CN105616409B - 小檗碱在制备克服慢性粒细胞白血病耐药性药物或抗慢性粒细胞白血病药物增敏剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种小檗碱在制备克服慢性粒细胞白血病耐药性药物或抗慢性粒细胞白血病药物增敏剂中的应用。所述的小檗碱可以增加慢性粒细胞白血病细胞对伊马替尼的敏感性和克服慢性粒细胞白血病细胞对伊马替尼的多药耐药性。其中，小檗碱主要通过泛素化的机制降解BCR‑ABL蛋白进而克服由于T315I突变引起的慢性粒细胞白血病的多药耐药性。

Description

小檗碱在制备克服慢性粒细胞白血病耐药性药物或抗慢性粒 细胞白血病药物增敏剂中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种小檗碱在制备克服慢性粒细胞白血病耐药性药物或抗慢性粒细胞白血病药物增敏剂中的应用。
背景技术
慢性粒细胞白血病(Chronic Myeloid Leukemia,CML)是造血干细胞异常转化的髓系恶性克隆性疾病。其典型的遗传学特征为t(9；22)(q34；q11)易位，并由此产生BCR/ABL融合基因。全球CML占所有成人白血病的15～20％，发病率在我国列于白血病的第三位。
在过去的20多年中，CML的疾病进展率和死亡率居高不下。近年来随着分子靶向治疗药物酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitor，TKI)伊马替尼的问世，使得CML的治疗发生了革命性的进步，5年无事件生存率(EFS)和总生存率(OS)分别为83％和89％。然而，酪氨酸激酶抑制剂的耐药性成为了慢性粒细胞白血病治疗面临的主要问题。为了解决这一问题，先后研发出几个新的TKI，如Dasatinib、Nilotinib和Danusertib，但都有一定的缺陷。
CML对伊马替尼的耐药现象于2000年首次报道，由于bcr-abl融合蛋白中abl的TKIs结合区域发生突变，T315I是第一个被检测到的abl突变类型。此外还有bcr-abl基因扩增导致bcr-abl融合蛋白过表达，这两者属于bcr-abl依赖的耐药(bcr-ab-dependent)。还有一类属于bcr-abl非依赖的耐药(bcr-abl-independent)，如药物外流泵的上调及药物内流泵的下调，过表达Lyn(一个Src激酶)等。在CML耐药病例中，20％是bcr-abl非依赖性的耐药，由于它通常与bcr-abl下游信号通路上的癌基因有关，因此近年来日益收到关注。
BCR-ABL突变赋予了BCR-ABL对酪氨酸激酶抑制剂较高的抵抗性，还可以促进CML从CP越过加速期(Accelerated Phase，AP)到BC的发展。突变改变了BCR-ABL蛋白的序列，阻止了BCR-ABL激酶抑制剂结合，进而降低了对激酶抑制剂的敏感性。有报道显示，40～90％的伊马替尼耐药的病人出现了BCR-ABL的突变。大多数的BCR-ABL的突变出现在急变期。目前已经发现超过55种类型的BCR-ABL突变影响伊马替尼的结合。在这些BCR-ABL中ABL激酶区域突变中，T315I突变占具首位。
纯天然植物中潜在着丰富的抗肿瘤资源宝库，例如小檗碱。小檗碱(Berberine，BB)又名黄连素，来源于毛莨科植物黄连的根状茎、小檗碱科植物日本小檗碱Berbergii DC根茎、芸香科植物黄柏树皮和果实等。小檗碱属于季铵型异喹啉生物碱，中药黄连素中的主要生物碱，是中国传统中广泛使用的处方药用植物。在过去3000多年，小檗碱主要作为中药治疗消化道疾病，最新的研究进展表明，小檗碱可通过体外和体内不同的机制来发挥其抗肿瘤的活性。小檗碱在肿瘤细胞、微生物和病毒的增殖和繁殖过程中能够显示一定的抑制作用，例如在肝癌、食管癌、heliobacter螺旋杆菌、乙肝病毒等。同时也能调控某些癌基因和肿瘤相关基因的表达以及DNA或RNA的转录。此外，小檗碱是一种广谱酶抑制剂，它影响N-乙酰转移酶，环氧合酶-2，拓扑异构酶的活性，及其基因或蛋白的表达。更重要的是，对于肿瘤的增殖和转移，联合用药更有利于药物发挥其抑制作用。
