CN102573472A - 治疗雄激素受体阳性癌症的方法 - Google Patents

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Abstract

在此提供了一种抑制雄激素受体阳性癌细胞的方法。该方法使得向诊断为或怀疑患有雄激素受体阳性癌症的个体给药成为必需并且向该个体给予一种包含可以抑制雄激素受体阳性癌症的生长的化合物的组合物。

Description

治疗雄激素受体阳性癌症的方法
本申请要求于2009年10月23日提交的美国临时申请号61/254395的优先权，其披露内容通过引用结合在此。
本发明是由于在由国立卫生研究院颁发的授权号R42CA 110400-012004-2005下的政府支持而做出的。政府在本发明中拥有一定的权利。
发明领域
本发明通常涉及癌症治疗并且更加特别地涉及用于治疗包含雄激素受体阳性癌细胞的方法。
相关技术说明
前列腺癌(PCa)是最常见的肿瘤疾病并且是男性中癌症相关死亡的第二大主要原因，仅在美国每年就会有30,000以上的男性死于此病。PCa肿瘤主要由前列腺腔上皮细胞组成。前列腺腔上皮细胞的分化部分由前列腺特异性标记物的雄激素受体(AR)驱动的表达来控制。AR通过何种机制来控制细胞的存活尚不清楚。除了前列腺癌之外，AR也涉及其他癌症的病因学，包括乳腺癌。AR属于类固醇受体家族并且充当转录因子而起作用。在缺乏配体的情况下，这个家族的成员是不稳定的蛋白质，这些蛋白质存在于结合至热激蛋白质90(Hsp90)上的细胞质中。在一种类固醇(如雄激素)结合至AR的配体结合域(LBD)时，AR从Hsp90中游离出来并且转移至原子核。原子核内雄激素结合的AR激活在启动子中具有雄激素应答元件(ARE)的基因的转录(Cato，A.C.等人，1998。Trends EndocrinolMetab 9：150-154)。＜.除了其作为转录激活物的功能以外，AR还能够抑制一些基因的转录(Claessens等人，2001。J Steroid Biochem Mol Biol76：23-30)。
雄激素的耗尽引起正常前列腺腔上皮细胞的死亡，这证实了AR路径在它们的存活中起着关键作用。癌性前列腺细胞继续表达AR并且它们的存活还取决于雄激素的存在，这使得雄激素剥夺成为晚期PCa患者的治疗选择。抗雄激素治疗，包括使用抑制剂氟他胺和康士得，一般初期有效，但是很少得到完全治愈。PCa复发发生在这样治疗的大部分患者中，这导致雄激素非依赖性的、化疗抵抗性肿瘤预后很差。因此，对于抗雄激素治疗的抵抗是成功治疗PCa中的一个主要障碍。
在肿瘤进展过程中由PCa获得的雄激素非依赖性的机制的分析表明AR信号的丧失很少涉及(Balk，S.P.2002。Urology 60：132-138；讨论138-139)。相反，雄激素非依赖性PCa的典型特征在于由于AR突变体的表达而提高了AR活性，AR突变体是配体非依赖性的(组成型活性的)配体或响应于非雄激素配体(Chen，Y.，等人2008.Curr Opin Pharmacol 8：440-448；Tilley，等人1996.Clin Cancer Res 2：277-285；Koivisto，等人1998 Am JPathol 152：1-9；Marques，等人2005.Int J Cancer 117：221-229；Bohl，C等人2005.J Biol Chem 280：37747-37754；Hara，T.，等人2003.Cancer Res63：149-153)。
最近显示，不像正常的前列腺干细胞，前列腺“肿瘤始发细胞”或“癌症干细胞”，一个次要的细胞群被认为是自我更新肿瘤细胞的主源，表达功能性AR(Vander Griend等人，2008。Cancer Res 68：9703-97111)。这个次要的细胞群，与已经进展到去势抵抗阶段的PCa肿瘤中观察到的AR活性维持一起，表明AR对于雄激素依赖和非依赖性PCa以及其他AR阳性癌症类型来说都是一种有希望的潜在治疗靶点。例如，乳腺上皮细胞，在很多方面，与前列腺细胞相似。由于PC细胞的存活取决于雄激素刺激的活性AR，乳腺上皮细胞类似地取决于相关雌激素(ER)和孕酮受体(PR)。在乳腺癌(BC)中ER和PR的作用以及它们作为一种治疗方法的功能调节这些年来已经成为研究焦点。但是，AR在正常乳房细胞中以低水平表达并且大多数BC中表达水平不同，包括50％的“三负”(ER-，PR-，Her2-)BC，对此还没有可用的靶向治疗方法。尽管已经在几个研究中论述了雄激素对于乳腺上皮细胞的作用，AR在BC中所起的作用仍然不清楚，(Birrell等人，(1995)J Steroid Biochem Mol Biol 52，459-467；Bresttes等人(2008)Bull Cancer 95，495-502；Di Monaco等人(1995)Anticancer Res15，2581-2584)。因此，目前的治疗方式对于AR阳性癌症在很大程度上是无效的，并且对于新的用于治疗AR阳性癌细胞(包括但不限于PCa和乳腺癌)的方法存在着迫切需要。
发明概述
本发明提供了一种用于抑制AR阳性癌细胞在个体中的生长的方法。该方法包括向诊断为或怀疑患有AR阳性癌症的个体给予一种包含能够抑制AR阳性癌细胞生长或杀死AR阳性癌细胞的化合物的组合物。AR阳性细胞可以是任何AR阳性癌细胞。在不同的实施方案中，AR阳性癌细胞为乳腺癌、前列腺癌、肝细胞癌细胞、甲状腺癌细胞、胶质母细胞瘤、或星形细胞瘤。
适合用于本发明中的化合物的结构在图7、8、9、10、11中进行了描绘。在图7、8、9、10、11中描绘的化合物的具体实例分别被指定为c5、c6、c11、c52和c85。这些化合物中的每一个都从购自Chembridge化学公司(加利福尼亚，圣地亚哥)的DiverSet化学文库的筛选而被鉴定，并且每个化合物都有一个公众可得的Chembridge识别号(ID)，这可用来鉴定具体的化合物结构。在不同的实施方案中，c5(Chembridge ID 6099112)、c6(Chembridge ID 5652306)、c11(Chembridge ID 6005978)、c52(Chembridge ID 5582367)和c85(Chembridge ID 6028717)可被用于本发明的方法中。
在一个实施方案中，本发明的方法包括向诊断为或怀疑患有AR阳性癌症的个体给予包含选自指定为c5、c6、c11、c52和c85的化合物的一种化合物以及它们的组合的组合物。
在一个实施方案中，施用于个体的组合物包括c52。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于鉴定一个个体是否是用包含能够抑制AR阳性癌细胞生长或杀死AR阳性癌细胞的化合物的组合物治疗的候选者的方法。该方法包括从该个体获得一个生物样品并且测定该样品是否包括雄激素受体阳性癌细胞，其中确定该生物样品包含雄激素受体阳性癌细胞指示该个体是该治疗的候选者，并且其中确定生物样品不包含雄激素受体阳性癌细胞指示该个体不是该治疗的候选者。附图简要说明
图1A提供了数据的图解表示，显示了ARDLBD在无血清培养基(SFM)中是转录活性的。在SFM中用AR依赖性报道分子构建体pARE-Luc和野生型(wt)AR、ARDLBD或阴性对照(空载体)表达构建体转染HeLa细胞。转染后24小时测量了荧光素酶活性。图1B提供了照片表示，显示了ARDLBD具有恒定的细胞核定位。如(A)中在SFM中转染的HeLa细胞未加处理或者用1nM的双氢睾酮(DHT)处理24小时，之后用抗AR抗体进行免疫荧光染色。C-E.用异位ARDLBD取代CWR22R细胞中的内源AR(通过结合靶向内源AR转录本的非翻译区的shRNA的慢病毒转导与一个ARDLBD表达构建体)。图1C提供了结果的照片表示，这些结果是通过用或不用转导制备的细胞溶解产物的蛋白质印迹法而获得的。用抗AR和抗肌动蛋白抗体探针探查印迹。图1D提供了数据的图解表示，这些数据来自在添加了不同浓度的DHT的SFM中生长的原始和转导细胞中进行的AR依赖性报道分子分析(pARE-Luc)。图1E提供了数据的图解表示，这些数据从测量常规含血清培养基中的原始和转导细胞的生长率(细胞计数)而获得。在图1D和图1E中显示的分析重复进行了三次。误差棒显示了标准偏差。
