CN105078969A - 臭椿酮在制备治疗前列腺疾病的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了中药单体式(I)臭椿酮(Ailanthone,AIL)在制备治疗前列腺疾病的药物中的应用,该化合物能显著抑制前列腺癌细胞的体外和/或体内生长和迁移,降低前列腺癌细胞内雄激素受体蛋白表达水平,抑制雄激素受体信号通路,具有前列腺癌治疗应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,具体涉及中药单体臭椿酮在制备治疗前列腺疾病的药物中的应用。
背景技术
前列腺癌(prostaticcarcinoma,PCa)是男性生殖系最常见的恶性肿瘤,发病率随年龄增加而增长。在我国,前列腺癌发病率从1993年的1.71人/10万男性人口增加到2005年的7.9人/10万男性人口,2008年中国男性前列腺癌发病率为11.00/10万,世界人口标化发病率(世标率)为6.73/10万。我国前列腺癌的发病率呈现明显持续增长趋势,前列腺癌正成为严重影响我国男性健康的泌尿系恶性肿瘤(中国前列腺癌发病现状和流行趋势分析,《临床肿瘤学杂志》2013年第04期)。
前列腺癌潜伏期较长,很难察觉,一旦发现一般已经发展为晚期前列腺癌。前列腺癌的生长和转移密切依赖于雄激素,雄激素的分泌约90%来自于睾丸,约10%来自肾上腺。雄激素(如双氢睾酮,DHT)分泌后进入细胞可以与雄激素受体(Androgenreceptor,AR)结合,雄激素受体是重要核转录因子,调控众多的基因表达和前列腺癌细胞增殖。当雄激素与雄激素受体结合后,雄激素受体进入细胞核启动基因表达(如筛查前列腺癌的重要指标:前列腺特异性抗原PSA),从而促进前列腺癌的增殖和转移。因此,去雄激素治疗(包括去势治疗即切除睾丸和药物抑制雄激素水平)对于大多数前列腺癌有明显疗效。但去雄激素治疗对肿瘤的控制一般仅能维持1.5到4.0年,几乎所有前列腺癌患者最终均转为雄激素非依赖前列腺癌(Androgen-independentProstateCancer,AIPC),进而发展为激素难治性前列腺癌(HormoneRefractoryProstateCancer,HRPC),也称去势抵抗性前列腺癌(CastrationResistantProstateCancer,CRPC)。此时,去雄激素治疗也就失去了效果,CRPC是导致前列腺癌病人死亡的重要原因。CRPC的发生机制有很多,包括雄激素受体突变、雄激素受体表达消失以及在低雄激素环境下雄激素不敏感的细胞群扩增等。即,虽然去雄激素治疗没有效果,但是在大多数去势抵抗性前列腺癌中雄激素受体也同样扮演着重要的角色,所以雄激素受体是目前治疗一般前列腺癌和去势抵抗型前列腺癌的重要靶点(去势抵抗的前列腺癌的新疗法:抑制雄激素的持续分泌和雄激素受体介导的信号转导,《泌尿外科杂志(电子版)》2011年第01期)。
最新FDA批准的治疗去势抵抗性前列腺癌(CastrationResistantProstateCancer,CRPC)的药物包括阿比特龙(Abiraterone)和MDV3100(Enzalutamide),前者是抑制雄激素的合成,后者是雄激素受体的拮抗剂,这两种药物都是针对雄激素受体信号通路,在去势抵抗性前列腺癌(CRPC)治疗方面取得较好一定的疗效,但是经过上述药物治疗后,病人依然会产生药物抵抗,且上述两种药不是我国自主知识产权的药物。因此,研发具有我国自主知识产权的新型抑制雄激素受体的药物对临床治疗具有十分重要意义。
发明内容
本发明提出式(I)所示的臭椿酮化合物或其水合物或药学上可接受的盐或药学上可接受的载体在制备治疗前列腺癌恶性肿瘤药物中的应用;
式(I)所示臭椿酮化合物是一种天然小分子化合物,又名臭椿苦酮,其化学名:11β,20-环氧-1β,11,12α-三羟基苦树素-3,13(21)-二烯-2,16-二酮(11β,20-Epoxy-1β,11,12α-trihydroxypicrasa-3,13(21)-diene-2,16-dione),英文名:Ailanthone,分子式:C20H24O7,分子量:376.405,CAS登录号:981-15-7。
本发明应用中,式(I)臭椿酮化合物抑制雄激素受体的转录活性。式(I)臭椿酮化合物抑制雄激素受体突变的前列腺癌细胞株的增殖。其在体外和/或体内抑制雄激素受体突变的前列腺癌细胞株22RV1的增殖、抑制雄激素依赖性前列腺癌细胞株LNCaP的增殖。
