CN113049558B - 黄连碱作为荧光探针标记真核细胞的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出了黄连碱及其类似物作为荧光探针在标记真核细胞核核仁及DNA中的应用，在真核细胞的固定细胞核核仁和/或活细胞核仁中标记不同应激状态下核仁形态、大小和分布的变化。其中黄连碱及其类似物可进入细胞，定位于活细胞核仁区，特异荧光标记细胞核、细胞核仁，能够对活的或经固定液固定的哺乳类原代细胞、肿瘤细胞、酵母和培养的植物细胞核和核仁直接进行荧光标记，且不产生核仁应激反应，不抑制rRNA的合成，操作简单、耗时短、经济、易制备试验重复性好。

Description

黄连碱作为荧光探针标记真核细胞的方法及应用

技术领域

本发明涉及属于生物医学技术领域，具体而言，涉及黄连碱作为荧光探针标记真核细胞的方法及应用。

背景技术

黄连碱(Coptisine)是从Coptis chinensis (CC)提取出来的天然小分子化合物，具有广泛的药理作用。在目前的研究中，黄连碱(Coptisine)能够通过抑制MMP-3和MMP-9、下调PI3K和AKT 25、下调Bcl2及上调Bax，caspase‐3 等凋亡相关蛋白以及降低G1/S相关基因的表达等，阻止肿瘤的粘附和迁移、降低上皮间质的转化、促进肿瘤细胞的凋亡，从而达到抗肿瘤的效果。黄连碱(Coptisine)可以通过阻断NF‐κB, MAPK以及PI3K/AKT信号通路的转导抑制LPS诱导的炎症反应。黄连碱(Coptisine)也能阻断ROCK通路，降低NADPH氧化酶和ROS水平来保护心血管。黄连碱(Coptisine)能通过抑制疟疾化疗靶点PfDHODH降低金黄色葡萄球菌粘附；黄连碱(Coptisine) 能够通过调节IκBα/NF‐κB信号通路减轻腹泻程度及回肠黏膜损伤。黄连碱(Coptisine) 能激活Nrf2信号通路导致下游基因heme oxygenase1和NADPH quinone oxidoreductase 1的上调改善糖尿病氧化性肾损伤。

真核细胞核仁是一个动态、无膜结构的复合体，被核内异染色质包围。从里向外有三个区域：纤维中心（FC）、致密纤维组分（DFC）、颗粒组分（GC）。纤维中心（FC）是rRNA基因的储存位点，主要有rDNA、RNA聚合酶I（Pol I）和结合的转录因子。致密纤维组分（DFC）中主要有rRNA、核仁纤维蛋白（fibrillarin）、核仁蛋白（nucleolin）和Ag-NOR蛋白。颗粒组分（GC）是核仁的主要结构，由RNP（RNA和蛋白质复合物）构成。核仁区是rDNA的转录、rRNA的合成与加工以及核糖体亚单位组装场所。一直以来病理学家将核仁形态和数量变化作为相关疾病的标志，如在癌症中，核仁体积变大，数量增多以适应蛋白质合成及增殖的需要。肿瘤细胞核仁改变与RNA聚合酶I（Pol I）上游信号通路的激活、负调控rRNA肿瘤抑制因子的缺失以及核糖体蛋白高表达有关。核仁功能障碍也与许多疾病密切相关。例如核糖体蛋白突变、核糖体蛋白伴侣分子TSR2及造血转录因子GATA-1的突变都介导了先天性再生障碍性贫血（DBA）疾病的表型；RPS14基因的缺失导致5q-综合征；SBDS及DNAJC21的突变影响60S核糖体蛋白的成熟导致Shwachman-Diamond 综合征（SDS）的发生；合成rRNA相关基因TCOF1、POLR1D、POLR1C的突变导致特雷彻•柯林斯综合征（TCS）疾病。此外在细胞周期调控、神经损伤方面靶向核仁调控相关基因都有明显的改善作用。

