JP6446067B2 - 表面外胚葉系細胞から誘導された角膜上皮様細胞 - Google Patents
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本出願は，日本特許出願２０１５−００４３８９（２０１５年１月１３日出願）に基づく優先権を主張しており、この内容は本明細書に参照として取り込まれる。
本発明は表面外胚葉由来の細胞からケラチン１２陽性の角膜上皮様細胞を誘導する方法に関する。より詳細には、口腔粘膜上皮細胞等の表面外胚葉由来の細胞にPAX6、KLF4、及びOCT4を導入することにより、K12陽性の角膜上皮様細胞を誘導する方法及び前記方法で誘導された角膜上皮様細胞に関する。
本出願は，日本特許出願２０１５−００４３８９（２０１５年１月１３日出願）に基づく優先権を主張しており、この内容は本明細書に参照として取り込まれる。
本発明は表面外胚葉由来の細胞からケラチン１２陽性の角膜上皮様細胞を誘導する方法に関する。より詳細には、口腔粘膜上皮細胞等の表面外胚葉由来の細胞にPAX6、KLF4、及びOCT4を導入することにより、K12陽性の角膜上皮様細胞を誘導する方法及び前記方法で誘導された角膜上皮様細胞に関する。
難治性角膜上皮疾患に対して、献眼による角膜移植術が施行されているが、絶対的なドナー不足と移植後の拒絶反応という問題がある。これを解決するため、患者自身の口腔粘膜上皮細胞を用いた治療法が開発されている。この方法では、口腔粘膜上皮細胞から培養角膜上皮様細胞シートを作製し患眼に移植するが（特許文献１〜３、非特許文献１）、口腔粘膜上皮は完全な角膜上皮には分化しないため、角膜上皮を用いた場合に比較して透明性が低く、脆弱という問題がある。また、血管新生を引き起こす能力も異なるため、口腔粘膜上皮シート移植後、一部の症例では本来無血管である角膜において血管の侵入が起こることがある。
一方、未分化な細胞（幹細胞）を分化誘導することで、損傷した組織器官の補填を図る再生医療の研究が進められている。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、胎盤以外のすべての細胞に分化可能であるため、各細胞系譜への分化誘導やその分化決定因子の同定が注目されたが、倫理的問題からその研究や利用には制約が多く、また拒絶反応の問題もあることから、未だ臨床応用には至っていない。
ｉＰＳ細胞等の人工多能性幹細胞を利用した再生医療は、倫理的問題がないばかりか、患者由来の細胞をソースとすることで拒絶反応の問題も回避することができる。しかし、ｉＰＳ細胞は分化誘導後も未分化細胞が残留し、移植後に腫瘍化のリスクがある。また、ｉＰＳ細胞の樹立と分化誘導に数か月以上かかるという問題がある。
これに対し、ｉＰＳ細胞を介することなく目的とする体細胞を直接誘導するダイレクトリプログラミングにより、皮膚線維芽細胞から神経細胞（非特許文献２）や心筋細胞（非特許文献３）を誘導する方法が知られている。この方法によれば、未分化細胞の残留による腫瘍化のリスクもなく、簡便かつ短時間で目的とする体細胞を得ることができる。
Nishida K. et al., N. Engl. J. Med., (2004) 351:1187-96
Vierbuchen T. et al., Nature, (2010)463:1035-1041
Ieda M., Cell. (2010) 142(3):375-86.
