JPWO2003043542A1 - 角膜上皮様シート、及びその作製方法 - Google Patents

Abstract

角膜上皮の移植が必要とされる眼表面疾患に適用可能な移植用材料（角膜上皮様シート）を提供する。羊膜上に口腔粘膜上皮細胞を播種し、支持細胞の共存下で培養する。口腔粘膜上皮細胞が重層化した後、その最表層を空気に接触させ、分化誘導する。そして、羊膜上に口腔粘膜上皮細胞層が形成された角膜上皮様のシートを得る。

Description

技術分野
本発明は、角膜上皮様シート、及び角膜上皮移植用シート、並びにこれらの作製方法に関する。本発明は、角膜上皮の移植が必要な疾患（眼表面疾患）の治療に利用できる。特に両眼性の角膜性疾患に対して有効な治療手段を提供する。
背景技術
角膜が結膜上皮で覆われ混濁を生じる眼表面疾患に対する外科的治療としては、現在は角膜上皮移植術が行われているが、強い炎症を伴った難治性角結膜疾患（Ｓｔｅｖｅｎｓ−Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群や眼類天疱瘡、角膜腐食など）においては、その予後が極めて不良である。その最大の理由として、強い抗原性を有する異系（アロ）の角膜上皮が宿主の免疫系に認識され拒絶を受けることが挙げられる。更に、拒絶反応の予防のため術後に多量の免疫抑制剤を全身及び局所投与することによる合併症もその予後不良の大きな要因となっている。一方、アロの角膜上皮を利用する場合には、ドナー不足の問題がある。従って、アロではなく自己の角膜上皮組織を用いた移植を行うことが理想と考えられる。片眼性の疾患（角膜腐食など）では、健眼からの角膜上皮を患眼に移植することで良好な成績を収めた報告は過去にもみられるが、難治性角膜疾患の多くは両眼性でありこうした手法を用いることができないのが現実である。
発明の開示
本発明は以上の背景の下、眼表面疾患に適用可能な移植用材料である角膜上皮様シート、及び角膜上皮移植用シート、並びにこれらの作製方法を提供することを課題とする。特に、自己の角膜幹細胞の取得が困難な患者に対する治療に使用できる移植材料を提供することを目的とする。
本発明者らは、以上の課題に鑑み鋭意検討を行った。まず、両眼性疾患の患者においては自己の角膜細胞を取得することができないことから、他の健常な部位の自己粘膜組織を利用できることが理想的であると考え、細胞源として口腔粘膜上皮組織を選択した。口腔粘膜上皮には局所粘膜組織での幹細胞の存在が示唆されており、また、他の上皮組織である皮膚表皮に比べて低分化で分裂能が高く、比較的入手し易いからである。一方、口腔粘膜上皮細胞を培養する基質として羊膜を採用した。
まず、家兎の口腔粘膜上皮を採取し、酵素的処理により上皮下組織を除去して幹細胞を含む細胞浮遊液を調製した。次に、酵素的処理により上皮を掻爬した羊膜上に細胞浮遊液を播種し、支持細胞（ｆｅｅｄｅｒ細胞）との共培養、上皮細胞への分化誘導を施す処理を行った。その結果、口腔粘膜上皮細胞が重層化した角膜上皮様の細胞層（角膜上皮様シート）を得ることに成功した。得られた細胞層の形態的観察をしたところ、羊膜上に５〜６層の細胞が積層し、また最上層には扁平形状の細胞が存在しており、さらには高い透明性を備え、角膜上皮に極めて類似した構造を有していた。一方、角膜上皮様の細胞層を、基質として用いた羊膜とともに、家兎の眼に自家移植してその生着を観察した。その結果、移植片が眼表面に生着、伸展し、術後透明性を維持することが確認された。このことから、口腔粘膜上皮を細胞源として用い、併せて羊膜を基質として用いることにより、口腔粘膜上皮細胞が重層化した角膜上皮様の細胞層（角膜上皮様シート）を形成できることが示され、またこの角膜上皮様の層は、角膜上皮の代替として好適に利用できることが示された。本発明はかかる知見に基づき完成されたものであって、次の構成からなる。
［１］ 口腔粘膜上皮細胞由来の細胞が重層化した細胞層からなる角膜上皮様シート。
［２］ 最表層の細胞が角化していない、［１］に記載の角膜上皮様シート。
［３］ 最表層の細胞が扁平形状である、［１］又は［２］に記載の角膜上皮様シート。
［４］ バリア機能を備える、［１］〜［３］のいずれかに記載の角膜上皮様シート。
［５］ コラーゲン層上に、口腔粘膜上皮細胞由来の細胞が重層化した細胞層が形成されている、ことを特徴とする角膜上皮移植用シート。
［６］ 前記細胞層の最表層の細胞が角化していない、［５］に記載の角膜上皮移植用シート。
［７］ 前記細胞層の最表層の細胞が扁平形状である、［５］又は［６］に記載の角膜上皮移植用シート。
［８］ 前記コラーゲン層が羊膜由来である、［５］〜［７］のいずれかに記載の角膜上皮移植用シート。
［９］ 前記コラーゲン層が上皮を除去した羊膜からなる、［５］〜［７］のいずれかに記載の角膜上皮移植用シート。
［１０］ バリア機能を備える、［５］〜［９］のいずれかに記載の角膜上皮移植用シート。
［１１］ ａ）コラーゲン層上で口腔粘膜上皮細胞を培養するステップ、
ｂ）口腔粘膜上皮細胞が増殖して重層化した後、最表層を空気に接触させるステップ、
を含む、角膜上皮様シートの作製方法。
［１２］ 前記ステップａ）が支持細胞の共存下で行われる、［１１］に記載の角膜上皮様シートの作製方法。
［１３］ 前記ステップａ）が、支持細胞の共存下であって、支持細胞と前記コラーゲン層との間に支持細胞が通過できないポアサイズの隔離膜が存在した状態で行われる、［１１］に記載の角膜上皮様シートの作製方法。
［１４］ 前記コラーゲン層が羊膜由来である、［１１］〜［１３］のいずれかに記載の角膜上皮様シートの作製方法。
［１５］ 前記コラーゲン層が上皮を除去した羊膜からなる、［１１］〜［１３］のいずれかに記載の角膜上皮様シートの作製方法。
［１６］ 第１の容器内に支持細胞を播種し、支持細胞層を形成させるステップ、
前記第１の容器内に、前記支持細胞が通過できないポアサイズの隔離膜からなる底面を有する第２の容器を、底面が培養液中となるように設置するステップ、
前記第２の容器の前記底面上にコラーゲン層を形成するステップ、
前記コラーゲン層上に口腔粘膜上皮細胞を播種するステップ、
培養して口腔粘膜上皮細胞を重層化させるステップ、
重層化した口腔粘膜上皮細胞の最表層を空気に接触させるステップ、
を含む角膜上皮様シートの作製方法。
［１７］ 前記コラーゲン層が羊膜由来である、［１６］に記載の角膜上皮様シートの作製方法。
［１８］ 前記コラーゲン層が上皮を除去した羊膜からなる、［１６］に記載の角膜上皮様シートの作製方法。
