CN110129271A - 一种胶质瘤干细胞的分选方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于肿瘤细胞研究技术领域，公开了一种胶质瘤干细胞的分选方法，具体为利用还原型辅酶I的自发荧光性质，利用流式细胞分选仪对胶质瘤干细胞进行分选，该分选方法无需标记、操作简单、费用低廉、细胞毒性小、分选效果好，对分选出来的干细胞进行干性测试，结果表明，该方法分选出来的胶质瘤干细胞活性高、纯度均高于目前常用方法。此方法的建立将有力促进靶向胶质瘤干细胞治疗的研究。

Description

一种胶质瘤干细胞的分选方法

技术领域

本发明属于细胞研究技术领域，涉及一种肿瘤细胞的分选方法，特别涉及一种胶质瘤干细胞的分选方法。

背景技术

胶质瘤是我国发病率和致死率最高的中枢神经系统恶性肿瘤，胶质瘤干细胞被认为是其发生发展的根源。胶质瘤干细胞特性的研究是建立靶向胶质瘤干细胞治疗的基础，而进行这方面的研究的前提是获取高活性和高纯度的胶质瘤干细胞。至今，已建立起多种获取胶质瘤干细胞样细胞的技术方法，主要包括表面标记法、侧群(side population,SP)细胞法、细胞内酶活性(ALDH)法和悬浮培养法，但每种方法都有其自身的局限性。表面标记法是应用最广的方法，但特异性的表面分子仍未确定。SP法不适用于所有胶质瘤类型且Hoechst33342具有潜在的细胞毒性。细胞内酶活性(ALDH法)是一个动态的反应过程，分选及检测过程中存在不稳定性。悬浮培养法分离、富集效率偏低，且连续传代过程中，细胞球内的胶质瘤干细胞发生分化或自发凋亡。鉴于现有方法均存在局限性，探索新的胶质瘤干细胞分离鉴定方法成为当务之急。

还原型辅酶I(NADH)是一种具有自身荧光功能的内源性代谢辅酶，在生物体内，NADH是体内最重要的递H体和递电子体，参与能量代谢。目前需要解决的问题是如何利用NADH的自发荧光分选胶质瘤干细胞，从而提供一种无标记、无细胞毒性且富集效率高的胶质瘤干细胞分选方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种操作简单、无标记、费用低廉的胶质瘤干细胞分选方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

1.本发明提供了一种胶质瘤干细胞的分选方法，利用参与细胞代谢的物质具有自发荧光的特性，对胶质瘤干细胞进行分选。

优选的，所述参与细胞代谢的物质为还原型辅酶I(NADH)。

优选的，所述分选方法，包括以下步骤：

(1)细胞系或原代培养细胞用含有胎牛血清的DMEM培养基培养至70-80％的汇合度，经消化酶消化后悬于PBS中制成单细胞悬液；

(2)按照流式细胞分选仪器标准程序启动仪器，稳定液流，对仪器进行精准调节、精度校准后清洗仪器；

(3)将步骤(1)的单细胞悬液上机检测，设置分选参数，对胶质瘤干细胞进行分选。

优选的，步骤(1)中，所述细胞系为LN229，所述原代培养细胞为临床胶质瘤样本经原代培养所得。

优选的，步骤(1)中，所述消化酶为胰蛋白酶或Accutase；所述DMEM培养基为高糖型培养基；所述DMEM培养基中胎牛血清的体积分数为10％；所述培养条件为37℃，CO₂体积分数5％，湿度为100％；所述PBS为pH＝7.4、0.1mol/L磷酸盐缓冲液；所述单细胞悬液的浓度为1～9×10⁶个细胞/mL。

