CZ20001771A3 - Tkáňová kostra pro transplantační chirurgii - Google Patents

Abstract

Řešení se týká tkáňové kostry pro transplantační chirurgii se sendvičovou strukturou obsahující plošný substrát a vrstvu kultivovaných buněk tělesného povrchu přiléhajících na plošný substrát. Řešení se vyznačuje tím, že se kultivace buněk povrchu těla provádí tak, aby alespoň 10 % buněk povrchu těla nebylo kontaktně inhibováno a aby substrát vykazoval vstřebatelný nosný materiál s modulem pružnosti raději menším než 1 N/mm2.

Description

Tkáňová kostra pro tranšplantační chirurgii

Popis

Vynález se týká „tkáňové kostry pro tranšplantační chirurgii sé sendvičovou, strukturou obsahující plošný substrát a vrstvu kultivovaných buněk povrchu těla přiléhajících na plošném substrátu. - Výrazem tkáňová kostra máme na' mysli předmět, který vykazuje živé buňky na neživoucím substrátu. Při tom néní tkání nutně myšlen buněčný svazek jako· ten, který se vyskytuje v organismu.. Zejména pak nemusí výraz tkáň v rámci vynálezu nutně označovat shluk buněk, ve kterém na .základě buněčného růstu popř. buněčné prolíferace už ve značné míře došlo ke kontaktní inhibici;

Tkáňové kostry se obzvláště používají jako umělé kůže k uzavírání a regeneraci ran, obzvlášť . popálenin. Regenerace je potřebná, pokud pacientovi chybí větší plocha epidermis a dermis, například na základě excize spálené, kůže .nebo. .ji,zvově tkáně potřebné u těžkých popálenin. Regenerací jé myšleno vytváření nové epidermis a dermis v oblasti postiženého místa. Tkáňové, kostry se dají použít k zavírání jiných poškozených ran (vrozených, při poruchách prokrvování a. jiných) . ,

11/05/2000 18:43 +49-30-28305225

V

A.L&J, BERLIN

S. 05

Tkáňové kostry základního složení zmíněného úvodem jsou uvedeny například v literatuře US-A 5, 131, '90.7, US-A. 5 .273, 900 (zde je podáno rozsáhlé zobrazení pozadí technologických souvislostí), ÍUS-A 5, 282, 859, US-A 5, 800, 537 . a. US-A 5, 888, 248. Tomuto stavu techniky je společné,· že se jako substrát používá kolagen·a že buňky povrchu těla jsou kultivovány do hustého povrchového růstu, tedy ve více vrstvách a s plně vytvořenou kontaktní inhibici. Vytváří se tedy úplná tkáň (ve vlastním smyslu slova) in vitro. Použití kolagenu jako substrátů má několik nevýhod. Zaprvé není kolagen, ať už zesítěný nebo nezesítěný, dostatečně pružný popř. není dostatečně . elasticky poddajný, aby se dal u (třídimenzionálních) komplexních ’ forem ran přiléhavě nanést na celou. oblast rány. Dokonalé přilnutí je však podstatný;předpoklad pro narůstání buněk povrchu těla na tkáň. pacienta. Dále je kolagen neprůhledný popř. mléčně kalný, čímž je. při. kultivaci buněk povrchu těla na kolagenu '· znesnadněno světelné mikroskopické pozorování buněk. Celkově se ukazuje, že potud známé tkáňové kostry nenarůstají dostatečně jistě, čímž budou .v případě nenarůstání nutně potřebné opakované léčby umělou kůží a/nebo transplantacemi.

Pro. biokompatibilnl. a v daném případě i vstřebatelné membrány a materiály, je kolagen jako takový mnohokrát popsán. Pokud jde o zesítěný kolagen, lze odkázat na

A,L&J, BERLIN • · 9 · ·* ► · 9 ·

11/05/2000 18:43 +49-30-28305225 <» ··

• ·· · místa v literatuře US-A 5, 874, 537, US-A 5, 782, 931 _a US-A 5, 795, 605. Alé i zesítěná želatina je jako taková známá jako materiál pro biokompatibilní membrány. Tady odkazujeme například na místa v literatuře US-A 5, 834, 232 a US-A 5, 723, 142.

Oproti výše popsaným ' tkáňovým kostrám je základem vynálezu technický problém zaručení vyšší jistoty narůstání buněk povrchu těla.

«►

K řešeni tohoto problému vynález ukazuje, že se kultivace buněk povrchu těla provádí tak, aby nejméně 10% buněkpovrchu těla nebylo, kontaktně inhibováno a aby substrát vykazoval vstřebatelný nosný materiál s modulem pružnosti méně než 1 N/mm² (18°C) . - Kontaktní inhibice je fyziologický proces buněčné komunikace, přičemž detekce povrchových molekul dvou sousedních buněk inhibuje proliferaci. Tím . se přirozeným způsobem zabraňuje nekontrolovanému · růstu. Buňka, která je kontaktně inhibována, už totiž nemůže proliferovat, na rozdíl od buňky, která (ještě) není kontaktně inhibována. Buňky, povrchu těla označují všechny druhy buněk, které tvoří povrch organismu,· ať už vnější nebo vnitřni povrch. Rozumí sé, že. buňky povrchu těla se vybírají tak, aby byly: vhodné, pro pacientův povrch, který má být nahrazen. Postižená místa se.zejména spravují popř. ošetřují právě