本発明の課題は、多能性細胞の状態を経由することなく、ダイレクトリプログラミングにより、本来の角膜上皮細胞に近い機能を有する細胞を誘導することにある。
上記課題を解決するために、角膜上皮細胞と発生学的・機能的に類似した口腔粘膜上皮細胞に、角膜上皮に発現することが知られている転写因子PAX6、及びKLF4に加えて、OCT4を導入することにより、多能性細胞の状態を介することなく、角膜上皮特異的なケラチン１２を発現している角膜上皮様細胞を誘導できることを見出した。
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１２）を提供する：
（１）表面外胚葉由来の細胞にPAX6、KLF4、及びOCT4を導入することにより、ケラチン１２陽性の角膜上皮様細胞を誘導することを特徴とする、角膜上皮細胞の製造方法；
（２）多能性細胞の状態を介することなく角膜上皮様細胞が誘導される、上記（１）に記載の方法；
（３）表面外胚葉由来の細胞が口腔粘膜上皮細胞である、上記（１）又は（２）に記載の方法；
（４）角膜上皮様細胞がさらにケラチン３陽性である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法；
（５）２つのPAX6アイソフォームPa及びPbの両方を導入する、上記（４）に記載の方法；
（６）PAX6、KLF4、及びOCT4を１つのウイルスベクターで導入する、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法；
（７）上記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法で角膜上皮様細胞を製造し、前記細胞を重層化することを特徴とする、角膜上皮様細胞シートの製造方法；
（８）表面外胚葉由来の細胞から直接誘導されたケラチン１２陽性の角膜上皮様細胞。
（９）さらにケラチン３陽性である、上記（８）に記載の角膜上皮様細胞；
（１０）表面外胚葉由来の細胞が口腔粘膜上皮細胞である、上記（８）又は（９）に記載の角膜上皮様細胞；
（１１）表面外胚葉由来の細胞にPAX6、KLF4、及びOCT4を導入して得られる、上記（１０）に記載の角膜上皮様細胞；
（１２）上記（８）〜（１１）のいずれかに記載の細胞を重層してなる角膜上皮様細胞シート。
（１）表面外胚葉由来の細胞にPAX6、KLF4、及びOCT4を導入することにより、ケラチン１２陽性の角膜上皮様細胞を誘導することを特徴とする、角膜上皮細胞の製造方法；
（２）多能性細胞の状態を介することなく角膜上皮様細胞が誘導される、上記（１）に記載の方法；
（３）表面外胚葉由来の細胞が口腔粘膜上皮細胞である、上記（１）又は（２）に記載の方法；
（４）角膜上皮様細胞がさらにケラチン３陽性である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法；
（５）２つのPAX6アイソフォームPa及びPbの両方を導入する、上記（４）に記載の方法；
（６）PAX6、KLF4、及びOCT4を１つのウイルスベクターで導入する、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法；
（７）上記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法で角膜上皮様細胞を製造し、前記細胞を重層化することを特徴とする、角膜上皮様細胞シートの製造方法；
（８）表面外胚葉由来の細胞から直接誘導されたケラチン１２陽性の角膜上皮様細胞。
（９）さらにケラチン３陽性である、上記（８）に記載の角膜上皮様細胞；
（１０）表面外胚葉由来の細胞が口腔粘膜上皮細胞である、上記（８）又は（９）に記載の角膜上皮様細胞；
（１１）表面外胚葉由来の細胞にPAX6、KLF4、及びOCT4を導入して得られる、上記（１０）に記載の角膜上皮様細胞；
（１２）上記（８）〜（１１）のいずれかに記載の細胞を重層してなる角膜上皮様細胞シート。
従来の培養口腔粘膜上皮細胞シートではケラチン１２の発現が認められず、それが透明性が不十分である一因と考えられていた。本発明によれば、角膜上皮特異的なケラチン１２陽性の細胞を口腔粘膜上皮細胞等の外胚葉由来の細胞から誘導することができる。さらに、このケラチン１２陽性培養口腔粘膜上皮細胞を細胞源として、従来の培養口腔粘膜上皮シートに比べてより角膜上皮細胞に近い性質をもつ角膜上皮様細胞シートの作成が可能になる。
本発明の方法では、多能性細胞の状態を介することなく直接体細胞から角膜上皮様細胞を誘導するため、多能性幹細胞からの誘導に比べて腫瘍化のリスクが少なく、簡便かつ短時間で目的とする細胞を得ることができる。その結果、臨床的にもより良好なアウトカムが得られ、患者のＱＯＬ改善にも資する。
１．定義
表面外胚葉由来の細胞：
ヒトの胚は、発生の段階で３つの胚葉、すなわち内胚葉、中胚葉、外胚葉を形成する。内胚葉は、胃や小腸の粘膜上皮、肝臓、膵臓等に、中胚葉は筋肉、骨、血管や血液、皮下組織、心臓、腎臓等になる、外胚葉は神経、目（角膜上皮）、表皮等を形成する。外胚葉はさらに脳や神経組織となる神経外胚葉、主に皮膚の表面の上皮組織となる表面外胚葉に分かれ、後者を「表面外胚葉由来の細胞」と称する。