本发明应用中,式(I)臭椿酮化合物在体外和/或体内抑制前列腺癌细胞的转移。
本发明应用中,式(I)臭椿酮化合物抑制雄激素受体活性和前列腺癌细胞生长。
本发明应用中,式(I)臭椿酮化合物显著抑制原代分离的前列腺癌细胞株增殖。
本发明应用中,式(I)臭椿酮化合物抑制前列腺癌细胞的克隆形成。
本发明应用中,式(I)臭椿酮化合物促进雄激素受体突变细胞22RV1凋亡。
本发明应用中,式(I)臭椿酮化合物显著抑制雄激素受体的蛋白表达;还能够抑制AR调控的下游基因表达。式(I)臭椿酮对雄激素阳性的前列腺癌细胞株抑制效果更为明显。
本发明应用中,式(I)臭椿酮能够在小鼠模型中抑制去势抵抗性前列腺癌细胞的增殖和转移。
本发明应用中,式(I)臭椿酮化合物的水合物或药学上可接受的盐或药学上可接受的载体等同样具有与式(I)臭椿酮相同的抑制效果。
本发明还提出了式(I)臭椿酮化合物在抑制雄激素受体突变的前列腺癌细胞株增殖的应用及方法。式(I)臭椿酮可以抑制比卡鲁胺或MDV3100治疗无效的雄激素受体突细胞株22RV1细胞增殖。
本发明提出式(I)所示的臭椿酮化合物在体外和/或体内抑制前列腺癌细胞转移的应用及方法。式(I)臭椿酮可以体外抑制前列腺癌细胞系PC3M、DU145和LNCaP细胞迁移及LNCaP和22RV1细胞的体内转移。
本发明提出式(I)所示的臭椿酮化合物抑制雄激素受体活性和前列腺癌细胞生长的应用及方法。式(I)臭椿酮可以抑制双氢睾酮(DHT)诱导的雄激素受体活性以及缺失配体结构域的雄激素受体(AR1-651)活性。式(I)臭椿酮同样可以抑制前列腺癌细胞株LNCaP、22RV1、PC3、DU145及病人来源原代前列腺细胞株的生长。
本发明提出式(I)臭椿酮化合物对雄激素受体产生抑制作用的应用及方法。式(I)臭椿酮通过阻断雄激素受体与其分子伴侣HSP90复合体之间的结合,使得雄激素受体蛋白稳定性下降而被蛋白酶体降解,因此可以显著下调雄激素受体蛋白水平而抑制其转录活性并抑制下游基因表达。
本发明通过荧光素酶报告基因法筛选得到单体式(I)臭椿酮,该单体能够在体外和体内强烈抑制前列腺癌细胞的增殖和迁移,并且能够有效阻断雄激素受体信号通路。
本发明研究表明式(I)臭椿酮化合物不仅能高效抑制雄激素依赖性前列腺癌细胞株LNCaP的增殖,而且能抑制雄激素受体突变的前列腺癌细胞株22RV1(该细胞株表达持续激活的突变雄激素受体,且对临床药物雄激素受体拮抗剂比卡鲁胺和MDV3100具有抗性)的增殖。此外本发明从体外和体内证明了该单体能够抑制前列腺癌细胞的转移。进一步实验证明表达雄激素受体的前列腺癌细胞株对式(I)臭椿酮化合物具有较好的敏感性,式(I)臭椿酮化合物单体通过抑制雄激素受体与热休克分子伴侣之间的结合而诱导雄激素受体泛素化,从而被蛋白酶体降解,进而抑制了雄激素受体活性和前列腺癌细胞生长。根据以上结果,单体式(I)臭椿酮化合物不仅可以治疗早期雄激素依赖性前列腺癌,也可以治疗晚期去势抵抗性前列腺癌和转移性前列腺癌。
本发明中,“去势抵抗性前列腺癌(CRPC)”是指,前列腺癌病人经去势治疗(切除睾丸或化学去势降低雄激素)后复发,去势治疗无效的前列腺癌称为去势抵抗性前列腺癌,这种前列腺癌是威胁前列腺癌患者的最大杀手。
本发明中,“雄激素受体(AR)”是指,雄激素受体(AR)属于核受体超家族中的类固醇受体。AR一般由四个结构域组成:N端转录激活区(NTD)、DNA结合区(DBD)、铰链区和配体结合区(LBD)。雄激素受体与前列腺癌的发生发展密切相关。雄激素如双氢睾酮(Dihydrotestosterone,DHT)与雄激素受体结合后,雄激素受体可以进入细胞核与转录激活域结合启动下游基因表达。目前临床使用的雄激素受体拮抗剂如比卡鲁胺(Bicalutamide)及MDV3100(Enzalutamide)都是与雄激素受体的配体结合区(LBD)结合而抑制了其转录活性。
本发明中,“蛋白质降解”是指细胞内的蛋白质经泛素化后被蛋白酶体识别而发生降解的过程。