11/05/2000 18:43 +49-30-28305225

A.L&J, BERLIN

stejnými druhy na buňkách povrchu těla. Podstatnou součástí substrátu je nosný materiál. V nosném materiálu nebo na povrchu, nosného, materiálu se dají plánovat látky, které podstatně neovlivňují vlastnosti nosného materiálu, ale. jsou prospěšně terapeutickému využití nebo kultivaci buněk. Pro tento .účel se jako příklad uvádějí: antibiotika ' (např. tetracykliny), chemoterapeutika (např.: tauroíidiň), růstové faktory, anestetika (lokální). Modul pružnosti udává pružnost materiálu a vyplývá z podílu diferenciálu napínání ..(normálního napínání) diferenciálem roztažení .· Napínáni je podíl .diferenciálu síly a.plochy. Roztažení je délková diference dělena původní délkou. Kostrou dle vynálezu se, vyjádřeno jinými slovy, tvoří přirozeným způsobem nová kůže se svou strukturou vrstvy ne in vitro ale nejprve in vivo, tedy po nanesení tkáňové kostry.. '

Vynálezem se? dosahuje překvapivě vysoké jistoty, co se týče. narůstání ' tkáňové kostry . na postiženém místě. Dodatečná Opatření, obzvláště opakované transplantace jsou prakticky ve .všech případech zbytečné. Abychom měli jistotu, je samozřejmě možné provést opakování. Povrch, který še.tkáňovou kostrou, nově vytvoří, zvlášť kůže, se dobře, prokrvú.je · a nevytváří rušivou jizvovou tkáň. Dosahuje se pozoruhodně uspokojivé tvorby nové kůže. Aniž i

S.

· ·

11/05/2000 18:43	+49-30-28305225		A.L&J, BERLIN • · · · · • · · · · · • · · ·
		5	• · · · · • · · · ·«····· ··

i

bychom se vázali na nějakou teorii, domníváme se, že na zákjadě neexistující, kontaktní inhibice může tkáňová kostra, obzvláště, dobře zarůst do eventuálních mezer. . Díky pružným vlastnostem nosného materiálu se eventuální mezery udržují správně malé, aby se dala takzvaným sacím kontaktem dopravit tkáňová kostra podle vynálezu.

Podle použití má'přednost, když jsou buňky, povrchu těla vybírány ze skupiny složené z „keratinocytů a ěpithelových buněk respiračního traktu, ústní sliznice, cornea nebo vnitřních tělesných povrchů jako močový měchýř, žlučník, ,a jim podobných. Jestliže se má tkáňová kostra použít k nahrazení 'porušené kůže, upřednostňuje se použití keratinocytů.. . Dá se pracovat i s tkáňovými kostrami obsahujícími tukové buňky nebo fibroblasty.

Při regenerací kůže se dají nanášet tkáňové kostry podle vynálezu s tukovými buňkami a/nebo fibroblasty a/nebo keratinocyty v tomto pořadí v časovém odstupu (1 až 5 dní), a v uvedeném pořadí. V rámci vynálezu je ale také možné, vytvořit a nanést multilayerový sendvič obsahující sled vrstev (ve směru, z rány) „tukové buňky, substrát, fibroblasty, substrát, keratinocyty, substrát. V poslednějším případě se- vrstvy substrátu rozkládají podle aplikace: subšekventné ' ze strany rány na základě kolagenázy v ráně. Použitím fibroblastů se podporuje

S. 09 «·

A.L&J, BERLIN • · · ·· ··· • · · · · · · • · · · ···

11/05/2000 18:43 +49-30-28305225

«·····♦ ·· · · · vytvářeni nového vaziva. V obou alternativách tohoto přikladu provedeni se mohou vynechat tukové buňky nebo fibroblasty.

Co se týče buněčné hustoty buněk povrchu těla, upřednostňujeme, když alespoň 20%, raději však alespoň 50%, a nejlépe přinejmenším 70%, ještě lépe 80 nebo 90 až 100% buněk povrchu těla není kontaktně inhibováno. Čím vyšší je podíl kontaktně neinhibovaných buněk povrchu těla, tím lépe se daří narůstání tkáňové kostry v postiženém místě.

Co se týče mechanických vlastností, upřednostňujeme nosný materiál, který vykazuje modul pružnosti menší než 1 N/mm², ještě lepší je modul pružnosti menší než 0,5 N/mm², a úplně nejvhodnější jsou hodnoty v oblasti od 0,05 do 0,15 N/mm², Čím pružnější je nosný materiál, tím snadněji se tkáňová kostra v (třídimenzionálním) komplexním postiženém, místě nechá úplně přilehnout. Zlomové roztahování by mělo být co nejvyšší a mělo by být alespoň vyšší než 20%, a ještě lépe vyšší než 50%. Zlomové roztahování je definováno jako roztahování, při kterém nastane zlom. Rozumí se, že modul pružnosti nesmí být' tak malý, aby se pod vlastní vahou tkáňové kostry dosáhlo zlomového roztažení. Uvedené hodnoty se vztahují na 18°C á okolní vzduch.

Po dopravení kostry podle vynálezu do rány se mění vlastnosti materiálu. Typicky má substrát tloušťku od 0,1

11/05/2000 18:43 +49-30-28305225

A,L&J, BERLIN » ···».,• · ♦ · · · do 5 mm, zvlášť 0,3 až 2 mm, nanejvýš obzvlášť od 0,3 do 1 mm.

