CN109394758A - 臭椿酮的药物用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了臭椿酮的一种药物用途，所述的药物用途是指以臭椿酮或其水合物、药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体、前体化合物中的至少一种作为活性成分用于制备复制应激的靶向治疗药物。实验表明：臭椿酮能够抑制DNA复制，对复制应激导致疾病尤其是感染性疾病和恶性肿瘤具有显著的治疗作用，可望开发为制备复制应激的靶向治疗药物，具有重要药用价值。

Description

臭椿酮的药物用途

技术领域

本发明涉及臭椿酮的一种药物用途，具体说，是涉及臭椿酮在用于制备复制应激的靶向治疗药物中的用途，属于医药技术领域。

背景技术

根据中国肿瘤登记年报显示，全国每天约有1万人被确诊为癌症，每分钟大约7人，并且肿瘤的发生率和死亡率逐年增加，因此恶性肿瘤已严重影响我国人民的生命健康。手术、放疗、化疗是目前治疗恶性肿瘤的三大治疗方法，手术治疗不能完全抑制其发生转移，放疗和化疗在将恶性肿瘤清除的同时损坏了人体的正常细胞尤其是免疫细胞，因此这三种治疗方法都有相应的弊端或毒副作用，因此，寻找新的治疗恶性肿瘤的方法成为必然趋势。

靶向治疗是指以标准化的生物标志物来识别是否存在某种疾病特定的控制肿瘤生长的基因或基因谱，以此确定针对特异性靶点的治疗方法。在肿瘤治疗中，靶向治疗是一种特异性的从几个方面阻断肿瘤生长相关信号通路的系统治疗方法，靶向治疗具有疗效好、不良反应轻、易于被患者接受等优点，目前正成为放化疗以外的一种新的临床治疗手段。靶向药物的治疗靶点有人抑癌基因p53、表皮生长因子(EGFR)、血管内皮生长因子(VEGF)、间变性淋巴瘤激酶(ALK)、程序性死亡受体1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTAL-4)等。DNA复制过程是生物遗传的基础，其精确性也是遗传物质准确传递给后代的保证。在肿瘤的发生发展中DNA的复制扮演着重要角色，细胞的致癌基因发生突变或抑癌基因受到抑制都会引发复制应激(replication stress)，这是基因组不稳定的来源，也是癌变前细胞和癌变细胞的重要标志。复制应激通常会引发p53介导的衰亡进程，或者细胞凋亡，用以预防肿瘤发生。然而某些细胞能克服持续性复制应激，越过p53途径，导致细胞无限增殖进而发展成恶性肿瘤。因此，复制应激已成为肿瘤治疗的重要新靶点。

随着中医药在临床应用越来越广泛，中药在抗肿瘤方面也成为了研究的热点，以中药为代表的天然药物是我们的巨大的药物库资源，目前临床用药约有50％来源于天然的小分子化合物，即中药有效成分。因此，从中药中发现靶向复制应激的药物是抗感染和抗肿瘤新药研发的有效途径。

臭椿(Ailanthus altissima)为苦木科臭椿属落叶乔木，因叶基部腺点发散臭味而得名。臭椿树皮、根皮、果实均可入药，具有清热燥湿、收涩止带、止泻、止血之功效。我们的研究发现臭椿皮提取物能够有效抑制肺癌细胞生长，其活性成分臭椿酮具有相似的功能。臭椿酮，英文名称：Ailanthone，分子式：C₂₀H₂₄O₇，分子量为376.405，CAS登录号为981-15-7，化学结构式为：

虽然已有研究报道臭椿酮具有抗菌、抗原虫作用，对人体鼻咽癌(KB)细胞有细胞毒活性，对淋巴细胞白血病P388显示一定的活性，可以通过抑制细胞周期并引起凋亡从而对人肝癌细胞Huh7产生抑制作用，同时中国专利(申请号为201410186500.9、名称为：臭椿酮在制备治疗前列腺疾病的药物中的应用)中公开了臭椿酮具有治疗前列腺癌的作用。但是目前还没有臭椿酮做为复制应激的靶向治疗药物用于肿瘤和其它复制应激相关疾病的治疗方面的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供臭椿酮在用于制备复制应激的靶向治疗药物中的用途，以拓宽臭椿酮的应用范围。

本发明所述的臭椿酮的药物用途，是指以臭椿酮或其水合物、药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体、前体化合物中的至少一种作为活性成分用于制备复制应激的靶向治疗药物。

作为优选方案，所述的臭椿酮的药物用途，是指以臭椿酮或其水合物、药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体、前体化合物中的至少一种作为活性成分用于制备抗复制应激导致的感染性疾病或恶性肿瘤的药物。