本发明中,“荧光素酶报告基因检测(Luciferaseassay)”是指,荧光素酶(Luciferase,LUC)报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化荧光素生成氧化荧光素(oxyluciferin),在荧光素氧化的过程中,会发出生物荧光(Bioluminescence)。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(Luminometer)或液闪测定仪测定荧光素氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系,可以极其灵敏、高效地检测基因的表达,是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。
本发明还公开了一种药物组合物,其包括式(I)臭椿酮化合物或其水合物或药学上可接受的盐或药学上可接受的载体。
本发明还公开了式(I)臭椿酮化合物或其水合物或药学上可接受的盐或药学上可接受的载体、以及含有式(I)臭椿酮化合物的组合物在制备治疗与雄激素受体突变和异常扩增相关的恶性肿瘤疾病的药物中的应用。
本发明中,所述恶性肿瘤为雄激素受体异常扩增和突变的恶性肿瘤,包括前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、脑癌、皮肤癌、膀胱癌、肾癌等。
本发明通过雄激素受体荧光素酶报告基因方法从多种中草药单体中筛选得到了臭椿酮(Ailanthone)。臭椿酮,又名臭椿苦酮,分子式:C20H24O7,分子量:376.405,CAS登录号:981-15-7,主要存在于苦木科植物臭椿Ailanthusaltissima(Mill.)Swingle的种子、根皮、树皮中。现代研究表明,臭椿酮具有抗阿米巴痢、抗疟疾、抗溃疡等作用(一种臭椿酮的制备方法,中华人民共和国专利,专利号:201010170495.4)。但是至今尚没有臭椿酮可以抗前列腺癌的报道。本发明从体内外实验证明该化合物能够有效抑制前列腺癌细胞的生长和转移。与上述两种FDA最新批准的抗前列腺癌药物相比的优点在于:本发明应用中所采用的化合物臭椿酮来源广泛,提取该化合物的臭椿树在我国广泛存在,并且所属中药已纳入《中国药典》,我国民间使用多年,具有研发中成药(复方)的潜能。其次,目前临床上的药物对于雄激素受体突变的前列腺癌细胞疗效不佳,而实验证明本发明应用中所采用的化合物对耐MDV3100的前列腺癌细胞仍具有很好的杀伤效果,说明对于MDV3100治疗无效的前列腺癌,应用本发明则仍然有效。此外,本发明应用中所采用的化合物机理比较明确,揭示了该化合物抗前列腺癌的分子机制,实验表明该化合物在低浓度(<1μM)能显著抑制前列腺癌细胞的体外生长和迁移;在小鼠动物模型中,剂量为2mg/kg的该小分子单体化合物能有效抑制前列腺癌细胞体内生长和转移,实验证明臭椿酮能够抑制雄激素受体与分子伴侣Hsp90的结合,并诱导雄激素受体的降解而下调雄激素受体的蛋白水平,抑制下游基因的表达,抑制雄激素受体信号通路,从而实现抑制前列腺癌的目的。目前我国前列腺癌用药基本依赖于进口药物,而本发明在前列腺癌治疗方面取得的新突破,正是成功填补了国内该领域的空白。
附图说明
图1所示为荧光素酶报告基因检测各前列腺癌细胞株中式(I)臭椿酮对雄激素受体活性的抑制效果。
图1(A)表示式(I)臭椿酮在前列腺癌细胞LNCaP中抑制双氢睾酮(DHT)所诱导的雄激素受体(AR)转录活性。
图1(B)表示式(I)臭椿酮在前列腺癌细胞22RV1中抑制双氢睾酮(DHT)所诱导的雄激素受体(AR)转录活性。
图1(C)表示式(I)臭椿酮在前列腺癌细胞LAPC4中抑制双氢睾酮(DHT)所诱导的雄激素受体转录活性。
图1(D)表示式(I)臭椿酮在前列腺癌细胞PC3(转染了外源野生型雄激素受体AR)中抑制双氢睾酮(DHT)所诱导的雄激素受体转录活性。
图1(E)表示式(I)臭椿酮在前列腺癌细胞22RV1中抑制缺失配体结构域的雄激素受体(AR1-651)所诱导的雄激素受体(AR)转录活性。
图2所示为式(I)臭椿酮对各前列腺癌细胞株增殖活性的抑制效果。
图2(A)表示式(I)臭椿酮抑制前列腺癌细胞LNCaP增殖活性。
图2(B)表示式(I)臭椿酮抑制前列腺癌细胞22RV1增殖活性。
图2(C)表示式(I)臭椿酮抑制前列腺癌细胞DU145增殖活性。
图2(D)表示式(I)臭椿酮抑制前列腺癌细胞PC3增殖活性。
图2(E)表示式(I)臭椿酮抑制前列腺癌病人原代细胞增殖活性。