随着对小檗碱及其衍生物的深入研究发现，小檗碱对多种实体瘤均有治疗作用，其中包括肝癌、结肠癌、肺癌、食管癌、脑肿瘤、膀胱癌等等。也有研究报道小檗碱能抑制血液病中白血病细胞的生长和增殖，如通过下调白血病人早幼粒细胞HL-60的核仁磷酸蛋白B23和端粒酶活性诱导其凋亡。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种小檗碱在制备克服慢性粒细胞白血病耐药性药物或抗慢性粒细胞白血病药物增敏剂中的应用。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种小檗碱在制备克服慢性粒细胞白血病耐药性药物或抗慢性粒细胞白血病药物增敏剂中的应用；
所述的小檗碱通过促进BCR-ABL融合蛋白泛素化降解进而克服慢性粒细胞白血病耐药性或增加抗慢性粒细胞白血病药物对慢性粒细胞白血病的敏感性；
所述的慢性粒细胞白血病耐药性优选为慢性粒细胞白血病细胞对伊马替尼的耐药性；
所述的克服慢性粒细胞白血病耐药性药物优选为慢性粒细胞白血病耐药性逆转剂；
一种克服慢性粒细胞白血病耐药性药物或抗慢性粒细胞白血病药物增敏剂，包含小檗碱或其药学上可接受的盐，以及小檗碱或其药学上可接受的盐的溶剂化合物、对映异构体、非对映异构体、互变异构体或其任意比例的混合物，包括外消旋混合物；
所述的克服慢性粒细胞白血病耐药性药物或抗慢性粒细胞白血病药物增敏剂还可以含有一种或者是至少两种药学上可以接受的载体；
所述的载体优选为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂等；
所述的克服慢性粒细胞白血病耐药性药物或抗慢性粒细胞白血病药物增敏剂可以进一步制成注射剂、片剂、粒剂或胶囊等多种形式，各种剂型的药物可以按照药学领域的常规方法制备；
上述小檗碱在制备促进BCR-ABL融合蛋白泛素化降解产品中的应用；
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明是通过对慢性粒细胞白血病bcr-abl融合蛋白的泛素化降解机制而产生抗白血病作用，对耐药和非耐药的慢性粒细胞白血病均有效。为慢性粒细胞白血病耐药治疗需找了一种可能的治疗方案。为治疗和克服慢性粒细胞白血病耐药，找到新的视角。同时，也为传统的中药小檗碱找到了新的靶点。
附图说明
图1是小檗碱和/或伊马替尼对BaF3-P210细胞相对活力影响的结果分析图；其中，A：小檗碱处理BaF3-P210细胞48h；B：小檗碱处理BaF3-P210细胞72h；C：伊马替尼单独处理与小檗碱+伊马替尼联合处理BaF3-P210细胞48h。
图2是小檗碱和/或伊马替尼对BaF3-P210-T315I细胞相对活力影响的结果分析图；其中，A：小檗碱或伊马替尼处理BaF3-P210-T315I细胞48h；B：小檗碱或伊马替尼处理BaF3-P210-T315I细胞72h；C：小檗碱和伊马替尼联合处理BaF3-P210-T315I 48h。
图3是小檗碱或伊马替尼处理SFO2细胞48h后对SFO2细胞相对活力影响的结果分析图。
图4是小檗碱对K562细胞相对活力影响的结果分析图；其中，A：小檗碱处理K562细胞48h；B：小檗碱处理K562细胞72h；C：小檗碱和伊马替尼联合处理K562细胞48h。
图5是细胞集落形成法检测小檗碱对BaF3-P210-T315I细胞恶性程度影响的结果分析图；其中，A：集落数统计分析(Mean±SD.n＝3)；B：集落形态；*：与对照相比，P<0.05。
图6是细胞集落形成法检测小檗碱对BaF3-P210细胞恶性程度影响的结果分析图；其中，A：集落数统计分析(Mean±SD.n＝3)；B：集落形态；*：与对照相比，P<0.05。
图7是Real time PCR检测小檗碱处理后的细胞中BCR-ABL mRNA表达水平的结果分析图；其中，A：BaF3-P210-T315I细胞BCR-ABL mRNA表达水平；B：BaF3-P210细胞BCR-ABLmRNA表达水平；C：K562细胞BCR-ABL mRNA表达水平。