优选的，步骤(2)中，所述流式细胞分选仪器型号为BD FACSAria II或BeckmanMoflo XDP；对BD FACSAria II仪器进行精准调节的标准品为rainbow beads；对BeckmanMoflo XDP仪器进行精准调节的标准品为Beckman Calibration Beads；校准BD FACSAriaII仪器分选精度的标准品为accudrop beads；Beckman Moflo XDP仪器通过自身软件进行精度调节；所述清洗仪器的清洗液是体积分数为70％的酒精和无菌双蒸水。

优选的，步骤(3)中，所述设置分选参数为100μm喷嘴，用375nm(BD FACSAria II)或355nm(Beckman Moflo XDP)激光器激发NADH，然后用450/50nm滤光片通道对NADH的荧光进行接收，选用仪器分选的纯度模式，调整仪器侧液流的偏转角度，并将分选速度设为低速进行分选。

优选的，步骤(3)中，按照荧光强度高低，分选收集单细胞悬液中荧光强度高的10％细胞作为胶质瘤干细胞(NADH^high)，而荧光强度最弱的10％细胞作为非胶质瘤干细胞(NADH^low)。

本发明的有益效果在于：本发明直接利用NADH的自发荧光分选胶质瘤干细胞，不需要抗体或染料等外源标记，无细胞毒性；不需要购买抗体、染料或试剂盒，费用低廉；直接分选，操作简便，不仅省时且干扰因素少；本发明分选的胶质瘤干细胞纯度高、活性高。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：

图1为新鲜胶质瘤样本中胶质瘤细胞NADH自发荧光强度检测结果图；A为各胶质瘤样本中NADH荧光强度测试结果图，B为统计学结果图。

图2为LN229细胞的分选结果图及激光共聚焦显微镜图；A为LN229细胞的分选结果图；B为NADH^high亚群和NADH^low亚群的激光共聚焦显微镜图。

图3为GBM1和LN229细胞中分选的NADH^high细胞亚群较NADH^low细胞亚群显著高表达干性相关转录因子结果图；A为qRT-PCR检测结果图；B为western blot检测结果图。

图4为GBM1和LN229细胞中分选的NADH^high细胞亚群的成球能力显著高于NADH^low细胞亚群；A为极限稀释法检测NADH^high细胞亚群和NADH^low细胞亚群细胞成球能力结果图；B为NADH^high细胞亚群和NADH^low细胞亚群细胞成球体积的大小比较图。

图5为NADH^high胶质瘤细胞具有多向分化潜能结果图。

图6为NADH^high胶质瘤细胞亚群具有肿瘤干细胞特性的体内成瘤能力测试结果图；A为小鼠体内接种4×10⁵，4×10⁴，4×10³个NADH^High与NADH^Low胶质瘤细胞后，生物发光活体成像检测成瘤情况图；B为不同数量NADH^high与NADH^low胶质瘤细胞亚群在NOD/SCID小鼠皮下成瘤的大小统计图；C为为移植瘤中H&E染色，干性标记SOX2及增殖标记物Ki67免疫组化染色情况图。

图7为NADH^high胶质瘤细胞亚群与CD133+以及CD15+细胞亚群干性基因表达的比较图；A为NADH^high胶质瘤细胞亚群与CD133+细胞亚群干性基因表达的比较图；B为NADH^high胶质瘤细胞亚群与CD15+细胞亚群干性基因表达的比较图。

图8为NADH^high胶质瘤细胞亚群与CD133+以及CD15+细胞亚群成球能力的比较图；A为极限稀释法检测各细胞亚群成球能力结果图；B各细胞亚群成球体积的大小比较图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

下面将结合附图，对本发明的实施例进行详细的描述，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、NADH^high胶质瘤细胞亚群的分选及肿瘤干细胞特性鉴定