图3所示为式(I)臭椿酮对各前列腺癌细胞株克隆形成的抑制效果。
图3(A)表示式(I)臭椿酮抑制前列腺癌细胞PC3、DU145、LNCaP、22RV1克隆形成效果图。
图3(B)表示式(I)臭椿酮抑制前列腺癌细胞PC3克隆形成统计图。
图3(C)表示式(I)臭椿酮抑制前列腺癌细胞DU145克隆形成统计图。
图3(D)表示式(I)臭椿酮抑制前列腺癌细胞22RV1克隆形成统计图。
图3(E)表示式(I)臭椿酮抑制前列腺癌细胞LNCaP克隆形成统计图。
图4所示为式(I)臭椿酮对各前列腺癌细胞株增殖抑制敏感性的比较。
图4(A)表示式(I)臭椿酮对雄激素受体表达阴性细胞株(PC3、DU145、WPMY-1)和雄激素受体表达阳性株(LNCaP、22RV1、LAPC4、c4-2b)增殖活性抑制效果比较。
图4(B)表示式(I)臭椿酮对前列腺正常细胞(WPMY-1)、雄激素受体表达阴性前列腺癌细胞(PC3)和雄激素受体表达阳性前列腺癌细胞(LNCaP)细胞形态影响效果比较。
图4(C)表示式(I)臭椿酮对雄激素受体表达阴性前列腺癌细胞株(PC3、DU145)和雄激素受体表达阳性前列腺癌细胞株(LNCaP、22RV1)克隆形成抑制效果比较(统计图)。
图4(D)表示式(I)臭椿酮对雄激素受体表达阴性前列腺癌细胞株(PC3、DU145)和雄激素受体表达阳性前列腺癌细胞株(LNCaP、22RV1)克隆形成抑制效果比较(形态图)。
图5所示为式(I)臭椿酮对图列中前列腺癌细胞22RV1细胞凋亡促进效果。
图6所示为式(I)臭椿酮对图列中前列腺癌细胞迁移、浸润影响。
图6(A和B)表示式(I)臭椿酮抑制前列腺癌细胞株PC3M细胞迁移效果。
图6(C和D)表示式(I)臭椿酮抑制前列腺癌细胞株DU145细胞侵袭效果。
图6(E和F)表示式(I)臭椿酮抑制前列腺癌细胞株LNCaP细胞侵袭效果。
图7所示为式(I)臭椿酮对雄激素受体表达及其靶基因表达的影响。
图7(A)表示式(I)臭椿酮抑制前列腺癌细胞株LNCaP和22RV1细胞中雄激素受体蛋白水平效果。
图7(B)表示式(I)臭椿酮抑制在雄激素R1881刺激的条件下的前列腺癌细胞株LNCaP、22RV1和c4-2b细胞中雄激素蛋白水平效果。
图7(C)表示式(I)臭椿酮抑制雄激素受体下游靶基因效果。
图8所示为式(I)臭椿酮下调雄激素受体的作用机理。
图8(A)表示式(I)臭椿酮抑制雄激素受体下游基因PSA的同时对本身mRNA抑制效果并不显著。
图8(B)表示式(I)臭椿酮影响雄激素受体蛋白稳定性效果。
图8(C)表示式(I)臭椿酮对雄激素受体蛋白水平的下降被蛋白酶体抑制剂MG132所抑制。
图8(D)表示式(I)臭椿酮诱导雄激素受体蛋白泛素化。
图8(E)表示式(I)臭椿酮阻断雄激素受体与其分子伴侣HSP90、HSP70之间的结合。
图9所示为式(I)臭椿酮在体内对前列腺癌细胞株生长和转移的抑制效果。
图9(A)和(B)表示式(I)臭椿酮在小鼠动物模型中抑制比卡鲁胺(bicalutamide)耐药性前列腺癌细胞22RV1生长效果。
图9(C)和(D)表示式(I)臭椿酮在小鼠动物模型中抑制比卡鲁胺(bicalutamide)敏感性前列腺癌细胞LNCaP生长效果。
图9(E)和(F)表示式(I)臭椿酮在小鼠动物模型中抑制前列腺癌细胞LNCaP转移效果。
图9(G)表示式(I)臭椿酮和比卡鲁胺对小鼠体重的影响。
图10所示为式(I)臭椿酮在体内对去势抵抗性前列腺癌细胞株生长和转移的抑制效果。
图10(A)和(B)表示式(I)臭椿酮在去势小鼠模型抑制比卡鲁胺耐药的前列腺癌细胞22RV1生长的效果。
图10(C)和(D)表示式(I)臭椿酮在去势小鼠模型抑制比卡鲁胺耐药的前列腺癌细胞22RV1转移的效果。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图,对本发明作进一步的详细说明,本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下,本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中,并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等,除以下专门提及的内容之外,均为本领域的普遍知识和公知常识,本发明没有特别限制内容。