目前对核仁的形态的变化监测手段主要是免疫组化或免疫荧光试验，这种方法主要利用核仁结构蛋白如B23 和Fibrillarin。缺点是不能实时观察活细胞核仁的变化。过表达B23-GFP/RFP或Fibrillarin-GFP/RFP可实时监测细胞核仁，但是，受B23或Fibrilian蛋白合成和代谢的调控，GFP和RFP是否对核仁有影响也无法评估。

因此，实时监测核仁的状态显得尤为重要。目前靶向标记核仁的方式有三种：一是针对核仁蛋白的抗体。但是抗体免疫标记核仁有如下缺点，如抗体制备程序复杂，价格昂贵，受特异性影响。试验周期长，并且只能免疫荧光标记固定细胞，不能实时标记活细胞。

二是过表达荧光蛋白（GFP、RFP）与核仁特异蛋白的融合蛋白。该方法适合活细胞标记核追踪细胞核仁的结构和形态变化，不能用于固定细胞染色。该方法需要质粒构建，细胞转染等程序，试验实施程序复杂。

目前唯一一个商品化核仁染料是SYTO RNA-Select（美国thermo,S32703）。该产品主要对RNA进行标记，通过靶向RNA定位核仁。缺点是，此染料不能很好地用于活细胞标记，适用于固定细胞RNA的标记，但是试剂储存时间短，稳定性差。

因此，为克服现有技术的不足，提出一种真核细胞核仁的标记方法能够对活的或固定的真核细胞核仁直接进行荧光标记，且不产生核仁应激反应，不抑制rRNA的合成，操作简单、耗时短、经济、易制备试验重复性好是本领域技术人员亟需解决的技术问题。

发明内容

本发明正是基于上述技术问题至少之一，本发明提供了黄连碱作为荧光探针标记真核细胞的方法及应用，黄连碱可进入细胞，定位于活细胞核仁区，特异荧光标记细胞核、细胞核仁，能够对活的或固定的哺乳类原代细胞、肿瘤细胞、酵母和培养的植物细胞核和核仁直接进行荧光标记，且不产生核仁应激反应，不抑制rRNA的合成，操作简单、耗时短、经济、易制备试验重复性好。

有鉴于此，本发明提出了黄连碱及其类似物作为荧光探针在标记真核细胞核核仁中应用，黄连碱在真核细胞核核仁内，在激发光下发出绿色荧光。

根据本发明第二个方向，提出了黄连碱及其类似物作为荧光探针在标记真核细胞核核仁DNA中应用，黄连碱在真核细胞核核仁DNA处，在激发光下发出绿色荧光，黄连碱及其类似物在真核细胞核核仁内与rDNA结合，增强黄连碱的荧光亮度。

