厚みは、当該切片を免疫染色に付す場合は20μmであり、及び、免疫染色以外の染色に付す場合は10μmであった。薄切された凍結切片は、スライドガラスに載せられ、4%PFA/PBSで室温10分間固定化処理され以下で述べる染色に付された。
組織学的分析に用いられた試薬類は以下の手順で調製された。
ヘマトキシリン水溶液:フラスコにイオン交換水を入れて、沸騰させる。沸騰したイオン交換水にヘマトキシリン(品番:1.15938、製造会社名:MERCK)1.5gを添加し、スターラーでヘマトキシリンを溶解させる。攪拌しながら、溶解液を室温に下げる。当該溶解液に酢酸(017-00256、和光純薬株式会社)を加えてpH3.0に調整する。当該溶解液に、ヨウ素酸ナトリウム(190-02252、和光純薬株式会社)0.3gを加え攪拌し、そして、アンモニウムみょうばん(018-01825、和光純薬)75gを加え攪拌する。撹拌後、イオン交換水を加えて1Lとし、そして、濾過してヘマトキシリン水溶液を得る。
エオシン溶液:ピュアエオシン液(3204-2、武藤化学)30mLと95%エタノール120mLとを混合してエオシン液を作成する。染色において用いるときに時に、当該エオシン液は95%エタノールで5倍希釈して、希釈された溶液がエオシン溶液として用いられる。
ファストグリーン水溶液:ファストグリーン(1A304、CHROMA)80mgをイオン交換水100mLで溶解し、そして、当該溶解液を濾過して、0.08質量%ファストグリーン水溶液を得る。
サフラニンO水溶液:サフラニンO(1B463、CHROMA)100mgをイオン交換水100mLで溶解し0.1質量%サフラニンO水溶液を得る。
クエン酸緩衝液:クエン酸一水和物をイオン交換水で溶解し、0.01Mクエン酸水溶液(以下A液という)を得る。クエン酸三ナトリウム2水和物をイオン交換水で溶解し。0.1Mクエン酸ナトリウム水溶液(以下B液という)を得る。A液95mL及びB液415mLを合わせ攪拌し、そして、1N NaOHでpH6.0に調整して、0.01Mクエン酸緩衝液を得る。
1.前処理
前記切片の100%エタノールへの10分間の浸漬が1回行われた。
2.水洗処理
上記1.で処理された切片が、水で洗浄された。
3.イオン交換水への浸漬
上記2.の水洗後、当該切片が、イオン交換水に5分間浸漬された。
4.ヘマトキシリン処理
上記3.の浸漬後、当該切片が、前記ヘマトキシリン水溶液中に4〜5秒間浸漬された。
5.水洗処理
上記4.の処理後、当該切片が、お湯(50℃)で3〜4分間洗浄された。
6.ファストグリーン処理
上記5.の洗浄後、当該切片が、前記0.08質量%ファストグリーン水溶液中に10分間浸漬された。
7.酢酸処理
上記6.の処理後、当該切片が、1体積%酢酸水溶液によって1又は2回処理された。
8.サフラニン処理
上記7.の処理後、当該切片が、前記0.1質量%サフラニンO水溶液中に10分間浸漬された。
9.脱水
上記8.の処理後、当該切片が、エタノール列を用いて脱水された。当該エタノール列は、7つの100体積%エタノールであった。
10.透徹
上記9.の脱水後、当該切片が、キシレン列を用いて透徹された。すなわち、キシレンが入った容器を7つ用意し、当該切片は、各容器中のキシレンに浸漬された。
11.封入
上記10.の透徹後、当該切片を封入した。当該封入において、封入剤としてMalinol(品番:2009-3、会社名:武藤化学株式会社)を用いた。
上記「細胞シートのI型コラーゲン染色」の「10.一次抗体反応」及び「12.二次抗体反応」において用いた試薬を変更した以外は、同じ方法でアグリカン染色が行われた。一次抗体反応において用いた抗体は、Goat anti-human-aggrecan (SC006、R&D、BlockAidTM Blocking Solution(Thermo Fisher Scientific Inc.、Catalog no. B10710)で10 mg/mLに希釈)であった。二次抗体反応において用いた試薬は、Donkey anti-Goat IgG(H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546(Thermo Fisher Scientific Inc.、A-11056)であった。
上記「細胞シートのI型コラーゲン染色」の「10.一次抗体反応」及び「12.二次抗体反応」において用いた試薬を変更した以外は、同じ方法でアグリカン染色が行われた。一次抗体反応において用いた抗体は、Anti-Fibronectin mIgG (MAB1940、Chemicon、1% Goat Normal Serumで0.2μg/mLに希釈)であった。二次抗体反応において用いた試薬は、F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG(H+L)Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488(Thermo Fisher Scientific Inc.、A-11017)であった。