「表面外胚葉由来の細胞」としては、表皮、口腔粘膜上皮、角膜上皮などの体表を覆っている重層上皮細胞が挙げられる。特に、口腔粘膜上皮は機能的にも角膜上皮に近く、取得も容易であることから、角膜上皮様細胞誘導のソースとして好ましい。
表面外胚葉由来の細胞：
ヒトの胚は、発生の段階で３つの胚葉、すなわち内胚葉、中胚葉、外胚葉を形成する。内胚葉は、胃や小腸の粘膜上皮、肝臓、膵臓等に、中胚葉は筋肉、骨、血管や血液、皮下組織、心臓、腎臓等になる、外胚葉は神経、目（角膜上皮）、表皮等を形成する。外胚葉はさらに脳や神経組織となる神経外胚葉、主に皮膚の表面の上皮組織となる表面外胚葉に分かれ、後者を「表面外胚葉由来の細胞」と称する。
「表面外胚葉由来の細胞」としては、表皮、口腔粘膜上皮、角膜上皮などの体表を覆っている重層上皮細胞が挙げられる。特に、口腔粘膜上皮は機能的にも角膜上皮に近く、取得も容易であることから、角膜上皮様細胞誘導のソースとして好ましい。
PAX6：
「PAX6（Paired box protein）」 は、胚発生期に発現する転写因子で、aniridia type II protein (AN2) あるいは oculorhombin とも称される。PAX6は眼と脳の発生における重要な制御遺伝子であり、PAX6にコードされるタンパクはDNAに結合し遺伝子転写のレギュレータとして機能する２つの異なる結合部位を有する。PAX6の変異は眼の様々な異常を引き起こすことが知られている。「PAX6」には、２つのアイソフォームPaとPbが存在する。DNA結合部位のうちPAIRED domainの中に5a sequenceが含まれないものがPaで、含まれるものがPbである。
「PAX6（Paired box protein）」 は、胚発生期に発現する転写因子で、aniridia type II protein (AN2) あるいは oculorhombin とも称される。PAX6は眼と脳の発生における重要な制御遺伝子であり、PAX6にコードされるタンパクはDNAに結合し遺伝子転写のレギュレータとして機能する２つの異なる結合部位を有する。PAX6の変異は眼の様々な異常を引き起こすことが知られている。「PAX6」には、２つのアイソフォームPaとPbが存在する。DNA結合部位のうちPAIRED domainの中に5a sequenceが含まれないものがPaで、含まれるものがPbである。
KLF4：
「KLF4（Kruppel-like factor 4）」はKLF転写因子ファミリーのメンバーであり、増殖、分化、アポトーシス、体細胞リプログラミンを制御する。
「KLF4（Kruppel-like factor 4）」はKLF転写因子ファミリーのメンバーであり、増殖、分化、アポトーシス、体細胞リプログラミンを制御する。
OCT4：
「OCT4 (octamer-binding transcription factor 4)」は、POU（Pit-Oct-Unc）ドメインを有する転写因子で、初期胚発生やES細胞の多能性維持に重要な役割を果たす。OCT4は、エピゲノム状態を変化させ、未分化胚性幹細胞の自己複製に密接に関与するため、未分化マーカー（多能性マーカー）として利用されている。また、生殖細胞の癌化に対するマーカーとしても用いられている。
「OCT4 (octamer-binding transcription factor 4)」は、POU（Pit-Oct-Unc）ドメインを有する転写因子で、初期胚発生やES細胞の多能性維持に重要な役割を果たす。OCT4は、エピゲノム状態を変化させ、未分化胚性幹細胞の自己複製に密接に関与するため、未分化マーカー（多能性マーカー）として利用されている。また、生殖細胞の癌化に対するマーカーとしても用いられている。
角膜上皮様細胞：
角膜は、表面から、角膜上皮層、角膜実質層、角膜内皮層の３層構造をしている。角膜上皮細胞は、この角膜の一番外側の層を構成する細胞で、４〜５層の角膜上皮細胞層から構成されている。角膜上皮細胞は表皮外胚葉に由来するが、角膜の実質と内皮は神経堤由来であり、それぞれ個別の幹細胞が存在すると考えられている。本発明にかかる「角膜上皮様細胞」は、この角膜上皮細胞に似た機能と特性を有する細胞で、角膜上皮分化マーカーであるケラチン１２の発現によって特徴づけられる。
角膜は、表面から、角膜上皮層、角膜実質層、角膜内皮層の３層構造をしている。角膜上皮細胞は、この角膜の一番外側の層を構成する細胞で、４〜５層の角膜上皮細胞層から構成されている。角膜上皮細胞は表皮外胚葉に由来するが、角膜の実質と内皮は神経堤由来であり、それぞれ個別の幹細胞が存在すると考えられている。本発明にかかる「角膜上皮様細胞」は、この角膜上皮細胞に似た機能と特性を有する細胞で、角膜上皮分化マーカーであるケラチン１２の発現によって特徴づけられる。
角膜上皮細胞特異的マーカー：
ケラチン１２（Cytokeratin 12：K12）及びケラチン３（Cytokeratin 3：K3）は、いずれも角膜上皮細胞特異的マーカーである。
ケラチン１２（Cytokeratin 12：K12）及びケラチン３（Cytokeratin 3：K3）は、いずれも角膜上皮細胞特異的マーカーである。
多能性マーカー：