实施例1:式(I)臭椿酮体外抑制雄激素受体的转录活性
技术方法:
1.细胞的培养
本实验中所用细胞购自中科院上海细胞库,部分细胞来自上海市调控生物学重点实验室翁杰敏教授实验室;另有一株细胞来自于第二军医大学附属长海医院,是从前列腺癌病人组织原代分离的前列腺癌细胞,细胞培养于37℃恒温培养箱(湿度95%,CO2浓度5%)中,培养基为含10%胎牛血清(Front)的RPMI-1640(6ibco)。
2.双荧光素酶报告基因检测
本实验所用质粒为MMTV-LUC(核激素受体报告基因)和Renila(内参报告基因)。MMTV-LUC是带有雄激素受体转录激活元件(ARresponseelements)和荧光素酶的报告基因质粒,雄激素受体与雄激素结合后可以启动该质粒表达出荧光素酶,荧光素酶可以催化其底物荧光素发出荧光,通过检测荧光的强度便能检测雄激素受体激活的程度;Renila内参报告基因带有海肾荧光素酶,能表达海肾荧光素酶,通过该质粒可以确定每组细胞的转染效率是否一致,雄激素对Renila内参报告基因质粒没有影响。为初步探究式(I)臭椿酮能否抑制雄激素受体(Androgenreceptor,AR)的转录活性,本实施例分别在前列腺癌细胞株22RV1,LNCaP和LAPC4等细胞中用脂质体2000(Lipofectamine2000Reagent)转染MMTV-LUC和Renila两种质粒,此外还在不表达AR的PC3细胞中转入外源AR,以及在22RV1细胞中转入AR1-651(该段AR缺失配体结构域,但是可以持续激活);细胞转染24小时后加入雄激素双氢睾酮(Dihydrotestosterone,DHT)激活MMTV-LUC报告基因表达萤火虫荧光素酶;在加入DHT的同时加入不同浓度药物处理。转染AR1-651的22RV1细胞可以直接激活MMTV-LUC报告基因不用加入DHT刺激,在转染AR1-651的同时加入药物以验证化合物可否抑制突变型的AR活性。细胞处理12小时后裂解细胞并测定两种报告基因的表达荧光强度,最终结果用MMTV-LUC的活性与内参质粒Renila的活性相比表示,每组实验重复三次。
实验结果如图1(A)、图1(B)、图1(C)、图1(D)所示,式(I)臭椿酮在不同前列腺癌细胞株都能够剂量依赖性地降低雄激素(DHT)诱导的MMTV-LUC报告基因的活性,并且在低浓度(约0.1μM)就能够达到半数抑制率(IC50);此外如图1(E)所示式(I)臭椿酮同样可以抑制缺失配体结构域的雄激素受体活性。证明式(I)臭椿酮不仅可以体外抑制雄激素诱导的雄激素受体的转录活性,也可以抑制持续激活的突变型雄激素受体转录活性。
实施例2:式(I)臭椿酮对不同前列腺癌细胞的增殖活性及克隆形成的抑制作用
技术方法:
1.SRB(磺酰罗丹明)法测定细胞增殖
不同的前列腺细胞株以5×103个/孔密度接种至96孔板(Corning),24h后,加入不同浓度本单体化合物,对照组加入等量的DMSO,各组设6个复孔。分别继续培养24h,48h和72h后,加预冷却的TCA(三氯乙酸,50%,w/V)4℃孵育60min以上固定细胞。固定后,流水冲洗5遍,风干。每孔加入50μlSRB染液(4%,w/V),室温孵育10min染色。将染液吸出,每孔加入1%醋酸100μl洗5遍,除去未结合染料。风干后,每孔加入浓度为10mMTris溶液100μl,震荡溶解结合的SRB染料。将96孔板置于酶标仪(SPECTRAMAX190)中,在515nm波长下测定OD值。统计分析药物对于细胞增殖水平的影响。
2.克隆形成实验
将1000个前列腺癌细胞接入到6孔板中,待细胞贴壁后加入图3中所示浓度的式(I)臭椿酮,一周后用多聚甲醛将细胞固定,然后用结晶紫染色,拍照并统计克隆数,每组实验重复三次。克隆形成是检测癌细胞增殖能力的有效方法之一。
3.流式细胞仪检测细胞凋亡-AnnexinV/PI双染色法
在正常细胞中,磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35.8KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力特异性结合。利用AnnexinV-FITC作为荧光探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(PropidineIodide,PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来,通过流式细胞仪可以检测凋亡细胞的比例。