作为进一步优选方案，所述的臭椿酮的药物用途，是指以臭椿酮或其水合物、药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体、前体化合物中的至少一种作为活性成分用于制备以抑制DNA复制为靶点的抗复制应激导致的感染性疾病或恶性肿瘤的药物。

作为更进一步优选方案，所述的臭椿酮的药物用途，是指以臭椿酮或其水合物、药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体、前体化合物中的至少一种作为活性成分用于制备抗复制应激导致的结核性感染的药物。

作为更进一步优选方案，所述的臭椿酮的药物用途，是指以臭椿酮或其水合物、药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体、前体化合物中的至少一种作为活性成分用于制备抗复制应激导致的非小细胞肺癌、骨肉瘤、胰腺癌、食管癌、胃癌、肠癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、脑肿瘤、淋巴瘤、白血病中的任意一种疾病的药物。

所述臭椿酮可通过化学合成或从植物中提取得到；作为优选方案，所述臭椿酮从苦木科植物臭椿的树皮中提取分离得到。

本发明所述的药物可以各种给药途径给予患者，包括但不限于口服、透皮、肌肉、皮下和静脉注射。

本发明所述的药物的剂型不限，只要是能够使活性成分有效地到达体内的剂型都可以，包括：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂等；优选口服剂型，如：胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等。

本发明所述药物中，除了含有主要活性成分之外，还可含有少量的且不影响有效成分的次要成分和/或药学上可接受的载体以及各种制剂所必要的辅料等。例如，所述药物为口服剂型时，可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。适宜的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂；适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠；适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁；适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。

本发明中所述术语的定义如下：

术语“药学上可接受的盐”是指所述化合物与药学上可接受的无机酸或有机酸所形成的盐，所述的无机酸包括但不限于：盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸；所述的有机酸包括但不限于：甲酸、乙酸、丙酸、丁二酸、1,5-萘二磺酸、亚细亚酸、草酸、酒石酸、乳酸、水杨酸、苯甲酸、戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、庚二酸、己二酸、马来酸、苹果酸、氨基磺酸、苯丙酸、葡糖酸、抗坏血酸、烟酸、异烟酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸，以及氨基酸；所述“药学上可接受的”是指适用于人而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)，即有合理的效益/风险比的物质。

术语“互变异构体”是指因分子中某一原子在两个位置迅速移动而产生的官能团异构体，例如：烯醇与相应的酮。

术语“立体异构体”是指由分子中原子在空间上排列方式不同所产生的异构体，例如：顺反异构体、对映异构体、构象异构体等。

术语“前体化合物”是指在体外无活性，但能够在生物体内进行代谢或化学反应转化为本发明的活性成分，从而发挥其药理作用的化合物。

与现有技术相比，本发明具有如下显著性有益效果：

本发明的研究结果显示：臭椿酮在体外可以通过抑制DNA复制从而明显抑制复制应激导致的恶性肿瘤细胞的活性和增殖以及结核菌生长；尤其是，臭椿酮在体内实验中可以明显抑制复制应激导致的恶性肿瘤皮下瘤及原位瘤的生长。这表明臭椿酮对复制应激导致疾病尤其是恶性肿瘤和感染性疾病具有显著的治疗作用，可望作为活性成分用于制备复制应激的靶向治疗药物，尤其是用于制备抗复制应激导致的感染性疾病和恶性肿瘤的药物。