尚、本明細書において「角膜上皮様シート」とは、角膜上皮に類似する特徴を有し、角膜上皮の代替として移植に供され得る細胞層を意味する用語として使用される。
同様に、「角膜上皮移植用シート」とは、角膜上皮に類似する特徴を有する細胞層を備え、角膜上皮の再建のために移植に供され得る組成物を意味する用語として使用される。
発明を実施するための最良の形態
本発明の第１の局面は、口腔粘膜上皮細胞由来の細胞が重層化した細胞層からなる角膜上皮様シートに関する。
ここで、口腔粘膜上皮細胞由来の細胞が重層化した細胞層とは、口腔粘膜上皮部の細胞を出発原料とし、これを培養することによって増殖、少なくとも一部が分化、及び重層化して形成された細胞層のことをいう。この細胞層を形成する細胞の由来としては、口腔内縁粘膜上皮部の細胞、口唇部の細胞、口蓋部の細胞、頬部の細胞などの口腔粘膜上皮細胞である。これらの細胞由来であることは、細胞層を形成する細胞において、口腔粘膜上皮細胞特異的なケラチン４、又はケラチン１３が発現していることを指標として確認することができる。又は、ケラチン３を発現していることを指標とすることもできる。このケラチン３は、角膜特異的ケラチンの一つと知られているが、口腔粘膜上皮細胞においても発現していることが確認されている。尚、この角膜特異的ケラチンであるケラチン３を発現している点において、口腔粘膜上皮細胞を角膜上皮移植用の組成物を作製する材料として用いることは好ましいといえる。
一方、口腔粘膜上皮細胞特異的な遺伝子の発現を調べることによっても、細胞層を形成する細胞が口腔粘膜上皮細胞由来であることを確認することができる。
本発明の角膜上皮様シートは、好ましくは以下の性状ないしは特性のいくつかを備えるものである。特に好ましくは、以下の全ての性状ないしは特性を備えるものである。
（１）最上層の細胞が角化していない。これは、角膜上皮が備える特徴の一つである。この特徴が認められることにより、本発明の角膜上皮様シートは角膜上皮に類似し、角膜上皮と同様の機能を発揮することが期待される。尚、角化とは、別名角質化とも呼ばれ、細胞内にケラチンを生じ、核等の細胞内小器官が失われる現象をいう。細胞が角化しているか否かは、例えば細胞の扁平化や核の有無を指標として確認することができる。
（２）最上層の細胞が扁平形状である。すなわち口腔粘膜上皮細胞層が、略円柱形状の細胞からなる層の上に扁平形状の細胞からなる層が形成されて構成される。扁平形状の細胞が最上層を覆うことにより、細胞間の気密性が高まり以下のバリア機能が奏されると考えられる。角膜上皮においても最上層の細胞は扁平形状である。この特徴が認められることにより、本発明の角膜上皮様シートは角膜上皮に類似し、角膜上皮と同様の機能を発揮することが期待される。
（３）バリア機能を備える。バリア機能とは、表層からの液体、気体などの浸潤や、表層を介して液体の放散などを防止する機能をいう。かかるバリア機能を有することにより、移植後その表面に水分（涙）を保持することができ、また必要以上の水分が放散することを防止することができる。角膜は、バリア機能を備えることによりその表面に水分を保持でき、これによって瞬目に耐えることができるという機能を発揮する。したがってバリア機能を備えることは、角膜用移植材料に求められる重要な一つの特性である。この特徴が認められることにより、本発明の角膜上皮様シートは角膜上皮に類似し、角膜上皮と同様の機能を発揮することが期待される。バリア機能を備えるか否かは、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）等の標識物質を含む溶液の浸潤の程度によって調べることができる。
この角膜上皮様シートは、角膜を損傷、欠損等した患者に対する移植材料（角膜上皮の代替）として用いることができる。移植の際には、手術用縫合糸を用いて移植片を周囲の組織と固定し、生着を促すことが好ましい。また、移植後、治療用コンタクトレンズで移植部表面を一時的に被覆して保護することが好ましい。
本発明の第２の局面は、次の構成からなる角膜上皮移植用シートを提供する。即ち、コラーゲン層上に、口腔粘膜上皮細胞由来の細胞が重層化した細胞層が形成されている、ことを特徴とする角膜上皮移植用シートである。換言すれば、コラーゲン層上に、上で説明した角膜上皮様シートが形成されていることを特徴とする角膜上皮移植用シートである。ここでのコラーゲン層は羊膜由来であることが好ましく、羊膜から掻爬処理などにより上皮を除去したものであることが更に好ましい。コラーゲン層がこのような上皮を除去した羊膜を原材料としたものであることは、コラーゲン層に羊膜上皮層の細胞が含まれていないことを調べることによって確認できる。尚、羊膜としてヒト羊膜を用いることが特に好ましい。
この角膜上皮移植用シートは、角膜を損傷、欠損等した患者に対する移植材料（角膜上皮の代替）として用いることができる。この場合、コラーゲン層が眼球側となるように角膜上皮欠損部に移植される。移植の際には、手術用縫合糸を用いて移植片を周囲の組織と固定し、生着を促すことが好ましい。また、移植後、治療用コンタクトレンズで移植部表面を一時的に被覆して保護することが好ましい。
以上の角膜上皮様シート、及び角膜上皮移植用シートは、以下の方法により作製することができる。
本発明の第３の局面は角膜上皮様シートの作製方法に関し、次のステップを含んで構成される。
ａ）コラーゲン層上で口腔粘膜上皮細胞を培養するステップ、
ｂ）口腔粘膜上皮細胞が増殖して重層化した後、最表層を空気に接触させるステップ、である。
ここで、コラーゲン層の原材料となるコラーゲンの種類は特に限定されず、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲンなどを用いることができる。複数の種類のコラーゲンが混在するものを用いることもできる。これらのコラーゲンは、ブタ、ウシ、ヒツジなどの動物の皮膚、軟骨などの結合組織から、酸可溶化法、アルカリ可溶化法、酵素可溶化法などにより抽出、精製することができる。尚、抗原性を低下させる目的から、ペプシンやトリプシンなどの分解酵素で処理することによりテロペプチドを除去した、いわゆるアテロコラーゲンとしたものを用いることが好ましい。