进一步的，激发光波长为400-500nm。

进一步的，黄连碱及其类似物作为荧光探针，在真核细胞的固定细胞核核仁和/或活细胞核仁中标记不同应激状态下核仁形态、大小和分布的变化。

其中不同应激为热应激、Act D等应激刺激。

进一步的，黄连碱及其类似物作为荧光探针能和其它细胞核DNA荧光共染，在真核细胞的固定细胞核核仁和/或活细胞核仁中标记不同应激状态下核仁形态、大小和分布的变化。

进一步的，活细胞包括肿瘤细胞、原代细胞，植物细胞和酵母细胞。

根据本发明第三个方向，黄连碱及其类似物作为荧光探针在肿瘤细胞分群中应用，黄连碱及其类似物根据荧光强度区分肿瘤细胞的异质性，能定位肿瘤干细胞。

进一步的，黄连碱类似物包括小檗碱、巴马汀、表小檗碱、药根碱中的一种或两种以上组合物。

根据本发明第四个方向，利用黄连碱及其类似物作为荧光探针标记活细胞的方法，包括如下步骤：

（1）利用细胞培养基将黄连碱稀释成20μM/L；

（2）将稀释好的黄连碱加入哺乳类细胞中，37℃，CO₂ 孵育4-6 h；

（3）PBS液清洗2次后观察。

根据本发明第五个方向利用黄连碱及其类似物作为荧光探针标记固定细胞的方法，包括如下步骤：

（1）利用4% PFA固定细胞15-20 min；后用PBS洗2次；

（2）利用PBS将黄连碱稀释成20μM/L

（3）将稀释好的黄连碱加入细胞培养孔中，24-37℃，孵育4-6 h；

（4）PBS液清洗2次后观察。

通过以上技术方案，其具有以下优点：黄连碱可作为荧光探针进入细胞，定位于活细胞核仁区，特异荧光标记细胞核、细胞核仁，能够对活的或固定的哺乳类原代细胞、肿瘤细胞、酵母和培养的植物细胞核和核仁直接进行荧光标记，且不产生核仁应激反应，不抑制rRNA的合成，操作简单、耗时短、经济、易制备试验重复性好。

附图说明

图1为本发明实施例1所提供的黄连碱的激发光谱图。

图2为本发明实施例1所提供的黄连碱的发射光谱图。

图3为本发明实施例2所提供的黄连碱标记Hela细胞流式细胞分析结果分析图。

图4为本发明实施例2所提供的黄连碱标记Hela细胞流式细胞分析结果统计图。

图5为本发明实施例3所提供的不同浓度黄连碱标记Hela细胞流式细胞分析结果分析图。

图6为本发明实施例3所提供的不同浓度黄连碱标记Hela细胞流式细胞分析结果统计图。

图7为本发明实施例4所提供的黄连碱荧光标记Hela细胞图。

图8为本发明实施例5所提供的黄连碱荧光标记五种肿瘤细胞系核仁图。

图9为本发明实施例6所提供的黄连碱与核仁蛋白共定位图。

图10为本发明实施例7所提供的黄连碱荧光标记不同应激状态下的核仁图。

图11为本发明实施例8所提供的黄连碱与rDNA结合增强荧光图。

图12为本发明实施例9所提供的黄连碱将肿瘤细胞分群情况图。

图13为本发明实施例9所提供的黄连碱不能对小鼠原代耳朵成纤维细胞分群情况图。

图14为本发明实施例10所提供的平板克隆实验结果统计图。

图15为本发明实施例10所提供的软琼脂实验结果统计图。

图16为本发明实施例11所提供的黄连碱低荧光强度细胞群干细胞Maker CD133高表达图。

图17为本发明实施例11所提供的黄连碱低荧光强度细胞群干细胞Maker LGR5高表达图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。

本发明实施例所用仪器如下：二氧化碳细胞培养箱（Thermo forma, 3121, USA）；倒置荧光显微镜（NIKON，TS100-F）；激光扫描共聚焦显微镜（NIKON，A1R + STORM）；恒温水浴锅（Thermo Forma）；流式细胞仪（BD Biosciences）；常温离心机（Eppendorf，5415 R）；细胞计数仪（Count Star）；多功能酶标仪（Thermo，3001-1100）；高压灭菌锅（LDZX-40BI）；体式显微镜（JSZ6S，ISH500）；摇床（Thermo，MaxQ2000）。

试剂如下：DMSO（Sigma）；琼脂（上海贝晶生物技术有限公司）；DMEM（Gibco）；CD133抗体（abcom，ab19898）；LGR5抗体（Abnova，2B5B9）。

实施例1

黄连碱(Coptisine)的荧光光谱

将黄连碱结构如下：

将黄连碱用DMSO（Sigma）溶解，母液浓度为20 mM/L。取2 μL母液到2 ml DMSO中使得黄连碱终浓度为20 μM/L。取一新的96孔板，每孔中加入200 μL 稀释好的黄连碱 ；DMSO作空白溶剂对照。每组设三个复孔，加完样品后去测多功能酶标仪（Thermo）。先固定发射光波长为550 nm，扫描得到黄连碱的激发波谱；然后固定激发光波长为460 nm，扫描得到黄连碱的发射光谱，如图1-2。由图1-2可知，黄连碱激发光谱有两个峰，绿色荧光最大激发光波长为460 nm，最大发射光波长为550 nm。