附图说明

图1体现了不同浓度的臭椿酮干预24h后对于肺腺癌A549细胞活性的影响；

图2体现了不同浓度的臭椿酮干预24h后对于非小细胞肺癌H1299细胞活性的影响；

图3体现了不同浓度的臭椿酮干预24h后对于非小细胞肺癌H1975细胞活性的影响；

图4体现了不同浓度的臭椿酮干预24h后对于骨肉瘤Saos-2细胞活性的影响；

图5体现了不同浓度的臭椿酮干预24h后对于食管癌Eca109细胞活性的影响；

图6体现了不同浓度的臭椿酮干预24h后对于胃癌BGC823细胞活性的影响；

图7体现了不同浓度的臭椿酮干预24h后对于卵巢癌SKOV-3细胞活性的影响；

图8体现了不同浓度的臭椿酮干预24h后对于甲状腺癌SW579细胞活性的影响；

图9体现了不同浓度的臭椿酮干预24h后对于淋巴瘤Raji细胞活性的影响；

图10体现了不同浓度的臭椿酮干预24h后对于白血病CML细胞活性的影响；

图11体现了不同浓度的臭椿酮对结核杆菌H37Ra活性的影响；

图12体现了不同浓度的臭椿酮在共培育24小时后对非小细胞肺癌细胞DNA复制的影响；

图13体现了不同浓度的臭椿酮在共培育24小时后对非小细胞肺癌细胞DNA复制S期的影响；

图14体现了不同浓度的臭椿酮在共培育48小时后对非小细胞肺癌的细胞周期的影响；

图15体现了不同浓度的臭椿酮在共培养12小时后对非小细胞肺癌凋亡的影响；

图16体现了不同浓度的臭椿酮在共培育24小时后对非小细胞肺癌细胞A549PCNA、RPA1、POLE2、LIG1四种基因mRNA的影响；

图17体现了不同浓度的臭椿酮在共培育24小时后对非小细胞肺癌细胞H1299PCNA、RPA1、POLE2、LIG1四种基因mRNA的影响；

图18体现了不同浓度的臭椿酮在共培育24小时后对非小细胞肺癌细胞H1975PCNA、RPA1、POLE2、LIG1四种基因mRNA的影响；

图19体现了不同浓度的臭椿酮在共培育24小时后对非小细胞肺癌细胞A549PCNA、RPA1两种基因蛋白水平的影响；

图20体现了不同浓度的臭椿酮在共培育24小时后对非小细胞肺癌细胞H1299PCNA、RPA1两种基因蛋白水平的影响；

图21体现了不同浓度的臭椿酮在共培育24小时后对非小细胞肺癌细胞H1975PCNA、RPA1两种基因蛋白水平的影响；

图22体现了不同浓度的臭椿酮在共培育24小时后对A549及H1299 RPA1过表达细胞活性的影响；

图23体现了臭椿酮用药组与对照组在不同时间点对A549荷瘤小鼠细胞肿瘤大小的影响；

图24体现了臭椿酮用药组与对照组在不同时间点对H1975荷瘤小鼠细胞肿瘤大小的影响；

图25体现了臭椿酮用药组与对照组在不同时间点对A549-luciferase原位荷瘤小鼠细胞肿瘤大小的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

本发明中所述的臭椿酮可从云南西力生物技术有限公司购得，用DMSO溶解，在-20℃下存放备用。

实施例1：考察臭椿酮对肺腺癌细胞A549生长的影响

用不同浓度臭椿酮与肺腺癌细胞A549共培育24小时，用噻唑蓝(MTT)实验检测活细胞数目，具体测试结果见表1和图1所示。

表1臭椿酮对A549细胞活性的影响(％)

图1体现了不同浓度的臭椿酮药物处理24h对非小细胞肺癌细胞A549的细胞活性的影响，图中A、B、C、D、E、F、G、H、I、J依次代表臭椿酮的药物浓度为0、0.078、0.156、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20μM。

结合表1和图1可见：随着臭椿酮剂量增加，臭椿酮对非小细胞肺癌细胞A549的抑制作用越显著，具有明显的剂量依赖性。

实施例2：考察臭椿酮对非小细胞肺癌细胞H1299生长的影响

用不同浓度臭椿酮与非小细胞肺癌细胞H1299共培育24小时，用噻唑蓝(MTT)实验检测活细胞数目，具体测试结果见表2和图2所示。

表2臭椿酮对H1299细胞活性的影响(％)

图2体现了不同浓度的臭椿酮药物处理24h对非小细胞肺癌细胞H1299的细胞活性的影响，图中A、B、C、D、E、F、G、H、I、J依次代表臭椿酮的药物浓度为0、0.078、0.156、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20μM。

结合表2和图2可见：随着臭椿酮剂量的增加，臭椿酮对非小细胞肺癌细胞H1299的抑制作用越显著，具有明显的剂量依赖性。

实施例3：考察臭椿酮对非小细胞肺癌细胞H1975生长的影响

用不同浓度臭椿酮与非小细胞肺癌细胞H1975共培育24小时，用噻唑蓝(MTT)实验检测活细胞数目，具体测试结果见表3和图3所示。

表3臭椿酮对H1975细胞活性的影响(％)

图3体现了不同浓度的臭椿酮药物处理24h对非小细胞肺癌细胞H1975的细胞活性的影响，图中A、B、C、D、E、F、G、H、I、J依次代表臭椿酮的药物浓度为0、0.078、0.156、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20μM。

结合表3和图3可见：随着臭椿酮剂量的增加，臭椿酮对非小细胞肺癌细胞H1975的抑制作用越显著，具有明显的剂量依赖性。

由实施例1至3的结果可知：臭椿酮对多种非小细胞肺癌都具有明显的抑制作用并存在时间和剂量依赖性。

实施例4：考察臭椿酮对骨肉瘤细胞Saos-2生长的影响

用不同浓度臭椿酮与骨肉瘤细胞Saos-2共培育24小时，用噻唑蓝(MTT)实验检测活细胞数目，具体测试结果见表4和图4所示。

表4臭椿酮对Saos-2细胞活性的影响(％)