本発明では細胞のヒト細胞の多能性の指標となる遺伝子・タンパクである。多能性(幹細胞)マーカーとしては、OCT4（前掲）、NANOG、TRA-1-60、SSEA-4を挙げることができる。
本発明では細胞のヒト細胞の多能性の指標となる遺伝子・タンパクである。多能性(幹細胞)マーカーとしては、OCT4（前掲）、NANOG、TRA-1-60、SSEA-4を挙げることができる。
NANOG：
NANOGは内部細胞塊やES細胞の増殖、自己複製に関与する転写調節因子である。ES細胞の胚体外内胚葉や栄養外胚葉への分化を抑制し、多能性を維持する。また、NANOGはSMAD1に作用し、SMAD1の転写を活性化するコアクチベーターの結合を阻害することにより、BMPシグナルによるES細胞の中胚葉分化を阻止すると考えられている。
NANOGは内部細胞塊やES細胞の増殖、自己複製に関与する転写調節因子である。ES細胞の胚体外内胚葉や栄養外胚葉への分化を抑制し、多能性を維持する。また、NANOGはSMAD1に作用し、SMAD1の転写を活性化するコアクチベーターの結合を阻害することにより、BMPシグナルによるES細胞の中胚葉分化を阻止すると考えられている。
TRA-1-60：
抗TRA-1-60抗体は、ヒトEC細胞、EG細胞、ES細胞、iPS細胞の表面に発現する抗原を認識する。
抗TRA-1-60抗体は、ヒトEC細胞、EG細胞、ES細胞、iPS細胞の表面に発現する抗原を認識する。
SSEA-4：
SSEA-4（stage specific embryonic antigen 4）は細胞表面に局在するスフィンゴ糖脂質の一種である。ヒトではEC細胞、EG細胞及びES細胞でSSEA-4の発現が認められるが、分化とともにその発現は低下し、代わりにSSEA-1の発現が上昇する。このため、SSEA-4はヒトの多能性(幹細胞)マーカーとして用いられる。
SSEA-4（stage specific embryonic antigen 4）は細胞表面に局在するスフィンゴ糖脂質の一種である。ヒトではEC細胞、EG細胞及びES細胞でSSEA-4の発現が認められるが、分化とともにその発現は低下し、代わりにSSEA-1の発現が上昇する。このため、SSEA-4はヒトの多能性(幹細胞)マーカーとして用いられる。
２．角膜上皮様細胞の誘導
本発明では、表面外胚葉由来の細胞にPAX6、OCT4、及びKLF4を導入することで、ケラチン１２（K12）陽性の角膜上皮様細胞を誘導する。
本発明では、表面外胚葉由来の細胞にPAX6、OCT4、及びKLF4を導入することで、ケラチン１２（K12）陽性の角膜上皮様細胞を誘導する。
遺伝子の導入方法は特に限定されず、公知のベクターを用いて行うことができる。ベクターは、哺乳動物細胞に上記遺伝子を導入可能なものであれば特に限定されない。例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルス等のウイルスベクターを利用することができる。このうち、アデノウイルスベクターは大量発現が可能だが毒性が高く、レトロウイルスベクターは長期に安定した発現が期待できるが非分裂細胞に不向きであり、アデノ随伴ウイルスベクターには大きな遺伝子を組み込めないという欠点がある。一方レンチウイルスベクターは上記した問題は少なく、長期に安定した発現が期待できる。
PAX6、OCT4、及びKLF4はそれぞれ別個のベクターで導入してもよいし、１つのベクターで導入してもよい。後述する実施例で実証されるように、１つのベクターに遺伝子を直列に配置して導入しても、各タンパクは独立して発現し、別個に導入したときと同様に、K12陽性の角膜上皮様細胞を得ることができる。
上記の方法によれば、細胞は多能性の状態を経由することなく、表面外胚葉由来の細胞から直接に角膜上皮様細胞へと誘導される。それゆえ、多能性幹細胞からの誘導のように未分化細胞が残留することに起因する腫瘍化のリスクが少なく、簡便かつ短時間で目的とする角膜上皮様細胞を得ることができる。
表面外胚葉由来の細胞としては、表皮、口腔粘膜上皮、角膜上皮様細胞等が挙げられるが、機能面で類似した口腔粘膜上皮細胞が好ましく、特に得られた角膜上皮様細胞を移植する患者自身の口腔粘膜上皮細胞がより好ましい。
細胞の培養は、上皮細胞の培養に使用可能な培地であれば特に限定されない。市販の上皮細胞用の培地を用いてもよいし、基本培地に細胞の維持増殖に必要な各種栄養源や分化誘導に必要な各成分を添加して作成してもよい。基本培地としては、DMEM培地、Keratinocyte-SFM培地、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、α MEM培地、Dulbecco MEM培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、McCoy's培地、ウイリアムスE培地、及びこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地であればいずれも用いることができる。