实施例2

将Hela细胞铺至小皿（35mm）中，每组设三个复孔。次日从培养箱中取出细胞，弃去培养基，用PBS洗一次。之后用实施例1得到的黄连碱母液用培养基（DMEM（Gibco）（含10%FBS））稀释至20 μM/L，每皿加入1.5 ml培养基稀释好的黄连碱（倒序加药，比如先加孵育8h组，隔2 h加孵育6 h组，以此类推），放置细胞培养箱（37℃, 5% CO₂）孵育相应时间，对照为加实验组黄连碱量同体积的DMSO孵育8 h。之后从培养箱取出细胞，弃去培养基，用PBS洗2次。向皿里加入500 μL 0.25% 胰酶（含EDTA）消化2-5 min。然后向皿里加入500 μL DMEM（含10% FBS）终止消化，收集细胞至离心管中500 rpm离心5 min。倒掉上清，细胞用PBS重悬洗涤一次500 rpm离心5 min。离心完毕倒掉上清加入500 μL PBS重悬细胞并转移至流式管中。随后将收集的细胞上流式细胞仪（BD Biosciences）检测，结果如图3-4。由图3-4可知，黄连碱标记Hela细胞4小时之后达到稳定。

实施例3

不同浓度黄连碱 (Coptisine) 标记细胞荧光强度

将Hela细胞铺至6孔板中，每组设三个复孔。次日从培养箱中取出细胞，弃去培养基，用PBS洗一次。之后黄连碱母液用培养基（DMEM（含10% FBS））稀释至20 μM/L、10 μM/L,、5 μM/L、1 μM/L，每孔加入1.5 ml培养基稀释好的黄连碱，放置细胞培养箱（37℃, 5% CO₂）孵育6 h，对照为加实验组黄连碱量同体积的DMSO孵育6 h。之后从培养箱取出细胞，弃去培养基，用PBS洗2次。向每孔中加入500 μL 0.25% 胰酶（含EDTA）消化2-5 min。然后向每孔加入500 μL DMEM（含10% FBS）终止消化，收集细胞至离心管中500 rpm离心5 min。倒掉上清，细胞用PBS重悬洗涤一次500 rpm离心5 min。离心完毕倒掉上清加入500 μL PBS重悬细胞并转移至流式管中。随后将收集的细胞上流式细胞仪检测，结果如图5-6。由图5-6可知，黄连碱标记Hela细胞荧光强度随着黄连碱浓度的增加而增加。

实施例4

黄连碱 (Coptisine) 进细胞发出绿色荧光

将Hela细胞铺到12孔板的爬片上，次日从培养箱取出细胞，弃去培养基，用PBS洗一次。将黄连碱母液用培养基（DMEM（含10% FBS））稀释至20 μM/L，向每孔中加入500 μL培养基稀释好的黄连碱，放置细胞培养箱（37℃, 5% CO₂）孵育6 h。之后拿出12孔板，弃去培养基，每孔用500 μL PBS洗一次，向每孔中加500 μL 4% PFA固定15 min，吸弃固定液，用PBS洗一次。将爬片用镊子小心取出，倒扣在滴有封片剂的载玻片上，用指甲油涂边固定。避光操作及保存。拿到倒置荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察、拍照，结果如图7。由图7可知，黄连碱与Hoechst33342共定位，其中Hoechst33342可用于细胞成像技术中细胞核的固定细胞和活细胞荧光染色标记，且黄连碱在核仁处荧光最亮，因此黄连碱可用于核仁的定位标记。