实验结果如图2(A)、图2(B)、图2(C)、图2(D)所示,式(I)臭椿酮化合物单体对各株前列癌细胞的增殖都有很显著的抑制效果,其48小时半数抑制浓度都在0.4μM之内。并且,式(I)臭椿酮化合物单体除了对常用前列腺癌细胞株增殖抑制效果显著之外,对来自临床病人原代分离的前列腺癌细胞株也具同样效果,如图2(E)所示。
如图3(A)及图3(B、C、D、E)所示的实验结果,式(I)臭椿酮同时也强烈抑制各株前列腺癌细胞的克隆形成。利用上述的细胞增殖实验及克隆形成实验,发明人比较了式(I)臭椿酮对雄激素阳性及阴性的细胞株增殖的敏感性,实验结果如图4(A和B)及图4(C和D)所示,不论是在细胞增殖还是克隆形成方面,式(I)臭椿酮对雄激素受体阳性的前列腺癌细胞株抑制效果更为明显。图4(A和B)表明式(I)臭椿酮相比正常前列腺细胞WPMY-1和雄激素受体阴性细胞PC3、DU145而言,对雄激素受体阳性的前列腺癌细胞LNCaP、22RV1、LAPC4、c4-2b增殖抑制效果更为明显。图4(C和D)表明式(I)臭椿酮相比雄激素受体阴性细胞PC3、DU145而言,对雄激素受体阳性的前列腺癌细胞LNCaP、22RV1克隆形成抑制效果更为明显。此外,如图4所述,式(I)臭椿酮可以促进雄激素受体突变的22RV1细胞凋亡。
以上实验表明式(I)臭椿酮在低浓度就能显著抑制各株前列腺癌细胞增殖,并且对雄激素受体阳性的前列腺癌细胞抑制效果更为显著。
实施例3:式(I)臭椿酮单体对前列腺癌细胞迁移能力的抑制作用
技术方法:
1.划线迁移实验
为研究式(I)臭椿酮是否抑制细胞的横向迁移,将细胞接种至6孔板,肿瘤细胞在37℃5%CO2培养箱中常规培养24h,至细胞长至100%满。更换无血清培养基,继续培养12h。在长满细胞的培养孔中,用200μl的灭菌枪头(tip)进行划痕,划痕后用PBS洗细胞两次,将浮起的细胞洗走,每孔中加入1ml完全培养基。分别向细胞培养孔中加入不同浓度药物,将培养板放入CO2培养箱,37℃继续常规培养24h。显微镜下观察细胞向划线部分运动的情况,拍照。统计分析不同剂量药物组迁移进入划线区域的细胞数量,确定药物对细胞迁移能力的影响。
2.Transwell小室迁移侵袭实验
为研究式(I)臭椿酮是否抑制细胞的纵向迁移和侵袭,利用transwell小室,并且在其上室和下室中间的隔膜铺上一层基质胶。在上室接入过量的细胞,这样细胞就会向下室迁移,并且细胞要穿过基质胶需要分泌胶原酶来消化上室与下室中间的基质胶,通过该实验既可以测定细胞的纵向迁移能力也可以测定细胞的侵袭能力;同时加入不同浓度的药物,12小时后拍照统计细胞迁移率,证明药物对细胞的纵向迁移和侵袭能力的抑制效果。
实验结果如图6(A和B),5(C和D),5(E和F)所示,式(I)臭椿酮同样在较低剂量下就可以有效抑制PC3M,DU145,LNCaP三株转移性前列腺癌细胞的迁移,可见式(I)臭椿酮可以作为抗前列腺癌转移应用于制备治疗前列腺癌疾病的潜在药物。
实施例4:式(I)臭椿酮显著下调雄激素受体蛋白表达水平及其靶基因
技术方法:
1.免疫印迹(westernblot)实验
细胞经加不同浓度药物处理后,细胞经裂解提取蛋白,蛋白经煮沸变性后用聚丙烯酰胺凝胶PAGE电泳分离蛋白质样品,然后转移到硝酸纤维素薄膜上,首先用雄激素受体AR的抗体及其它蛋白的抗体(一抗)孵育两小时,再用带有荧光标记的二抗体孵育一小时,最后用扫膜仪Odyssey检测该蛋白的表达水平。
2.聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)实验
细胞经不同浓度药物处理后,用TRIzol分离提取RNA,RNA经反转录后得到cDNA,用不同的AR下游特异性引物(如PSA,TMPRSS2)通过实时定量PCR(Q-PCR)检测其mRNA的表达水平。
3.放线菌酮(CHX)检测蛋白稳定性实验
放线菌酮(CHX)可以抑制核糖体并阻断蛋白质的合成。先用放线菌酮处理前列腺癌细胞,阻断其蛋白质合成,再同时加入臭椿酮处理,然后用免疫印迹实验检测AR蛋白表达水平;比较放线菌酮和臭椿酮同时处理组与单独用放线菌酮处理组的AR蛋白表达水平以检测该药物对蛋白质稳定性的影响。