图2A-2D描绘了AR抑制剂对不同细胞的毒性的数据。图2A提供了数据的图解表示，这些数据通过分析用不同的化学品处理7天的指示细胞的集落形成测定而获得。图2B提供了EC50(抑制CWR22R中的AR依赖性报道分子)和IC50(对CWR22R细胞的毒性)的图解比较。图2C提供了数据的图解表示，显示了几种化合物对于一组不同来源的细胞系的剂量依赖性毒性。图2A和C中的误差棒-试验中重复三次之间的标准偏差；图2B中-EC50和IC50的置信区间。
图3A-3D描绘了显示AR蛋白水平的下降与选择的AR抑制剂目标物(hits)对PCa细胞的毒性有关的数据。图1A是一张溶解产物的蛋白质印迹法的照片表示，这些溶解产物来自用10mM的指示目标物处理36小时的CWR22R细胞。AR抗体显示了全长和天然存在于这些细胞中的AR的DLBD形式。GAPDH抗体被用来控制蛋白质负荷。图3B提供了数据的图解表示，显示不像亲本CWR22R细胞，在c52(c52R)存在下选择的一个克隆对于c52的作用是抵抗的。在CWR22R的c52R克隆中的AR蛋白表达没有被c52处理而减少。亲本和有或没有c52处理(10μM处理36小时)的c52抵抗的CWR22R细胞的蛋白质印迹法。图3C提供了数据的图解表示，这些数据来自在化合物添加之后用亚甲蓝染色4天的细胞活力分析。误差棒-试验中重复三次之间的标准偏差。图3D提供了数据的图解表示，显示所选化合物对CWR22R细胞的细胞周期分布的作用，细胞周期分布是通过细胞DNA含量的碘化丙啶染色而测量的(通过荧光激活的细胞分选)。分析进行了两次。误差棒-两次测量之间的偏差。
图4A和4B提供了比较两种不同的靶向AR的shRNA(shAR5和shAR6)和AR突变体HD1-KRAB-AR122对AR依赖性转录和AR表达PCa细胞的存活的作用的数据。图4提供了数据的图解表示，这些数据从用pARE-Luc和不同量的shRNA或AR突变体HD1-KRAB-AR122构建体转染的CWR22R细胞进行报道分子分析而获得的，如x轴所显示。转染混合物中的DNA总量通过添加shControl载体DNA而保持相等。转染效率通过pCMV-b-gal构建体的共转染而标准化。分析重复进行两次。图4B提供了数据的图解表示，这些数据来自用指示构建体转染并且被选为嘌呤毒素抵抗的CWR22R细胞的集落形成测定。分析重复进行两次。误差棒-两次测量结果之间的偏差。
图5A和5B提供了显示AR抑制剂对类固醇受体活性的作用的数据。图5A提供了数据的图解表示，显示了CWR22R细胞中的ARE-Luc报道分子活性可以被不同的类固醇(DHT-双氢睾酮，Dex-地塞米松，Ald-醛固酮)诱导，但是取决于AR表达。靶向AR的siRNA或GAPDH的siRNA(对照)被转染进入在SFM中的CWR22R-ARE-Luc细胞中。将指示浓度的类固醇添加到转染的细胞中并且24小时之后测量了萤光素酶活性。图4B提供了数据的图解表示，显示了目标化合物对由DHT、Dex或Ald诱导的MDA-MB-453-MMTV-Luc细胞中的荧光素酶活性的作用，表示为DMSO对照的％。X轴-目标物的浓度，单位μM。误差棒显示了在试验中重复两次之间的标准偏差。
图6A和6B提供了显示在雄激素非依赖性PCa的小鼠模型中的所选目标物的抗肿瘤活性的数据。图6A提供了数据的图解表示，这些数据从腹腔注射所列化合物或DMSO载体进入携带皮下(s.c)C4-2肿瘤的裸鼠中而获得。当肿瘤的尺寸大约为100mm3时开始给予每日注射六次。每组4-5只小鼠，每只小鼠有两个肿瘤。分别将星号(*)和井号(#)置于c6和c11组的测量平均值下，根据ANOVA检验它们在统计学上不同于对照组(＞99％)。B.将C52(9mg/kg或18mg/kg)或DMSO载体注射到携带皮下CWR22R肿瘤的裸鼠的尾静脉中。当肿瘤的尺寸大约为40mm3时开始给予每日注射五次。每组10只小鼠，每只小鼠有1个肿瘤。将星号(*)置于测量平均值下，根据ANOVA检验它们在统计学上不同于对照组(＞99％)。在图6A和6B两者中的误差棒-在一个给定治疗组之内的肿瘤尺寸之间的标准偏差。
图7提供了第1类化合物的结构。
图8提供了第3类化合物的结构。
图9提供了第6类化合物的结构。
图10提供了第54类化合物的结构。
图11提供了第XX类化合物的结构。
图12提供了数据的图解表示，这些数据是通过对不同的乳腺癌和前列腺癌细胞分析由不同浓度的化合物c52、c70和c85引起的细胞死亡而获得的。9AA是9-氨基吖啶并且被用作阳性对照。还显示了蛋白质印迹(WB)，显示了这些化合物对AR(AR)表达的作用。
图13提供了数据的图解表示，这些数据是通过对不同的乳腺癌和前列腺癌细胞分析在不同浓度的化合物c52、c70和c85存在下的细胞存活而获得的。
图14提供了数据的图解表示，这些数据是通过对不同的乳腺癌和前列腺癌细胞分析在不同浓度的化合物c52、c70和c85存在下的细胞存活而获得的。还显示了蛋白质印迹，显示了这些化合物对AR蛋白表达的作用。
图15提供了数据的图解表示，这些数据是通过对乳腺癌和前列腺癌细胞分析在不同浓度的化合物c52、c70和c85存在下的细胞存活而获得的。
图16提供了数据的图解表示，这些数据是通过对乳腺癌和前列腺癌细胞分析由不同浓度的化合物c52、c70和c85引起的细胞死亡而获得的。
图17提供了数据的图解表示，这些数据是通过对AR阴性的乳腺癌和前列腺癌分析在不同浓度的化合物c52、c70和c85存在下的细胞存活而获得的。
图18提供了数据的图解表示，这些数据是通过分析不同浓度的c5、c85、c6和c52对多个细胞系的存活的作用而获得的，这些细胞系包括CWR22R、LNCaP、C4-2(AR阳性前列腺癌AR)、PC3、DU145、PPCI(AR阴性前列腺癌)、MDA-MB-231(AR阴性乳腺癌)、ACHN、SK-RC45(AR阴性肾细胞癌)、MRC5(正常二倍体成纤维细胞)和NKE-hTERT(正常肾上皮成纤维细胞)。
本发明的说明
本发明提供了一种用于抑制个体中AR阳性癌细胞生长的方法。这个方法包括向诊断为或怀疑患有AR阳性癌症的个体给予一种包含能够抑制AR阳性癌细胞生长或杀死AR阳性癌细胞的化合物的组合物。适合用于本发明的化合物的一般结构如在图7、8、9、10、11中所描绘。在图7中所描绘的结构在此也被称为第1类。在图8中所描绘的结构在此也被称为第3类。在图9中所描绘的结构在此也被称为第6类。在图10中所描绘的结构也被称为第54类。在图11中所描绘的结构在此也被称为第XX类。
在图7、8、9、10、11中所描绘的化合物的具体实例被分别指定为c5、c6、c11、c52和c85。从购自Chembridge化学公司(加利福尼亚，圣地亚哥)的DiverSet化学文库中存在的34,000个化合物中鉴定出c5、c6、c11、c52和c85适合用于本发明的方法中。这些化合物中的每一个都与一个公众可得的Chembridge识别号(ID)相关，因此每一个结构都可以被相应地访问。
本领域的技术人员将会认识到的是，在图7-11中所描绘的结构各自包括多种化合物，这些化合物通过可能存在于R位置的替代基团而互不相同。例如，对于在图7中所示的化合物的类别，R5、R6和R7各自独立地是氢；包含1至6个碳的烷基；芳基烷基，其中芳基部分包含5或6个碳并且烷基部分包含1至4个碳(如甲苯基团)；烷基酮基，其中烷基部分包含1至4个碳(如乙酸基)；卤化物(如氟化物、氯化物、溴化物和碘化物)；或羟基。R3是氢或羟基。R8、R9和R10各自独立地是氢；包含1至6个碳的烷基；卤化物(如氟化物、氯化物、溴化物和碘化物)；或者硝基。X1是氧原子或硫原子。
对于在图8中所示的化合物的类别，R12、R13和R14各自独立地是氢；包含1至6个碳的烷基；烷基醚基，其中烷基部分包含1至6个碳(如甲醚或乙醚基)；卤化物(如氟化物、氯化物、溴化物和碘化物)；氨基；羟基；或者硝基。X2是氧原子或硫原子。