图8是小檗碱处理BaF3-P210-T315I细胞后，BCR-ABL蛋白表达水平变化的结果分析图。
图9是小檗碱处理BaF3-P210细胞后，BCR-ABL蛋白表达水平变化的结果分析图。
图10是小檗碱处理细胞后BCR-ABL泛素化水平的结果分析图；其中，A：小檗碱处理BaF3-P210细胞后的蛋白泛素化水平；B：K562细胞经过小檗碱处理后BCR-ABL蛋白泛素化水平；C：BaF3-P210细胞经过小檗碱处理后的BCR-ABL蛋白泛素化水平；D：BaF3-P210-T315I细胞经过小檗碱处理后的BCR-ABL蛋白泛素化水平。
图11是BCR-ABL蛋白可以与小檗碱模拟对接的空间结构示意图；其中，A：BCR-ABL蛋白羧基末端(1519aa～1644aa)的F肌动蛋白连接区域(1ZZP)与小檗碱模拟对接；B：BCR-ABL蛋白中间部位(743aa～1028aa)的Protein Kinase区域(2ZQOH)与小檗碱模拟对接；C：BCR-ABL蛋白中间部位(743aa～1028aa)突变后的Protein Kinase区域(3IK3)与小檗碱模拟对接；D：BCR-ABL蛋白SH2区域(635aa～746aa，3K2M)与小檗碱模拟对接。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
MTT和DMSO及甲基纤维素购自Sigma公司；胎牛血清及RPMI-1640培养基购自Gibco公司；LipofectamineTM 2000购自Invitrogen公司；Anti-Ubiquitin Mouse mAb(FK2)购自美国美国MILLIPORE公司；Protein A/G PLUS-Agarose购自美国SIGMA公司；IgG antibody(H-270)购自美国SIGMA公司；Anti-Bcr antibody购自美国ABCAM公司。
人慢性粒细胞白血病K562细胞株购于中国科学院上海细胞库；BaF3-P210、BaF3-P210-T315I细胞株由重庆医科大学医学检验系临床血液学教研室提供(陈熙.干扰Apg-2基因在BaF3-p210及BaF3-p210-T3151中的作用研究[D].重庆医科大学,2012.)，BaF3-P210细胞中含有P210BCR-ABL蛋白，是一种慢性粒细胞白血病细胞系的模型，BaF3-P210-T315I细胞是一种BCR-ABL突变引起耐伊马替尼的细胞模型；KCL-22(BCL6-mediated repressionof p53is critical for l eukemia stem cell survival in chronic myeloidleukemia.J Exp Med.2011Oct 24；208(11):2163-74.)和SFO2细胞(BCL6enables Ph+acute lymphoblastic l eukaemia cells to survive BCR-ABL1kinaseinhibition.Nature.2011May 19；473(7347):384-8)由美国洛杉矶儿童医院提供；
K562、KCL-22、BaF3-P210三个细胞是正常表达BCR-ABL蛋白的慢性粒细胞白血病细胞，对伊马替尼(imatinib)的治疗敏感；BaF3-P210-T315I是表达BCR-ABL蛋白发生突变的慢性粒细胞白血病细胞，其中T315I对伊马替尼(imatinib)的治疗不敏感敏感，也就是耐药细胞，这种突变是慢性粒细胞白血病耐药的主要方式；SFO2是正常表达BCR-ABL蛋白的慢性粒细胞白血病细胞，但对伊马替尼(imatinib)的治疗不敏感，也就是耐药。
实施例1小檗碱处理细胞株检测细胞活力