4.免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)
免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的proreinA预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的proreinA就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合。
实验结果如图7所示,利用免疫印迹实验(westernblot)证明式(I)臭椿酮处理能够显著抑制雄激素受体的蛋白表达;利用聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)实验证明式(I)臭椿酮能够抑制AR调控的下游基因表达。图7(A)表明式(I)臭椿酮可以剂量依赖地下调雄激素受体蛋白水平;图7(B)表明式(I)臭椿酮同样可以抑制雄激素刺激条件下雄激素受体的蛋白水平;图7(C)表明式(I)臭椿酮可以抑制雄激素受体下游的靶基因。
进一步实验发现,在一定浓度下式(I)臭椿酮并没有影响AR的mRNA水平但显著抑制了其下游基因PSA的表达,如图8A所示。而且用放线菌酮(CHX)阻断蛋白质的合成后,式(I)臭椿酮依然能够进一步使AR的蛋白表达水平下降,即影响了AR的稳定性,如图8B所示。此外,蛋白酶体抑制剂MG132可以阻断式(I)臭椿酮导致的AR蛋白表达水平的下降,如图8C所示,这说明臭椿酮诱导的AR蛋白表达水平下降可能与蛋白酶体降解途径相关。实验还发现式(I)臭椿酮可以导致AR泛素化的增加,如图8D所示,进一步说明式(I)臭椿酮诱导的AR蛋白表达水平下降可能与蛋白酶体降解途径相关。免疫共沉淀实验还证明式(I)臭椿酮可以导致AR与其分子伴侣之间的结合下降,如图8E所示。上述实验表明式(I)臭椿酮通过抑制雄激素受体与热休克分子伴侣之间的结合诱导其泛素化,从而被蛋白酶体降解,进而抑制了雄激素受体活性和前列腺癌细胞生长。
实施例5:式(I)臭椿酮在小鼠前列腺癌生长和转移模型中的抑制效果
技术方法:
1.式(I)臭椿酮对小鼠前列腺癌生长模型的抑制作用
分别用人前列腺癌细胞22RV1和LNCaP建立两个小鼠前列腺癌生长模型。将500万个人前列腺癌细胞22RV1细胞和LNCaP细胞皮下注射到免疫缺陷小鼠(BLAB/c-nude,裸鼠)背部皮下,待皮下肿瘤长到100mm3左右时,将小鼠分为三组(平均肿瘤体积相同),加药组小鼠每天腹腔注射2mg/kg溶于DMSO的式(I)臭椿酮,阳性药物组注射10mg/kg比卡鲁胺(Bicalutamide,BIL),对照组仅注射DMSO,每天测量并记录小鼠体重以及肿瘤的长与宽,22RV1肿瘤(n≥7)和LNCaP肿瘤(n≥4)分别施药24天和49天后处死小鼠,取皮下肿瘤,拍照。按照公式体积=长×宽2×0.52计算,统计肿瘤体积。
2.式(I)臭椿酮对小鼠前列腺癌转移模型的抑制作用
将转移性前列腺癌细胞LNCaP转入萤火虫荧光素酶(Luciferase)表达质粒(该质粒带有G418抗性筛选标记),并用G418筛选稳转细胞系,稳转细胞可以表达荧光素酶,荧光素酶与其底物荧光素接触后会发出荧光,可以用动物活体成像系统检测到细胞的数量和位置。构建好稳转细胞系后,将细胞用基质胶混匀注射到小鼠前列腺背侧叶,这样通过活体成像技术就可以检测到小鼠体内的LNCaP细胞的生长和转移情况。
实验结果如图9(A)和9(B)所示,通过肿瘤体积的测定表明2mg/kg/day的剂量下该化合物对表达雄激素受体的两株前列腺癌细胞(LNCaP和22RV1)都具有显著的抑制效果。临床药物比卡鲁胺(雄激素受体拮抗剂)对LNCaP细胞具有一定的抑制效果,而对22RV1细胞则抑制效果不明显。但是式(I)臭椿酮对这两株前列腺癌细胞都具有较好的抑制效果。
如图9(E)所示的用药35天后对小鼠前列腺原位癌的作用效果图(n≥5),通过动物活体成像系统拍照图片,由于肿瘤细胞中带有荧光素酶,通过向小鼠体内打入荧光素底物后,肿瘤细胞会发出荧光,这样利用动物活体成像系统可以确定肿瘤细胞的位置和大小,图中阴影代表荧光信号,表明该区域有肿瘤细胞聚集,荧光强度越深表明肿瘤越大。实验结果显示在2mg/kg/day剂量的式(I)臭椿酮化合物能显著抑制前列腺原位癌的转移,如图9(F)图所示,并且效果显著优于阳性药物10mg/kg/day比卡鲁胺(Bicalutamide)。而且,给药小鼠与对照组小鼠的体重无显著差别,表明式(I)臭椿酮化合物在该剂量下的毒副作用较小,如图9(G)所示。