对于在图9中所示的化合物的类别，R17和R18各自独立地是氢；包含1至6个碳的烷基；或者烷基醚基，其中烷基部分包含1至4个碳(如甲醚或乙醚)。R19和R20各自独立地是氢；包含1至6个碳的烷基；或者卤化物(如氟化物、氯化物、溴化物和碘化物)。
对于在图10中所示的化合物的类别，R21(R25)是氢；或者包含1至6个碳的烷基，其任选地可以被一个或多个羟基或氰基取代。R22、R23和R24(R26、R27和R29)各自独立地是氢；包含1至6个碳的烷基；烷基酮基，其中烷基部分包含1至4个碳并且任选地可以被一种或多种卤化物(如乙酸酯基或一个取代或者一个三氟乙酸酯基)；烷氧基，其中烷基部分包含1至4个碳并且可以任选地，被一种或多种卤化物取代；卤化物(如氟化物、氯化物、溴化物和碘化物)；烷基磺酰胺，其中烷基基团包含1至4个碳(如甲基磺酰胺)；或者羟基。R30、R31和R41各自独立地是氢或是包含1至6个碳的烷基，其任选地可以被一种或多种卤化物取代。R32是包含1至6个碳的烷基，其任选地可以被一种或多种卤化物(如氟化物、氯化物、溴化物和碘化物)取代；或者氨基。R33和R34各自独立地是包含1至6个碳的烷基，其任选地可以被一种或多种卤化物(如氟化物、氯化物、溴化物和碘化物)取代；或者烷基环己基基团，其中烷基部分包含1至4个碳(如甲基环己基基团)。
对于在图11中所示的化合物的类别，R35是氢；包含1至6个碳的烷基，其任选地可以被一种或多种卤化物(如氟化物、氯化物、溴化物和碘化物)取代；或卤化物(如氟化物、氯化物、溴化物和碘化物)。R35和R37各自独立地是氢；或者包含1至6个碳的烷基，其任选地可以被一种或多种卤化物(如氟化物、氯化物、溴化物和碘化物)取代。R38和R39各自独立地是氢；包含1至6个碳的烷基，其任选地可以被一种或多种卤化物(如氟化物、氯化物、溴化物和碘化物)取代；或者羟基。R40是氢或者羟基。此处呈现的一些结构在某些位置上没有描绘氢。本领域的技术人员可以理解这些结构包括这种氢取代基。
包含在本披露之内的化合物的具体实例被指定为c5、c6、c8、c11、c16、c17、c18、c47、c52、c55、c61、c66和c73(Chembridge识别号6443213)。带有Chembridge ID号的具体结构显示如下。
Figure BDA0000155469940000091
Figure BDA0000155469940000101
Figure BDA0000155469940000111
Figure BDA0000155469940000121
在一个实施方案中，本发明的方法包括向诊断为或怀疑患有AR阳性癌症的个体给予一种包含选自在此指定为c5、c6、c11、c52和c85的化合物的一种化合物以及它们的组合的组合物。
在一个实施方案中，对个体所给予的组合物包含c52。
在此提及的AR阳性癌细胞是表达可检查量的AR蛋白的癌细胞。“雄激素受体”(被缩写为“AR”)是本领域的技术人员所熟知的术语，并且在此被用来表示由人癌细胞表达的AR蛋白，包括人AR蛋白的所有同种型和等位基因变异型。
在一个实施方案中，其生长可以通过实施本发明的方法在个体中被抑制的AR阳性癌细胞是表达被任何类型的抗人AR抗体特异性识别的AR的细胞。抗人AR抗体是可商购的。在一个实施方案中，其生长可以通过实施本发明的方法在个体中被抑制的AR阳性癌细胞是表达被抗人AR抗体(购自加利福尼亚，圣地亚哥的BD PharMingen，目录编号为#554225)特异性识别的AR的细胞。在一个实施方案中，可检测的AR蛋白量是可以被蛋白质印迹法检测的AR蛋白的量。
在一个实施方案中，AR阳性癌细胞是表达具有基因库登录号P10275的氨基酸序列(2009年9月1日登录)的AR的细胞，通过引用结合在此。在一个可替代的实施方案中，AR阳性癌细胞是表达与提供为基因库登录号P10275的氨基酸序列(2009年9月1日登录)具有70％至99％之间(端值包含在内，并且包括这之间的所有整数)同源的氨基酸序列的AR的细胞。AR阳性细胞可以是表达具有任何这种序列的这样一种AR的癌细胞，其中AR可以通过蛋白质印迹检测到。
AR阳性癌细胞可以是任何类型的癌细胞。在一个实施方案中，这些癌细胞是前列腺癌细胞。前列腺癌细胞可以是雄激素依赖性的或雄激素非依赖性的。
在另一个实施方案中，AR阳性细胞是乳腺癌细胞。乳腺癌细胞可以是任何类型的乳腺癌细胞，前提是它们是AR阳性的。乳腺癌细胞可以是ER-、PR-、Her2-中的任何一种，或者它们的组合。
在另一个实施方案中，AR阳性细胞是肝细胞癌细胞、甲状腺癌细胞、胶质母细胞瘤、或星形细胞瘤。
抑制AR阳性癌细胞生长可以是部分抑制或完全抑制。从个体中铲除一些或所有AR阳性癌细胞应当被认为是一种抑制AR阳性癌细胞生长的类型。
在一个实施方案中，本发明包括通过使这些细胞与有效量的一种组合物相接触来抑制癌细胞的生长，该组合物包含具有描绘于图7、8、9、10、11中的一种结构的化合物。
在本发明的一个实施方案中，一个个体可以被鉴定为用包含有效量的化合物的一种组合物治疗的候选者，该化合物选自描绘于图7、8、9、10、11中的化合物的组。通过来自该个体的癌性组织获得一个生物样品来鉴定该个体为候选者并且确定该癌性组织是否表达AR。确定癌性组织表达AR表明该个体是该治疗的候选者。同样地，确定该组织不表达可检测量的AR表明该个体不是该治疗的候选者。确定该癌性组织是否表达AR可以使用任何适合的技术来进行，如免疫学技术。在一个实施方案中，本发明包括将从个体获得的生物样品中的AR转化成AR抗体复合物，并且使用一个免疫诊断设备检测AR抗体复合物。
在不同的实施方案中，本发明进一步包含将癌性组织固定在一种有形媒介中用于确定其是否表达AR，和/或将对该个体的治疗介绍固定在该有形媒介中。该有形媒介可以是任何类型的有形媒介，如任何类型的数字媒介，包括但不限于可以存储在计算机、DVD、CD-ROM中的数字化文件，或者电子邮件信息。可以将有形媒介提供给医疗保健提供者以便开发一种治疗方案，由此开发包含进行本发明的方法的针对该个体的治疗方案。
用于进行本发明的方法的包含化合物的组合物可以通过与任何适合的药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂混合来制备。适合用于与这些化合物混合的组合物的一些实例可以在Remington：药剂学科学和实践(2005)第21版，美国宾夕法尼亚州费城，Lippincott Willianms&Wilkins中找到。
可以使用任何有效的方法和途径将包含在此所述的化合物的组合物给予个体，包括口服、肠胃外、皮下、腹膜内、肺内、鼻内和颅内注射。肠胃外输注包括肌肉注射、静脉注射、动脉内注射、腹膜内注射、以及皮下注射。
本发明的方法可以在常规抗癌治疗(包括但不限于化学治疗、外科手术、以及放射治疗)之前、同时或之后进行。
本领域的技术人员将会认识到的是，本发明的方法中所使用的具体给药方案的形式和性质将由给药途径和其他熟知的变量、个体的性别和尺寸、以及正在被治疗的具体癌症的类型和阶段来决定。基于这种标准，本领域的技术人员可以确定给予该个体的组合物的有效剂量。
在达到本发明的过程中，我们鉴定了一些AR抑制剂，这些AR抑制剂靶向不同于AR-配体相互作用的AR功能方面。我们通过首先在配体非依赖性PCa细胞系中鉴定AR依赖性转录的特异性抑制剂来实现这个过程。我们选择了显示出针对AR表达PCa细胞系的特异性毒性的那些化合物。值得注意的是，不是所有的AR依赖性转录抑制剂都对雄激素非依赖性PCa细胞系有毒，这表明AR转录功能就其本身而言不控制PCa细胞存活。我们在PCa的小鼠异种移植模型中测试了最佳AR抑制剂的体内抗肿瘤活性，并且我们通过最有效的化合物分析了AR抑制的分子机制。这导致发现了从细胞中消除AR蛋白对细胞存活与抑制AR的反式激活功能相比具有不同的影响，这表明AR通过一种转录非依赖性机制(被认为是重要的且先前没有认识到的抗癌方法)来控制前列腺细胞(以及有可能其他类型的AR阳性癌细胞，如乳腺癌细胞)的存活(由在此展示的数据证明)。
下面的实例是为了说明但不是限制本发明
实例1
这个实例提供了用来获得在此展示的结果的材料和方法的说明。