图4体现了不同浓度的臭椿酮药物处理24h对骨肉瘤细胞Saos-2的细胞活性的影响，图中A、B、C、D、E、F、G、H、I、J依次代表臭椿酮的药物浓度为0、0.078、0.156、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20μM。

结合表4和图4可见：随着臭椿酮剂量的增加，臭椿酮对骨肉瘤细胞Saos-2的抑制作用越显著，具有明显的剂量依赖性。

实施例5：考察臭椿酮对食管癌细胞Eca109生长的影响

用不同浓度臭椿酮与食管癌细胞Eca109共培育24小时，用噻唑蓝(MTT)实验检测活细胞数目，具体测试结果见表5和图5所示。

表5臭椿酮对Eca109细胞活性的影响(％)

图5体现了不同浓度的臭椿酮药物处理24h对食管癌细胞Eca109的细胞活性的影响，图中A、B、C、D、E、F、G、H、I、J依次代表臭椿酮的药物浓度为0、0.078、0.156、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20μM。

结合表5和图5可见：随着臭椿酮剂量的增加，臭椿酮对食管癌细胞Eca109的抑制作用越显著，具有明显的剂量依赖性。

实施例6：考察臭椿酮对胃癌细胞BGC823生长的影响

用不同浓度臭椿酮与胃癌细胞BGC823共培育24小时，用噻唑蓝(MTT)实验检测活细胞数目，具体测试结果见表6和图6所示。

表6臭椿酮对BGC823细胞活性的影响(％)

图6体现了不同浓度的臭椿酮药物处理24h对胃癌细胞BGC823的细胞活性的影响，图中A、B、C、D、E、F、G、H、I、J依次代表臭椿酮的药物浓度为0、0.078、0.156、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20μM。

结合表6和图6可见：随着臭椿酮剂量的增加，臭椿酮对胃癌细胞BGC823的抑制作用越显著，具有明显的剂量依赖性。

实施例7：考察臭椿酮对卵巢癌细胞SKOV-3生长的影响

用不同浓度臭椿酮与卵巢癌细胞SKOV-3共培育24小时，用噻唑蓝(MTT)实验检测活细胞数目，具体测试结果见表7和图7所示。

表7臭椿酮对SKOV-3细胞活性的影响(％)

图7体现了不同浓度的臭椿酮药物处理24h对卵巢癌细胞SKOV-3的细胞活性的影响，图中A、B、C、D、E、F、G、H、I、J依次代表臭椿酮的药物浓度为0、0.078、0.156、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20μM。

结合表7和图7可见：随着臭椿酮剂量的增加，臭椿酮对卵巢癌细胞SKOV-3的抑制作用越显著，具有明显的剂量依赖性。

实施例8：考察臭椿酮对甲状腺癌细胞SW579生长的影响

用不同浓度臭椿酮与甲状腺癌细胞SW579共培育24小时，用噻唑蓝(MTT)实验检测活细胞数目，具体测试结果见表8和图8所示。

表8臭椿酮对SW579细胞活性的影响(％)

图8体现了不同浓度的臭椿酮药物处理24h对甲状腺癌细胞SW579的细胞活性的影响，图中A、B、C、D、E、F、G、H、I、J依次代表臭椿酮的药物浓度为0、0.078、0.156、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20μM。

结合表8和图8可见：随着臭椿酮剂量的增加，臭椿酮对甲状腺癌细胞SW579的抑制作用越显著，具有明显的剂量依赖性。

实施例9：考察臭椿酮对淋巴瘤细胞Raji生长的影响

用不同浓度臭椿酮与淋巴瘤细胞Raji共培育24小时，用噻唑蓝(MTT)实验检测活细胞数目，具体测试结果见表9和图9所示。

表9臭椿酮对Raji细胞活性的影响(％)

图9体现了不同浓度的臭椿酮药物处理24h对淋巴瘤细胞Raji的细胞活性的影响，图中A、B、C、D、E、F、G、H、I、J依次代表臭椿酮的药物浓度为0、0.078、0.156、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20μM。

结合表9和图9可见：随着臭椿酮剂量的增加，臭椿酮对淋巴瘤细胞Raji的抑制作用越显著，具有明显的剂量依赖性。

实施例10：考察臭椿酮对白血病细胞CML生长的影响

用不同浓度臭椿酮与白血病细胞CML共培育24小时，用噻唑蓝(MTT)实验检测活细胞数目，具体测试结果见表10和图10所示。

表10臭椿酮对CML细胞活性的影响(％)

图10体现了不同浓度的臭椿酮药物处理24h对白血病细胞CML的细胞活性的影响，图中A、B、C、D、E、F、G、H、I、J依次代表臭椿酮的药物浓度为0、0.078、0.156、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20μM。