1.前処理
切片の100%エタノールへの5分間の浸漬が3回行われた。次に、当該切片の70%エタノールへの5分間の浸漬が1回行われた。
2.水洗処理
上記1.で処理された切片が、水で洗浄された。
3.イオン交換水への浸漬
上記2.の水洗後、当該切片が、イオン交換水に5分間浸漬された。
4.抗原賦活化処理
上記3.の浸漬後、当該切片が、前記クエン酸緩衝液中に、98℃で10分間浸漬された。
5.イオン交換水への浸漬
上記4.の処理後、当該切片のイオン交換水への5分間の浸漬が3回行われた。
6.過酸化水素含有メタノール溶液への浸漬
上記5.の浸漬後、当該切片が、過酸化水素含有メタノール溶液(0.3質量%H2O2)中に15分間浸漬された。
7.イオン交換水への浸漬
上記6.の浸漬後、当該切片のイオン交換水への5分間の浸漬が3回行われた。
8.PBS洗浄
上記7.の浸漬後、当該切片の0.01M PBSへの5分間の浸漬が3回行われた。
9.血清によるブロッキング
上記8.の洗浄後、当該切片が、2.5% normal horse serum(VECTOR社のImmPRESS HRP REAGENT KIT Anti-GOAT IgG(#MP-7405)に添付されている血清)中に10分間浸漬された。
10.一次抗体反応
上記9.のブロッキング後、当該切片が、I型コラーゲンに対する抗体(1310−01、SouthernBiotech社、0.01MのPBSによる1:100希釈)を用いた一次抗体反応に2時間付された。
11.PBS洗浄
上記10.の反応後、当該切片の0.01M PBSへの5分間の浸漬が3回行われた。
12.二次抗体反応
上記11.の洗浄後、当該切片が、ImmPRESS Polymer Anti−Goat IgG Reagent (MP−7405、Vector Laboratories)を用いた二次抗体反応に1時間付された。
13.PBS洗浄
上記12.の反応後、当該切片の0.01M PBSへの5分間の浸漬が3回行われた。
14.発色
上記13.の洗浄後、当該切片が、DAB(0.05M Tris−HCl (200ml)、DAB(40 mg)、30% H2O2 (34μl))による発色反応に2分間付された。
15.イオン交換水への浸漬
上記14.の発色反応後、当該切片が、イオン交換水に5分間浸漬された。
16.核染色
上記15.の浸漬後、当該切片が、前記ヘマトキシリン水溶液によって2秒間処理された。
17.水洗処理
上記16.の処理後、当該切片が水で洗浄された。
18.脱水、透徹、及び封入
上記「細胞シートのサフラニンO染色」において述べたとおりに、これらの処理が行われた。
上記「細胞シートのI型コラーゲン染色」の「10.一次抗体反応」及び「12.二次抗体反応」において用いた試薬を変更した以外は、同じ方法でII型コラーゲン染色が行われた。一次抗体反応において用いた抗体は、II型コラーゲン1次抗体 (協和ファーマケミカル株式会社、0.01MのPBSにより1:100希釈したもの)であった。二次抗体反応において用いた試薬は、ImmPRESS Polymer Anti−Mouse IgG Reagent(MP−7402、Vector Laboratories社)であった。
軟骨部分が固定化され、そして、パラフィン中に包埋された。固定化は、20%ホルマリンに浸漬することにより行われた。包埋は、包埋剤としてヒストプレップ586(415-25791、和光純薬株式会社)を用い且つエンベディングコンソールシステム(Tissue-Tek、サクラファインテックジャパン株式会)により行われた。包埋された試料を立位の状態としたときに垂直方向に薄切された。薄切された切片の厚みは、当該切片を免疫染色に付す場合は20μmであり、及び、免疫染色以外の染色に付す場合は10μmであった。薄切された切片は、スライドガラスに載せられ、以下で述べる染色に付された。
1.脱パラフィン処理
切片のキシレンへの5分間の浸漬が3回行われた。次に、当該切片の100%エタノールへの5分間の浸漬が3回行われた。次に、当該切片の70%エタノールへの5分間の浸漬が1回行われた。
2.水洗処理
上記1.の処理後、当該切片が水で洗浄された。
3.イオン交換水への浸漬
上記2.の水洗後、当該切片がイオン交換水に5分間浸漬された。
4.ヘマトキシリン処理
上記3.の浸漬後、当該切片が、前記ヘマトキシリン水溶液中に3〜4分間浸漬された。
5.水洗処理
上記4.の処理後、当該切片が、お湯(50℃)で3〜4分間洗浄された。
6.エオシン処理
上記5.の洗浄後、当該切片が、前記エオシン溶液中に10分間浸漬された。
7.脱水、透徹、及び封入
上記「細胞シートのサフラニンO染色」において述べたとおりに、これらの処理が行われた。
上記「細胞シートのサフラニンO染色」における「1.前処理」の代わりに上記「軟骨のヘマトキシリン及びエオシン染色」で述べた「1.脱パラフィン処理」が行われたこと以外は、上記「細胞シートのサフラニンO染色」と同じ方法で染色が行われた。