本实施例所用的主要材料及来源：LN229购买于ACTT(ATCC-CRL-2611)、原代培养细胞(GBM1)为临床胶质瘤样本经原代培养所得。

1.新鲜胶质瘤样本中胶质瘤细胞NADH荧光测定的方法如下：

(1)根据WHO分级，通过临床手术分别取4例Ⅱ级胶质瘤样本，取3例Ⅲ级胶质瘤样本，取6例Ⅳ级胶质瘤样本，将临床手术取下的各胶质瘤样本(GBM1)放在冰上，30分钟内分别用消化酶消化并悬于PBS中制成13个单细胞悬液，均将细胞浓度调整为1×10⁶个细胞/mL。

(2)按照流式细胞分选仪器BD FACSAria II标准程序，启动仪器，稳定液流，然后用rainbow beads标准品对仪器进行精准调节。

(3)将各浓度为1×10⁶个/mL的单细胞悬液分别上机检测，设置喷嘴100μm，检测条件375nm激光器激发，450/50nm滤光片接收，然后用flowjo将检测的流式图形进行叠加。

检测结果如图1所示，其中，图1中A为各胶质瘤样本中NADH荧光强度测试结果图，图1中B为统计学结果图，由图1可知，Ⅱ级与Ⅲ级中的样本NADH自发荧光强度均一，Ⅳ级中6例样本的NADH自发荧光强度变化较大，但是NADH自发荧光强度随WHO分级增加而增加。

2.利用NADH自发荧光分选LN229及GBM1细胞株NADH^high和NADH^low细胞亚群方法如下：

(1)将胶质瘤细胞系LN229或GBM1细胞株采用含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养基常规培养，培养条件为37℃、CO₂体积百分含量为5％，湿度为100％。培养到70-80％的汇合度，然后将培养的LN229或GBM1细胞株用胰酶或Accutase酶消化成单细胞，用PBS将其重悬成1×10⁶个细胞/mL的单细胞悬液。

(2)按照流式细胞分选仪器BD FACSAria II标准程序，启动仪器，稳定液流，然后用rainbow beads标准品对仪器进行精准调节。

(3)将浓度为1×10⁶个/mL的单细胞悬液上机检测，设置喷嘴100μm，375nm激光器激发，450/50滤光片接收，采用纯度模式分选，分选出荧光最强的10％和荧光强度最弱的10％。图2中A展示了对LN229细胞的分选结果，将荧光强度最强的10％的细胞定义为NADH^high亚群，将荧光强度最弱10％的细胞定义为NADH^low亚群。图2中B显示经激光共聚焦显微镜技术验证，无论是GBM1还是LN229细胞，其NADH^high细胞中的荧光强度显著强于NADH^low细胞。

3.干性相关基因表达的测定，方法如下：

从GBM1和LN229细胞系各分选出5×10⁵个NADH^high和NADH^low细胞，分别提取RNA，反转录合成cDNA，以Nanog、Oct4、Oligo2和Sox2的特异性引物进行qRT-PCR。如图3中A所示，无论是GBM1还是LN229细胞，其NADH^high细胞在mRNA水平上较NADH^low细胞显著高表达这些干性相关基因。

从GBM1和LN229细胞系各分选出6×10⁶个NADH^high细胞和NADH^low细胞，分别用RIPA裂解液裂解细胞提取总蛋白，BCA法测定总蛋白浓度，与5X加样缓冲液混合并在100℃变性10分钟，用10％SDS-聚丙稀酰胺胶进行电泳分离，然后anti-CD133、Anti-Nanog、Anti-Oct4和Anti-Sox2特异抗体进行Western blot分析。如图3中B所示，无论是GBM1还是LN229细胞，其NADH^high细胞在蛋白水平上较NADH^low细胞显著高表达这些干性相关基因。