K562、SFO2细胞、BaF3-P210和BaF3-P210-T315I细胞接种于含体积分数10％的胎牛血清、有抗生素的RPMI-1640培养基中，放置在37℃、5％的CO2培养箱中，饱和湿度下培养，每隔一天换液传代；取对数生长期的K562、SFO2细胞、BaF3-P210和BaF3-P210-T315I，各组细胞以1×108cell/L的密度接种于96孔板中，每孔中100μL；每种细胞分为小檗碱组、伊马替尼组、小檗碱+伊马替尼组和空白组，每组设3个重复孔，每孔加入含有相应浓度药物的培养基100μL，对照组加入空白培养基，总体积为200μL；加完药物之后，放入培养箱中培养48h或72h；细胞加药处理48h或72h后每孔加入MTT液20μL，于培养箱中培养4h，然后10000r/min离心20min；弃上清，然后每孔加入150μL DMSO，放在摇床上震荡10min，溶解结晶；在多功能酶标仪上测定吸光度A570，实验重复3次，计算增殖抑制率：增殖抑制率(％)＝(1-A实验组/A对照组)×100％。
图1是小檗碱和/或伊马替尼处理BaF3-P210细胞后细胞相对活力影响的结果分析。其中，BaF3-P210细胞的细胞活力随着小檗碱浓度增加有降低的趋势，小檗碱处理BaF3-P210细胞48h和72h后，细胞活力变化相同(图1A和图1B)。小檗碱(终浓度5μM)和伊马替尼(终浓度0.5、1、1.5、2μM)联合处理BaF3-P21048h，小檗碱可以增加细胞对伊马替尼的敏感性(图1C)。
图2是小檗碱和/或伊马替尼处理BaF3-P210-T315I细胞后细胞相对活力影响的结果分析。其中，BaF3-P210-T315I细胞的细胞活力随着小檗碱浓度增加有降低的趋势；而伊马替尼浓度的增加对BaF3-P210-T315I细胞的细胞活力没有明显的影响。小檗碱或伊马替尼处理BaF3-P210-T315I细胞48h或72h后，细胞活力变化相同(图2A和图2B)。小檗碱(终浓度0～8μM)和伊马替尼(终浓度0～8μM)联合处理耐药细胞株BaF3-P210-T315I细胞后，小檗碱可以增加耐药细胞对伊马替尼的敏感性(图2C)。根据图2中的数据，可计算出小檗碱对BaF3-P210-T315I细胞的半数抑制率为5μM。
图3是小檗碱和伊马替尼分别处理SFO2细胞48h后对SFO2细胞相对活力影响的结果分析。其中，小檗碱浓度的增加，使得SFO2细胞的细胞活力降低。伊马替尼浓度增加，SFO2细胞的细胞活力有降低的趋势。但是在一定浓度范围内，伊马替尼对SFO2的细胞活力没有明显的影响。
图4是小檗碱和/或伊马替尼处理K562细胞后细胞相对活力影响的结果分析。其中，随着小檗碱浓度的增加，K562细胞的相对活力有降低的趋势；小檗碱或伊马替尼处理K562细胞48h和72h后细胞活力变化有相同的趋势(图4A和图4B)。小檗碱(终浓度5μM)和伊马替尼(终浓度0.5、1、1.5、2μM)联合处理K562细胞，小檗碱可以增加K562细胞对伊马替尼的敏感性(图4C)。
综上所述，用不同浓度的小檗碱处理对伊马替尼敏感的人类CML细胞(K562、BaF3-P210)和耐药性细胞株(BaF3-P210-T315I和SFO2)，并与伊马替尼对照。实验结果显示，小檗碱在5μM浓度处理24h时，不仅可以抑制敏感K562和BaF3-P210细胞活力，也显著抑制耐药的BaF3-P210-T315I和SFO2细胞细胞活力。伊马替尼和小檗碱联合作用于敏感K562、BaF3-P210和耐药的BaF3-P210-T315I，实验显示，小檗碱可以增加K562、BaF3-P210对伊马替尼敏感性和克服BaF3-P210-T315I细胞对伊马替尼的耐药性。小檗碱最佳作用K562和BaF3-P210-T315I浓度为5μM。
实施例2小檗碱对BaF3-P210和BaF3-P210-T315I细胞集落形成的影响
本实施例采用由甲基纤维素为载体的集落形成法(colony forming method)检测细胞的自我更新和增殖能力。实验分组小檗碱组、伊马替尼组和空白组，小檗碱浓度选为5μM，伊马替尼浓度5μM。取对数期生长的BaF3-P210和BaF3-P210-T315I细胞，按1×103cell/L(含相应浓度处理药物)接种于2mmol/L的L-谷氨酰胺，含体积分数20％胎牛血清，5μmol/Lβ-巯基乙醇和质量分数0.9％甲基纤维素的固体培养基中，放置在37℃、5％的培养箱中。培养箱中放置一个星期。一周后倒置显微镜下计数群落数，一个集落至少包含40个细胞。