上記「細胞シートのI型コラーゲン染色」における「1.前処理」の代わりに上記「軟骨のヘマトキシリン及びエオシン染色」で述べた「1.脱パラフィン処理」が行われたこと以外は、上記「細胞シートのI型コラーゲン染色」と同じ方法で染色が行われた。
上記「細胞シートのII型コラーゲン染色」における「1.前処理」の代わりに上記「軟骨のヘマトキシリン及びエオシン染色」で述べた「1.脱パラフィン処理」が行われたこと以外は、上記「細胞シートのII型コラーゲン染色」と同じ方法で染色が行われた。
1.脱パラフィン処理
上記「ヘマトキシリン及びエオシン染色」で述べたとおりに、脱パラフィン処理が行われた。
2.水洗処理
上記1.の脱パラフィン処理後、当該切片が水で洗浄された。
3.イオン交換水への浸漬
上記2.の水洗後、当該切片が、イオン交換水に5分間浸漬された。
4.抗原賦活化
上記3.の浸漬後、当該切片が、前記クエン酸緩衝液中に、98℃で10分間浸漬された。
5.冷却
上記4.の処理後、当該切片が、実験台で30分間冷却された。
6.血清によるブロッキング
上記5.の冷却後、当該切片が、5%のnormal goat serum(品番:D204-00-0100、会社名:ROCKLAND)を含む0.01M PBS(0.2%のTweenを含む)により1時間処理された。
7.抗体反応
上記6.のブロッキング後、当該切片が、anti−human Vimentin抗体Alexa Fluor 647 Conjugate (#9856、CST社、0.01MのPBSで1:100 希釈)を用いた抗体反応に4℃で16時間付された。
8.PBS洗浄
上記7.の反応後、当該切片の0.01M PBSへの5分間の浸漬が3回行われた。
9.封入
上記8.の洗浄後、当該切片が、VECTASHIELD HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI(Vector Laboratories社)を用いて封入された。
[1]軟骨組織由来の細胞の培養物から形成された軟骨修復用細胞シートであって、
前記細胞シートは2型コラーゲンに対する抗体を用いた免疫染色において陰性を示すものである、前記細胞シート。
[2]1型コラーゲンに対する抗体を用いた免疫染色において陽性を示すものである、[1]に記載の細胞シート。
[3]サフラニンO染色に対して陰性を示すものである、[1]又は[2]に記載の細胞シート。
[4]アグリカンに対する抗体を用いた免疫染色において陽性を示すものである、[1]〜[3]のいずれか一つに記載の細胞シート。
[5]前記細胞が、多指症の動物の軟骨組織に由来するものである、[1]〜[4]のいずれか一つに記載の細胞シート。
[6]前記細胞が、間葉系幹細胞を含むものである、[1]〜[5]のいずれか一つに記載の細胞シート。
[7]軟骨組織由来の細胞の培養物から形成された軟骨修復用細胞シートの製造方法であって、
前記方法は、温度応答性ポリマーが固定化された面を有する膜の当該面上で、軟骨組織由来の細胞を培養して前記細胞シートを得ることを含み、
前記培養は、前記細胞シートが、2型コラーゲンに対する抗体を用いた免疫染色において陽性を示す前に終了される、
前記製造方法。
[8]前記細胞シートが、前記培養終了時に1型コラーゲンに対する抗体を用いた免疫染色において陽性を示す、[7]に記載の製造方法。
[9]前記培養は、前記細胞シートがアグリカンに対する抗体を用いた免疫染色において陽性を示すまで継続される、[7]又は[8]に記載の製造方法。
[10]前記培養は、サフラニンO染色に対して陽性を示す前に終了される、[7]〜[9]のいずれか一つに記載の製造方法。
[11]前記面上の前記ポリマーの固定化量が0.3〜5.0μg/cm2である、[7]〜[10]のいずれか一つに記載の製造方法。
[12]前記膜が多孔膜であり、
前記培養において、前記細胞は、前記多孔膜の上側の培地と接し、且つ、前記多孔膜の下側の培地と前記多孔膜の孔を介して接している、[7]〜[11]のいずれか一つに記載の製造方法。
[13]前記培養が、セルカルチャーインサートを用いて行われる、[7]〜[12]のいずれか一つに記載の製造方法。
Claims (17)
- 軟骨組織由来の細胞の培養物から形成された軟骨修復用細胞シートであって、
前記細胞シートは2型コラーゲンに対する抗体を用いた免疫染色において陰性を示すものであり、
前記軟骨組織由来の細胞は、滑膜に由来するものでなく、且つ、
前記培養物は、FBSを含むDMEM/F12培地において前記軟骨組織由来の細胞を培養して得られたものであり、当該DMEM/F12培地は、TGF−βを含まない、
前記細胞シート。 - 軟骨組織由来の細胞の培養物から形成された軟骨修復用細胞シートであって、
前記細胞シートは2型コラーゲンに対する抗体を用いた免疫染色において陰性を示すものであり、
前記軟骨組織由来の細胞は、滑膜に由来するものでなく、
前記培養物は、FBSを含むDMEM/F12培地において前記軟骨組織由来の細胞を培養して得られたものであり、且つ、