从本实验中可以看出，利用本发明的分选方法分选出的NADH^high胶质瘤细胞亚群较NADH^low细胞亚群高表达干性相关基因。

4.NADH^high与NADH^low的细胞亚群自我更新能力的测定比较，具体方法如下：

在低粘附96孔板中加入含有20μL/mL B27、20ng/mL EGF和20ng/mL bFGF的F12培养基，100μL/孔，利用流式细胞分选仪将GBM1或LN229细胞分选出来的NADH^high细胞亚群及NADH^low亚群分别铺入低粘附96孔板中，每群细胞分为1、5、10、20、40个细胞/孔，每个数量级重复10孔。然后于37℃培养2周，显微镜下观察各孔中肿瘤球的有无，采用极限稀释算法计算各群细胞形成肿瘤球的频率。如图4中A所示，无论是GBM1还是LN229细胞，其NADH^high细胞亚群的成球能力均显著高于NADH^low细胞亚群。NADH^high细胞亚群不仅仅表现出成球能力显著高于NADH^low细胞亚群，而且所成球的体积也显著大于NADH^low细胞亚群(图4中B)。

从本实验中可以看出NADH^high细胞亚群比NADH^low细胞亚群表现出了较高的细胞成球率和成球的体积，说明NADH^high细胞亚群比NADH^low细胞亚群具有更高的自我更新的能力。

5.NADH^high胶质瘤细胞亚群具有多向分化潜能的测定，具体方法如下:

(1)分化细胞的获得

分别将从GBM1和LN229细胞中分选的NADH^high细胞分别作细胞爬片，培养于含10％FBS的完全培养基中，贴壁培养6小时的细胞作为分化前的对照细胞，贴壁培养7天后的细胞为分化细胞。

(2)NADH^high胶质瘤细胞亚群具有多向分化潜能的测定

将本实验步骤1培养的分化细胞及对照细胞在4％多聚甲醛中固定30分钟，室温下用10mM，pH7.2-7.4的PBS冲洗3次，用含10％正常山羊血清和0.3％Triton的封闭缓冲液孵育30分钟，再用稀释400倍的荧光素标记的抗Sox2抗体、抗Nestin抗体和抗GFAP抗体，在4℃孵育12小时，用Hoechst 33342对细胞核进行染色。样品经PBS洗涤后，用LeicaTCS-SP5共聚焦显微镜(63×物镜)进行检测，如图5所示，无论是GBM1还是LN229细胞，其NADH^high细胞经分化培养后，其NADH自发荧光强度显著降低，同时其干性因子Sox2和Nestin的表达显著下调，而分化因子GFAP显著上调，表明该亚群细胞具有多向分化的潜能。

6.NADH^high胶质瘤细胞亚群具有肿瘤干细胞特性的体内成瘤能力鉴定

本实施例使用5周龄雌性NOD/SCID小鼠，购自陆军军医大学实验动物中心。动物研究按照西南医院动物保护和使用机构委员会批准的协议进行。

(1)将LN229分选出来的NADH^high和NADH^low胶质瘤细胞亚群分别悬浮于PBS中并与Matrigel按1：1体积比进行混合，再分别调整细胞浓度为4×10³、4×10⁴和4×10⁵个细胞/100μL的悬液。

(2)分别将100μL NADH^high细胞浓度分别为4×10³、4×10⁴和4×10⁵个细胞/100μL的悬液接种于5周雌性NOD/SCID小鼠的左侧皮下腹股沟区，而将NADH^low细胞相应地接种于右侧皮下腹股沟区，每个浓度组各5只小鼠。

(3)接种4周后，应用生物发光成像技术(IVIS)(Perkin-Elmer，Waltham，MA)和活体图像软件(Live Image Software of IVIS)检测肿瘤生长情况，并处死小鼠，取其皮下移植瘤称重，并进行HE染色确定其肿瘤性质以及作Sox2和Ki67免疫组化染色以比较干性强弱和增殖能力大小。