图5是小檗碱和伊马替尼分别处理BaF3-P210-T315I细胞后colony结果分析。其中，小檗碱处理的BaF3-P210-T315I细胞的集落数明显比空白组的数量少且差异显著(P<0.05)。伊马替尼处理耐药的BaF3-P210-T315I细胞后的集落数与空白组的集落数相比没有显著差异。
图6是小檗碱和伊马替尼分别处BaF3-P210细胞后colony结果分析。其中，小檗碱处理的BaF3-P210细胞的集落数明显比空白组的数量少且差异显著(P<0.05)。伊马替尼处理BaF3-P210细胞后的集落数与空白组的集落数相比也出现了显著差异(P<0.05)。
综上所述，小檗碱对耐药细胞的细胞集落能力(colony)的影响实验结果显示：小檗碱可以有效抑制耐药BaF3-P210-T315I细胞的集落形成，有效抑制细胞的恶性程度；而伊马替尼不能显著抑制BaF3-P210-T315I细胞的集落形成；小檗碱也可以有效抑制BaF3-P210细胞的集落形成，有效抑制细胞的恶性程度。
实施例3 Real time PCR检测BCR-ABL mRNA水平
(1)总RNA的提取：小檗碱处理BaF3-P210-T315I细胞、BaF3-P210细胞和K562细胞24h后，1500rpm，离心5min收集细胞于1.5mL EP管中，加入500μLTrizol试剂，吹打混匀细胞，冰上静置5min；加入100μL氯仿(氯仿：Trizol＝1：5)，剧烈震荡15sec，冰上静置10min；12000rpm，4℃离心15min，吸取上清置于另一个EP管中，加入等体积的异丙醇(大约200μL)，震荡均匀，-20℃静置10min，12000rpm，4℃离心10min；弃上清，EP管底部可见白色沉淀；每管加入500μL体积分数为75％的乙醇(用RNase-free ddH2O配制)，洗涤RNA沉淀；洗涤后，12000rpm，4℃离心5min，此步骤重复3次；弃上清，室温干燥2～3min，加入RNase-freeddH2O 30μL，轻轻吹打将沉淀完全溶解；
(2)cDNA的合成(FastQuant RT Kit(with gDNAase)，天根生物科技(北京)有限公司)：根据RNA浓度，计算2μg RNA所需的体积。建立20μL反应体系；将RT试剂中的试剂解冻后，迅速放在冰上；使用前将每种溶液涡旋震荡混匀，简短离心收集管壁上的残留液体；根据试剂盒提供步骤剂量去除体系中基因组DNA(5×gDNA Buffer 2μL，2μg Total RNA；并用RNase-Free ddH2O补足到10μL，彻底混匀；短暂离心，并置于42℃，孵育3min，然后放在冰上；配制逆转录反应体系混合液(10×Fast RT Buffer 2μL；RT Enzyme Mix 1μL；FQ-RTPrimer Mix 2μL；RNase-Free ddH2O 5μL)将上述试剂充分混匀，加到gDNA去除步骤的反应液中，再次充分混匀；然后进行PCR，程序设定为：42℃，孵育15min；95℃，孵育3min；之后放于冰上，得到的cDNA可用于后续实验，或低温保存；
(3)Real time PCR(SuperReal PerMix Plus(SYBR Green)购自天根生物科技(北京)有限公司)：将Real time PCR中的试剂，模板，引物和RNa se-Free ddH2O室温溶解，彻底混匀，在冰上进行Real time RCR反应液的配制；20μL反应体系：2×SuperReal PreMixPlus 10μL；Forward primer 0.6μL；Reberse primer 0.6μL；cDNA 2μL；RNase-Free ddH2O补足到20μL；然后盖上反应管，轻柔混匀，可短暂离心，确保所有组分在管底；将反应体系放入荧光定量PCR仪中，按照如下程序进行反应：1、95℃15min；2、95℃10sec；3、55℃30sec；4、72℃30sec；5、Plate read Go to 2，39more times；6、Mlet-curve 65℃to95℃increment0.5for 5sec+plate read；7、End.开始运行程序，程序结束关闭仪器。分析数据，靶基因的mRNA的相对表达水平用△CT和2-△△CT计算。β-actin mRNA作为内参照；其中，引物序列如下：BCR-ABL-Forward primer：AGCATTCCGCTGACCATCAA；BCR-ABL-Reverse primer：GCCTAAGACCCGGAGCTTTT，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；