栄養源としては、グリセロール、グルコース、果糖、ショ糖、乳糖、ハチミツ、デンプン、デキストリン等の炭素源、また、脂肪酸、油脂、レシチン、アルコール類等の炭化水素類、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素、硝酸ナトリウム等の窒素源、食塩、カリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等の無機塩類、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、モリブデン酸ナトリウム、タングステン酸ナトリウム及び硫酸マンガン、各種ビタミン類、アミノ酸類等を含むことができる。
その他必要に応じて、レチノイン酸、ピルビン酸、ピルビン酸、βメルカプトエタノール等のアミノ酸還元剤、血清あるいは血清代替物等を挙げることができる。なお血清代替物としては、例えば、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン）、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、βメルカプトエタノール又は３’チオールグリセロール、成長因子(epidermal growth factor; EGF, keratinocyte growth factor; KGFなど)、市販のKnockout Serum Replacement（KSR）、bovine pituitary extract (BPE)、Chemically-defined Lipid concentrated（Gibco社製）、Glutamax（Gibco社製）、B27 supplement(Gibco社製)、Y-27632 (和光純薬)が挙げられる。
これらの成分を配合して得られる培地のｐＨは５．５〜９．０、好ましくは６．０〜８．０、より好ましくは６．５〜７．５の範囲である。
培養は、３６℃〜３８℃、好ましくは３６．５℃〜３７．５℃で、１％〜２５％ Ｏ２、１％〜１５％ ＣＯ２の条件下で行われる。
角膜上皮様細胞はK12に加えて、ケラチン３（K3）も発現していることが好ましい。なお、K12やK3の遺伝子レベルでの発現はリアルタイムPCRにより容易に確認でき、また蛋白質レベルでの発現は、K12及びK3に特異的な抗体を用いた免疫染色により容易に確認することができる。
PAX6には２つのアイソフォームPa及びPbがあるが、Pbは主としてK12の発現を制御し、Paは主としてK3の発現を制御すると思われる。本発明においては、Pa及びPbの両方を導入すれば、K12およびK3の両方が得られる。
３．表面外胚葉系細胞から誘導された角膜上皮様細胞
本発明は、表面外胚葉由来の細胞から誘導されたK12陽性の角膜上皮様細胞も提供する。前記細胞はさらにK3陽性であることが好ましい。
本発明は、表面外胚葉由来の細胞から誘導されたK12陽性の角膜上皮様細胞も提供する。前記細胞はさらにK3陽性であることが好ましい。
K12及びK3はいずれも角膜上皮細胞特異的マーカーであり、K12やK3を発現している細胞は、本来の角膜上皮細胞と同様の機能や特性を有する。それゆえ、本発明の角膜上皮様細胞は、研究、再生医療における細胞製剤として利用することができる。
前記細胞製剤は、細胞の維持・増殖、患部への投与を補助する足場材料や成分、他の医薬的に許容しうる担体を含んでいてもよい。細胞の維持・増殖に必要な成分としては、炭素源、窒素源、ビタミン、ミネラル、塩類、各種サイトカイン等の培地成分、あるいはマトリゲルＴＭ等の細胞外マトリックス調製品、が挙げられる。
患部への投与を補助する足場材料や成分としては、生分解性ポリマー；例えば、コラーゲン、ポリ乳酸、ヒアルロン酸、セルロース、及びこれらの誘導体、ならびにその２種以上からなる複合体、注射用水溶液；例えば生理食塩水、培地、ＰＢＳなどの生理緩衝液、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液（例えばD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム）等が挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート80、HCO-50等と併用してもよい。
その他、必要に応じて、医薬的に許容される有機溶剤、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤等を含んでいてもよい。
実際の添加物は、本発明の治療剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれるが、これらに限定するものではない。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製された抗体を溶剤、例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に溶解し、これに吸着防止剤、例えばTween80、Tween20、ゼラチン等を加えたものを使用することができる。
本発明の細胞製剤の対象となりうる疾患としては、例えば、Ｓｔｅｖｅｎｓ−Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群、眼類天疱瘡、熱・化学外傷、無虹彩症、周辺部角膜潰瘍、輪部腫瘍、膠様滴状角膜ジストロフィ等が挙げられる。