コラーゲン層として、羊膜由来、特にヒト羊膜由来のものを用いることが特に好ましい。ここで、羊膜由来とは、広く羊膜を出発原料として得られたものであることを意味する。ヒト羊膜は子宮と胎盤の最表層を覆う膜であって、コラーゲンに富む実質組織上に基底膜、上皮層が形成されて構成される。ヒト羊膜は、例えば分娩時に後産として得られるヒト胎仔膜、胎盤などから採取することができる。具体的には、分娩直後に得られるヒト胎仔膜、胎盤及び臍帯からなる一体物を処理、精製することによりヒト羊膜を調製することができる。処理、精製方法は、特開平５−５６９８号に記載される方法などの公知の方法を採用できる。すなわち、分娩時に得られる胎仔膜より羊膜を剥離し、超音波洗浄等の物理的処理及び酵素処理などにより残存組織を除去し、適宜洗浄工程を経てヒト羊膜を調製することができる。
このように調製したヒト羊膜は、使用時まで凍結して保存しておくことができる。ヒト羊膜の凍結は、例えば−８０℃、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）とグリセロールとを体積比で等量混合した液中で行うことができる。凍結保存することにより操作性が向上することは勿論のこと、抗原性が低下することも期待できる。
羊膜をそのままコラーゲン層として利用することもできるが、羊膜から掻爬処理などによって上皮を除去したものを利用することが好ましい。例えば、上記のように凍結保存したヒト羊膜を解凍した後、ＥＤＴＡやタンパク分解酵素で処理して細胞間の接着を緩め、そしてセルスクレイパーなどを用いて上皮を掻爬することにより、上皮が除去されたヒト羊膜を調製することができる。
コラーゲン層上には口腔粘膜上皮細胞が培養される。口腔粘膜上皮には幹細胞の存在が示唆されており、上皮様細胞層を形成する細胞へと分化誘導を行い易いと考えられる。また、口腔粘膜上皮細胞を用いることは、採取が容易なこと、多量の細胞を採取可能なこと、更には両眼性の患者を処置する場合においても自己の細胞を用いて移植材料を調製できること等の利点を有する。特に、角膜上皮細胞を採取不可能な患者に対して、自己の細胞由来の移植材料を適用できるという利点は、臨床上極めて重要な拒絶反応の問題を大幅に解消するものと期待される。
口腔粘膜上皮細胞としては歯根部に存在する細胞（口腔内縁粘膜上皮細胞）、口唇部の細胞、口蓋部の細胞、頬部の細胞などが用いられる。中でも口腔内縁粘膜上皮細胞はその増殖能が高く、また抗原性が低いことから、これを用いることが特に好ましい。口腔粘膜上皮細胞は、目的とする細胞が存在する場所をメスなどで切除したり、掻爬したりすることにより採取することができる。口腔内縁粘膜上皮細胞にあっては、抜歯に付着している口腔粘膜上皮をエナメルセメント移行部より分離し、これより採取することができる。尚、結合組織などの不純物を除去するために、ディスパーゼやトリプシンなどの酵素による処理や、フィルター処理を施すことが好ましい。
本発明によって作製される角膜上皮様シートが移植される患者以外の口腔より採取した口腔粘膜上皮細胞を用いることもできるが、免疫拒絶反応を考慮すれば、患者自身の口腔より口腔粘膜上皮細胞を採取し、培養に供することが好ましい。
このようにして採取された口腔粘膜上皮細胞は、コラーゲン層上で培養される。例えば上記の方法によって口腔粘膜上皮細胞浮遊液を調製し、これをコラーゲン層上に播種し、適当な培養条件下で培養する。コラーゲン層として上皮を除去したヒト羊膜を利用する場合には、上皮を除去して表出した面側（即ち、基底膜側）に口腔粘膜上皮細胞を播種することが好ましい。この面側には、ＩＶ型コラーゲンがリッチに含まれており、播種された口腔粘膜上皮細胞の増殖、重層化が良好に行われると考えられるからである。
口腔粘膜上皮細胞は、例えば細胞密度が約１×１０^３個／ｃｍ^２以上、好ましくは約１×１０^３個／ｃｍ^２〜約１×１０^７個／ｃｍ^２、更に好ましくは約１×１０^４個／ｃｍ^２〜約１×１０^６個／ｃｍ^２となるようにコラーゲン層上に播種することができる。
口腔粘膜上皮細胞の培養は支持細胞の存在下で行うことが好ましい。支持細胞とは、ｆｅｅｄｅｒ細胞とも呼ばれ培養液中に成長因子等などを供給する。支持細胞との共存下で培養することにより、口腔粘膜上皮細胞の増殖効率が向上する。支持細胞には、例えば３Ｔ３細胞（スイスマウス３Ｔ３細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞、３Ｔ３Ｊ２細胞など）などを用いることができる。中でも、増殖効率、取り扱いの容易さなどの観点からマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞を支持細胞として用いることが好ましい。
支持細胞を予めマイトマイシンＣなどを用いて不活性化しておくことが好ましい。支持細胞自体が増殖することによって口腔粘膜上皮細胞の増殖が阻害されることを防止し、口腔粘膜上皮細胞の増殖効率を上昇させるためである。このような不活性化は、放射線処理などによっても行うことができる。
口腔粘膜上皮細胞の培養を支持細胞の共存下で行う場合には、支持細胞とコラーゲン層との間に支持細胞が通過できないポアサイズの隔離膜を存在させることが好ましい。この隔離膜の利用によって、培養時にコラーゲン層側（即ち、口腔粘膜上皮細胞側）に支持細胞が侵入することを防止できる。その結果、最終的に得られる角膜上皮様シート内に支持細胞が混在するおそれが無くなる。このことは、支持細胞による免疫拒絶の問題のない角膜上皮様シートの作製が可能になることを意味し、臨床上極めて有意義である。
隔離膜としては、支持細胞が通過できないポアサイズを有する公知のものを適宜選択して使用することができる。例えば、ポリカーボネート製、ポアサイズが約０．４μｍ〜３．０μｍの膜を用いることができる。隔離膜の材質は特に限定されず、ポリカーボネートの他、ポリエステルなどであってもよい。このような隔離膜は市販されており、容易に入手することができる。
隔離膜を用いた場合の培養方法の例として以下の方法を挙げることができる。まず、シャーレ等の容器（第１の容器）に不活性化した支持細胞を播種して培養することにより、容器表面に支持細胞層を形成させる。次に、隔離膜で底面を形成した第２の容器を、第１の容器内に設置する。この際、第２の容器の底面が培養液中となるように第２の容器の位置を調整する。続いて、第２の容器の底面、即ち隔離膜上にコラーゲン層を形成する。そして、コラーゲン層上に口腔粘膜上皮細胞を播種し、培養する。
第２の容器の底面に予めコラーゲン層を形成しておき（例えば、第２の容器の底面に上皮を除去した羊膜をのせる。この状態で一旦乾燥処理を行ってもよい。）、この第２の容器を、支持細胞を播種した第１の容器内に設置し、そしてコラーゲン層上に口腔粘膜上皮細胞を播種し、培養を行ってもよい。