细胞系：LNCaP、DU145、MDA-MB-453-MMTV-Luc、HeLa、ACHN、MRC5和HT1080细胞从ATCC获得。RCC45和正常肾上皮细胞(NKE)描述于Gurova等人2004，《癌症研究》64：1951-1958中。永生化NKE-hTERT细胞是通过在pBabe-puro载体中转导人端粒酶亚基而获得的。CWR22R和C4-2是由Dr.Warren Heston(克利夫兰临床机构的癌症生物学系)提供的。已经描述了pARE-Luc报道分子构建体和CWR22R-ARE-Luc报道分子细胞(Tararova，N等人，2007，《前列腺》67：1801-1815)。尽管由AR结合的共有DNA元件也被几种其他类固醇受体识别，pARE-Luc报道分子利用了前列腺碱性蛋白(probasin)启动子的一个区，已知该区是最大的AR特异性启动子区域之一(Tararova，N等人，2007，《前列腺》67：1801-18154)。
所有的前列腺细胞系和MDA-MB-453-MMTV-Luc在添加了10％FBS、1mM丙酮酸钠、10mM HEPES缓冲剂、55nMβ-巯基乙醇和抗生素的RPMI1640培养基中培养。HeLa和HT1080细胞维持在具有10％FBS和抗生素的DMEM培养基中。无酚红培养基和炭剥离血清(CSS)被用来产生无类固醇培养基(SFM)。CSS从Biosource(Rockville，MD)购得。
质粒：pTZV-wtAR和pTZV-ARΔLBD慢病毒表达构建体是通过将野生型全长(1-919aa)AR或相应于人AR的第一639aa的AR片段亚克隆到pTZV-CMV载体中而获得的(Tararova，N等人，2007，《前列腺》67：1801-1815)。指导抗人AR的shRNA表达的pLPCPw-shAR慢病毒载体如所述而被产生(Tararova，N等人，2007，《前列腺》67：1801-1815)。相应于人AR的非翻译区的shRNA序列是TGATCCTCATATGGCCCAG。pHD1-KRAB-AR122是从G.Jenster博士(荷兰鹿特丹，Erasmus MC，Josephine Nefkens Institute的泌尿科)获得的并且已经进行了说明(23)。＜.pLV-CMV-Luc载体由Peter Chumakov博士(克利夫兰临床机构，分子遗传科)友情提供。
慢病毒转导和siRNA转染如前所述并且使用常规技术来进行(Gurova等人，2004，《癌症研究》64：1951-1958)。
化学品：34,000DiverSet化学文库(包括分子量大约500Da的小型多环分子)购自Chembridge化学公司(加利福尼亚，圣地亚哥)。DHT是从克利夫兰临床药学系获得的(俄亥俄州，克利夫兰)醛固酮、地塞米松、BSA、核糖核酸酶A和碘化丙啶购自Sigma-Aldrich(密苏里州，圣路易斯)。康士得(比卡鲁胺)购自TRC(加拿大，多伦多)。
初步化学筛选：将来自DiverSet Library的化学品以最终浓度20μM施用到一个96孔板内的CW22R-ARE-Luc细胞单层上。第二天，使用BrightGlo荧光素酶测定系统(Promega，Madison，WI)阅读荧光素酶活性并且计算化学品处理的细胞中的报道分子活性的百分位数(与用DMSO处理的细胞作为100％进行比较)。对于这个参数为50％或更低的化合物被考虑为初步目标物(primary hits)。将目标物的列表与从同一文库的其他筛选获得的那些进行了比较，这些包括由包含p53、NF-κb或E-box结合元件以及对HeLa、黑素瘤和神经细胞瘤细胞有毒的化合物的启动子驱动的报道分子的抑制剂。对也呈现在这些其他列表中的任何之一的AR-抑制性目标物不再加以考虑。在具有CMV-Luc报道分子的HT1080细胞中测试了转录/翻译或荧光素酶活性的非特异性抑制，并且对在这个系统中的活性目标化合物不再加以考虑。
报道分子活性的剂量依赖性抑制：将CWR22R细胞置于一个96孔板内，每孔5×104个细胞。以2倍增量从1至20000nM的剂量范围加入化合物。每个剂量测试一式二份。对照是0.1％的DMSO和15μg/ml的放线菌素D。加入化合物之后24小时通过Bright Glo测定(Promega，Madison，WI)测量荧光素酶活性。这个测定进行两遍，使用CalcuSyn软件(Biosoft，Chembridge，英国)通过sigmoid近似法计算与DMSO比较抑制50％报道分子活性的化合物的有效浓度(EC50)。对每一个sigmoid计算置信区间。
细胞集落测定：将细胞置于一个24孔板内，密度为在融合前允许6-7天的指数生长。每48小时更换一次培养基和化合物以使潜在的化合物不稳定性的效应最小化。在化合物存在下赋予7天之后，细胞被固定并且用亚甲蓝染色，之后用1％SDS提取染料并且在650nm下进行分光光度测定。每个测定一式三份地进行，在对照和化合物处理的孔之间的差异使用Student t-检验来确定。
细胞生长的剂量依赖性抑制：将细胞置于96孔板中，每个孔1×103个细胞。以两倍增量从1至20000nM的剂量范围加入化合物。每个剂量测试一式三份。对照是0.1％DMSO(对细胞活力没有作用)和50μM 9-氨基吖啶(完全细胞死亡)。将细胞培养6天，然后固定并且用亚甲蓝染色，之后用1％SDS提取染料并且在650nM下进行分光光度测定。该测定进行两次，并且基于这些结果，使用CalcuSyn软件(Biosoft，Chembridge，英国)通过sigmoid近似法计算与DMSO相比抑制50％细胞生长的化合物的抑制浓度(IC50)。对每个sigmoid计算置信区间。
CWR22R细胞的化合物抵抗性变异体的选择是通过在10×IC50的一种化合物存在下将107个细胞孵育3天来进行的。然后将这些细胞保持在无药的培养基中直到它们达到预融合(pre-confluent)的水平。这个过程被重复几次直至在化合物的存在下观察不到死亡细胞为止。
在有或没有10μM试验化合物下培养这些细胞72小时之后使用来自Antigenix America(纽约，亨廷顿)“人PSA ELISA试剂盒”来确定条件培养基中的PSA蛋白水平。
蛋白质印迹分析。将细胞溶解在细胞培养溶解试剂中(Promega，Madison，WI)。使用Dc蛋白测定(Biorad，Hercules，CA)确定总蛋白浓度。使用预凝的4％-12％SDS Novex凝胶(Invitrogen)和PVDF膜(PharmaciaBioTech)进行蛋白质印迹法。使用了以下抗体：抗AR(BD PharMingen，加利福尼亚，圣地亚哥；#554225，1μg/ml)；抗GAPDH作为内参照(loadingcontrol)(圣克鲁斯生物技术公司，加利福尼亚，圣克鲁斯)。
细胞周期分布的分析是基于通过碘化丙啶的DNA含量染色。使用胰蛋白酶从培养皿移出105个细胞，用PBS洗涤并且再悬浮于在PBS中的300μl3％BSA中，之后添加5μl 70％的乙醇。细胞在-20℃下保持几个小时，然后用10μg/ml碘化丙啶在30μg/ml RNA酶A存在下在37℃染色2小时。使用FACS Calibur仪器和CellQuest软件(Becton Dickinson，FranklinLakes，NJ)评定DNA含量。
根据IACUC批准的方案进行化合物在小鼠中的安全性的测试。使用来自Harlan(印第安纳波利斯，IN)的远交8周大的NIH瑞士雄性小鼠来进行这个实验，每组4只小鼠。IC50浓度被用来计算基于小鼠重量的体内剂量(以mg/kg计的IC50体内剂量当量＝IC50mg/ml×1000，基于1g的小鼠组织具有大约1ml体积的假设)。将这些化合物(在25％DMSO至75％PBS中)腹膜内注射，从相当于化合物体外细胞毒剂量的20×IC50开始。在两次随后的注射50×IC50(剂量2)和100×IC50(剂量3)的每一次之前三天观察小鼠。对照组小鼠接受3次注射25％DMSO至75％PBS，间隔为三天。通过BioReliance(Rockville，MD)进行血生化分析。