实施例6:式(I)臭椿酮在小鼠去势抵抗性前列腺癌生长和转移模型模型中的抑制效果
如实施例5中所述,将去势抵抗性前列腺癌细胞22RV1转入萤火虫荧光素酶(Luciferase)表达质粒构建稳转细胞系。构建好稳转细胞系后,将细胞用基质胶混匀注射到小鼠前列腺背侧叶,待肿瘤形成后将小鼠进行去势(阉割)。22RV1前列腺癌细胞可以在去势以后继续生长,抗雄激素药物比卡鲁胺对其治疗无效,形成去势抵抗性前列腺癌。
同样通过动物活体成像系统拍照图片观察肿瘤的生长和转移情况及药物的治疗效果。如图10(A和B)中所述,式(I)臭椿酮能够显著抑制去势小鼠中的22RV1前列腺原位肿瘤的生长,该肿瘤对比卡鲁胺则产生耐药性。此外,如图10(C和D)所示,式(I)臭椿酮还可以抑制该肿瘤的转移。
综上所述,式(I)臭椿酮可以抑制小鼠模型中去势抵抗前列腺癌的生长和转移。
上述实施例仅为了说明本发明的技术构思及特点,其目的在于让本领域技术人员能够了解本发明的内容并据以实施,并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作出的等效变化或修饰,都应涵盖在本发明保护范围内。
Claims (16)
1.式(I)所示的臭椿酮化合物或其水合物或药学上可接受的盐或药学上可接受的载体在制备治疗前列腺癌疾病的药物中的应用;
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述式(I)臭椿酮化合物在体外和/或体内抑制雄激素受体突变的前列腺癌细胞株22RV1的增殖、抑制雄激素依赖性前列腺癌细胞株LNCaP的增殖。
3.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述式(I)臭椿酮化合物体外和/或体内抑制前列腺癌细胞的转移。
4.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述式(I)臭椿酮化合物抑制去势抵抗性前列腺癌的生长和转移。
5.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述式(I)臭椿酮化合物抑制雄激素受体活性、抑制前列腺癌细胞生长、迁移和侵袭以及促进前列腺癌细胞凋亡。
6.如权利要求2所述的应用,其特征在于,式(I)臭椿酮抑制比卡鲁胺或MDV3100治疗无效的雄激素受体突细胞株22RV1细胞增殖。
7.如权利要求3所述的应用,其特征在于,式(I)臭椿酮体内抑制前列腺癌细胞LNCaP和22RV1的转移。
8.如权利要求4所述的应用,其特征在于,式(I)臭椿酮在去势小鼠动物中抑制前列腺癌细胞22RV1的生长和转移。
9.如权利要求5所述的应用,其特征在于,式(I)臭椿酮体外抑制前列腺癌细胞PC3M的迁移。
10.如权利要求5所述的应用,其特征在于,式(I)臭椿酮抑制前列腺癌细胞DU145和LNCaP的侵袭。
11.如权利要求5所述的应用,其特征在于,式(I)臭椿酮可以抑制双氢睾酮诱导的雄激素受体活性以及缺失配体结构域的雄激素受体活性。
12.如权利要求5所述的应用,其特征在于,式(I)臭椿酮抑制前列腺癌细胞株LNCaP、22RV1、PC3、DU145及病人来源原代前列腺细胞株的生长。
13.如权利要求5所述的应用,其特征在于,式(I)臭椿酮可以促进前列腺癌细胞22RV1的凋亡。
14.一种药物组合物,其特征在于,其包括式(I)臭椿酮化合物或其水合物或药学上可接受的盐或药学上可接受的载体。
15.式(I)臭椿酮化合物或其水合物或药学上可接受的盐或药学上可接受的载体或如权利要求14所述的组合物在制备治疗与雄激素受体突变和异常扩增相关的恶性肿瘤疾病的药物中的应用。
16.如权利要求15所述的应用,其特征在于,所述恶性肿瘤为雄激素受体异常扩增和突变的恶性肿瘤,包括前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、脑癌、皮肤癌、膀胱癌、肾癌。
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