实施例5

将Hela、H1299、A549、HuH-7、HepG2细胞铺到12孔板的爬片上，次日从培养箱取出细胞，弃去培养基，用PBS洗一次。将黄连碱母液用培养基（DMEM（含10% FBS））稀释至20 μM/L，向每孔中加入500 μL培养基稀释好的黄连碱，放置细胞培养箱（37℃, 5% CO₂）孵育6 h。之后拿出12孔板，弃去培养基，每孔用500 μL PBS洗一次，向每孔中加500 μL 4% PFA固定15 min，吸弃固定液，用PBS洗一次。将爬片用镊子小心取出，倒扣在滴有封片剂的载玻片上，用指甲油涂边固定。避光操作及保存。拿到倒置荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察、拍照，结果如图8。由图8可知，黄连碱可荧光标记五种肿瘤细胞系核仁。

实施例6

黄连碱荧光标记细胞核仁与核仁蛋白共定位

质粒构建：将核仁蛋白B23和核仁纤维蛋白fibrilliarin CDS序列利用基因重组技术构建到pmCherry-C1载体上，形成pRFP-B23和pRFP-fibrilliarin重组质粒。

转染：将Hela细胞按50%-60% 密度提前一天铺至含有爬片的6孔板中，第二天进行细胞转染。对一种质粒，6孔板其中1孔而言，在超净工作台中首先取出2个无菌的1.5 ml EP管，向各管分别加入500μL 0.9% NaCl。然后向其中一管中加入1.5μg pRFP-B23或pRFP-fibrilliarin重组质粒，向另一管中加入6 μL PEI转染试剂。分别混匀离心静置5 min。最后将静置好的PEI转染试剂加入到质粒溶液中。混匀离心静置20 min。取出6孔板待转染细胞，吸弃培养基，用PBS洗一次，每孔加入1.5 ml 有血清（10% FBS）或无血清DMEM培养基。将静置好的PEI/质粒溶液均匀滴加到6孔板中，有血清培养基转染过夜或者无血清培养基转染4-6 h后更换成完全培养基继续培养24-36 h。

黄连碱染色：将黄连碱母液用培养基（DMEM（含10% FBS））稀释至20 μM/L。从培养箱取出细胞，弃去培养基，用PBS洗一次。向每孔中加入1.5 ml培养基稀释好的黄连碱，放置细胞培养箱（37℃, 5% CO₂）孵育6 h。之后取出6孔板，弃去培养基，每孔用1 ml PBS洗一次。向每孔中加1 ml 4% PFA固定15 min，吸弃固定液，用PBS洗一次。将爬片用镊子小心取出，倒扣在滴有封片剂的载玻片上，用指甲油涂边固定。避光操作及保存。拿到倒置荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察、拍照，结果如图9。由图9可知，黄连碱荧光标记细胞核仁能够与核仁蛋白实现定位重合。

实施例7

黄连碱荧光标记不同应激状态下的核仁

转染：将Hela细胞按20 %-30 % 密度提前一天铺至含有爬片的35 mm小皿中，第二天进行细胞转染。对于每皿而言，在超净工作台中首先取出2个无菌的1.5 ml EP管，向各管分别加入500 μL 0.9% NaCl。然后向其中一管中加入1.5μg pRFP-B23重组质粒，向另一管中加入6 μL PEI转染试剂。分别混匀离心静置5 min。最后将静置好的PEI转染试剂加入到质粒溶液中。混匀离心静置20 min。取出一小皿待转染细胞，吸弃培养基，用PBS洗一次，每孔加入1.5 ml 有血清（10% FBS）或无血清DMEM培养基。将静置好的PEI/质粒溶液均匀滴加到小皿中，有血清培养基转染过夜或者无血清培养基转染4-6 h后更换成完全培养基继续培养24 h。