根据IACUC批准的方案在来自Harlan(印第安纳波利斯，IN)的8周大的雄性无胸腺的裸鼠中进行化合物在小鼠中的抗肿瘤效果的测试。对于C4-2异种移植模型，将106个C4-2细胞(在PBS中的50％基质胶(BDBiosciences，Bradford，MA)中)皮下(s.c)注射到每个小鼠的2个位置。在显影可见的肿瘤中，使用数字式卡尺测量它们。根据以下公式进行计算肿瘤体积：体积＝长度×宽度2/2。用化合物每天腹膜内注射小鼠，共注射6天，从每只小鼠中至少一个肿瘤达到100mm3的大小的那天开始。每组使用了5只小鼠。对于CWR22R异种移植模型，将CWR22R细胞接种在50％基质胶中(每个接种物中105个细胞)，每只小鼠一个位点。当肿瘤生长到至少25mm3的大小时开始治疗。将化合物稀释在captisol(CyDex，Lenexa，KS)中并且经由静脉递送(以减少肝脏“首过”效应)，每天一次，共5天。每组使用了十只小鼠。每天监测小鼠并且每隔一天测量肿瘤。当肿瘤大小达到1000mm3时根据制度规定使小鼠安乐死。使用ANOVA检验将对照组和治疗组的小鼠的肿瘤生长进行比较。
实例2
本实例提供了适合用于本发明的方法中的化合物的鉴定的说明。
我们筛选了小分子的文库以便鉴定AR的抑制剂。由于许多原因我们选择了一种基于细胞的读出方法，这些原因包括(i)我们希望将潜在靶标从仅仅AR蛋白本身扩展至整个AR信号途径，这对于体外生化测定是不可能的；(ii)不清楚AR的哪个功能/结构域/结合位点负责控制细胞存活；以及(iii)全长AR的晶体结构还没有解析。由于后面两个事实，合理的设计方法是不可能的。
为了增加鉴定新类型的AR抑制剂的可能性，这些新类型AR抑制剂通过不同于AR配体相互作用的机制起作用，我们从几个可得的培养的细胞系中选择了最为雄激素非依赖性的细胞，CWR22R，用于文库筛选。这些细胞的增殖不受雄激素缺乏的影响并且AR转录活性作为雄激素除去的结果而被最低程度地降低(与其他PCa细胞系相比)。这个细胞系的另一个重要特征是它表达了缺乏LBD的截短的AR突变体(ARΔLBD Cancer Res62：6606-6614)。存在于CWR22R细胞中的超过50％的AR蛋白是ARΔLBD形式，而剩余的是具有LBD突变的全长形式。使用其中大部分AR活性是由于缺乏LBD的突变体的细胞增加了分离小分子抑制剂的机会，这些小分子抑制剂通过不同于AR配体相互作用的抑制的机理起作用。为了证明ARΔLBD具有配体非依赖性AR功能并且是鉴定抑制剂的适合靶标，我们通过试验产生了仅仅存在ARΔLBD的CWR22R细胞。CWR22R细胞与shRNA共同转导，shRNA靶向内源AR转录本的非翻译区以及指导ARΔLBD异位表达的表达构建体(图1)。在这些细胞中，ARΔLBD突变体作为一种转录因子是具有组成型活性的并且即使在缺乏任何配体的情况下被定位于细胞核(即，在用炭剥离血清制成的无类固醇培养基(SFM)中，图1A和B)。我们还证明尽管消除对CWR22R细胞有毒的所有AR蛋白，异位表达的ARΔLBD可以在缺乏全长AR的情况下支持CWR22R细胞的增殖(图1C-E)。这些结果表明AR的ARΔLBD突变体形式具有与全长蛋白相同的转录和促存活活性，但是不需要配体。
为了监测库化学品对AR活性的作用，我们将AR依赖性荧光素酶报道分子构建体(pARE-Luc)引入CWR22R细胞中，以产生具有整合的报道分子的一个稳定细胞系。将一个具有34,000个小分子的文库以20μM的浓度施用到生成的CWR22R-ARE-Luc细胞上，并且在24小时孵育之后将至少两倍抑制报道分子中的荧光素酶活性的化合物被筛选为初步目标物。从初步目标物的列表中，我们排除了(i)抑制用相同的文库测试的其他报道分子体系的化合物(例如CMV-GFP、E-box-荧光素酶)以避免转录或翻译的一般的或非特异性的抑制剂以及荧光素酶酶活性的抑制剂，以及(ii)对非PCa细胞(例如Hela，黑素瘤，RCC细胞)有毒的化合物以避免非特异性(明显与AR信号不相关)毒性化合物。使用CWR22R-ARE-Luc细胞在报道分子剂量响应测定中证实过滤的目标物，具有EC50(导致报道分子活性减少50％的有效浓度)＜10μM的那些目标物被选择，用于进一步分析。
为了证实目标物对内源AR靶标基因的AR抑制的活性，我们评定了化合物对前列腺特异性抗原(PSA)表达的作用。这个测定是在与用于文库筛选不同的PCa细胞系(C4-2)中进行的，以便排除对于一种特定的细胞类型特异性的目标物。C4-2细胞系是雄激素敏感的LNCaP细胞系的衍生物，基于能够在去势小鼠中生长而被选择并且因此展示了去势抵抗性PCa的另一种模型。C4-2细胞具有与LNCaP细胞相同的AR LBD突变但是具有改变的AR共调节子表达，这使得AR对DHT更加敏感几倍。当以10μM浓度施用时通过C4-2细胞抑制PSA分泌＞60％的化合物被选择用于进一步分析，这个分析使用在10μM的化合物存在下孵育了24小时的CWR22R-ARE-luc细胞中的荧光素酶活性，并且被分析为在用0.1％DMSO孵育的细胞中的荧光素酶活性的百分比。在72小时时测量了shAR6的作用；在10μM化合物存在下在孵育了72小时的C4-2细胞的培养基中的PSA的水平被分析为在用0.1％DMSO孵育的细胞中的PSA水平的百分比。在72小时时测量了shAR6的作用。在10μM化合物存在下生长的集落数目被分析为在0.1％DMSO存在下的集落形成百分比。
在天然存在于FBS中的类固醇存在下或在SFM中高达10nM的双氢睾酮(DHT)存在下，选择的化合物抑制了两种细胞系(CWR22R和C4-2)中的AR转录活性。因此，选择的化合物在雄激素非依赖性PCa的至少两种模型中是AR转录活性的抑制剂。
实例3
本实例提供了所选化合物对PCa细胞生长的作用的说明。为了测试鉴定的AR抑制剂对不同来源的细胞的毒性，我们使用一种单一剂量的每个化合物(10μM)在几种PCa(LNCaP、C4-2、CWR22R和DU145)以及两种非PCa(HT1080和HeLa)细胞系上进行了集落形成测定(图2A)。除了一个单一化合物(c66)之外，选择的小分子没有影响非PCa细胞或AR阴性PCa细胞(DU145)的生长。几乎所有所测试的分子、以及阳性对照比卡鲁胺(目前用于临床的一种AR抑制剂)，不同程度地抑制了表达AR的雄激素敏感性LNCaP细胞的生长(图2A)。同时，比卡鲁胺没有抑制C4-2或CWR22R细胞的生长(表达AR的雄激素非依赖性细胞系)，而一些所选分子抑制了它们的生长。因此，我们鉴定了几种化合物(c5、c6、c11、c17、c18、c52、c85)对三种表达AR的PCa细胞系有不同程度的毒性但是对非PCa细胞或AR阴性细胞没有毒性。但是，几种化合物(c8、c16、c47、c55、c61、c73)表现得与比卡鲁胺相似，它们抑制LNCaP细胞的生长，但是不抑制CWR22R或C4-2细胞的生长。这些化合物不是比抑制这些细胞生长的化合物更弱的CWR22R或C4-2中的AR转录活性的抑制剂。例如，化合物c55、c61和c85是AR依赖性转录的可比的抑制剂，如通过EC50和ARE-Luc报道分子活性和PSA分泌的最大抑制作用判断；但是，c85抑制雄激素非依赖性CWR22R和C4-2细胞系的生长，而c55和c61不抑制。这些发现证明AR依赖性转录活性的抑制，就其本身而言，不足以抑制雄激素非依赖性PCa细胞的生长。
我们发现，用于文库筛选的参数，CWR22R细胞中的AR依赖性报道分子表达的抑制，并不必然反映化合物对这些细胞的毒性，有以下两种可能的解释：(i)AR通过一种转录非依赖性机制控制雄激素非依赖性PCa细胞的存活，鉴定的抑制AR依赖性转录的集合包括同样抑制AR的假定的转录非依赖性抗细胞凋亡的功能的一些化合物；或者(ii)在筛选中鉴定的AR抑制剂的毒性不依赖于AR，并且观察到的AR转录活性的抑制是毒性或者这些化合物通过某一其他机制产生的其他作用的反映。在我们筛选中鉴定的毒性化合物显示出毒性的特异性的事实(对表达AR的三种测试的靶标PCa细胞系中的三种有毒，但是对三种测试的非靶标细胞系中的三种无毒)反对第二种方案。