Po. optické stránce má přednost, když · je substrát transparentní a opticky jasný. Potom pokrok při kultivaci bez potíží sledovat mikroskopem s inverzním světlem. Toto· má naprosto podstatný praktický význam, protože se dá potom kultivace snadno kontrolovat a při dosaženi, požadované buněčné hustoty popř. před dosažením nežádoucí vysoké, kontaktní; inhibice přerušit.

Tkáňová kostra, . která dostačuje všem mechanickým požadavkům, se například obdrží, když se nosný materiál skládá z Želatiny zesítěné prostřednictvím síťovadla· umožňujícího, pružnost. Želatina je produkt rozkladu kolagenu. Želatina se dá získat z kolagenů různých typů, tedy. z kolagenu T až IV. Kolagen může být lidského nebo zvířecího původu. Dobře se hodí želatina z vepřové kůže s bloomovou silou, od 100 . do 400, popřípadě 300. Jako síťovadla přicházejí v úvahu všechny možné látky, pokud jsou na. jedné straně, fyziologicky nezávadné a na druhé straně umožňují v dostatečné míře pružnost. Po chemické stránce má přednost síťovadlo, organické spojení vzorce R1-X-R2, přičemž mohou být Rl a R2 znázorňuji skupiny,' ’ které se aminoskupinami a/nebo karboxylovými případě i. sulfhydrylovými ·skupinami stejne nebo různé a dají realizovat' skupinami, v daném a , přičemž Xje C211/05/2000 18:43 +49-30-28305225 .AJ

A,L&J, BERLIN • *·

s.

··· ·· ··

CŽO-Alkyl v daném.případě s funkční skupinou umožňující pružnost. Pro Rl a R2 se dají například jmenovat: -CHO, imidoester Cl až C5 alkanolu, N-hydroxysuccinimidylester, maleinimid, a-haloače.tal, pyridyldisulfid. Jako příklad skupiny umožňující, pružnost se dá jmenovat carbamat. Přednost mají homóbifunkční sít'ovadla, obzvlášť 1,5pentandial.

Vytváření nosného materiálu může vycházet ze Ί až 25%ního (w/v), zejména 10 až 20%-ního, nanejvýš zejména 10 až 14%-niho vodnat.ého želatinového roztoku. Při ca. 20% sé dostane nepatrně.zmenšená pružnost, stabilita se však značně zvýší.

Tkáňová kostra podlé vynálezu je k dostání tím, že se sloučí vrstva z buněk povrchu těla nanesením jednotlivých buněk povrchu těla a kultivací nanesených buněk povrchu těla až po vytvoření tloušťky vrstvy maximálně jedné monovrstvy.

Přednost má, když se kultivace buněk povrchu těla, například keratinocytů, fibroblastů a tukových buněk provádí přinejmenším homologně, obzvlášť autologně. Homológní kultivací se myslí kultivace v prostředí obsahujícím sérum jiného individua stejného druhu. Áutologickou kultivací se myslí kultivace v prostředí obsahujícím sérum stejného individua, pro které je tkáňová kostra určena.

11/05/2000 18:43 +49-30-28305225

A.L&J, BERLIN ..

• ·· ······ ·· ·· • to « to to · · · · ♦ ♦ • · to to to to to tototo· to ···« ··· · · · ·· ·· · · · · * «······ · · ♦·· ♦ · . · · Homologní kultivace je uplatněna, pokud sérum individua, pro které je tkáňová . kostra určena, není například ná základě medikace použitelné nebo by se muselo nákladně ošetřovat. Podíl ňa.séru v prostředí činí . typicky i až 20·%/ například 10%, Jako hlavní součást prostředí přicházejí, v úvahu běžná složení prostředí,· pojmenované příkladně pouze DMEM.· Principielně se dá pracovat i bez sera.

Tkáňová kostra podle vynálezu jek dostání například přes následující, stupně postupů: . a) organismu, zejména pacientovi, pro kterého je tkáňová kostra určena, se odebere tkáň. obsahujčí buňky povrchu těla, b) tkáň ze stupně a) se mechanicky rozděluje á buňky povrchu těla se izolují z rozdělené tkáně, c) buňky povrchu těla ze stupně b) se rozmnožují pasážováním zejména mnohonásobným pasážováním dj buňky povrchu těla dosažené ve stupni c) se prostřednictvím proteázy, zejména- prostřednictvím endopeptidázy, nanejvýš zejména prostřednictvím trypsinu odděluji a suspenduji do média obsahujícího autologní sérum, e) suspendované buňky povrchu těla ze stupně d) se na substrátu vysévají' á kultivují·, přičemž se hustota výsevu a doba kultivace řídí pravidlem, že buňky povrchu těla tvoří u kostry připravené k transplantaci.monoláž a přinejmenším ' 10% · buněk povrchu -těla ' není kontaktně inhibováno. .

AiL&J, BERLIN • ·♦

11/05/2000 18:43 +43-30-28305225

s.