４．角膜上皮様細胞シート
本発明の方法で得られたK12陽性の角膜上皮様細胞を重層化することにより角膜上皮様細胞シートを作製することができる。本発明はそのような角膜上皮様細胞シートとその製造方法も提供する。
本発明の方法で得られたK12陽性の角膜上皮様細胞を重層化することにより角膜上皮様細胞シートを作製することができる。本発明はそのような角膜上皮様細胞シートとその製造方法も提供する。
細胞の重層化は、発明者らの既報（WO2004/069295、特開2005-130838、Nishida k et al., N. Engl. J. Med. (2004)351:1187-96等）にしたがって実施できる。たとえば、本発明の方法で誘導された角膜上皮様細胞を多孔膜上で培養し、当該多孔膜を介して培地が下層から常に供給されるようにすることで、上皮系細胞を重層化して培養上皮細胞シートを作製できる（特開2005-130838号）。
得られた細胞シートは、透明感及び機械的強度に優れ、本来の角膜上皮細胞と同様の特性及び機能を有する。それゆえ、臨床応用により適している。
実施例１：口腔粘膜上皮細胞からの角膜上皮様細胞の誘導
１．材料・方法：
（細胞）
不死化ヒト口腔上皮細胞(OKF6/TERT-1細胞)を用いた。
１．材料・方法：
（細胞）
不死化ヒト口腔上皮細胞(OKF6/TERT-1細胞)を用いた。
（培地・培養条件）
25μg/mL bovine pituitary extract (BPE), 0.2ng/ml epidermal growth factor (EGF), 0.3mM CaCl2を加えたKeratinocyte-SFM中で5% CO2 37℃で培養した。
25μg/mL bovine pituitary extract (BPE), 0.2ng/ml epidermal growth factor (EGF), 0.3mM CaCl2を加えたKeratinocyte-SFM中で5% CO2 37℃で培養した。
（ベクター構築）
PAX6の各アイソフォームPaおよびPb、その変異体、PAX6-OCT4-KLF4を2Aで連結したall-in-one vectorはpLenti7.3/V5-DEST Vector (Life technologies)に挿入した。OCT4およびKLF4はCSV-CMV-MCS-IRES2-Venus plasmid (RIKEN Bio Resource Center)に挿入した。
以下、PAX6の各アイソフォームをPa及びPb、KLF4をK、及びOCT4をOと記載することもある。
PAX6の各アイソフォームPaおよびPb、その変異体、PAX6-OCT4-KLF4を2Aで連結したall-in-one vectorはpLenti7.3/V5-DEST Vector (Life technologies)に挿入した。OCT4およびKLF4はCSV-CMV-MCS-IRES2-Venus plasmid (RIKEN Bio Resource Center)に挿入した。
以下、PAX6の各アイソフォームをPa及びPb、KLF4をK、及びOCT4をOと記載することもある。
（トランスダクション）
pLenti7.3関連ベクターは293FT細胞にViraPower Lentiviral Expression System (Life technologies)を用いて導入、レンチウイルスを産生した。CSV-CMV-MCS-IRES2-Venus plasmid関連ベクターは293T細胞にpCMV-VZV-G-RSV-Rev, pCAG-HIV-gp (RIKEN Bio Resource Center)と共にFuGene HD(Roche)を用いて導入、レンチウイルスを産生した。
これらのレンチウイルスを1.875x104cell/48wellプレートで前日に播種した細胞に感染させ(polybreneも添加)、翌日培地交換、さらに2日間培養した。
pLenti7.3関連ベクターは293FT細胞にViraPower Lentiviral Expression System (Life technologies)を用いて導入、レンチウイルスを産生した。CSV-CMV-MCS-IRES2-Venus plasmid関連ベクターは293T細胞にpCMV-VZV-G-RSV-Rev, pCAG-HIV-gp (RIKEN Bio Resource Center)と共にFuGene HD(Roche)を用いて導入、レンチウイルスを産生した。
これらのレンチウイルスを1.875x104cell/48wellプレートで前日に播種した細胞に感染させ(polybreneも添加)、翌日培地交換、さらに2日間培養した。
（PCR）
RNAをRNeasyPlus Micro Kitで抽出し、SuperScript III First-Strand Synthesis Systemを用いてcDNA化した。cDNAはTaqman Gene Expression Assayにて定量した。
RNAをRNeasyPlus Micro Kitで抽出し、SuperScript III First-Strand Synthesis Systemを用いてcDNA化した。cDNAはTaqman Gene Expression Assayにて定量した。