为了进一步分析这些化合物的AR特异性，我们比较了AR抑制的定量参数以及由这些化合物引起的PCa细胞毒性。在添加化合物之后24小时测量的CWR22R细胞中的AR依赖性荧光素酶活性抑制的EC50与在添加化合物之后6天的抗CWR22R细胞毒性的IC50(导致少于50％的活细胞的化合物的抑制浓度)进行了比较(图2B)。重要的是，在24小时时没有化合物显示出毒性(数据未显示)。这与靶向AR的siRNA在这些细胞上的延迟毒性作用相似，其在施用siRNA之后4-6天变得明显。图2B显示了对于24小时时AR依赖性报道分子的抑制的EC50与6天时毒性的IC50在相同的范围内。这证明AR依赖性转录抑制发生在毒性之前以及在AR抑制与PCa细胞的毒性(对于PCa细胞有毒的那些化合物)之间存在着关联。这些结果，与一些AR抑制剂无毒的事实一起，表明AR可以通过一些不同的模式被灭活：(i)仅抑制AR的转录活性对于雄激素非依赖性PCa细胞是无毒的(与雄激素戒断作用类似)；(ii)抑制AR转录活性连同控制PCa细胞存活的AR的一些其他转录非依赖性功能对雄激素依赖和非依赖性PCa细胞两者是有毒的；以及(iii)仅抑制AR的假定的转录非依赖性的促存活功能而没有影响AR介导的转录预期对所有PCa细胞是有毒的，尽管到目前为止还没有鉴定出这样的抑制剂。我们的读出体系是基于监测AR依赖的反式激活，通过假定的第三种模式作用的化合物在我们的筛选中没有被分离。
我们还测试了所选化合物在非靶标细胞系(非PCa细胞系和不表达AR的PCa细胞)的更大的一组(n＝10)中的作用。这些数据的实例显示在图2C中。选择的目标物仅对靶细胞有毒并且在所有测试浓度下对AR阴性细胞无毒。因此，我们可以高水平的置信度得出结论，显示出毒性的所选目标物仅对表达AR的PCa细胞是有毒的，因此这些化合物的毒性同样与它们对AR的作用有关。
在图2C中的数据也显示，对PCa细胞有毒的化合物基于它们的毒性的程度可以被分成两类：化合物c52和c85在第7天时在培养物中实际上杀死所有PCa细胞；相反，与未处理的对照细胞相比，其他化合物引起生长减弱，但是没有明显的细胞死亡(图2C，化合物c5和c6，并且对于化合物c11、c17、c18未显示数据)。在这些后者的情况下，增加孵育时间或化合物剂量仍然不能带来细胞的完全消除。这表明一个亚组的化合物抑制了PCa细胞的增殖，但是没有杀死它们。为了测试这种可能性，我们评定了用两类化合物处理的CWR22R细胞的细胞周期分布。用第一类型的化合物(c52、c85)处理导致凋亡细胞的具有sub-G1DNA含量特征的细胞的出现(图3D)。相反，用第二类型的代表性化合物(c5、c6、c11)处理细胞没有导致具有sub-G1DNA含量的细胞的出现，但是确实导致了细胞周期分布的改变，指示细胞周期停滞(细胞周期的G1期的细胞按比例增加以及S期的细胞按比例降低)。因此，抑制雄激素非依赖性PCa细胞中的AR依赖性转录的不同亚组的化合物引起生长停滞或者这些细胞的凋亡。无论化合物引起生长停滞还是细胞凋亡都不是由该化合物作为AR依赖性转录的抑制剂的潜能所决定的。(即图2B)。
实例4
本实例提供了在化合物对PCa细胞的毒性与它们对AR蛋白水平的影响之间的关联的说明。
基于上述结果，我们在筛选中鉴定的AR依赖性转录的抑制剂中可以区分出三类化合物：(i)卡鲁胺样化合物(c8、c16、c47、c55、c61、和c73)，其抑制雄激素敏感性LNCaP细胞生长但是不影响雄激素非依赖性C4-2或CWR22R细胞生长；(ii)抑制表达AR的所有(雄激素依赖性和非依赖性的)PCa细胞生长的化合物(c5、c6、c11、c17、和c18)；以及(iii)杀死表达AR的所有PCa细胞的化合物(c52和c85)。第一类型中的AR抑制剂有可能靶向配体结合(表示它们对雄激素非依赖性癌细胞是无毒的)并且因此认为它们在本发明的方法中是没有用的。另外两类是感兴趣的，因为它们显示出代表新类型的AR抑制剂，它们有潜力治疗雄激素非依赖性PCa和其他AR阳性癌症，并且因此被称为ARTIS(AR转录抑制剂-抑制性的，包括化合物c5、c6、c11、c17、c18)和ARTIK(AR转录抑制剂-杀伤性的，包括化合物c52和c85)。
为了努力阐明为什么ARTIS和ARTIK对PCa细胞的生长具有不同的作用，我们比较了用两类化合物以及对PCa细胞无毒的第一类的几种目标物处理的CWR22R细胞中的AR蛋白水平。这个分析显示，用ARTIK(c52和c85)处理导致AR蛋白从细胞中完全消失。相反，用ARTIS化合物或非毒性AR抑制剂处理没有影响细胞中的AR蛋白的水平(图3A)。这支持AR通过转录非依赖性机制控制雄激素非依赖性PCa细胞的存活。不同化合物的比较表明，AR蛋白的消除导致雄激素依赖性和非依赖性细胞的死亡(并且解释了观察到的AR依赖性转录的抑制)。另一方面，在AR蛋白水平方面没有降低的AR依赖性转录的抑制抑制了雄激素依赖的(并且在一些情况下雄激素非依赖性的)PCa细胞的生长，但是没有杀死它们。通过抵抗ARTIK毒性的一个CWR22R克隆的体外选择证明了AR消除对于一种ARTIK化合物的毒性作用的关键意义。(图3B，详细参见实例1)。在c52存在下在107个细胞生长之后获得一个单一克隆，这个克隆即使在c52恒定存在下生长时保持AR的表达(图3C)，这表明AR有可能是c52的一个直接靶点。没有获得对化合物c85抵抗的克隆。
作为AR的转录非依赖性功能是否控制PCa细胞的存活的另一个试验，我们比较了两种基因构建体对CWR22R细胞存活的作用。靶向AR的ShRNA引起AR表达的抑制，导致与ARTIK化合物相似地消除AR蛋白。另一方面，AR突变体HD1-KRAB-AR122(其中部分AR反式激活结构域的一部分(aa 1-122)被KRAB和HDAC1的反式阻抑结构域取代)不影响内源AR蛋白水平，但是通过与内源AR蛋白竞争结合到ARE DNA序列上而完全消除AR依赖性转录(Bramlett等人，2001，Mol Cell Endocrinol183：19-28)。＜.在一定剂量范围内在用ARE-Luc报道分子的CWR22R共转染测定中测试了这两种构建体对AR依赖性转录的作用(图4A)，并且测试了它们在集落形成测定中对CWR22R存活的作用(图4B)。这两种构建体几乎完全抑制了CWR22R细胞中的AR依赖性荧光素酶的表达，其中在同等量的DNA的转染时HD1-KRAB-AR122突变体比shRNA构建体略微更有效力。但是，如前所示，抗AR的shRNA抑制了CWR22R集落的生长，而HD1-KRAB-AR122构建体没有抑制。这种情况摹拟了我们的用AR抑制性小分子组观察到的情况，并且对AR通过反式激活非依赖性功能(先前没有被表征)控制PCa细胞存活的假设提供了另外的支持。
实例5
几种类固醇受体(SR)是高度同源的，包括AR、雌激素(ER)、孕酮(PR)、糖皮质激素(GR)和盐皮质素类(MR)受体。所有这些受体的配体激活形式识别并且结合至相同的DNA序列元件。＜.试图分离作用于受体-配体相互作用的下游的AR抑制性化合物(例如我们的筛选)可以在理论上导致能够抑制所有这些SR的分子的分离。ER或PR抑制不期望是一个对于PCa治疗的严重问题，因为这些受体不控制男性中的生活功能。但是，GR和MR体系在男性中是起作用的并且它们通过交叉反应的AR抑制剂的抑制可以引起不良副作用，尤其是慢性给药。
为了确定我们的AR抑制形化合物之一是否还抑制GR或MR，我们首先测试了用于我们筛选的CWR22RARE-Luc报道分子体系是否响应于除了雄激素以外的类固醇。这是一个要进行的重要实验，因为我们的文库筛选在FBS存在下进行，这可能包含GR和MR配体。我们用GR配体地塞米松(Dex)或MR配体醛固酮(Ald)处理在SFM中的CWR22RARE-Luc细胞并且在所选目标物存在或缺乏下测量荧光素酶活性。Dex和Ald都诱导了在CWR22R细胞中的ARE-Luc报道分子的活性。而且，所有选择的AR抑制性目标物抑制了这个活性并且抑制的程度与它们对DHT诱导的ARE-Luc活性的作用成比例(数据未显示)。
CWR22R细胞不仅表达ARΔLBD，还表达包含LBD突变的全长AR，这可能影响其配体特异性(图1)。为了测试观察的由Dex和Ald诱导的荧光素酶是否由于这些配体而活化AR，我们使用了AR特异性siRNA来阻断AR(ΔLBD和全长)在CWR22R细胞中的表达。与用对照siRNA转染的细胞相比，经过所有三种配体的DHT、Dex和Ald的ARE-Luc活化在这些细胞中被抑制，这说明在CWR22R细胞中存在的LBD-突变的AR的泛宿主性质(图5A)。这个实验证明了选择的目标物能够抑制AR，即使它被不同于DHT的配体刺激。同时，这些数据不能完全排除这些目标物影响其他细胞中的GR和/或MR活性的可能性。