·· ·· • ♦ · · • · · · • · · · • · « · ·· ··

Pasážováním je označeno enzymatické · oddělování (a odlučování) buněk po kultivaci a obnovené vysévání v nízké buněčné hustotě. Tím rychle dostaneme. ze srovnatelně malého počtu buněk odebraných jedné osobě vysoký počet buněk. Vysévání buněk'nastává zpravidla (jak. při pasážování tak při ' rozsévání ve stupni e) jako uloženi . buněčné suspenze v (sérum obsahujícím) kultivačním prostředí. V případě kreatinocytů je vhodný . ve stupni e) výsev. s hustotou od. 10^? až 10⁵, zejména ca. 10⁴ . buněk/cm², ve spojení s kultivační dobou od 12 do 48 hodin, zejména 24 až 36 hodin. Přednost má, když pasážování a/nebó kultivace v médiu obsahujícího látku nebo více látek ze skupiny skládající se ze „jednoducho nenasycené mastné kyseliny, . několikrát nasycené mastné kyseliny, butyrátú. Ukázalo se, že sé potom dostaví zvlášť dobrý růst buněk popř. zvlášť dobrá proliferace. Jako použitelné mastné kyseliny se uvádějí: crotonová kyselina, palmitoleinová kyselina, olejová kyselina, . erpcaová kyselina, sorbová kyselina, linolová kyselina, linolenová kyselina, elaeostearová kyselina; arachidonová kyselina, clupanodortová kyselina a docosahexaenová kyselina. Butyráty jsou soli a estery, například Cl až CIO alkylester máselné kyseliny. Jako tvůrce soli je v každém případě upřednostňováno natrium.

Tkáňová kostra by mělá být co nejhomogeničtější, < co se týče buněk povrchu.těla. To se obzvlášť dobře daří, pokud nastane vysev ve stupni e) podkladem sterilní mřížky na

11/05/2000 10:43 +49-30-28305225

A.L&J, BERLIN substrát a dopraveni. suspenze do mřížkových segmentů/ přičemž se mřížka.po .sedimentaci a přilnutí buněk povrchu těla odstraní. Mřížka má rastrovou míru nejméně 1 mm> účelně 1/10 .áž 1/100 délky hrany substrátu. Výsev může nastat mnohokrát. Potom je celkové množství vysetých povrchových . tělesných buněk vůči jednorázovému výsevu nezměněno. Vyjádřeno jinými slovy při například trojnásobném výsevu se při kažném výsevu vysévá třetina celkového množství buněk povrchu těla, .které se mají vysévat.

V rámci kultivace vestupni b) - e) se může pracovat bez feederla.yer (buněčná vrstva, která nepochází od osoby, která má být ošetřena, se před výsevem buněk povrchu těla kultivuje a vhodným způsobem inaktivuje)· a/nebo bez zvířecích sér nebo tkáňových extraktů.

Vynález se týká i postupu k vytváření tkáňové kostry podle vynálezu, přičemuž se . odkazuje na patentové požadavky 16 až 22. Pro postup dle vynálezu platí podle smyslu výše uvedené vysvětlivky.

Vynález se dále týká použití tkáňové kostry k nahrazeni kůže excidované kvůli poškozené nebo chybné funkci, obzvlášť kůže excidované kvůli spálení.

11/05/2000 18:43 +49-30-28305225

AjL&J, BERLIN »» ·*·♦ « · · • · ···

S.

Vynález se dá použít y rámci' následující léčebné metody. Především se. obvyklým způsobem připraví spodina rány kožního defektu, obzvlášť se. odstraní porušená (nebo zjizvená/jinak vadná) kožní tkáň (např. včetně tukové tkáně). Potom. se nanese popř. dopraví vynalezená tkáňová kostra s buněčnou vrstvou ve směru na spodinu rány. V daném’ případě se· může tkáňová kostra předem vhodným způsobem upravit. Potom se nanese obvaz, který je proveden tak, že tlak při přitisknutí, který tím působí na tkáňovou kostru, je co nej rovnoměrně j šl. Po několika dnech je substrát díky kolagenázám keratinocytů a/nebo sekretů rány (např. granulo.cyty) úplně degradován.

Dále se vynález blíže vysvětluje na základě příkladů znázorňujících pouze formy provedení.

Příklad 1: Příprava licích kazet.

Licí kyveta, složená ze dvou skleněných desek a jednoho spacetu z gumy, který se volí podle tloušťky .substrátu, která se má· dostavit,, se před složením řádně očistí vodou a prostředkem na vyplachování a potom · řádně vypláchne destilovanou vodou. Skleněné desky a spacer se potom řádně otřou pod sterilním pracovním stolkem nejméně třikrát 70% abs.. ETOH ve vodě a sterilní mulovou látkou.

11/05/2000 18:43 +49-30-28305225 »9 9 9 9 9 ·· ·· '· 9 9 9. · · · · • > 9999 9· 9. 9 ♦

9 9 ·

A.L&J, BERLIN ···· ·♦ 999 >· 99

Liči· kyveta se potom sestaví, přičemž se horní strana neutěsní spacerem a místo toho se dá uzavřít sterilní lepicí páskou. Po sestavení se licí kyveta zahřívá v nahřívací skříňce·při.60^eC po dobu nejméně 30 minut.

Přiklad 2; Rozpouštění želatiny

K . vytváření substrátu se používá 12% (w/v) vodnatého želatinového roztoku, K tomu se naplní pohárek sterilovaný autoklávováním příslušným množstvím sterilní vody bez pyrogenu („agua in injectabília) a želatina (získaná z vepřově kůže, s bloomovou silou 300) se při pokojové teplotě za míchání (například prostřednictvím magnetického míchače) přimíchává k vodě. Vzniká vysoce viskózní suspenze. Hodnota pH suspenze se dostaví, na pH 7,6 až 7,8. Pohárek se uzavírá například hliníkovou fólií a suspenze se zahřívá, přičemž se želatina rozpouští. Při tom by se mělo zabránit delšímu ohřívání. Zahřívání může nastat například prostřednictvím mikrovlně trouby.