终浓度为5μM的小檗碱处理K562、BaF3-P210和BaF3-P210-T315I细胞24h后，提取细胞内总RNA，逆转录，然后进行Real time PCR检测小檗碱对BCR-ABL mRNA水平的影响，结果如图7所示：小檗碱对细胞内BCR-ABL mRNA表达水平没有显著性的影响。
实施例4 Western blot检测细胞中BCR-ABL蛋白水平
取对数生长期的细胞以30×104cell/L的密度接种于六孔板中每孔中2mL，实验分小檗碱组和空白组，檗碱浓度选择5μM；小檗碱作用一段时间(0h，4h，12h，24h)后，收集细胞于1.5mL EP管中，5000rpm离心5min收集细胞，弃上清；PBS洗细胞，吹打均匀，5000rpm离心5min收集细胞；根据细胞沉淀量，加入适量的细胞裂解液(RIPA细胞裂解液购自碧云天公司)将细胞完全裂解：冰上裂解30min；4℃，13000rpm离心30min，吸取上清到另一个干净EP管中，按照Bradford蛋白浓度测定试剂盒(购自北京科为世纪生物有限公司)的说明书测定蛋白浓度；按比例添加上样缓冲液，计算50μg蛋白所需的上样量；加入上样缓冲液后，沸水浴中煮沸5min；配制SDS-PAGE胶，上样，80V电泳30min，120V电泳1h；电泳结束，转膜；在半干转装置中按照从下到上依次为：滤纸、膜、凝胶、滤纸，用玻璃棒赶压气泡，盖上仪器盖，12V，40min；转膜结束后，封闭：将PVDF膜放入质量分数5％脱脂奶粉的封闭液中，室温条件下，在摇床上摇动1h；封闭结束后，孵一抗(C-ABL单克隆抗体购自美国SANTA CRUZ公司)，按照比例稀释抗体，将PVDF膜放入的抗体中，4℃摇床上孵育过夜；孵育结束后，TBST洗涤PVDF膜三次，摇床上洗涤5min；室温孵育二抗(鼠源二抗IgG-HRP购自美国SANTA CRUZ公司)，选取合适比例浓度的二抗，用抗体稀释液稀释；将PVDF膜放入稀释好的二抗中；孵育结束后，TBST洗涤PVDF膜三次，摇床上洗涤10min；化学发光：按照说明书配制发光液(A、B液1:1混匀)，将发光液均匀滴加到PVDF膜上，放入ALLIANCE4.7凝胶成像系统中进行拍照。以内参蛋白(β-actin或GAPDH)比较BCR-ABL蛋白相对表达水平。
检测到小檗碱对BCR-ABL mRNA的表达水平没有影响后，同样选用终浓度为5μM的小檗碱处理BaF3-P210-T315I细胞4h、12h和24h，收集细胞提取蛋白进行Western blot检测BCR-ABL蛋白的表达水平。如图8所示，在BaF3-P210-T315I细胞中小檗碱浓度一定时，随着小檗碱处理时间增加，相比于内参β-actin蛋白，BCR-ABL蛋白出现了降低的趋势。同样选用终浓度为5μM的小檗碱处理BaF3-P210细胞4h、12h和24h，收集细胞提取蛋白进行westernblot检测BCR-ABL的表达水平。如图9所示，小檗碱浓度一定时，随着小檗碱处理时间增加，相比于内参β-actin蛋白，BCR-ABL蛋白出现了降低的趋势。
综上所述，小檗碱作用后，细胞中BCR-ABL蛋白水平和mRNA检测结果表明：小檗碱显著降低BaF3-P210-T315I和BaF3-P210细胞系中的BCR-ABL蛋白水平，而对BCR-ABL的mRNA水平无显著改变，因而可以认为小檗碱降解BCR-ABL融合蛋白。
实施例5检测BaF3-P210和BaF3-P210-T315I细胞内泛素化水平