结合表10和图10可见：随着臭椿酮剂量的增加，臭椿酮对白血病细胞CML的抑制作用越显著，具有明显的剂量依赖性。

由实施例1至10的结果可知：臭椿酮对多种恶性肿瘤都具有明显的抑制作用并存在时间和剂量依赖性。

实施例11：考察臭椿酮对结核分枝杆菌H37Ra的影响

用不同浓度的臭椿酮处理PMA诱导分化的THP-1 48h后收集细胞，裂解释放胞内菌，涂板，20天后观察菌落形成及直接抑制作用，具体测试结果见表11和图11所示。

表11臭椿酮对H37Ra的活性影响

图11体现了不同浓度的臭椿酮药物处理20天对结核分枝杆菌H37Ra活性的影响，图中A、B、C、D依次代表臭椿酮的药物浓度为0、5、10、20nM。

结合表11和图11可见：随着药物浓度的增加，臭椿酮对结核分枝杆菌H37Ra的抑制作用越显著，具有明显的抑菌作用。

实施例12：考察臭椿酮对非小细胞肺癌DNA复制的影响

用不同的臭椿酮浓度处理非小细胞肺癌A549、H1299、H1975三种细胞24h后，使用Brdu-labeling进行标记再进行Brdu-FITC及PI抗体染色后上流式仪进行流式检测，具体测试结果见图12和图13所示。

图12体现了不同浓度的臭椿酮在共培育24小时后对非小细胞肺癌细胞DNA复制的影响，图中A、B、C、D、E依次代表臭椿酮的药物浓度为0、0.625、1.25、2.5、5μM处理A549细胞24h；F、G、H、I、J依次代表臭椿酮的药物浓度为0、0.625、1.25、2.5、5μM理H1299细胞24h；K、L、M、N、O依次代表臭椿酮的药物浓度为0、0.625、1.25、2.5、5μM处理H1975细胞24h；R1、R2、R3、R4分别代表S期、G0/G1期、G2+M期、sub-G1期。

图13体现了不同的臭椿酮浓度处理三种非小细胞肺癌24h后对Brdu实验中S期的影响，图13-a中A、B、C、D、E依次代表臭椿酮的药物浓度为0、0.625、1.25、2.5、5μM处理A549细胞24h后S期的比例；图13-b中F、G、H、I、J依次代表臭椿酮的药物浓度为0、0.625、1.25、2.5、5μM处理H1299细胞24h后S期的比例；图13-c中K、L、M、N、O依次代表臭椿酮的药物浓度为0、0.625、1.25、2.5、5μM处理H1975细胞24h后S期的比例。

由图12和图13可见：随着药物浓度的增加，A549、H1299、H1975三种细胞的S期比例明显减少，由此可以判断臭椿酮抑制了三种细胞DNA的复制。

实施例13：考察臭椿酮对非小细胞肺癌细胞周期的影响

用不同的臭椿酮浓度处理A549、H1299、H1975三种细胞48h后，使用细胞周期试剂盒处理后上流式进行检测，具体测试结果见图14所示。

图14体现了不同臭椿酮浓度对三种非小细胞肺癌细胞周期的影响，图中A至E代表臭椿酮干预A549的细胞周期实验结果，A、B、C、D、E依次代表臭椿酮的药物浓度为0、0.625、1.25、2.5、5μM；F至J代表臭椿酮干预H1299的细胞周期实验结果，F、G、H、I、J依次代表臭椿酮的药物浓度为0、0.625、1.25、2.5、5μM；K至O代表臭椿酮干预H1975的细胞周期实验结果，K、L、M、N、O依次代表臭椿酮的药物浓度为0、0.625、1.25、2.5、5μM。

由图14可见：臭椿酮对于A549和H1299的细胞周期并没有明显的抑制或改变，而对于H1975细胞周期虽然有一定的G1期阻滞，但是并没有浓度依赖性，因此可以推断臭椿酮对非小细胞肺癌的细胞周期并无显著影响。

实施例14：考察臭椿酮对非小细胞肺癌细胞凋亡的影响

用不同的臭椿酮浓度处理A549、H1299、H1975三种细胞12h后，使用Annexin V-FITC及PI进行染色处理后上流式进行检测，具体测试结果见图15所示。

图15体现了不同臭椿酮浓度对三种非小细胞肺癌细胞凋亡的影响，图中A至E代表臭椿酮干预A549的细胞凋亡实验结果，A、B、C、D、E依次代表臭椿酮的药物浓度为0、0.625、1.25、2.5、5μM；F至J代表臭椿酮干预H1299的细胞凋亡实验结果，F、G、H、I、J依次代表臭椿酮的药物浓度为0、0.625、1.25、2.5、5μM；K至O代表臭椿酮干预H1975的细胞凋亡实验结果，K、L、M、N、O依次代表臭椿酮的药物浓度为0、0.625、1.25、2.5、5μM。