当該細胞シートは、動物への移植後に、2型コラーゲンに対する免疫染色において陽性を示すものである、
前記細胞シート。 - 軟骨組織由来の細胞の培養物から形成された軟骨修復用細胞シートであって、
前記細胞シートは2型コラーゲンに対する抗体を用いた免疫染色において陰性を示すものであり、
前記軟骨組織由来の細胞は、滑膜に由来するものでなく、
前記培養物は、FBSを含むDMEM/F12培地において前記軟骨組織由来の細胞を培養して得られたものであり、当該DMEM/F12培地は、TGF−βを含まず、且つ、
当該細胞シートは、動物への移植後に、2型コラーゲンに対する免疫染色において陽性を示すものである、
前記細胞シート。 - 1型コラーゲンに対する抗体を用いた免疫染色において陽性を示すものである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の細胞シート。
- サフラニンO染色に対して陰性を示すものである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の細胞シート。
- アグリカンに対する抗体を用いた免疫染色において陽性を示すものである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の細胞シート。
- 前記細胞が、多指症の動物の軟骨組織に由来するものである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の細胞シート。
- 前記細胞が、間葉系幹細胞を含むものである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の細胞シート。
- 軟骨組織由来の細胞の培養物から形成された軟骨修復用細胞シートの製造方法であって、
前記方法は、温度応答性ポリマーが固定化された面を有する膜の当該面上で、軟骨組織由来の細胞を培養して前記細胞シートを得ることを含み、
前記軟骨組織由来の細胞は、滑膜に由来するものでなく、
前記培養は、FBSを含むDMEM/F12培地において行われ、当該DMEM/F12培地は、TGF−βを含まず、且つ
前記培養は、前記細胞シートが、2型コラーゲンに対する抗体を用いた免疫染色において陽性を示す前に終了される、
前記製造方法。 - 軟骨組織由来の細胞の培養物から形成された軟骨修復用細胞シートの製造方法であって、
前記方法は、温度応答性ポリマーが固定化された面を有する膜の当該面上で、軟骨組織由来の細胞を培養して前記細胞シートを得ることを含み、
前記軟骨組織由来の細胞は、滑膜に由来するものでなく、
前記培養は、FBSを含むDMEM/F12培地において行われ、
前記培養は、前記細胞シートが、2型コラーゲンに対する抗体を用いた免疫染色において陽性を示す前に終了され、且つ
当該細胞シートは、動物への移植後に、2型コラーゲンに対する免疫染色において陽性を示すものである
前記製造方法。 - 軟骨組織由来の細胞の培養物から形成された軟骨修復用細胞シートの製造方法であって、
前記方法は、温度応答性ポリマーが固定化された面を有する膜の当該面上で、軟骨組織由来の細胞を培養して前記細胞シートを得ることを含み、
前記軟骨組織由来の細胞は、滑膜に由来するものでなく、
前記培養は、FBSを含むDMEM/F12培地において行われ、当該DMEM/F12培地は、TGF−βを含まず、
前記培養は、前記細胞シートが、2型コラーゲンに対する抗体を用いた免疫染色において陽性を示す前に終了され、且つ
当該細胞シートは、動物への移植後に、2型コラーゲンに対する免疫染色において陽性を示すものである
前記製造方法。 - 前記細胞シートが、前記培養終了時に1型コラーゲンに対する抗体を用いた免疫染色において陽性を示す、請求項9〜11のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記培養は、前記細胞シートがアグリカンに対する抗体を用いた免疫染色において陽性を示すまで継続される、請求項9〜12のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記培養は、サフラニンO染色に対して陽性を示す前に終了される、請求項9〜13のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記面上の前記ポリマーの固定化量が0.3〜5.0μg/cm2である、請求項9〜14のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記膜が多孔膜であり、
前記培養において、前記細胞は、前記多孔膜の上側の培地と接し、且つ、前記多孔膜の下側の培地と前記多孔膜の孔を介して接している、請求項9〜15のいずれか一項に記載の製造方法。 - 前記培養が、セルカルチャーインサートを用いて行われる、請求項9〜16のいずれか一項に記載の製造方法。
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