(1)Western blot：为了探索小檗碱引起BCR-ABL蛋白降解的机制，采用Westernblot检查细胞的泛素化水平，具体方法和操作步骤同实施例4，一抗为Anti-UbiquitinMouse mAb(FK2)(购自美国美国MILLIPORE公司)。
(2)免疫沉淀：蛋白提取步骤如实施例4，每组蛋白提取液中加入5μL IgG抗体(IgG抗体的种属与目的蛋白抗体的种属一致，IgG antibody(H-270))(购自美国SIGMA公司)，同时每管加入30μL Protein A/G。放在旋转式摇床上，4℃摇匀30min。摇匀结束后，将离心管放入低温离心机中。温度设为4℃，2500rpm离心5min。收集上清到新的EP管中，每管再加入30μL Protein A/G PLUS-Agarose(购自sigma公司)。放在旋转式摇床上，4℃摇匀30min。摇匀结束后，将离心管放入低温离心机中。2500rpm离心5min。收集上清到新的EP管中，使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒的说明书测定蛋白浓度。测得蛋白浓度后，根据1mg蛋白加入2μL BCR抗体(Anti-Bcr antibody购自美国ABCAM公司)，放在旋转式摇床上，4℃孵育过夜。第二天，每管中加入40μL Protein A/G.。旋转式摇床上，4℃孵育4h。孵育结束后，放入低温离心机中。温度设为4℃，2500rpm离心5min。去上清，每管加入1mL的PBS洗涤Protein A/G，4℃，2500rpm离心5min。重复三次。每管加入40μL1×上样缓冲液，沸水中煮10min。Westernblot上样量为5μL。Western blot实验步骤如实施例4。
(3)结果分析：
本实施例Western blot检测了小檗碱处理BaF3-P210后细胞中所有蛋白的泛素化水平的改变，结果如图10A所示，经过小檗碱处理12h后的BaF3-P210细胞，细胞内的泛素化水平明显增多。但是，随着时间的延长，细胞的泛素化水平又降低到一定水平。这说明，小檗碱可以在一定时间内增加BaF-P210细胞内总的泛素化水平，但是这种改变受到时间的限制。
选取小檗碱处理K562、BaF3-P210和BaF3-P210-T315I细胞24h后，分别使用免疫沉淀的方法检测各细胞中的BCR-ABL泛素化水平，结果如图10所示。图10B中显示经过小檗碱处理的K562细胞中的BCR-ABL蛋白发生了泛素化；图10C显示小檗碱处理BaF3-P210细胞中的BCR-ABL蛋白发生了泛素化；图10D显示小檗碱处理BaF3-P210-T315I细胞中的BCR-ABL蛋白发生了泛素化：MG132可以抑制蛋白酶体的活性，进而阻断被泛素化的BCR-ABL蛋白的降解，从图中可以看出MG132和小檗碱共同作用于BaF3-P210-T315I的条带比空白组有增加的趋势，这表明经过小檗碱处理的BaF3-P210-T315I中的BCR-ABL也发生了泛素化。
综上所述，在小檗碱处理BaF3-P210细胞时，发现小檗碱可以增加细胞内蛋白的整体泛素化水平。采用针对BCR-ABL免疫沉淀(IP)，使用泛素化抗体Western blot检测发现BCR-ABL蛋白发生了泛素化。
实施例7分子模拟对接小檗碱与BCR-ABL蛋白
从蛋白质数据库中找到BCR-ABL蛋白三维空间结构的PDB文件；在药物数据库中找到小檗碱的三维空间结构PDB文件。从Discovery的官网上下载免费使用的DicoveryStudio4.1软件。下载完软件Discovery Studio4.1后，将小檗碱和BCR-ABL蛋白的三维结构导入进入软件中。观察小檗碱与BCR-ABL蛋白的某些空间结构结合或者小檗碱插入到BCR-ABL蛋白空间结构中去的结果。
Discovry Studio软件分析小檗碱与BCR-ABL可对接的位点对接结果如图11，小檗碱可以与BCR-ABL中的SH2区域、蛋白激酶区域和F肌动蛋白结合区域对接上。并且在小檗碱的活性作用区域，都发现有潜在泛素化位点Lys的存在，说明可能的泛素化位点的存在。