Příklad 3: Lití membrány.

Horký želatinový roztok se prostřednictvím míchání homogenizuje, natahuje se do sterilní stříkačky a nalévá do předehřáté licí kyvety. Po naplnění zůstane licí kyveta ještě na ca. 15 minut v ohřívací skříňce (60®C), přičemž se usadí eventuální vzduchové bubliny.

f . ' · ’ t

t · · , ·

11/05/2000 18:43 +49-30-28305225

A,L&J, BERLIN

s.

·« ···· • »9 • ·· · · • · · • · · ·« .··· • · · · • · · 9 • · · · • 9 ·9

Poté se želatina polymerizuje nejméně po dobu 10 hodin při teplotě 4°C.

Příklad 4: Zesítění želatiny.

.Substrát' se vypustí pod sterilním pracovním stolkem z licí.kyvety a položí · do 4°C studeného vodnatého („aqua ad injectabilia) roztoku s 0,0083 Vol. -% 1,5-pentandial na dobu 12 hodin. Zásadně se dá pracovat s koncentracemi na 1,5 pentandial od 0,001 do 0,05 Vol. přičemž u vyšších koncentrací by.se mělo pracovat s kratšími dobami zesítění (u 0,0125 Vol. -% popřípadě 30 minut). Dále se odstraní roztok 1,5 pentandial a substrát se omývá dvakrát ha 60 minut sterilní bezpyrogenní vodou („aqua ad injectabilia). Substrát se potom až do dalšího použití uloží v 70% abs. ETOH, Alternativně se může substrát omývat 0,5% glycerinem, mrazově sublimovat a sterilně zabalit.

Příklad.5; Rehydratace substrátu.

Substrát se. odebere z alkoholu (nebo sterilního obalu) a dvakrát se na · 6.0 minut rehydratuje sterilním roztokem

0,9%. NaCl. Během rehydratování se mohou do substrátu dopravit, přísady .'jako. růstové faktory (např. EGF, rozlišovací faktory neboantibiotika.

11/05/2000 18:43 +49-30-28305225

A,L£J, BERLiy.......

S. 18

• «4· • 4 ··· ·· 44

Takto obdržený substrát je připraven na výsev buněk.

Příklad 6: Alternativy vytvářeni substrátu.

Alternativně k příkladům 1 až 5 se dá pracovat' se spacerem . popř. .nádobkou, jejíž tloušťka vykazuje mnohonásobek tloušťky , která se má dostavit pro substrát; Substrát se pak může vytvořit odříznutím z takto získaného želatinového bloku, Žesitění může nastat před nebo po odříznutí.

Příklad 7: Měření modulu pružnosti

Substrát rozměrů 131 mm x 105 mm x 0,5 rom se na jedné straně utvrdil. Protější strana byla silou zaražena závažími. Vyšly tyto hodnoty:

Hmota (g) délka (mm) roztažení E (N/mm²)

200

280

490

145 ; 0, 381·

150 0,429

180 0,714

0, 081 0, 100

0,106

Po Odlehčení, nastane zpětná pozice na původní délku během nejvýš ca. 60 sekund..

11/05/2000 18:43 +49-30-28305225

A.L&J, BERLIN « «« • · · ·

♦ · t.I. «» »»S· • « « · · · ·

W . · · ··» * * · * • · » · » « » » * » · • ». ·· ··«·· ··» ··» ·» ·« ·* ·» ? příklad 8; Nanášení keratinocytů na substrát.

Keratinocyty z mechanicky . rozdělené tkáně . se obvyklým způsobem · izolují a. předkultivují. To · nastává mnohonásobným pasážovánim buněk. Přitom se buňky enzymaticky oddělují od podkladu a následně vysévají v nízké hustotě buněk. Rozmnožováním. buněk· stoupá následně hustota . -buněk, buňky, mohou po případě růst ve více vrstvách..

Před výsevem na substrátu se kondicionují keratinocyty. Toto nastane oddělením od podkladu · prostřednictvím trypsinu. Následně se buňky vysévají na substrátu (0,3 až 1 mm tloušťky), Hustota'výsevu a následná' doba kultivace, se volí tak, aby buňky při použití tkáňové.kostry ležely těsně v jedné . vrstvě, jejich rozmnožení však není kontaktní inhibici podstatně redukováno, například 10⁴ buněk/cm² s následnou kultivací přes 24 až' 36 hodin. Výsév nastává prostřednictvím sterilní mřížky, která se položí na substrát.· Db- mřížkových segmentů se vpipetuje suspenze buněk do kulturního prostředí obsahujícího sérum (DMEM). Po sedimentací a přilnutí buněk na substrát sé mřížka opět. odstraní (pd 30 až 60 minutách) . Toto se může vícekrát opakovat.

Kulturní podmínky, jsou jak následuje:· žádný -feederlayer (buněčná vrstva.k podpoře růstu keratinocytů), autologní, po případě homologhí podmínky,

11/05/2000 18:43 +49-30-28305225

A,L&J, BEF^LI^, ·· • ft'-’

9 9 ·

9 9 9

9 9 9

9 9 9

99

·· ·*»· * · ♦ · » • · * ··· 9 • · · · · · ·

9 · · « ftft ftft ll • 9

999 9999 žádné použití zvířecích sér nebo tkáňových extraktů;

přídavek 1 áž 50 pg/ml mastné kyseliny, například 5 pg/ml

Na-linolov.é kyseliny, k prostředí.