支持細胞の細胞密度は、例えば約１×１０^２個／ｃｍ^２以上、好ましくは約１×１０^２個／ｃｍ^２〜約１×１０^７個／ｃｍ^２、更に好ましくは約１×１０^３個／ｃｍ^２〜約１×１０^５個／ｃｍ^２とすることができる。口腔粘膜上皮細胞数との対比でいえば、使用する支持細胞数を、例えば口腔粘膜上皮細胞数に対して１／１０^３倍〜１×１０^２倍、好ましくは１／１０^２〜１倍となるような条件で培養を行うことができる。支持細胞数が少ないと口腔粘膜上皮細胞の増殖率が低下し、少なすぎる場合には良好な口腔粘膜上皮細胞の重層化が得られない。一方、支持細胞数が多すぎる場合には、かえって口腔粘膜上皮細胞の増殖率を低下させることとなり好ましくない。
口腔粘膜上皮細胞を培養する際に用いられる培養液は、当該細胞を増殖させ、重層化できるものであれば特に限定されない。例えば、上皮細胞の成長に通常用いられるＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）とハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２ ｍｅｄｉｕｍ）とを所定割合で混ぜ、ＦＢＳ、成長因子、抗生物質等を添加した培地を使用することができる。具体例としては、ＦＢＳ（１０％）、インシュリン（５ｍｇ／ｍｌ）、コレラトキシン（０．１ｎＭ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）（１０ｎｇ／ｍｌ）、及びペニシリン−ストレプトマイシン（５０ＩＵ／ｍｌ）を添加した、ＤＭＥＭとハムＦ１２培地の混合培地（混合体積比１：１）が挙げられる。また、トリヨードサイロニン（例えば、２ｎＭ）、グルタミン（例えば、４ｍＭ）、トランスフェリン（例えば、５ｍｇ／ｍｌ）、アデニン（例えば、０．１８ｍＭ）、及び／又はハイドロコルチゾン（例えば、０．４ｍｇ／ｍｌ）を更に添加したＤＭＥＭ／ハムＦ１２混合培地を用いることもできる。
ステップａ）によって、コラーゲン層上で口腔粘膜上皮細胞が増殖し、重層化する。そして、重層化した細胞層の表層を空気に接触させるステップ（ステップ（ｂ））が行われる。尚、このステップを本明細書においてエアーリフティング（Ａｉｒ−ｌｉｆｔｉｎｇ）とも呼ぶ。このステップ（ｂ）は、細胞層を形成する細胞の分化、及びバリア機能の誘導のために行われる。
このステップは、培養液の一部をスポイト、ピペットなどを用いて一時的に除去することにより培養液表面を低下させ、これにより口腔粘膜上皮細胞層の最表層を一時的に培養液外に露出させることによって行うことができる。又は、口腔粘膜上皮細胞層をコラーゲン層ごと持ち上げて、最表層を培養液表面から一時的に露出させることにより行うこともできる。更には、チューブなどを用いて空気を培養液中に送り込み、口腔粘膜上皮細胞層の最上層に空気を接触させてもよい。操作の容易さの観点から、培養液表面を低下させて口腔粘膜上皮細胞の最表層を露出させる方法により行うことが好ましい。
このステップ（ｂ）を行う時間、即ち重層化した細胞層の最表層を空気に接触させる時間は、細胞の状態や培養条件などによって変動するが、例えば３日〜３週間程度であり、好ましくは５日〜２週間、更に好ましくは約１週間である。
以上の本発明の方法により、コラーゲン層上において、口腔粘膜上皮細胞が重層化した角膜上皮様の細胞層（角膜上皮様シート）が形成される。この角膜上皮様シートは、口腔粘膜上皮細胞の培養基質として用いられるコラーゲン層とともに、角膜を損傷、欠損等した患者に対する移植材料（角膜上皮の代替）として用いることができる。この場合、コラーゲン層が眼球側となるように角膜上皮欠損部に移植される。移植の際には、手術用縫合糸を用いて移植片を周囲の組織と固定し、生着を促すことが好ましい。また、移植後、治療用コンタクトレンズで移植部表面を一時的に被覆して保護することが好ましい。
尚、コラーゲン層の一部除去したもの、又は全部を除去したもの（即ち、角膜上皮様シートのみ）を移植片として用いることもできる。このコラーゲン層の除去は、ＥＤＴＡ等による化学処理、タンパク分解酵素等による酵素処理、ピンセット等による掻爬などの物理的処理を適宜組み合わせて行うことができる。
本発明の第３の局面によれば、口腔粘膜上皮細胞が重層化した角膜上皮様の細胞層（角膜上皮様シート）が作製されるが、本発明の方法を、当該細胞層がコラーゲン層上に形成されてなる角膜移植用の移植材料（角膜上皮移植用シート）を提供するものと見ることもできる。即ち、本発明の方法は、このような構造を有する角膜上皮移植用シートの作製方法として用いることができるものでもある。
＜実施例１＞家兎を用いた角膜上皮様シートの評価
［羊膜の採取］
羊膜は、全身的合併症のない帝王切開予定の妊婦に対して事前に産婦人科医とともに十分なインフォームドコンセントを行った後、手術室で帝王切開時に採取した。操作は清潔に気をつけ、手術操作に準じて手洗いの後に専用ガウンを装用した。分娩前に清潔な羊膜採取用のバットと洗浄用の生理食塩水を準備した。分娩後に胎盤組織をバットに移し、用手的に羊膜組織を胎盤より剥離した。羊膜と胎盤との癒着が強い部分はハサミで切除した。
［羊膜の処理］
羊膜処理の過程は（１）洗浄、（２）トリミング、（３）保存の順で行った。すべての過程において、操作は清潔なドラフト内で行うのが望ましく、使用する容器や器具もすべて滅菌されたものを使用し、シャーレ等は滅菌された使い捨て（ディスポーザブル）タイプのものを使用した。採取した羊膜に付着した血液成分を生理食塩水にて洗浄しながら除去し、さらに十分量の生理食塩水（０．００５％ｏｆｌｏｘａｃｉｎ添加）にて洗浄した。次に羊膜をシャーレ内のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に移し、ハサミを用いて約４×３ｃｍ程度のサイズに分割した。分割後さらに数個のシャーレに保存液を浸し、その中で状態のよい羊膜を選別した。
［羊膜の保存］
２ｃｃの滅菌クライオチューブに１ｃｃずつ保存液を入れ、そこに採取、洗浄して選別された羊膜を１枚ずついれラベルした後、−８０℃の冷蔵庫に保存した。保存液には５０％滅菌済みグリセロールｉｎ ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’Ｓ Ｍｏｄｏｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ：ＧＩＢＣＯＢＲＬ社）を使用した。保存された羊膜の使用期限は３ヶ月とし、期限が過ぎれば焼却処分した。
［羊膜上皮の処理］