结果如图6所示，图6中A为小鼠体内接种4×10⁵，4×10⁴，4×10³个NADH^High与NADH^Low胶质瘤细胞后，生物发光活体成像检测成瘤情况图；图6中B为不同数量NADH^high与NADH^low胶质瘤细胞亚群在NOD/SCID小鼠皮下成瘤的大小统计图；图6中C为为移植瘤中H&E染色，干性标记SOX2及增殖标记物Ki67免疫组化染色情况图；由图6可知，NADH^high胶质瘤细胞亚群比NADH^low胶质瘤细胞亚群具有更强的体内成瘤能力，且前者较后者所成移植瘤显示更强的Sox2和Ki67表达。

7.NADH^high胶质瘤细胞亚群与CD133+以及CD15+胶质瘤细胞亚群的体外干性特性比较，具体方法如下：

(1)GBM1和LN229胶质瘤细胞中CD133+和CD133-以及CD15+和CD15-细胞亚群的分选，具体方法为：

LN229胶质瘤细胞中CD133+和CD133-细胞亚群的分选：在分别标记为空白对照、同型对照和待测样本的3个流式管中各加入100μL浓度为1×10⁶个/100μL的LN229细胞悬液；加5μL的CD133同型对照REA Control(S)-APC(美天旎)于同型对照管中，加5μL的CD133-APC抗体(美天旎)于待测样本管中，混匀；4℃孵育30min，PBS洗涤2次；再向三个流式管中各加500μL的PBS对细胞进行重悬，将上述三个样本用BD FACSAria II流式细胞分选仪分选，分选时设置喷嘴为100μm，激光器激发波长为375nm，接收滤光片型号为450/50nm，采用纯度模式分选CD133+和CD133-细胞。

LN229胶质瘤细胞中CD15+和CD15-细胞亚群的分选：分选方法同LN229胶质瘤细胞中CD133+/-细胞分选，不同之处在于CD15同型对照为FITC Mouse IgM(Biolegend)，标记抗体为CD15-FITC抗体(Biolegend)。

GBM1胶质瘤细胞中CD133+和CD133-细胞亚群的分选：分选方法与LN229胶质瘤细胞中CD133+和CD133-细胞亚群的分选方法相同，不同之处在于用GBM1代替LN229。

GBM1胶质瘤细胞中CD15+和CD15-细胞亚群的分选：分选方法与LN229胶质瘤细胞中CD15+和CD15-细胞亚群的分选方法相同，不同之处在于用GBM1代替LN229。

(2)以NADH、CD133和CD15为标志物分选的各细胞亚群干性相关基因mRNA水平表达的比较

以qRT-PCR检测各亚群细胞中Nanog、Oct4、Olig2和Sox2的表达水平，方法如下：

用流式细胞仪分别分选5×10⁵个NADH^high/CD133+,NADH^high/CD133-,NADH^low/CD133⁺和NADH^low/CD133^-细胞，分别提取RNA，用提取出的RNA反转录合成cDNA，采用Nanog、Oct4、Oligo2与Sox2特异性引物，进行QT-PCR检测。

如图7中A所示，NADH^high/CD133⁺亚群的干性相关基因表达水平最高，NADH^low/CD133^-亚群的表达水平最低；NADH^high/CD133^-和NADH^low/CD133⁺亚群的干性基因表达水平显著高于NADH^low/CD133^-亚群而低于NADH^high/CD133⁺亚群。

用流式细胞仪分别分选5×10⁵个NADH^high/CD15⁺,NADH^high/CD15^-,NADH^low/CD15⁺和NADH^low/CD15^-细胞，分别提取RNA，用提取出的RNA反转录合成cDNA，采用Nanog、Oct4、Oligo2与Sox2特异性引物，进行QT-PCR检测。结果显示其表达趋势与NADH和CD133组合一致(图7中B)。