Příklad 9: Provádění transplantace.

Tkáňová kostra podle vynálezu se nanáší na povrch kožního defektu po vhodné přípravě spodiny rány s vrstvou buněk

.. ve směru na spodinu rány (takřka obtiskovacímu obrázku), . . . po případě po nástřihu tkáňové kostry, U hlubších defektů se dá pracovat se srovnatelně tlustými substráty. Potom nastane vazba, která tkáňovou kostru co nej rovnoměrněji zarazí tlakem. Po několika dnech je buněčné vrstva narostlá a substrát degraduje. Buněčná vrstva narůstá po prakticky každé.transplantaci a tvoří bezjizvovou a dobře překrvenou novou tělesnou tkáň. Pro jistotu lze provést další transplantací, není však nutně zapotřebí.

Tkáňová kostra pro transplantační chirurgii Příklady provedení vynálezu

Příklad 10

Kvantifikování podílu kontaktně inhibujících buněk

Inhibice kontaktu keratinocytů se morfologicky vyznačuje tvorbou velmi těsných kontaktů buňka-buňka, anglicky „tight junctions, které jsou zprostředkovány adhezi molekul stabilní buněčné membrány. Tyto buněčné kontakty , které jsou dobře zobrazitelné optickými metodami s vysokým rozlišením, jsou významnou charakteristickou vlastností keratinocytů. Intracelulárně se kontaktní inhibice indukuje řadou dosud neúplně objasněných mechanizmů, které převádějí buňky ze stavu proliferativního do sekretorického. Zejména u keratinocytů dochází také ke změně tvaru buňky a povrchu. Principiálně se tudíž hodí jako markéry přechodu od proliferativního na sekretorický stav jakož i pro zjišťování proteinů tvořících těsné kontanty, anebo pro přímé vysoce rozlišující optické stanovení existence těsných kontaktů a určení rozsahu kontaktní inhibice v buněčné kultuře.

Optickým pozorováním a spočítáním počtu těchto těsných kontaktů jedné buňky může být tedy definováno, jestli příslušná buňka kontaktně inhibuje, nebo ne. Je-li počet těchto těsných kontaktů, přiřazených jedné buňce , menší než 4, tak se tato buňka kvalifikuje jako kontakt neinhibující. Je-li počet spojení nad 10, pak se tato buňka kvalifikuje jako kontakt inhibující. Buňky s 4 - 10 spojeními zůstávají nezohledněny. Jestliže se takto spočítá skupina například o 100 buňkách, lépe však 1000 buňkách, tak se hned zjistí počet buněk, které kontaktně neinhibují.

Vazby buňka-buňka, které vznikají v rámci kontaktní inhibice, mají však ještě jeden další efekt. Napojením do ···· φ · · * · · • ··· · · · · • · · · · · · · buněčného svazku se významně redukuje schopnost migrace příslušných buněk. To platí zejména pro keratinocyty. Proto se může určovat kontaktní inhibice stanovením migrační schopnosti migračním testem. Migrační test lze provést následovně:

K přezkoumání kontaktní inhibice se evidují kultury keratinocytů mikroskopicky v různých optických rovinách (například pomocí konfokálního laserového mikroskopu) po definovanou dobu, typicky mezi 2-24 hodin, s výhodou 6 až 10 hodin, například 8 hodin. Potom se spočítá počet putujících buněk. Jako pohyb buňky se vyhodnocuje to, jestliže se v době pozorování příslušná buňka pohne o úsek cesty, který je větší než největší buněčný průměr (sledované buňky) v rovině ortogonálně k optické ose mikroskopu. K lepší identifikaci a ohraničení se mohou buňky označit membránově stabilní biotickou barevnou látkou (například PHK2-GL, získatelnou u firmy Sigma).

Předešlý obecný postup je použitelný pro homogenní kultury keratinocytů s podílem nekeratinocytů (například fibroblastů) menším než 10 %, Při vyšším obsahu cizích buněk se tyto buňky musí označit speciálními markéry a vypustit při vyhodnocování. Rozdělení typů buněk se případně určí podle rozlišení buněk a barvení vhodnými specifickými markéry.

Konkrétně bylo měřeno tak, jak následuje. V 25 cm² láhvi na buněčnou kulturu se pod mikroskopem vyznačí oblasti, které budou zkoumány. Na každé vyznačené místo se skalpelem vyryje jemný křížek na spodní stranu láhve. Ke znovunalezení vyznačené oblasti se vnější strana křížku opatří bodem. Pro fotografování buněk se křížek pod mikroskopem při 40-násofcném zvětšení umístí doprostřed zobrazeného výřezu a pomocí bodu na spodní rovině zaostří. Po zaostření bodu se provedou dvě úplné otáčky jemného

To

• 9999	99 99	99 99
99 9	9 9 9	9 9 9 9
9 ·	9 9 999	9 9 9 9
• · 9 99	99 99	99 99

ústrojí a udělá se první snímek (malý obrázek 24 x 36 mm) . Potom se jemné ústrojí otočí pětkrát o půl otáčky^. pokaždé se fotografuje.