由图15可见：臭椿酮对于A549和H1299的细胞并没有明显的增加早期或晚期凋亡的比例，只有在处理H1975细胞后存在一定的早期凋亡比例的增加，由此可以推断臭椿酮只能诱导H1975细胞发生凋亡，而对于A549及H1299则没有明显影响，因此细胞凋亡也不是臭椿酮抑制非小细胞肺癌的主要手段。

实施例15：臭椿酮对非小细胞肺癌DNA损伤标志物γ-H2AX的影响

用不同臭椿酮药物处理A549、H1299、H1975细胞24h，4％多聚甲醛固定，0.5％Triton X 100 PBS透膜，一抗4度孵育过夜，二抗室温1h，DAPI染色20分钟后激光共聚焦进行拍照，喜树碱(CPT 10μM)作为阳性对照，分别考察药物浓度为0、0.625、1.25、2.5、5μM的椿酮药物对A549 DNA损伤标志物γ-H2AX、H1299 DNA损伤标志物γ-H2AX和H1975DNA损伤标志物γ-H2AX的影响。

实验结果显示：臭椿酮对于A549并没有出现代表γ-H2AX的绿色荧光出现，说明臭椿酮并不引起A549细胞DNA损伤，而对于H1299及H1975则会引起DNA损伤并且随着药物浓度的增加，DNA损伤的强度也增强；由此可以推断，DNA损伤也不是非小细胞肺癌细胞受到抑制所必需的，尤其是对p53野生型的A549细胞DNA没有损伤。

由实施例12至15的结果可知：臭椿酮可以通过抑制DNA复制从而抑制非小细胞肺癌的增殖。

实施例16：臭椿酮对非小细胞肺癌PCNA、RPA1、POLE2、LIG1四种基因mRNA水平的影响

用不同的臭椿酮浓度处理A549、H1299、H1975三种细胞24h后提取RNA定量后进行real time PCR检测，具体测试结果见图16、图17和图18所示。

图16体现了1.25μM的臭椿酮浓度处理A549细胞24h后PCNA、RPA1、POLE2、LIG1四种基因mRNA水平的影响，图中A、B代表臭椿酮0和1.25μM处理A549细胞24h后PCNA mRNA水平的表达情况；C、D代表臭椿酮0和1.25μM处理A549细胞24h后RPA1mRNA水平的表达情况；E、F臭椿酮0和1.25μM处理A549细胞24h POLE2mRNA水平的表达情况；G、H臭椿酮0和1.25μM处理A549细胞24h后LIG1mRNA水平的表达情况。

图17体现了1.25μM的臭椿酮浓度处理H1299细胞24h后PCNA、RPA1、POLE2、LIG1四种基因mRNA水平的影响，图中A、B代表臭椿酮0和1.25μM处理H1299细胞24h后PCNA mRNA水平的表达情况；C、D代表臭椿酮0和1.25μM处理H1299细胞24h后RPA1mRNA水平的表达情况；E、F臭椿酮0和1.25μM处理H1299细胞24h POLE2mRNA水平的表达情况；G、H臭椿酮0和1.25μM处理H1299细胞24h后LIG1mRNA水平的表达情况。

图18体现了1.25μM的臭椿酮浓度处理H1975细胞24h后PCNA、RPA1、POLE2、LIG1四种基因mRNA水平的影响，图中A、B代表臭椿酮0和1.25μM处理H1975细胞24h后PCNA mRNA水平的表达情况；C、D代表臭椿酮0和1.25μM处理H1975细胞24h后RPA1mRNA水平的表达情况；E、F臭椿酮0和1.25μM处理H1975细胞24h POLE2mRNA水平的表达情况；G、H臭椿酮0和1.25μM处理H1975细胞24h后LIG1mRNA水平的表达情况。

图16、图17、图18中*代表p<0.05；**代表p<0.01；***代表p<0.001；ns代表没有统计学意义。

由图16、图17和图18可见：臭椿酮处理A549和H1975 24h后四种基因的mRNA水平显著下调，而臭椿酮处理H1299 24h后只有PCNA和RPA1两种基因的mRNA水平显著下调，POLE2、LIG1两种基因则是没有明显改变，由此可以判断臭椿酮在参与非小细胞肺癌DNA抑制过程主要是抑制PCNA和RPA1两种基因。

实施例17：臭椿酮对非小细胞肺癌PCNA、RPA1两种基因蛋白水平表达的影响

用不同的臭椿酮浓度处理A549、H1299、H1975三种细胞24h后提取蛋白定量后进行western blot检测，以β-actin蛋白作为内参，具体测试结果见图19、图20和图21所示。