为了进一步明晰我们的AR抑制性目标物是否影响其他SR，我们使用了根据文献表达GR、MR和AR的MDA-MB-453乳腺癌细胞(Zhou，C等人，2008，DBr J Pharmacol 154：440-45029)。我们用包含DNA结合元件(在其启动子区域中被所有三种SR识别)的MMTV-Luc报道分子构建体转染这些细胞。在这个体系中，除了c66的所有目标化合物都是DHT刺激的报道分子活性的特异性抑制剂，对Dex或Ald刺激的MMTV-Luc没有作用(图5B)。因此，我们得出的结论是，大部分选择的目标分子是特异性AR抑制剂，它们即使针对高度同源的GR和MR也没有活性(表1)。
实例6
五种目标化合物，代表ARTIS和ARTIK类别两者(c6、c11、c17、c52和c85)，被选择用于基于所有先前测定的体内试验。化合物c5由于非常低的微粒体稳定性而被淘汰(用大鼠微粒体孵育1小时之后＜5％)。在一个剂量递增测定中评价了化合物的毒性，其中雄性NIH瑞士小鼠(n＝4)接受三次连续的腹膜内(i.p.)注射每种化合物，递送以三天为间隔。第一个剂量对于CWR22R细胞中的化合物比体外IC50高20倍(20×IC50)，是基于小鼠体重重新计算的(见实例1)，第二个剂量和第三个剂量分别是50×IC50和100×IC50。在最后一次注射之后的那天，在每组中的一半小鼠被处死用于宏观病理学检查，并且收集血液用于血清生化测定，包括总蛋白、葡萄糖、胆红素、和肌酸酐水平、肝脏酶类活性、以及离子浓度。剩余的小鼠在最后注射化合物之后7天被处死并且进行类似评估。在任何注射化合物的小鼠中没有观察到任何异常情况，无论是视觉检查活小鼠还是宏观病理学检查。在几乎所有小鼠中在最后一次注射化合物之后的那天观察到血清葡萄糖浓度的微小降低(对照的70％-80％)，但是葡萄糖水平1周后正常(数据未显示)。低血清葡萄糖水平可能反映选择的化合物的较弱的短暂的GR抑制作用。但是总体上，这个实验证明了所测试的化合物剂量在小鼠中是无毒的，因此适合用于体内疗效测试。
我们使用裸鼠中的雄激素非依赖性PCa的C4-2和CWR22R异种移植模型评价了目标物的潜在抗肿瘤作用。C4-2荷瘤小鼠组(每组4-5只小鼠，每只小鼠有两个肿瘤)被给予了6天的化合物(100×IC50剂量)或DMSO载体的腹腔内注射。在这个治疗方案中，证明了化合物c6和c11明显抑制C4-2肿瘤生长，而c17、c52和c85不抑制其生长(图6A)。
还在CWR22R模型中测试了ARTIK化合物c52和c85。每日静脉注射五次剂量为18mg/kg/天(相当于200×IC50)的c52抑制了皮下CWR22R肿瘤的生长(图6B)，没有任何显著的不良副作用。未证明化合物c85可靠地抑制肿瘤生长。在用18mg/kg/天的c52治疗的10只小鼠中，2只小鼠中的肿瘤完全消失，1只小鼠中的肿瘤退化，5只小鼠中的肿瘤尺寸没有增长。相反，在10只对照动物中的9只显示出肿瘤进行性生长并且1只小鼠显示出肿瘤缓慢生长。
这些体内试验结果表明ARTIK和ARTIS两者的代表物(化合物c6、c11和c52)通常是无毒的，然而阻断雄激素非依赖性PCa肿瘤的生长，因此具有潜力作为对抗Pca和AR阳性BC的候选治疗剂。出于本披露的利益，有可能使用例行实验进行药理学优化来显著改进这些化合物的抗肿瘤效果以及揭示其他的在这些实验中不抑制肿瘤生长的目标化合物的体内效果。
实例7
本实例提出了抗AR阳性和AR阴性癌细胞以及非癌性细胞的化合物的作用的分析。具体而言，针对AR阳性乳腺癌细胞、AR阴性乳腺癌细胞、AR阳性前列腺癌细胞、AR阴性肾细胞癌、AR阴性宫颈细胞、以及AR阳性肝癌和正常肝细胞测试了这些化合物。在本实例中描述的实验基本按照实例1正所描述的进行。结果证明了在此所述的适合用于本发明的方法中的化合物在抑制AR阳性癌细胞的生长中是有效的，但是对AR阴性癌细胞无效。通过图解将这些结果概述于图12-20中。
根据本发明的前述说明和实例，本领域的技术人员将会清楚的是，为了鉴定用于治疗雄激素非依赖性(以及雄激素依赖性)PCa的新类型的AR抑制剂，我们筛选了针对缺乏LBD的AR(ARΔLBD)形式的小分子。其他AR结构域的靶向很少可能引起导致复发的突变的选择，因为大部分突变被期望导致结构域功能(例如反式激活、DNA结合、辅因子相互作用)的丧失。
我们的许多发现证明ARΔLBD是完全雄激素非依赖性的，然而保持了对于PCa细胞活性重要的所有AR功能：i)它从AR特异性前列腺碱性蛋白启动子激活pARE-Luc报道分子的表达(参见实例1)，ii)在缺乏AR的情况下CWR22R细胞不能存活，ARΔLBD的表达不足以支持这些细胞的正常增殖，以及iii)在雄激素存在下在SFM中的ARΔLBD的活性等于或优于野生型AR(在报道分子活性、核定位等的测定中)。这些数据确认了使用ARΔLBD作为鉴定新类型(不影响配体结合)的AR抑制剂的靶标，这些AR抑制剂能够干扰对于细胞存活是关键性的AR的功能并且具有广泛的抗不同AR变异体的活性。
我们采用的靶向AR的方法是基于不同的原理并且利用了不同于其他报告所描述的策略。Attar等人报道了新的非类固醇AR抑制剂的合理设计，这是基于结合至AR的LBD的比卡鲁胺的晶体结构的解析(Salvati等人，2005，Bioorg Med Chem Lett 15：271-276)。这些新抑制剂与比卡鲁胺相比具有改进的AR结合特性，并且尽管比卡鲁胺针对一些AR突变体形式是有效的，而新化合物对雄激素非依赖性PCa细胞更加有毒性。尽管如此，这个方法是靶向ARΔLBD的治疗的一个变体，因此很可能受到LBD可突变性的限制。
另一组发现在选择雄激素敏感性LNCaP细胞在缺乏雄激素下生长的能力时，最为普遍的遗传改变是AR基因的扩增(Nat Med 10：33-39)。＜.诸位作者假设观察到的扩增被选择，因为它通过增加每个细胞的AR分子的数目补偿了在缺乏配体下的AR的低活性同一组最近报道了他们将这些细胞用于选择具有抗雄激素非依赖性PCa的活性的小分子(Tran等人，2009，开发第二代抗雄激素用于治疗晚期前列腺癌(Development of asecond-generation antiandrogen for treatment of advanced prostate cancer)，Science 324：787-790)。在一个I期临床试验中，在具有去势抵抗性PCa的患者中已经证明了这个分子MDV3100在降低PSA水平中的效果。但是，MDV3100抗AR的活性的机制不同于我们认为的通过我们使用的方法分离的AR抑制剂的机制。MDV3100、以及其近同系物RD162，都是以高亲和力结合至AR LBD的AR的非竞争性拮抗剂。对于一种拮抗剂，MDV3100(和RD162)的结合亲和力最接近于到目前为止所获得的雄激素的亲和力。因此，相比于临床上可得的AR拮抗剂，如比卡鲁胺和氟他胺，这些化合物通过具有优越的效能的雄激素阻止AR的活化。另外，后者的分子被MDV3100或RD162没有显示的一部分激动活性所阻碍(Tran等人，2009，开发第二代抗雄激素用于治疗晚期前列腺癌(Development of asecond-generation antiandrogen for treatment of advanced prostate cancer)，Science 324：787-790)。这些新化合物的潜在问题可能来自以下事实：它们还结合LBD并且可能如康士得那样诱导LBD中的突变选择。