Snímky se opakují se 100 násobným zvětšením. Potom se fotografie vyvolají a pohyby buněk se pozorují pomocí jemného rastru, který lze na základě křížku na fotografiích přesně umístit. Ke zjištění pohybů buněk se na fotografie 9 x 13 cm položí průsvitný rastr velký 4 x 4 cm a zjišťuje se počet buněk v tomto 16 cm² velkém poli. Toto pole odpovídá skutečné velikosti 2,89 mm². Posice buněk se označí na rastru a porovnávají s obrázkem, fotografovaným 8 hodin později. Výpočet a vyhodnocení se provádí podle definice uvedené dříve, podle níž ta buňka kontaktně neinhibuje, která v intervalu referenční doby odputovala úsek cesty delší než největší průměr příslušné buňky (měřeno na konci časového intervalu).

Obecně se ukazuje snížení pohybů buňky s přibývajícím počtem buněk. Při vysokém počtu buněk nejsou putování buněk v definovaných oblastech rozpoznatelná, nýbrž jenom nepatrné pohyby buněk. Pro lepší znázornění jednotlivých buněk se může v hustém buněčném svazku použít fluorescenční barvivo PKH2-GL (Sigma). Jedná se přitom o alifatické barvivo, které se zabuduje do buněčné membrány, aniž by mělo toxický účinek na buňku. Toto barvivo je ve stěně buňky stabilní několik dní. Obarvené buňky se pak mohou pozorovat pod fluorescenčním mikroskopem, přičemž buňky lze ještě zobrazit jako fluoreskující body. Ke zjištění mitoseratů buněk se mohou obarvené buňky kvantitativně spočítat pomocí průtokového cytometru (FACS) .

Přitom se půlí při každém dělení buňky intenzita fluorescence , takže mohou být zachyceny všechny mitosy uvnitř definovaného časového intervalu.

Claims (20)

1, Tkáňová kostra - pro tiransplantační chirurgii se sendvičovou'.strukturou' obsahující plošný substrát a Vrstvu kultivovaných buněk povrchu těla přilnutou na plošném. substrátu,.

se vyznačuje tím, že se kultivace buněk.povrchu těla provádí tak, aby alespoň 10% buněk povrchu .těla nebylo kontaktně inhibováno a že substrát, vykazuje vstřebatelný nosný materiál s modulem pružnosti zejména menším než 1· N/mm² (18°C).

2. '· Tkáňová kostra podle požadavku 1, se vyznačuje tím, že buňky povrchu· těla jsou vybírány ze skupiny složené z ' „keratinocytů a epithelových buněk řespiřačniho traktu, ústní slizníce, cornea nebo vnitřních tělesných povrchů jako močový měchýř, Žlučník, a jim podobných

3. Tkáňová kostra podle požadavku 1 nebo 2, se vyznačuje tím, že sendvičová struktura je multilayerový sendvič

..... obsahujíc! 'sled vrstev „tukové buňky, substrát,

11705/2000 18:43 +49-30-28305225 A.L&J, BERLIN .. .··.;*·· ²²

H··»’ *!*··· ··· * ♦ · * ····

H.

B· ···. fibroblasty, substrát/ keratinocyty, substrát.

B.

4. Tkáňová kostra podle jednoho z požadavků.1 až 3, se vyznačuje tím, · že nejméně .20%, zejména nejméně 50%,

1| nanejvýš zejména '80 - 100% buněk povrchu těla není » kontaktně inhibováno.

/ ·

1 ···

5, Tkáňová kostra, podle jednoho z požadavků 1 až 4, se ·

I vyznačuje tím, žé nosný materiál vykazuje modul

I pružnosti méně než 10 N/mm², zejména méně než 1 N/mm², nanejvýš zejména méně než 0,5 N/mm².

'

6. Tkáňová kostra podle jednoho z požadavků 1 až 5 se vyznačuje tím, že je substrát transparentní a opticky jasný.

7. Tkáňová kostra podle jednoho z požadavků 1 až 6 se vyznačuje . tím, že se nosný materiál skládá ze želatiny, . zesítěné prostřednictvím síťovadla, umožňující pružnost.

8. Tkáňová kostra. ppdle jednoho z požadavků 1 až 7 se vyznačuje tím, že siťovadlo je organickým spojením vzorce R1 - X - R2 ., přičemž R1 a R2 mohou být

11/05/2000 18:43 +49-30-28305225

A,L&J, BERLIN. ..

·· s. ♦· » · · • · · stejné nebo různé a znázorňovat skupiny, které se dají realizovat . ami noskupinámi a/nebo karboxylovými skupinami a přičemž X je C2-C20-Alkyl v daném případě s funkční skupinou umožňující pružnost.

9. Tkáňová kostra podle jednoho z požadavků 1 až 8, která je k dosažení tím, že se vrstva vytváří z buněk povrchu těla nanášením jednotlivých buněk povrchu těla a · kultivací nanesených buněk povrchu těla až -do vytvoření vrstvy buněk maximálně jedné monovrstvy.

10.Tkáňová kostra podle požadavku 9, přičemž kultivace buněk povrchů těla popř. v daném případě fibroblastů se provádí přinejmenším homologně, zejména autologně.