图19体现了不同臭椿酮浓度处理A549细胞24h后PCNA和RPA1两种基因蛋白水平的影响，图19-a体现了不同臭椿酮浓度处理A549细胞24h后PCNA和RPA1两种基因蛋白水平的定性影响，图19-b和图19-c体现了不同臭椿酮浓度处理A549细胞24h后PCNA和RPA1两种基因蛋白水平的定量影响，图19-a中A、B、C、D分别代表臭椿酮的浓度为0、0.625、1.25、2.5μM；图19-b中E、F、G、H分别代表臭椿酮处理A549细胞24h后RPA1灰度值的统计结果；图19-c中I、J、K、L分别代表臭椿酮处理A549细胞24h后PCNA灰度值的统计结果。

图20体现了不同臭椿酮浓度处理H1299细胞24h后PCNA和RPA1两种基因蛋白水平的影响，图20-a体现了不同臭椿酮浓度处理H1299细胞24h后PCNA和RPA1两种基因蛋白水平的定性影响，图20-b和图20-c体现了不同臭椿酮浓度处理H1299细胞24h后PCNA和RPA1两种基因蛋白水平的定量影响，图20-a中A、B、C、D分别代表臭椿酮的浓度为0、0.625、1.25、2.5μM；图20-b中E、F、G、H分别代表臭椿酮处理H1299细胞24h后RPA1灰度值的统计结果；图20-c中I、J、K、L分别代表臭椿酮处理H1299细胞24h后PCNA灰度值的统计结果。

图21体现了不同臭椿酮浓度处理H1975细胞24h后PCNA和RPA1两种基因蛋白水平的影响，图21-a体现了不同臭椿酮浓度处理H1975细胞24h后PCNA和RPA1两种基因蛋白水平的定性影响，图21-b和图21-c体现了不同臭椿酮浓度处理H1975细胞24h后PCNA和RPA1两种基因蛋白水平的定量影响，图21-a中A、B、C、D分别代表臭椿酮的浓度为0、0.625、1.25、2.5μM；图21-b中E、F、G、H分别代表臭椿酮处理H1975细胞24h后RPA1灰度值的统计结果；图21-c中I、J、K、L分别代表臭椿酮处理H1975细胞24h后PCNA灰度值的统计结果。

图19、图20、图21中*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001。

由图19、图20、图21可见：在臭椿酮处理三种非小细胞肺癌后，RPA1和PCNA的蛋白水平显著降低并存在浓度依赖性。

实施例18：臭椿酮对非小细胞肺癌RPA1过表达细胞活性的影响

通过构建RPA1过表达质粒及电转使得A549、H1299细胞RPA1过表达，用不同浓度臭椿酮与RPA1过表达细胞共培育24小时，用噻唑蓝(MTT)实验检测活细胞数目，以β-actin蛋白作为内参，具体测试结果见图22所示。

图22体现了不同臭椿酮药物浓度处理RPA1过表达细胞24h后细胞活性的影响，图22-a和图22-b体现了不同臭椿酮药物浓度处理RPA1过表达细胞24h后细胞活性的定性影响，图22-c和图22-d体现了不同臭椿酮药物浓度处理RPA1过表达细胞24h后细胞活性的定量影响，图22-a中a、b分别代表A549细胞RPA1过表达组和对照组蛋白水平，图22-b中c、d分别代表H1299细胞RPA1过表达组和对照组蛋白水平，图22-c中A、B分别代表A549对照组及RPA1过表达组，图22-d中C、D分别代表H1299对照组及RPA1过表达组。

图22中*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001。

由图22可见：在A549及H1299 RPA1过表达的细胞中，RPA1蛋白水平明显提升，说明RPA1过表达细胞构建成功，而在这两种RPA1过表达的细胞中臭椿酮抑制细胞活性的功能受到抑制，细胞活性明显增强，由此可以证实臭椿酮抑制非小细胞肺癌DNA复制的靶点确实是RPA1。

实施例19：体内研究

19.1：臭椿酮对非小细胞肺癌细胞A549的体内研究

将A549(5×10⁶细胞/只)通过皮下接种在10只裸鼠的上背部，待肿瘤直径达3～5mm(约7天)，将臭椿酮通过腹腔注射给予其中的4只小鼠，剂量为2mg/kg，以形成用药组的5个平行样；并将DMSO通过腹腔注射给予另外5只小鼠，DMSO用量与臭椿酮用量体积相等，以形成对照组的5个平行样；给药频率为每三天给药一次，每三天用游标卡尺测量肿瘤大小，55天后处死小鼠，观察肿瘤大小，具体测试结果见表12和图23所示。

表12臭椿酮和对照组对A549肿瘤生长大小的影响对比(平均瘤块大小mm³)