本发明使用小檗碱处理对伊马替尼敏感的K562、BaF3-P210细胞和耐药细胞株BaF3-P210-T315I细胞，发现小檗碱可以抑制K562、BaF3-P210细胞和耐药细胞株BaF3-P210-T315I和SFO2的细胞活力；且小檗碱和伊马替尼联合处理细胞后，小檗碱可以增加K562、BaF3-P210细胞和耐药的BaF3-P210-T315I对伊马替尼的敏感性。细胞克隆形成实验则证明小檗碱可以显著降低BaF3-P210-T315I和BaF3-P210细胞的集落形成能力，有效抑制细胞的恶性程度。进一步研究发现，小檗碱可以降解细胞BaF3-P210-T315I细胞和BaF3-P210细胞中的BCR-ABL蛋白表达量：耐药细胞株和不耐药的细胞株经过小檗碱处理后，BCR-ABL蛋白都有明显降解现象。同时，对BCR-ABL的mRNA水平检测发现，小檗碱不能引起BCR-ABL mRNA水平的变化。以上结果表明，小檗碱直接作用于耐药株和敏感细胞株中的BCR-ABL蛋白，而不影响BCR-ABL的mRNA表达水平。
对细胞整体水平的泛素化检测结果结果显示：小檗碱可以在一定时间内增加BaF-P210细胞内总的泛素化水平，但是这种改变受到时间的限制。经过小檗碱处理K562、BaF3-P210细胞中的BCR-ABL泛素化水平都明显增加。MG132和小檗碱共同作用于BaF3-P210-T315I的条带比空白组有增加的趋势，这表明经过小檗碱处理的BaF3-P210-T315I中的BCR-ABL也发生了泛素化。
本发明对小檗碱分子与BCR-ABL蛋白进行分子对接模拟，发现BCR-ABL共有3部位(SH2区域、蛋白激酶区域和F-肌动蛋白连接区域)可以与小檗碱分子对接上。进一步观察发现，小檗碱与BCR-ABL蛋白的对接处序列中发现赖氨酸存在，提示泛素化位点的存在。
综上所述，小檗碱可以影响到CML耐药细胞株和不耐药细胞株的细胞活力和细胞的恶性程度。同时还发现小檗碱能够降解BCR-ABL蛋白，然而不改变BCR-ABL的mRNA水平。进一步研究BCR-ABL蛋白降解机制，发现小檗碱可以通过泛素化的途径降解BCR-ABL蛋白。本研究为CML耐药治疗需找了一种可能的治疗方案。为治疗和克服CML耐药，找到新的视角。同时，也为传统的中药小檗碱找到了新的靶点。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种小檗碱在制备克服慢性粒细胞白血病对伊马替尼耐药性的药物或抗慢性粒细胞白血病药物伊马替尼的增敏剂中的应用；
所述的小檗碱通过促进BCR-ABL融合蛋白泛素化降解进而克服慢性粒细胞白血病耐药性或增加抗慢性粒细胞白血病药物对慢性粒细胞白血病的敏感性；
所述的慢性粒细胞白血病对伊马替尼耐药性为慢性粒细胞白血病细胞对伊马替尼的耐药性；
所述的慢性粒细胞白血病细胞对伊马替尼的耐药性为慢性粒细胞白血病细胞中BCR-ABL融合蛋白的T315I突变引起的伊马替尼耐药性。
2.根据权利要求1所述的小檗碱在制备克服慢性粒细胞白血病对伊马替尼耐药性的药物或抗慢性粒细胞白血病药物伊马替尼的增敏剂中的应用，其特征在于：
所述的克服慢性粒细胞白血病对伊马替尼耐药性的药物为慢性粒细胞白血病耐药性逆转剂。
3.根据权利要求1或2所述的小檗碱在制备克服慢性粒细胞白血病对伊马替尼耐药性的药物或抗慢性粒细胞白血病药物伊马替尼的增敏剂中的应用，其特征在于：
所述的克服慢性粒细胞白血病对伊马替尼耐药性的药物或抗慢性粒细胞白血病药物伊马替尼的增敏剂含有一种或者是至少两种药学上可以接受的载体；
所述的载体为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂。
4.根据权利要求3所述的小檗碱在制备克服慢性粒细胞白血病对伊马替尼耐药性的药物或抗慢性粒细胞白血病药物伊马替尼的增敏剂中的应用，其特征在于：
所述的克服慢性粒细胞白血病对伊马替尼耐药性的药物或抗慢性粒细胞白血病药物伊马替尼的增敏剂进一步制成注射剂、片剂、粒剂或胶囊。
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