羊膜はその上皮を処理した後、培養に使用した。まず、−８０℃で保存していた羊膜を室温で解凍した後、シャーレ内の滅菌済みリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で十分に洗浄した。洗浄後０．０２％ＥＤＴＡ溶液（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社）に２時間３７℃で保存した後、ｃｅｌｌ ｓｃｒａｐｅｒ（Ｎｕｎｃ社ＵＳＡ）を用いて機械的に上皮を掻爬し、培養の基質として使用した。尚、この処理方法によって、１層の羊膜上皮が完全に掻爬されたことを光学的及び電子顕微鏡的操作（走査型電子顕微鏡）において確認した（図１）。尚、図１は走査型電子顕微鏡による羊膜像である。Ａは正常な状態（上皮処理を行っていない状態）の羊膜表面の像、Ｂは上皮掻爬処理（０．０２％ＥＤＴＡ溶液）後の羊膜表面の像である。
［口腔粘膜上皮細胞の回収］
６週令の日本白色家兎を抜歯後、歯に付着されている口腔粘膜上皮をエナメルセメント移行部より丁寧に分離した。尚、一連の操作は、滅菌済みの器具を使用してできるだけ滅菌的に行った。
採取した口腔粘膜上皮を５０ＩＵ／ｍｌのペニシリンストレプトマイシン、ゲンタシンを含有するリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に３０分、室温の条件で２回浸漬した。その後、組織を１．２Ｕディスパーゼ（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社）を含有するリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に１時間、３７℃の条件で浸漬し、続いて０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社）で３０分間、浸漬処理して細胞を分離した。酵素活性は１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭに浸漬させることにより停止させた。その後、６０μｍのｃｅｌｌ ｆｉｌｔｅｒで余分な組織を除去し、口腔粘膜上皮細胞（口腔内縁粘膜上皮細胞）を単離した。
［共培養細胞の調製］
共培養の細胞（支持細胞）として、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞（以下、「３Ｔ３細胞」と略称する）を使用した。事前に培養して７５Ｆフラスコ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社）でコンフレントになった３Ｔ３細胞を０．０５％マイトマイシンＣ溶液に２時間浸漬させ、３Ｔ３の増殖活性を抑えた。続いてリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で数回洗浄してマイトマイシンＣを除去した後、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液で処理することにより、３Ｔ３細胞懸濁液を調製した。
［羊膜上口腔粘膜上皮シートの形成］
上皮を掻爬したヒト羊膜を基質として、口腔粘膜上皮細胞を上記処理を施した３Ｔ３細胞と以下の手順で共培養した。培養器具としては６ｗｅｌｌのｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈ（培養皿）（Ｃｏｒｎｉｎｇ社，ＮＹ）とｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔ（培養挿入容器）（ポリカーボネート製、平均ポアサイズ３．０μｍ、Ｃｏｒｎｉｎｇ社，ＮＹ）を用いた。
まず、ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈ上に約１×１０^４個／ｃｍ^２の細胞密度となるように３Ｔ３細胞懸濁液を播種し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で培養した。また、ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔ上に掻爬した上皮側を上にして羊膜基質を静置して貼り付け、室温で１０分乾燥させた。その後、羊膜を貼り付けたｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔ上に約１×１０^５個／ｃｍ^２の細胞密度となるように口腔粘膜上皮細胞を含む細胞懸濁液を播種した。
以上の操作後、図２に示すように、ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔをｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈ内に設置し、３Ｔ３細胞と口腔粘膜上皮細胞を同じ培地中で培養した。尚、図２は培養中の状態を示した模式断面図である。ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈ１内にｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔ２が静置され、ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈ１底面には３Ｔ３細胞層５が形成される。また、ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔ ２の底面上に羊膜３が静置され、その上に口腔粘膜上皮細胞４が培養される状態が示される。符号６は培地である。
培地には、ＤＭＥＭ／ハムＦ１２混合培地（混合体積比１：１）に、１０％ＦＢＳ，インシュリン（５ｍｇ／ｍｌ）、コレラトキシン（０．１ｎＭ）、ペニシリンストレプトマイシン（５０ＩＵ／ｍｌ）、ヒトリコンビナント上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加したものを使用した。
上記の培地中で２週間培養した（Ｓｕｂｍｅｒｇｅ）。その後、粘膜上皮を分化誘導すべく、いわゆるＡｉｒ−ｌｉｆｔｉｎｇ法を用いて１週間培養した。Ａｉｒ−ｌｉｆｔｉｎｇ法とは、培地の液面を、羊膜上に形成された口腔粘膜上皮細胞層面までにし、当該細胞層の表面を空気中に暴露する方法である。Ｓｕｂｍｅｒｇｅ中は隔日で培地を交換し、ａｉｒ−ｌｉｆｔｉｎｇ後は毎日培地交換して培養を行った。