图23体现了臭椿酮用药组与对照组在不同时间点对A549荷瘤小鼠细胞肿瘤大小的影响；图中A代表对照组，B代表臭椿酮用药组。

结合表12和图23可见：臭椿酮在体内抑瘤实验中可以明显抑制非小细胞肺癌细胞A549荷瘤小鼠的瘤块生长。

19.2：臭椿酮对非小细胞肺癌细胞H1975的体内研究

将H1975(3×10⁶细胞/只)通过皮下接种在10只裸鼠的上背部，待肿瘤直径达3～5mm(约3天)，将臭椿酮通过腹腔注射给予其中的5只小鼠，剂量为1mg/kg，以形成用药组的5个平行样；并将DMSO通过腹腔注射给予另外5只小鼠，DMSO用量与臭椿酮用量体积相等，以形成对照组的5个平行样；给药频率为每三天给药一次，每三天用游标卡尺测量肿瘤大小，23天后处死小鼠，观察肿瘤大小，具体测试结果见表13和图24所示。

表13臭椿酮和对照组对H1975肿瘤生长大小的影响对比(平均瘤块大小mm³)

图24体现了臭椿酮用药组与对照组在不同时间点对H1975荷瘤小鼠细胞肿瘤大小的影响，图中A代表对照组，B代表臭椿酮用药组。

结合表13和图24可见：臭椿酮在体内抑瘤实验中可以明显抑制非小细胞肺癌细胞H1975荷瘤小鼠的瘤块生长。

19.3：臭椿酮对A549-luciferase的体内研究

将A549-luciferase(1×10⁶细胞/只)通过原位造模接种在SCID-bg小鼠左侧肺部，第四天通过腹腔注射发光底物进行活体成像后按照发光值随机分为两组，将臭椿酮通过腹腔注射给予其中的5只小鼠，剂量为2mg/kg，以形成用药组的5个平行样；并将DMSO通过腹腔注射给予另外4只小鼠，DMSO用量与臭椿酮用量体积相等，以形成对照组的4个平行样。给药频率为每三天给药一次，之后每周进行活体成像一次直至小鼠死亡，具体测试结果见表14和图25所示。

表14臭椿酮和对照组对A549-luciferase肿瘤生长大小的影响对比(平均瘤块大小mm³)

图25体现了臭椿酮用药组与对照组在不同时间点对A549-luciferase原位荷瘤小鼠细胞肿瘤大小的影响，图中A代表对照组，B代表臭椿酮用药组。

结合表14和图25可见：臭椿酮在进一步模拟人体肺癌模型A549-luciferase原位模型中也存在明显抑制肿瘤生长。

综上所述：臭椿酮在体外可以明显抑制结核分枝杆菌生长及非小细胞肺癌、骨肉瘤、食管癌、胃癌、卵巢癌、甲状腺癌、淋巴瘤、白血病等恶性肿瘤细胞的活性和增殖，尤其是可通过抑制DNA复制为靶点实现对非小细胞肺癌的明显抑制作用；另外，臭椿酮在体内实验中可以明显抑制复制应激导致的恶性肿瘤皮下瘤及原位瘤的生长，在进一步模拟人体肺癌模型A549-luciferase原位模型中也存在明显抑制肿瘤生长。由此可见，臭椿酮对复制应激导致疾病尤其是恶性肿瘤和感染性疾病具有显著的治疗作用，可望作为活性成分用于制备复制应激的靶向治疗药物，尤其是用于制备抗复制应激导致的感染性疾病或恶性肿瘤的药物，具有明显的临床应用价值。

Claims (5)

1.一种臭椿酮的药物用途，其特征在于：以臭椿酮或其水合物、药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体、前体化合物中的至少一种作为活性成分用于制备复制应激的靶向治疗药物。

2.根据权利要求1所述的药物用途，其特征在于：以臭椿酮或其水合物、药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体、前体化合物中的至少一种作为活性成分用于制备抗复制应激导致的感染性疾病或恶性肿瘤的药物。

3.根据权利要求2所述的药物用途，其特征在于：以臭椿酮或其水合物、药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体、前体化合物中的至少一种作为活性成分用于制备以抑制DNA复制为靶点的抗复制应激导致的感染性疾病或恶性肿瘤的药物。

4.根据权利要求3所述的药物用途，其特征在于：以臭椿酮或其水合物、药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体、前体化合物中的至少一种作为活性成分用于制备抗复制应激导致的结核性感染的药物。

5.根据权利要求3所述的药物用途，其特征在于：以臭椿酮或其水合物、药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体、前体化合物中的至少一种作为活性成分用于制备抗复制应激导致的非小细胞肺癌、骨肉瘤、胰腺癌、食管癌、胃癌、肠癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、脑肿瘤、淋巴瘤、白血病中的任意一种疾病的药物。