加药及热应激处理：对于加药处理组，首先取适量体积 5-FU、a-Amanitin、Act D、DOX药物母液用DMEM（含10% FBS）稀释成工作浓度分别为 0.1 mM/L、1 μg/ml、0.1 μg/ml、0.3 μM/L。取出转染培养细胞，吸弃培养基，加1 ml PBS洗一次，之后每皿分别加入1.5 ml培养基稀释好的药物放置细胞培养箱（37℃, 5% CO₂）按5-FU、a-Amanitin、Act D、DOX顺序分别处理24 h、24 h、2 h、6 h。对于热应激处理组，取出转染培养细胞，吸弃培养基，加1 mlPBS洗一次，加入1.5 ml DMEM（含10% FBS）培养基。用封口膜将小皿封闭，外层套两层密封袋以防止进水。放置45.5 ℃水浴锅孵育1 h。

黄连碱染色：将黄连碱母液用培养基（DMEM（含10% FBS））稀释至20 μM/L。加药和热应激处理完毕，取出细胞，吸弃培养基，每皿用1.5 ml培养基洗一次，然后每皿加入1.5ml培养基稀释好的黄连碱，放置细胞培养箱（37℃, 5% CO₂）孵育6 h。之后取出细胞，弃去培养基，每孔用1 ml PBS洗一次。向每孔中加1 ml 4% PFA固定15 min，吸弃固定液，用PBS洗一次。将爬片用镊子小心取出，倒扣在滴有封片剂的载玻片上，用指甲油涂边固定。避光操作及保存。拿到倒置荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察、拍照。结果如图10。由图10可知，黄连碱能够对加药及热应激状态下的核仁进行荧光标记。

实施例8

黄连碱 (Coptisine) 与rDNA结合发出荧光

取一新的96孔板，按上图实验分组分别在每孔中加入200 μL PBS,然后向对应孔中加入相应体积的各物质，使得质粒DNA为2 μg/孔、RNA为2 μg/孔、BSA为2 μg/孔、黄连碱工作液为20 μM/L、DNA酶为2 μg/孔、RNA酶为10 μg/孔。加完后每孔用枪尖轻轻吹打混匀。每组设三个复孔。37 ℃ 温箱孵育2 h后拿去多功能酶标仪下检测各孔荧光强度。设置参数激发波长为460 nm,发射波长为550 nm。由此得出各孔荧光值后用Graph Prism作图，如图11。由图11可知，黄连碱 (Coptisine) 与rDNA结合发出荧光，且能够增强黄连碱的荧光亮度。

实施例9

黄连碱 (Coptisine) 能够按荧光强度将肿瘤细胞分群

前一天将Hela细胞按80 %-90 %密度铺至35 mm小皿中。第二天首先将黄连碱母液用DMEM培养基（含10 % FBS）稀释成20 μM/L工作液。取出细胞，吸除培养基，用1 ml PBS洗一次，加入1.5 ml 培养基稀释的黄连碱。放置细胞培养箱（37℃, 5% CO₂）孵育6 h。之后拿出细胞，吸除培养基，用1 ml PBS洗一次，向皿里加入500 μL 0.25% 胰酶（含EDTA）消化2-5min。然后向皿里加入500 μL DMEM（含10% FBS）终止消化，收集细胞至离心管中500 rpm离心5 min。倒掉上清，细胞用PBS重悬洗涤一次500 rpm离心5 min。离心完毕倒掉上清加入500 μL PBS重悬细胞并转移至流式管中。随后将收集的细胞上流式细胞仪检测。上图由FlowJo 7.6.1分析结果，如图12。由图12可知，黄连碱 (Coptisine)能够将一皿肿瘤细胞分成荧光强度不同的三群细胞。而使用同一方法对一皿正常原代细胞（小鼠原代耳朵成纤维细胞）进行实验时，如图13。由图13可知，黄连碱不能将一皿正常原代细胞分成荧光强度不同的三群细胞。