［羊膜上口腔粘膜上皮シートの組織学的特性の検証］
上述のようにして培養された口腔粘膜上皮細胞層は約２０日間の培養により、角膜上皮に類似した５〜６層に多分化、重層化した上皮層（以下、「角膜上皮様シート」ともいう）を形成した（図３、図４）。この上皮層の基底側（羊膜側）には比較的円柱形をした基底細胞類似の細胞群が存在していた。また、最表層の細胞は扁平型を呈していたが核を有しており、皮膚とは異なりその表面は角化していないことが確認された。以上より、光学的顕微鏡観察では羊膜上に角膜類似の上皮層（角膜上皮様シート）が形成されていることが示された。
次に、この角膜上皮様シートの組織学的特性を検討するために免疫染色を行った。角膜上皮様シートを作製後、適切な大きさに切除してＯＣＴ ｃｏｍｐｏｕｎｄに凍結包埋した。その後クライオスタットにて薄切りし、スライド切片を作製した。免疫染色にあたっては、代表的な細胞骨格蛋白であるケラチン関連の検討を行った。すなわち、角膜特異的なケラチン３／１２、粘膜特異的なケラチン４／１３、表皮に特異的なケラチン１／１０を検討した。方法は以下のとおりである。スライド切片をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄した後、１％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）でブロッキングを行い非特異的な抗体反応を抑制した。その後、各ケラチンに対する抗体（１次抗体）を室温で１時間反応させた。反応後ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ含有のＰＢＳにて１５分、３回の条件で洗浄し、続いて蛍光標識化抗体（２次抗体）を室温で１時間反応させた。反応後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）にて１５分、３回の条件で洗浄し、封入した後コンフォーカルマイクロスコープにて組織を観察した。
角膜上皮様シートに対する各種ケラチンの抗体反応は以下の通りである。まず、角膜特異的ケラチン３に対する染色性が認められた（図５左欄）。Ｉｎ ｖｉｖｏの口腔粘膜ではケラチン３に対して染色性が認められるため、培養条件下でもその性質が保持されていると考えられた。一方、ケラチン１２に対しては染色性が認められなかった（図５右欄）。粘膜特異的ケラチン４および１３に対しては、その染色性が同様に認められた（図６）。しかるに表皮角化型ケラチンであるケラチン１／１０に対しては、その染色性は認められなかった（図７）。以上のことから、角膜上皮様シートの組織学的性質としては、細胞骨格の側面からは、表皮のように角化の方向へ分化しているのではなく、非角化型の粘膜上皮としての性質を保持しながら、角膜特異的なケラチンの１部（ケラチン３）も同時に保持していることがわかった。
［口腔粘膜上皮シートの自己移植］
次に、角膜上皮様シートを用いた自己移植実験を行った。上述の方法により、６週令日本白色家兎より口腔粘膜上皮細胞を採取し、羊膜上に角膜上皮様シートが形成された移植用シート（以下、「角膜上皮移植用シート」ともいう）を作製した。一方、口腔粘膜上皮細胞の採取を行った白色家兎に対し、輪部より４ｍｍ外側からクレセントナイフを用いて角膜および結膜上皮を１００μｍの厚さですべて除去した。この操作により角膜上皮幹細胞を含む上皮細胞が存在しなくなるため、人為的な眼表面幹細胞疲弊症が再現されると考えることができる。この操作の後、角膜上皮細胞を含む上皮が残存していないことをフルオレセイン染色で確認した（図８）。尚、フルオレセイン染色試験は、フルオレセイン試験紙に抗生剤の点眼などの水分を含ませて直接眼表面に塗布し、２、３度瞬目をさせた後、眼表面のフルオレセイン染色性を観察することにより行った。角膜上皮が残存していると、そのタイトな細胞間接着構造によってフルオレセイン色素は浸潤せず、フルオレセインによる染色が見られない。４週後、同家兎の眼表面は周辺の残存結膜上皮に覆われ透明性を維持していなかった（図９）。
次に、結膜上皮に被覆されて透明性を失った同眼に対し、眼表面の結膜組織を除去した後、前述の角膜上皮移植用シートを輪部よりやや内側の領域に移植した。移植の際には１０−０ナイロン糸を用いて周囲の組織に縫合した。移植後、移植片の上に治療用ソフトコンタクトレンズを縫着した。術後、抗生剤およびステロイド眼軟膏を２回／日塗布した。移植後の時点で、眼表面は、移植前の角膜上皮移植用シートと同様の透明性を示していた（図１０）。
移植後４８時間、及び１０日経過した時点で移植術を施した眼表面を観察した。移植後４８時間経過した時点では、移植された角膜上皮移植用シートは透明性を維持しており、また、フルオレセイン染色にて眼表面に欠損なく残存していることが確認された（図１１）。また、移植片（角膜上皮移植用シート）がフルオレセイン染色性を示さないことにより、本発明の角膜上皮移植用シート（角膜上皮様シート）は、角膜上皮同様のバリア機能を備えていることが確認された。さらに、フルオレセイン染色にて移植片の周囲は全周に渡ってフルオレセインの染色性が認められたことから、移植部に存在する組織は周囲の残存結膜上皮のコンタミネーションではないことが確認された。
尚、角膜上皮は細胞同士がタイトな接着構造で結合しているため、その表面よりフルオレセインの色素が浸潤せず、フルオレセイン染色において染色性を示さない。一方、細胞間の接着が緩んだり、細胞自体が剥離してバリア機能が障害されたときには、フルオレセイン色素の浸潤が生じて組織を染色する。したがって、フルオレセイン染色による染色性を調べることにより、移植した角膜上皮様シートが角膜上皮同様のバリア機能を備えるか否かを確認できる。
移植後１０日経過した時点で、上記と同様に眼表面を観察した。移植された角膜上皮移植用シートは眼表面に残存しており、しかも移植後４８時間経過した時点の状態と比較して周囲へ伸展していることがフルオレセイン染色より観察された（図１２）。移植片はフルオレセイン染色性を示さず、角膜上皮に必要とされるバリア機能を維持していることが確認された。また、透明性も維持されていた。
以上より、羊膜上で培養して得られる角膜上皮様シートが眼表面に生着、伸展し、術後長期間に渡って透明性を維持することが確認された。即ち、上述の方法により作製される角膜上皮様シートは角膜上皮の代替として良好に機能するものであって、また、羊膜とその上に形成された角膜上皮様シートからなるシート状の組成物（角膜上皮移植用シート）は、角膜の損傷、欠損などの場合に眼表面を再建するための移植材料として好適に利用できるものであることが確認された。