11.Tkáňová kostra podle požadavku 9 nebo 10, získat následujícími postupy:

která lze

a) organismu,' zejména pacientovi, pro kterého je. určena tkáňová kostra, odebereme tkáň obsahující buňky povrchu těla,

b) tkáň ze stupně a) se mechanicky rozděluje a buňky povrchu těla se z rozdělené tkáně izolují,

11/05/2000 18:43 +49-30-28305225 A.L&J, BERLIN S 24 ' · · · · ·· ·· , ·······

Ij^B· . -X c) .buňky povrchu těla ze stupně b) se rozmnožují .'β . pasážováním, zejména vícečetným pasážováním, ' W ' : d) buňky povrchu těla obdržené ve stupni c) se ·»··'·

1. ' odlučují· prostřednictvím proteázy, zejména.

1?..' . prostřednictvím · endopeptidázy, nanejvýš zejména

I prostřednictvím trypsinu a suspendují se zejména

I, v prostředí ·obsahujícím autologní sérum, ^? e) suspendované buňky povrchu těla ze stupně d) sě

I na substrátu vysévají a kultivují, přičemž

I . · hustota výsevu a doba kultivace jsou upraveny

I . tak, aby buňky povrchu těla u kostry připravené k

I transplantaci tvořily monoláž a přinejmenším 10%

I buněk povrchu těla nebylo kontaktně inhibováno.

12; . Tkáňová kostra podle jednoho z požadavků 9 až 11, přičemž pasážování a/nebo kultivace v prostředí obsahujícím látku nebo více látek ze skupiny složené. z,e „jednoducho nenasycených mastných kyselin, | . několikero nasycených'mastných kyselin, butyrátů. .

13. Tkáňová kostra podle jednoho z požadavků 9 až 12,· přičemž, výsev ve stupni e) nastává položením sterilní mřížky ná substrát a dopravením suspenze do

18:43 +49-30-28305225 A,L&J, BERLIN,

44 4 4

S... 25 • · 4 tr ' ' mřížkových segmentů, přičemž mřížka se po sedimentaci a přilnutí buněk povrchu těla odstraní.

Tkáňová kostra . podle požadavku 13, přičemž výsev nastane vícekrát a přičemž je celkové množství vysetých buněk . povrchu těla vůči jednorázovému výsevu nezměněno.

Tkáňová kostra podle jednoho z požadavků 9 až 14, přičemž se v' rámci kultivace pracuje bez feederlayeru a/nebo bez přísady zvířecích sér nebo tkáňových extraktů.

16. Postupy k vytváření tkáňové kostry podle jednoho z požadavků 1 až 15, přičemž se vrstva z buněk povrchu těla vytváří nanášením jednotlivých buněk povrchu těla a kultivací nanesených buněk povrchu těla až po vytvoření tloušťky vrstvy maximálně jedné monovrstvy. '

17.. Postupy podle, požadavku 16, přičemž se kultivace ·. buněk povrchu těla provádí přinejmenším homologně,' a ještě lépe autologně.

18. Postupy podle požadavku 16 nebo 17, následujícími stupni postupů:

11/05/2000 18:43 +49-30-28305225

A.LSJ, BERLIN

........^s·.. ²⁶ . . . · · · · · 1 « · · ·«« · · · · , «· · ·.·· ·· · . . . · · · ·· • ···· ·· ·♦· ·· . ··

a) organismu, zejména pacientovi, pro kterého je určena. tkáňová kostra, se odebere tkáň obsahující buňky povrchu těla,

b) tkáň že stupně a) se mechanicky rozděluje a buňky povrchu těla se z rozdělené tkáně izolují,

c) buňky povrchu těla ze stupně b) se rozmnožují pasážováním, zejména vícečetným pasážovánim,

d) buňky povrchu těla obdržené ve stupni c) ' se odlučují prostřednictvím proteázy, . zejména prostřednictvím endopeptidázy, nanejvýš zejména prostřednictvím trypsinu a suspendují se zejména v prostředí obsahujícím autologní sérum,

e) suspendované buňky povrchu těla ze stupně d) se na substrátu, vysévají a kultivují, přičemž hustota, výsevu a doba kultivace jsou upraveny tak, aby buňky povrchu těla u kostry připravené k transplantaci tvořily monoláž a přinejmenším 10% buněk . ·povrchu těla nebylo kontaktně . lnhibo.váno.

19. Postupy podle jednoho z požadavků 16 až 18, přičemž pasážování a/nebo kultivace

11/05/2000 18:43 +49-30-28305225 A.L&J, BERLIN S , · »· · · · · · · · · «······ v prostředí obsahující látku nebo více látek ze skupiny skládající se ze „jednoducho nenasycených mastných kyselin, vícekrát nasycených mastných kyselin, látek, které se dají fyziologicky převést v jednoducho nebo vícekrát nenasycené mastné kyseliny”.

20. Postupy podle jednoho z požadavků 16 až 19, přičemž výsev ve stupni e) nastává položením sterilní mřížky na substrát ' a dopravením suspenze do mřížkových segmentů, přičemž mřížka se po sedimentaci a přilnutí buněk povrchu těla odstraní.

21. Postupy podlé požadavku 20, přičemž výsev nastane . vícekrát a přičemž je celkové množství vysetých buněk povrchu těla vůči jednorázovému výsevu. nezměněno.

22. Postupy podle jednoho z požadavků 16 až 21, přičemž se v rámci kultivace pracuje bez feederlayeru a/nebo použití zvířecích sér nebo tkáňových extraktů.

.23., Použití tkáňové kostry podle jednoho z požadavků 1 až 15 k nahrazení kůže excidované kvůli poškozené nebo chybné, funkci, obzvlášť kůže excidované kvůli spálení.