（免疫染色）
100%冷メタノールもしくは4% paraformaldehydeで固定した培養細胞を5% normal donkey serumで、1時間常温でblockおよびpermeabilizeした。そのうえでヒツジ抗K12抗体、マウス抗K3/76抗体、ウサギ抗NANOG抗体、マウス抗SSEA4抗体、マウス抗TRA-1-60抗体を加え4℃でオーバーナイトでインキュベートした。さらにマウス、ウサギ、ヒツジの２次抗体と共にインキュベートした。最後にHoechst 33342を加えて画像を取得した。
100%冷メタノールもしくは4% paraformaldehydeで固定した培養細胞を5% normal donkey serumで、1時間常温でblockおよびpermeabilizeした。そのうえでヒツジ抗K12抗体、マウス抗K3/76抗体、ウサギ抗NANOG抗体、マウス抗SSEA4抗体、マウス抗TRA-1-60抗体を加え4℃でオーバーナイトでインキュベートした。さらにマウス、ウサギ、ヒツジの２次抗体と共にインキュベートした。最後にHoechst 33342を加えて画像を取得した。
２．結果：
（１）角膜特異的マーカーの発現
リアルタイムPCRの結果、K12はPbOKの組み合わせで、K3はPaOK又はPaKの組み合わせ、若しくはPaで効率よくmRNAの発現を誘導できた（図１）。
免疫染色の結果、mRNAの発現と同様に、K12はPbOKの組み合わせで、K3はPaOKの組み合わせ、若しくはPaにより、蛋白質レベルでもK12及びK3の発現が確認された（図２）。
（１）角膜特異的マーカーの発現
リアルタイムPCRの結果、K12はPbOKの組み合わせで、K3はPaOK又はPaKの組み合わせ、若しくはPaで効率よくmRNAの発現を誘導できた（図１）。
免疫染色の結果、mRNAの発現と同様に、K12はPbOKの組み合わせで、K3はPaOKの組み合わせ、若しくはPaにより、蛋白質レベルでもK12及びK3の発現が確認された（図２）。
（２）多能性マーカーの発現
多能性マーカーであるNANOGの発現をリアルタイムPCR及び免疫染色で確認したところ、single cell levelではわずかにmRNAの上昇が認められ、部分的なreprogrammingの可能性はあるものの、蛋白質レベルではNANOGの発現は見られなかった（図３）。
多能性マーカーであるSSEA4、TRA-1-60の発現を免疫染色で確認したところ、いずれも発現は見られなかった（図４）。
以上より、多能性幹細胞の状態を経由して、K3、12発現が誘導されたわけではないことが確認された。
多能性マーカーであるNANOGの発現をリアルタイムPCR及び免疫染色で確認したところ、single cell levelではわずかにmRNAの上昇が認められ、部分的なreprogrammingの可能性はあるものの、蛋白質レベルではNANOGの発現は見られなかった（図３）。
多能性マーカーであるSSEA4、TRA-1-60の発現を免疫染色で確認したところ、いずれも発現は見られなかった（図４）。
以上より、多能性幹細胞の状態を経由して、K3、12発現が誘導されたわけではないことが確認された。
実施例２：各種細胞への遺伝子導入
１．材料・方法
（細胞株）
表面外胚葉系細胞：OKF6/TERT-1, OKF6/TERT-2, N/TERT-1, N/TERT-2, HOK
神経外胚葉：ARPE-19, SH-SY5Y
神経堤：HCEC
中胚葉：HUVEC, NHDF-Ad, 293T
内胚葉：MKN1, HepG2
iPS細胞：201B7
上記した各細胞株に実施例１と同様にして様々な組み合わせでPAX6（Pa,Pb）、KLF4及びOCT4を導入し、得られた細胞におけるK12及びK3の発現をリアルタイムPCRで確認した。
１．材料・方法
（細胞株）
表面外胚葉系細胞：OKF6/TERT-1, OKF6/TERT-2, N/TERT-1, N/TERT-2, HOK
神経外胚葉：ARPE-19, SH-SY5Y
神経堤：HCEC
中胚葉：HUVEC, NHDF-Ad, 293T
内胚葉：MKN1, HepG2
iPS細胞：201B7
上記した各細胞株に実施例１と同様にして様々な組み合わせでPAX6（Pa,Pb）、KLF4及びOCT4を導入し、得られた細胞におけるK12及びK3の発現をリアルタイムPCRで確認した。
２．結果
結果を図５にまとめて示す。K12/K3は主に表面外胚葉由来の細胞において効率的に誘導することが可能であったが、内胚葉、中胚葉由来細胞やiPS細胞からはほとんど誘導されなかった。角膜上皮と発生起源が同じ表面外胚葉由来細胞では誘導効率が高かった。
結果を図５にまとめて示す。K12/K3は主に表面外胚葉由来の細胞において効率的に誘導することが可能であったが、内胚葉、中胚葉由来細胞やiPS細胞からはほとんど誘導されなかった。角膜上皮と発生起源が同じ表面外胚葉由来細胞では誘導効率が高かった。
実施例３：All-in-one vectorによる遺伝子導入
１．方法
All-in-one vectorにより3つの遺伝子（PAX6、OCT4、KLF4）を一つのレンチウイルスベクターにPaOKあるいはPbOKの組み合わせを2A配列で連結し、2種類のベクターを作製した。このベクターを実施例１と同様の方法で口腔粘膜上皮細胞にトランスダクションを行い、電気泳動、リアルタイムPCRと免疫染色でmRNA及び蛋白質の発現を確認した。