＜実施例２＞ヒトでの角膜上皮様シートの評価
次に、角膜上皮様シートをヒトに適用した場合の効果を確認した。移植対象者を（１）化学外傷急性期の遷延性上皮欠損を有する患者、（２）化学外傷慢性期の瘢痕組織侵入による混濁を有する患者、（３）眼類天疱瘡患者とし、各患者からそれぞれ口腔粘膜上皮細胞を上記実施例１と同様の方法で採取した。続いて口腔粘膜上皮細胞を、上皮を掻爬したヒト羊膜を基質として３Ｔ３細胞と共培養し、ヒト羊膜上に口腔粘膜上皮細胞層が形成された角膜上皮移植用シートを得た。尚、上皮を掻爬したヒト羊膜の調製方法、及び３Ｔ３との共培養条件については実施例１の場合と同様とした。このようにして調製した各角膜上皮移植用シートを、その調製に使用した細胞を採取した患者にそれぞれ移植して（自己移植）その効果を評価した。移植方法は実施例１に記載した方法と同様とした。但し、眼類天疱瘡の患者に対しては上方の瘢痕組織を切除して癒着を解除し、その後角膜上皮様移植シートの移植を上方３分の１に行い、同時に白内障手術を施行して眼内レンズを挿入した。
術前（左欄）及び術後５ヶ月（右欄）における、化学外傷急性期の遷延性上皮欠損患者の眼表面の状態を図１３に示す。術後５ヶ月では眼表面が見事に再建されていることが認められる。移植手術を行わない場合には、本患者の視力は瘢痕組織の侵入により手動弁程度になることが予想される状態であった。現在では、視力は０．５まで回復し、上皮の状態も安定している。また、自家移植であることから拒絶反応の懸念もなく、術後管理は従来の移植術に比較して格段に容易である。
図１４に、術前（左欄）及び術後２ヶ月（右欄）における、化学外傷慢性期の瘢痕性角結膜上皮症患者の眼表面の状態を示した。この患者は、術前には眼内の所見が得られないほどの重症であったが、移植手術によって癒着を解除することができ、水晶体まで透見可能となった。視力は光覚から指数弁に改善した。次の手術方針を決定するための予備的な手術として行ったが、眼内を観察するという当初の目的を達成した上に、美容的にも著しい改善が認められた。
図１５に、術前（左欄）及び術後１ヶ月（右欄）における、眼類天疱瘡患者の眼表面の状態を示す。眼類天疱瘡患者に対して通常の白内障手術を施すと、これを契機に結膜が侵入して瘢痕が形成され、それによって著しい角膜混濁をきたすことが知られている。本症例では術前に眼類天疱瘡による瞼球癒着が上方に認められたが、術後１ヶ月経過した時点で眼表面の状態は安定している。視力については術前０．０６しかなかったものが、現在では０．６にまで回復している。
以上の結果から、本発明の角膜上皮様シート（角膜上皮移植用シート）のヒトに対する有効性が実証された。
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
以下、次の事項を開示する。
（１１） ａ）コラーゲン層上で口腔粘膜上皮細胞を培養するステップ、
ｂ）口腔粘膜上皮細胞が増殖して重層化した後、最表層を空気に接触させるステップ、
を含む、角膜上皮移植用シートの作製方法。
（１２） 前記ステップａ）が支持細胞の共存下で行われる、（１１）に記載の角膜上皮移植用シートの作製方法。
（１３） 前記ステップａ）が、支持細胞の共存下であって、支持細胞と前記コラーゲン層との間に支持細胞が通過できないポアサイズの隔離膜が存在した状態で行われる、（１１）に記載の角膜上皮移植用シートの作製方法。
（１４） 前記コラーゲン層が羊膜由来である、（１１）〜（１３）のいずれかに記載の角膜上皮移植用シートの作製方法。
（１５） 前記コラーゲン層が上皮を除去した羊膜からなる、（１１）〜（１３）のいずれかに記載の角膜上皮移植用シートの作製方法。
（１６） 第１の容器内に支持細胞を播種し、支持細胞層を形成させるステップ、
前記第１の容器内に、前記支持細胞が通過できないポアサイズの隔離膜からなる底面を有する第２の容器を、底面が培養液中となるように設置するステップ、
前記第２の容器の前記底面上にコラーゲン層を形成するステップ、
前記コラーゲン層上に口腔粘膜上皮細胞を播種するステップ、
培養して口腔粘膜上皮細胞を重層化させるステップ、
重層化した口腔粘膜上皮細胞の最表層を空気に接触させるステップ、
を含む角膜上皮移植用シートの作製方法。
（１７） 前記コラーゲン層が羊膜由来である、（１６）に記載の角膜上皮移植用シートの作製方法。
（１８） 前記コラーゲン層が上皮を除去した羊膜からなる、（１６）に記載の角膜上皮移植用シートの作製方法。
産業上の利用の可能性
これまでの眼表面再建術は、自己（オート）又は他人（アロ）からの角膜上皮幹細胞を採取し、これを患者に移植するものであった。しかし、自己の健眼からの幹細胞採取は将来的に健眼の幹細胞疲弊症が危惧される。また、他人からの幹細胞移植では拒絶反応のリスクを常に伴うことに加え、ドナー不足の問題がある。本発明により提供される角膜上皮様シート及び角膜上皮移植用シートによれば、移植材料用の細胞源として自己の口腔粘膜上皮を用いることができるので、幹細胞疲弊症を引き起こす惧れが無く、拒絶反応のリスクも極めて少なく、更にはドナーの心配をすること無く移植術を行うことが可能となる。特に、自己の角膜上皮幹細胞の採取が困難か又は不可能な患者、即ち両眼性の角膜疾患患者においても、自己の細胞を用いて作製した移植材料を用いた移植術が可能となる点において有意義である。
本発明の角膜上皮様シート（角膜上皮移植用シート）は、移植後の生着が良好であって、かつ瞬目に耐え得るだけの接着性を有する。また、基底細胞層で一定であって、かつ瞬目に耐え得るだけの接着性を有する。また、基底細胞層で一定の増殖能を保ちながら、垂直方向に重層化、分化した上皮様細胞層が形成されており、角膜上皮に極めて類似する構造を備える。さらに、角膜上皮がその機能を発揮するために必要なバリア機能も備え、また透明度も高い。このように、本発明により提供される角膜上皮様シート及び角膜上皮移植用シートは、角膜上皮を再建するための移植材料として極めて優れたものである。
【図面の簡単な説明】
図１は、走査型電子顕微鏡による羊膜像を示す図である。Ａは正常な状態（上皮処理を行っていない状態）の羊膜表面の像、Ｂは上皮掻爬処理（０．０２％ＥＤＴＡ溶液）後の羊膜表面の像である。Ａでは多角形の羊膜上皮が観察される。一方、Ｂでは羊膜上皮が認められず、上皮が完全に除去されていることが確認される。