(3)以NADH、CD133和CD15为标志物分选的各细胞亚群成球能力的比较

以极限稀释法检测各细胞亚群的成球能力，具体方法参考具体实施例4。细胞亚群包括NADH^high/CD133⁺,NADH^high/CD133^-,NADH^low/CD133⁺和NADH^low/CD133^-与NADH^high/CD15⁺,NADH^high/CD15^-,NADH^low/CD15⁺和NADH^low/CD15^-细胞。结果如图8所示，从图8的A中可以看出：NADH^high/CD133⁺亚群的成球能力最强，NADH^low/CD133^-亚群的成球能力最弱；NADH^high/CD133^-和NADH^low/CD133⁺亚群的成球能力显著高于NADH^low/CD133^-亚群而低于NADH^high/CD133⁺亚群。NADH和CD15为标志物的亚群组合的成球能力与NADH和CD133为标志物的亚群组合的成球能力相似。从图8的B中可以看出：成球体积的大小与成球能力的大小相一致。

文献报道CD133+和CD15+干细胞亚群是相互独立的胶质瘤干细胞亚群。从本实施例可以看出，利用本发明的分选方法分选出的NADH^High胶质瘤细胞亚群具有明显的干细胞特性，但与CD133+和CD15+干细胞亚群也不完全重叠。

本发明中的流式细胞分选仪器还可以为型号为Beckman Moflo XDP的流式细胞分选仪器，该仪器的精准调节的标准品为Beckman Calibration Beads，通过自身软件进行精度调节。利用该型号仪器分选时，激光器波长为355nm。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.一种胶质瘤干细胞的分选方法，其特征在于，利用参与细胞代谢的物质自身的荧光性能，对胶质瘤干细胞进行分选。

2.根据权利要求1所述的分选方法，其特征在于，所述参与细胞代谢的物质为还原型辅酶I。

3.根据权利要求1所述的分选方法，其特征在于，所述分选方法包括以下步骤：

(1)细胞系或原代培养细胞用含有胎牛血清的DMEM培养基培养至70-80％的汇合度，经消化酶消化后悬于PBS中制成单细胞悬液；

(2)按照流式细胞分选仪器标准程序启动仪器，稳定液流，对仪器进行精准调节、精度校准后清洗仪器；

(3)将步骤(1)的单细胞悬液上机检测，设置分选参数，对胶质瘤干细胞进行分选。

4.根据权利要求3所述的分选方法，其特征在于，步骤(1)中，所述细胞系为LN229，所述原代培养细胞为临床胶质瘤样本经原代培养所得。

5.根据权利要求3所述的分选方法，其特征在于，步骤(1)中，所述消化酶为胰蛋白酶或Accutase；所述DMEM培养基为高糖型培养基；所述DMEM培养基中胎牛血清的体积分数为10％；所述培养条件为37℃，CO₂体积分数5％，100％湿度；所述PBS为pH＝7.4、0.1mol/L磷酸盐缓冲液；所述单细胞悬液的浓度为1～9×10⁶个细胞/mL。

6.根据权利要求3所述的分选方法，其特征在于，步骤(2)中，所述流式细胞分选仪器型号为BD FACSAria II或Beckman Moflo XDP；对BD FACSAria II仪器进行精准调节的标准品为rainbow beads；对Beckman Moflo XDP仪器进行精准调节的标准品为BeckmanCalibration Beads；校准BD FACSAria II仪器分选精度的标准品为accudrop beads；Beckman Moflo XDP仪器通过自身软件进行精度调节；所述清洗仪器的清洗液是体积分数为70％的酒精和无菌双蒸水。

7.根据权利要求3所述的分选方法，其特征在于，步骤(3)中，所述设置分选参数为喷嘴为100μm，流式细胞分选仪器型号为BD FACSAria II时，激光器波长为375nm，流式细胞分选仪器型号为Beckman Moflo XDP时，激光器波长为355nm，收集荧光时使用的滤光片型号为450/50nm。

8.根据权利要求3所述的分选方法，其特征在于，步骤(3)中，按照荧光强度高低，分选收集单细胞悬液中荧光强度高的10％细胞作为胶质瘤干细胞，而荧光强度最弱的10％细胞作为非胶质瘤干细胞。