实施例10

黄连碱 (Coptisine) 能区分肿瘤异质性

将肿瘤细胞前一天铺至10 cm大皿中。第二天首先将黄连碱母液用DMEM培养基（含10 % FBS）稀释成20 μM/L工作液。取出大皿细胞，每皿加3 ml PBS洗一次，然后加入8 ml培养基稀释的黄连碱，对照组为每皿里同体积黄连碱的DMSO。放置细胞培养箱（37℃, 5%CO₂）孵育6 h。之后拿出细胞，吸除培养基，每皿用3 ml PBS洗一次，向皿里加入3 ml 0.25%胰酶（含EDTA）消化2-5 min。然后向皿里加入3 ml DMEM（含10% FBS）培养基终止消化，收集细胞至离心管中500 rpm离心5 min。倒掉上清，细胞用PBS重悬洗涤一次500 rpm离心5min。离心完毕倒掉上清加入1 ml PBS重悬细胞0.45 μm滤膜过滤后转移至流式管中按黄连碱荧光强弱进行流式分选。分别将黄连碱荧光强弱不同的三群细胞收集到三个单独的流式管中，进行平板克隆和软琼脂实验。

平板克隆实验：将流式分选的三群细胞及对照组细胞用DMEM（含10 % FBS）培养基稀释，去细胞计数仪下计数。每组设三个复孔，各组取1500个细胞加入9 ml的培养基制成细胞悬液。取新的6孔板，各组每孔3 ml细胞悬液均匀加入到三个孔中。轻轻晃动，使细胞充分分散，放置细胞培养箱（37℃, 5% CO₂）培养2周。期间不断观察，及时补充培养基。2周克隆长到合适大小，终止培养。将6孔板中培养基吸除，每孔用1 ml的PBS洗两次 ，加入2 ml的甲醇固定20 min，之后吸除甲醇，用PBS洗两次，每孔加入2 ml的结晶紫染色30 min，回收结晶紫，加入PBS脱色摇床清洗三次，每次5 min。晾干拍照，计算克隆数及克隆形成率。结果用GraphPad Prism 8作图统计，结果如图14。

软琼脂实验：按实验分组配制适量的1.2 % 和0.6 % 的琼脂溶液，高压蒸汽灭菌，拧紧瓶盖放置60℃ 烘箱以防凝固。配制合适体积的培养基，配方为1 ml培养基中加200 μL胎牛血清（FBS）、20 μL双抗（PS）、2X DMEM 780 μL。首先铺下层胶，从烘箱中取出1.2% 的琼脂溶液，恢复至体温左右时，取等体积的琼脂溶液和培养基混合，按每孔3 ml加入到6孔板中待其凝固。将流式分选的三群细胞及对照组细胞用上述培养基稀释，去细胞计数仪下计数。从烘箱中取出0.6 % 的琼脂溶液，恢复至体温左右时，按实验分组取等体积的琼脂溶液和培养基混合，然后按每孔接种50000个细胞，每组三个复孔加入到以上溶液中混合均匀。按每孔3 ml分别加入到铺有下层胶的各孔中作为上层胶。待上层胶凝固后，在每孔中加入2ml DMEM培养基防止表面干燥。放置细胞培养箱（37℃, 5% CO₂）培养2周，期间不断观察各孔克隆形成情况及表面液体挥发情况及时补液，结果用GraphPad Prism 8作图统计，结果如图15。图14-15可知，低荧光强度的那群细胞增殖快，恶性程度高。高荧光强度的群细胞增殖慢，恶性程度低。

实施例11

黄连碱(Coptisine)低荧光染色群鉴定

黄连碱染色：将细胞前一天铺至35 mm小皿中，第二天先将黄连碱母液用DMEM培养基（含10 % FBS）稀释成20 μM/L工作液。取出铺好的小皿细胞，每皿用1 ml PBS洗一次，之后每皿加入1.5 ml培养基稀释的黄连碱，之后放置细胞培养箱（37℃, 5% CO₂）孵育6 h。