図２は、羊膜上に口腔粘膜上皮細胞を培養する際の器具等の状態を模式的に示した断面図である。ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈ１内にｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔ２が静置され、ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈ１底面には３Ｔ３細胞層５が形成される。また、ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔ２の底面上に羊膜３が静置され、その上に口腔粘膜上皮細胞４が培養される状態が示される。符号６は培地である。
図３は、コンフルエントな状態の口腔粘膜上皮層の光学顕微鏡像を示す図である。
図４は、羊膜上に形成された口腔粘膜上皮細胞層のＨＥ（ヘマトキシリン−エオジン）染色像を示す図である。角膜上皮に類似した５〜６層の細胞からなる層が形成されているのが観察される。
図５は、羊膜上の口腔粘膜上皮細胞層（口腔粘膜上皮シート）をケラチン３（Ｋ３）およびケラチン１２（Ｋ１２）に対する抗体を用いて染色した像を示す図である。ケラチン３に対しては染色性が認められ、ケラチン１２に対しては染色性が認められない。尚、染色された部分を白抜きで表している。
図６は、羊膜上の口腔粘膜上皮細胞層（口腔粘膜上皮シート）をケラチン４（Ｋ４）およびケラチン１３（Ｋ１３）に対する抗体を用いて染色した像を示す図である。ケラチン４及び１３に対して染色性が認められる。尚、染色された部分を白抜きで表している。
図７は、羊膜上の口腔粘膜上皮細胞層（口腔粘膜上皮シート）をケラチン１およびケラチン１０に対する抗体を用いて染色した像を示す図である。ケラチン１にもケラチン１０にも染色性は認められない。
図８は、角膜及び結膜上皮を除去した家兎の眼表面をフルオレセイン染色した像を示す図である。フルオレセインで染色された部分を白抜きで表している。眼表面全体がフルオレセインにより染色されているのが観察され、上皮が完全に除去されていることがわかる。
図９は、角膜及び結膜上皮を除去した家兎の４週後の眼表面を示す図である。眼表面が、周囲より瘢痕組織を伴う結膜侵入のため透明性を失っているのが観察される。
図１０は、角膜上皮移植用シートを移植後の眼表面の状態を示す図である。眼表面（移植部）が透明性を示していることがわかる。
図１１は、角膜上皮移植用シートを移植後、４８時間経過した時点のフルオレセイン染色像を示す図である。フルオレセインで染色された部分を白抜きで表している。眼表面（移植部）はフルオレセインに染色されず、移植片が眼表面に生着していることがわかる。また、移植片の周囲は全周にわたってフルオレセインの染色性が認められる。
図１２は、角膜上皮移植用シートを移植後、１０日経過した時点のフルオレセイン染色像を示す図である。フルオレセインで染色された部分を白抜きで表している。染色性を示さない領域が拡大しているのが観察され、移植片が眼表面に残存しており、しかも移植後４８時間経過した時点よりも周囲に伸展していることが示される。
図１３は、化学外傷急性期の遷延性上皮欠損患者の術前（左欄）及び術後５ヶ月（右欄）における眼表面の状態を示す図である。
図１４は、化学外傷慢性期の患者の術前（左欄）（瘢痕性角結膜上皮症）及び術後２ヶ月（右欄）における眼表面の状態を示す図である。
図１５は、眼類天疱瘡患者の術前（左欄）及び術後１ヶ月（右欄）における眼表面の状態を示す図である。

Claims (18)

1. 口腔粘膜上皮細胞由来の細胞が重層化した細胞層からなる角膜上皮様シート。
2. 最表層の細胞が角化していない、請求の範囲第１項に記載の角膜上皮様シート。
3. 最表層の細胞が扁平形状である、請求の範囲第１項又は第２項に記載の角膜上皮様シート。
4. バリア機能を備える、請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載の角膜上皮様シート。
5. コラーゲン層上に、口腔粘膜上皮細胞由来の細胞が重層化した細胞層が形成されている、ことを特徴とする角膜上皮移植用シート。
6. 前記細胞層の最表層の細胞が角化していない、請求の範囲第５項に記載の角膜上皮移植用シート。
7. 前記細胞層の最表層の細胞が扁平形状である、請求の範囲第５項又は第６項に記載の角膜上皮移植用シート。
8. 前記コラーゲン層が羊膜由来である、請求の範囲第５項〜第７項のいずれかに記載の角膜上皮移植用シート。
9. 前記コラーゲン層が上皮を除去した羊膜からなる、請求の範囲第５項〜第７項のいずれかに記載の角膜上皮移植用シート。
10. バリア機能を備える、請求の範囲第５項〜第９項のいずれかに記載の角膜上皮移植用シート。
11. ａ）コラーゲン層上で口腔粘膜上皮細胞を培養するステップ、
    ｂ）口腔粘膜上皮細胞が増殖して重層化した後、最表層を空気に接触させるステップ、
    を含む、角膜上皮様シートの作製方法。
12. 前記ステップａ）が支持細胞の共存下で行われる、請求の範囲第１１項に記載の角膜上皮様シートの作製方法。
13. 前記ステップａ）が、支持細胞の共存下であって、支持細胞と前記コラーゲン層との間に支持細胞が通過できないポアサイズの隔離膜が存在した状態で行われる、請求の範囲第１１項に記載の角膜上皮様シートの作製方法。
14. 前記コラーゲン層が羊膜由来である、請求の範囲第１１項〜第１３項のいずれかに記載の角膜上皮様シートの作製方法。
15. 前記コラーゲン層が上皮を除去した羊膜からなる、請求の範囲第１１項〜第１３項のいずれかに記載の角膜上皮様シートの作製方法。
16. 第１の容器内に支持細胞を播種し、支持細胞層を形成させるステップ、
    前記第１の容器内に、前記支持細胞が通過できないポアサイズの隔離膜からなる底面を有する第２の容器を、底面が培養液中となるように設置するステップ、
    前記第２の容器の前記底面上にコラーゲン層を形成するステップ、
    前記コラーゲン層上に口腔粘膜上皮細胞を播種するステップ、
    培養して口腔粘膜上皮細胞を重層化させるステップ、
    重層化した口腔粘膜上皮細胞の最表層を空気に接触させるステップ、
    を含む角膜上皮様シートの作製方法。
17. 前記コラーゲン層が羊膜由来である、請求の範囲第１６項に記載の角膜上皮様シートの作製方法。
18. 前記コラーゲン層が上皮を除去した羊膜からなる、請求の範囲第１６項に記載の角膜上皮様シートの作製方法。

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