我们的筛选的意外发现之一是AR转录活性的丧失并不必然导致雄激素非依赖性PCa细胞的生长或存活的抑制。我们鉴定为AR依赖性转录的抑制剂的几乎所有分子也抑制LNCaP细胞的生长，由此证实了AR转录活性对于配体依赖的PCa细胞的生长是重要的。然而，仅有一些化合物对雄激素非依赖性PCa细胞的生长有作用(C4-2和CWR22R)。重要的是，确实抑制表达AR的所有PCa细胞(雄激素依赖性和非依赖性的)的生长的少数目标化合物作为AR依赖性转录的抑制剂并不必然比显示出对雄激素非依赖性PCa细胞的生长没有作用的分子更有效力。在筛选结果中AR依赖性转录的无毒抑制剂与有毒(引起死亡或生长停滞)抑制剂的重要比例表明AR依赖性转录的抑制并不唯一地决定毒性，至少对于雄激素非依赖性的PCa细胞来说是如此。这表明至今尚未表征的除了转录调节之外的AR的另一种功能对于PCa细胞的存活是重要的。这些结果还表明，AR的转录调节功能可以使用没有消除这个其他的假设的促存活功能的小分子而被特异性地抑制。
显示出针对雄激素非依赖性PCa的毒性的AR抑制性目标物的其他表征显示它们可以被清楚地分成两类，杀死PCa细胞的那些和仅仅抑制它们增殖的那些。另外，这些化合物对AR蛋白水平的作用与它们诱导的毒性的类型相关：引起AR蛋白的消除的化合物杀死雄激素非依赖性PCa细胞，而对AR水平没有影响的化合物仅仅抑制它们的生长。本数据可能再次由AR的转录非依赖性功能的存在来解释，AR的转录非依赖性功能控制PCa细胞的存活并且当AR蛋白从这些细胞中消除时才完全废除。
需要AR蛋白的消除，而不是仅仅抑制其反式激活功能来诱导前列腺癌细胞死亡的观点由对表达野生型AR的正常前列腺上皮细胞(相比于在LBD中的具有突变的表达AR的前列腺肿瘤细胞)的不同的去势作用所支持。野生型AR在缺乏雄激素下是不稳定的，尤其是如果其结合配偶体HSP90被限制的话。因此，去势导致AR蛋白的丧失以及正常前列腺上皮细胞的凋亡。相反，由于AR LBD突变不仅影响配体结合的特异性而且促进在缺乏雄激素下AR的稳定性，去势并不会杀死具有突变的LBD的许多PCa细胞，而仅仅是抑制它们的增殖。
控制PCa细胞存活的AR的转录非依赖性的作用的存在进一步由我们的发现所支持，我们的发现是shRNA介导的AR消除减少了PCa细胞的集落形成而反式激活缺乏的显性负性HD1-KRAB-AR122 AR突变体的表达并不减少PCa细胞的集落形成。因此，我们的数据支持AR可能具有先前没有认识到的影响前列腺细胞存活的转录非依赖性功能。
值得注意的是，尽管我们选择的AR抑制性目标物有效地杀死了PCa细胞并且其他的目标物具有较弱的抗增殖效果，来自这两个类别的化合物显示出抗小鼠PCa肿瘤模型的效果。两类化合物的体内抗肿瘤效果可以通过以下几种方式来解释：(i)化合物经历体内代谢转化，这使得它们在体内比在体外更有效力；(ii)化合物具有活性机制，这个活性机制对于体外PCa细胞存活不是关键性的，但是在体内是更重要的；和/或(iii)一些化合物的生长抑制作用足以使体内肿瘤生长停止。
对雄激素非依赖性PCa细胞在体外有毒性的许多化合物在我们检查的小鼠模型中对于体内肿瘤生长没有显著作用。对此有两种可能的解释：(i)这些化合物还没有在药理学上优化，但是可以基于本披露而没有不适当的实验；和/或(ii)这些化合物的作用机制在体内体外不是一样重要。化合物C52在我们用C4-2模型的实验中没有显示出体内效果，但是在我们用CWR22R肿瘤的实验中显示有效。这个差异可能是由于在后者的实验中我们使用了更高的化合物剂量和不同的给药途径(静脉注射和腹膜内注射)。静脉注射可以显著提高相对不稳定的化合物如c52(在与大鼠微粒体孵育1小时之后剩余17％的化合物)的生物利用度，这是通过避免发生在腹腔内注射中的通过肝脏的首过效应而实现的。因此，在C4-2模型中c52效果缺乏可能是由于该化合物较差的药理性质所致，这是本领域的技术人员可以基于本披露而着手解决的。
总之，我们鉴定了许多具有非常特异性的体外和体内抗PCa特性的AR抑制性化合物。这些化合物代表了一个新的AR抑制剂类别，因为它们并不靶向AR-配体相互作用。因此，有可能的是，它们针对AR阳性细胞是有效的，不论对标准抗雄激素治疗产生响应的LBD突变。因此，在本披露中测试的具体化合物所属的化学类别也被期望针对AR阳性癌症是有用的。

Claims (13)

1.一种抑制在被诊断为或怀疑患有AR阳性癌症的个体中的AR阳性癌细胞的方法，包括向该个体给予一种包含选自具有以下结构的化合物的组的化合物的组合物：
Figure FDA0000155469930000011
其中R21或R25是氢或者包含1至6个碳的烷基，其任选地被一个或多个羟基或氰基取代，
其中R22、R23和R24或R26、R27或R29各自独立地是氢、包含1至6个碳的烷基、其中烷基部分包含1至4个碳并且任选地被一种或多种卤化物取代的烷基酮基、卤化物、其中烷基基团包含1至4个碳的烷基磺酰胺、羟基、其中烷基部分包含1至4个碳的烷氧基、或者以下基团：
Figure FDA0000155469930000012
其中R31是任选地被一种或多种卤化物取代的包含1至6个碳的烷基、或者氨基，
其中R32是任选地被一种或多种卤化物取代的包含1至6个碳的烷基、或者氨基，
其中R33是任选地被一种或多种卤化物取代的包含1至6个碳的烷基、氨基、任选地被一种或多种卤化物取代的包含1至4个碳的烷基酮基、或者其中烷基部分包含1至4个碳的烷基环己基基团；
Figure FDA0000155469930000021
其中R35是氢，任选地被一种或多种卤化物取代的包含1至6个碳的烷基、或卤化物，
其中R36和R37各自独立地是氢或者任选地被一种或多种卤化物取代的包含1至6个碳的烷基，
其中R38和R39各自独立地是氢或者任选地被一种或多种卤化物取代的包含1至6个碳的烷基、或者羟基，并且
其中R40是氢或者羟基；
Figure FDA0000155469930000031
其中R5、R6和R7各自独立地是氢、包含1至6个碳的烷基、其中芳基部分包含5或6个碳并且烷基部分包含1至4个碳的芳基烷基、其中烷基部分包含1至4个碳的烷基酮基、卤化物、或羟基，
其中R3是氢或羟基，
其中R8、R9和R10各自独立地是氢，包含1至6个碳的烷基、卤化物、或者硝基，并且
其中X1是氧原子或硫原子；
其中R12、R13和R14各自独立地是氢、包含1至6个碳的烷基、其中烷基部分包含1至6个碳的烷基醚基、卤化物、氨基、羟基、或者硝基，并且
其中X2是氧原子或硫原子；
Figure FDA0000155469930000041
其中R17和R18各自独立地是氢、包含1至6个碳的烷基、或者其中烷基部分包含1至4个碳的烷基醚基。
其中R19和R20各自独立地是氢、包含1至6个碳的烷基、或者卤化物，并且
i)在-v)中所列出的这些化合物的组合；
其中在向该个体给予该组合物之后在该个体中的雄激素受体阳性癌症的生长受到抑制。
2.如权利要求1所述的方法，其中该化合物具有以下结构：
Figure FDA0000155469930000051
3.如权利要求1所述的方法，其中该化合物具有以下结构：
4.如权利要求1所述的方法，其中该化合物具有以下结构：
Figure FDA0000155469930000053
5.如权利要求1所述的方法，其中该化合物具有以下结构：
Figure FDA0000155469930000061
6.如权利要求1所述的方法，其中该化合物具有以下结构：
Figure FDA0000155469930000062
7.如权利要求1所述的方法，其中雄激素受体阳性癌细胞选自前列腺癌细胞、乳腺癌细胞、肝细胞癌细胞、甲状腺癌细胞、胶质母细胞瘤、或星形细胞瘤。
8.如权利要求1所述的方法，其中该个体被诊断为或怀疑患有雄激素受体阳性前列腺癌。
9.如权利要求8所述的方法，其中雄激素受体阳性前列腺癌为雄激素非依赖性前列腺癌。
10.如权利要求1所述的方法，其中该个体被诊断为或怀疑患有雄激素受体阳性乳腺癌。
11.一种鉴定一个个体是否为用包含权利要求1所述的一种化合物的组合物治疗的候选者的方法，该方法包括从该个体获得一种生物样品并且确定该样品是否包括雄激素受体阳性癌细胞，其中确定该生物样品包含雄激素受体阳性癌细胞指示该个体是该治疗的候选者，并且其中确定生物样品不包含雄激素受体阳性癌细胞指示该个体不是该治疗的候选者。
12.如权利要求11所述的方法，其中该生物样品包含雄激素受体阳性前列腺癌细胞。
13.如权利要求11所述的方法，其中该生物样品包含雄激素受体阳性乳腺癌细胞。
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