１．方法
All-in-one vectorにより3つの遺伝子（PAX6、OCT4、KLF4）を一つのレンチウイルスベクターにPaOKあるいはPbOKの組み合わせを2A配列で連結し、2種類のベクターを作製した。このベクターを実施例１と同様の方法で口腔粘膜上皮細胞にトランスダクションを行い、電気泳動、リアルタイムPCRと免疫染色でmRNA及び蛋白質の発現を確認した。
２．結果
電気泳動の結果、各蛋白質が分離して発現していることが確認された。また、リアルタイムPCRと免疫染色の結果から、All-in-one vectorを用いて十分なPAX6、OCT4、KLF4の発現が得られ、また、それによりK12とK3の誘導が可能なことが確認された（図６）。
電気泳動の結果、各蛋白質が分離して発現していることが確認された。また、リアルタイムPCRと免疫染色の結果から、All-in-one vectorを用いて十分なPAX6、OCT4、KLF4の発現が得られ、また、それによりK12とK3の誘導が可能なことが確認された（図６）。
実施例４：K12及びK3の発現制御
K12もしくはK3の上流1K〜6Kの配列に分泌型ルシフェラーゼを結合したreporterを各6種作製し、reporterと共に、PaPbOKを様々な組み合わせで口腔粘膜上皮細胞にトランスダクションした。その結果、PaはK3の上流で直接発現を制御することが確認された（図７）。
K12もしくはK3の上流1K〜6Kの配列に分泌型ルシフェラーゼを結合したreporterを各6種作製し、reporterと共に、PaPbOKを様々な組み合わせで口腔粘膜上皮細胞にトランスダクションした。その結果、PaはK3の上流で直接発現を制御することが確認された（図７）。
また、iPS細胞樹立効率や維持に関係する小分子を加え、K12及びK3の発現をリアルタイムPCRで確認した。添加した小分子は、Wnt signalingに関わるBIO、エピゲノム修飾に関わるBIX、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤RG108、カルシウムチャネル作用薬BayK、ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）阻害剤であるバルプロ酸（VPA）である。その結果、BIOやBIXを添加した際にK12やK3の発現が上昇することが確認された（図８）。このことから、OCT4や小分子(BIX)によるエピゲノムの修飾がK12の誘導効率を上昇させ、BIOによるWnt signalingの修飾がK12およびK3の誘導効率を上昇させることがわかった。
PAX6の2つのDNA binding domain (PAIとRED)を様々な組み合わせでdeleteし、OCT4やKLF4と組み合わせて口腔粘膜上皮細胞に感染させたところ、PAIとREDを欠失させると、K12及びK3のいずれも発現が低下した（図９）。このことから、PAIとREDはともにK12/K3の誘導に必要であることがわかった。
本発明によれば、口腔粘膜上皮細胞等の表面外胚葉由来の細胞から本来の角膜上皮細胞に近いケラチン１２陽性の細胞を誘導することができる。また、本発明の方法は、多能性幹細胞からの誘導に比べて腫瘍化のリスクが少なく、簡便かつ短時間で目的とする細胞を得ることができる。この細胞を重層化した細胞シートは、透明性や機械的強度に優れ、それゆえ、角膜移植等の角膜上皮疾患の治療に有用である。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
Claims (8)
- 表面外胚葉由来の細胞にPAX6、KLF4、及びOCT4を導入することにより、ケラチン１２陽性の角膜上皮様細胞を誘導することを特徴とする、角膜上皮様細胞の製造方法。
- 多能性細胞の状態を介することなく角膜上皮様細胞が誘導される、請求項１に記載の方法。
- 表面外胚葉由来の細胞が口腔粘膜上皮細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
- PAX6、KLF4、及びOCT4を１つのウイルスベクターで導入する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- PAX6アイソフォームPaを導入する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- ２つのPAX6アイソフォームPa及びPbの両方を導入する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- 角膜上皮様細胞がさらにケラチン３陽性である、請求項５又は６に記載の方法。
- 請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法で角膜上皮様細胞を製造し、前記細胞を重層化することを特徴とする、角膜上皮様細胞シートの製造方法。
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