抗体孵育及流式分析：将孵育好的细胞吸弃培养基，每皿用1 ml PBS洗一次，加入500 μL 0.25% 胰酶（含EDTA）消化2-5 min。再向每皿中加入500 μL DMEM培养基（含10 %FBS）终止消化，吹打收集到1.5 ml EP管中。500 rpm离心5 min。倒掉上清液体，向留有细胞沉淀的EP管中加入1 ml PBS洗一次。倒掉上清加1 ml PBS 重悬后等分成2个1.5 ml EP管，500 rpm离心5 min弃去上清后其中一管加入1 ml 3% BSA（PBS配制）稀释的一抗（1:200），另一管加入1 ml 3% BSA（PBS配制）稀释的同型独照IgG。轻轻重悬混匀放置4℃ 孵育2 h。之后拿出孵育好的细胞，500 rpm离心5 min，回收一抗，每管用1 ml PBS洗两次。之后每管加入1 ml 3% BSA（PBS配制）稀释的荧光二抗Alexa Fluor 594（1:1000）室温孵育2 h。之后回收二抗，每管用1 ml PBS洗两次后用500 μL PBS重悬细胞后上流式细胞仪检测。用Flowjo 7.6.1分析得出结果，如图16-17。由图16-17可知，黄连碱(Coptisine)低荧光强度细胞群干细胞Maker（CD133、LGR5）高表达，因此黄连碱(Coptisine)低荧光染色群鉴定。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.黄连碱作为荧光探针在Hela肿瘤细胞分群中应用，其特征在于，黄连碱根据荧光强度区分所述Hela肿瘤细胞的异质性，并定位所述Hela肿瘤干细胞；包括步骤：

先将Hela肿瘤细胞铺至10 cm大皿中；隔天将黄连碱母液用含10 % FBS的DMEM培养基稀释成20μM/L工作液；每皿细胞加3ml PBS洗一次后加入8ml工作液，37℃，5%的CO₂孵育6h；

取出细胞并吸除培养基，每皿用3 ml PBS清洗后加入3 ml 含EDTA的0.25%胰酶消化2-5 min；向皿里加入3 ml 含10% FBS的DMEM培养基终止消化，

收集细胞至离心管中500 rpm离心5 min，倒掉上清，细胞用PBS重悬洗涤一次500 rpm离心5min后倒掉上清，并加入1 ml PBS重悬细胞0.45 μm滤膜过滤,后转移至流式管中按黄连碱荧光强弱进行流式分选，并进行平板克隆和软琼脂实验；

平板克隆实验：将流式分选的三群细胞用含10 % FBS的DMEM培养基稀释并分别计数；每组取1500个细胞加入9 ml的培养基制成细胞悬液；取新的孔板各组每孔3 ml细胞悬液均匀加入到三个孔中使细胞充分分散，并在37℃，5%的CO₂培养2周，期间及时补充培养基；

终止培养后将孔板中的培养基吸除，每孔用1 ml的PBS洗两次，加入2 ml的甲醇固定20min，之后吸除甲醇，用PBS洗两次，每孔加入2 ml的结晶紫染色30 min，回收结晶紫，加入PBS脱色摇床清洗三次，每次5 min；晾干拍照，计算克隆数及克隆形成率；

软琼脂实验：提供1.2%和0.6 %的琼脂溶液和配方为1 ml培养基中加200 μL胎牛血清FBS、20 μL双抗PS、2X DMEM 780 μL的培养基，首先铺下层胶，即取等体积的1.2%琼脂溶液和培养基混合，按每孔3 ml加入到六孔板中待其凝固；将分选的三群细胞利用培养基稀释后计数；

取等体积的0.6%琼脂溶液和培养基混合，按每孔接种50000个细胞加入其中混合均匀；按每孔3 ml分别加入到铺有所述下层胶上作为上层胶待其凝固，后在所述上层胶上加入2ml DMEM培养基；37℃，5%的CO₂培养2周，期间不断观察各孔克隆形成情况及表面液体挥发情况及时补液，计算结果并统计。

Images