CN111004847A - 一种基于copb2与nupr1的前列腺癌预测系统 - Google Patents

一种基于copb2与nupr1的前列腺癌预测系统 Download PDF

Info

Publication number
CN111004847A
CN111004847A CN201910672776.0A CN201910672776A CN111004847A CN 111004847 A CN111004847 A CN 111004847A CN 201910672776 A CN201910672776 A CN 201910672776A CN 111004847 A CN111004847 A CN 111004847A
Authority
CN
China
Prior art keywords
copb2
nupr1
expression
cells
prostate cancer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910672776.0A
Other languages
English (en)
Inventor
糜远源
祝黎洁
邵红宝
汪骏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuxi No 3 Peoples Hospital
Original Assignee
Wuxi No 3 Peoples Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuxi No 3 Peoples Hospital filed Critical Wuxi No 3 Peoples Hospital
Priority to CN201910672776.0A priority Critical patent/CN111004847A/zh
Publication of CN111004847A publication Critical patent/CN111004847A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57434—Specifically defined cancers of prostate
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57496—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving intracellular compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及生物医疗技术领域，尤其涉及一种基于COPB2与NUPR1的前列腺癌预测系统，所述系统涉及以下步骤：S1、研究COPB2、NUPR1单个或者组合的表达量与临床PCA的关系，以及与CRPC患者进展及预后相关性；S2、探索COPB2与NUPR1在前列腺癌中互相调控的关系，并探索对肿瘤增殖和侵袭的影响及其关键机制。通过本方法可为前列腺癌诊断和评估提供新指标，另一方面可明确COPB2与NUPR1蛋白互相调控的关系和具体机制，从而为将来前列腺癌的诊断治疗提供新策略。

Description

一种基于COPB2与NUPR1的前列腺癌预测系统
技术领域
本发明涉及生物医疗技术领域，尤其涉及一种基于COPB2与 NUPR1的前列腺癌预测系统。
背景技术
根据美国癌症协会2018年预测数据，前列腺癌(prostate cancer，PCA)仍是男性最常见的恶性肿瘤，其死亡率仅次于肺癌。 我国2015年新发现前列腺癌患者6.03万人，新增死亡人数为2.66 万人。依据2017年2月国家癌症中心最新数据显示，前列腺癌发病 率随着城市化发展程度逐渐上升，大城市前列腺癌发病率为 17.26/10万(居大城市男性癌症发病率第五位)，中等城市8.51/10 万，小城市<5/10万，大城市发病率几乎是小城市的4倍，前列腺 癌已成为威胁我国男性健康的重大疾病。
在前列腺癌发生的早期，雄激素受体(Androgen receptor, AR)通路发挥关键作用，雄激素阻断治疗对80％以上的患者有效， 但经过中位时间14-30个月后，几乎所有患者都将逐渐发展为雄激 素非依赖状态，即去势抵抗性前列腺癌(Castration refractoryprostate cancer,CRPC)，这是晚期前列腺癌患者死亡的主要原因， 中位生存时间小于20个月。CRPC发生机制相当复杂，目前研究表 明除AR通路发挥重要作用外，肿瘤相关通路PI3K/Akt，Ras/MAPK，TGF-β等均参与CRPC的进程。尽管多西紫 杉醇/强的松和AR阻断药(如阿比特龙、蒽杂鲁胺)能延缓CRPC进 展，但临床效果有限，因此深入研究疾病发展机理，探索新靶标及 开发有效的治疗方案依然是目前研究的热点和难点。
COPI是由7个亚基构成的七聚体复合物【亚基：ε-、α- 、β’-(COPB2)、β-、γ-、δ-、ζ-】,目前研究发现，膜泡转 运系统的正常运行是细胞发挥功能的基础，膜泡转运相关的调节蛋 白在癌症发生发展中发挥重要作用。NUPR1属于高活动性，分泌型 多肽类转录调节因子，在细胞应激反应中发挥重要作用并参与肿瘤 的转移过程。因此我们提出了一种基于COPB2与NUPR1的前列腺癌 预测系统。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一 种基于COPB2与NUPR1的前列腺癌预测系统。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种基于COPB2与NUPR1的前列腺癌预测系统，包括以下步骤：
S1、研究COPB2、NUPR1单个或者组合的表达量与临床PCA的关 系，以及与CRPC患者进展及预后相关性；
S2、探索COPB2与NUPR1在前列腺癌中互相调控的关系，并探 索对肿瘤增殖和侵袭的影响及其关键机制，所述S2具体的包括以下 步骤：
A1、Affymetrix全基因表达谱芯片的制作及IPA分析；
A2、研究COPB2与NUPR1在前列腺癌中相互调控并对肿瘤增殖 和侵袭的影响；
A3、免疫共沉淀Co-IP实验检测COPB2与NUPR1相互结合；
A4、检测COPB2与NUPR1定位变化；
A5、寻找COPB2与NUPR1互相调控下游关键信号。
优选的，所述S1中：
先收集200例前列腺癌组织标本，病理诊断200例癌及癌旁组 织；
免疫组化半定量测定组织中COPB2和NUPR1的表达；
设定染色阳性率评分标准：0％为0分；1-25％为1分；26-50％ 为2分；51-75％为3分；76-100％为4分，染色程度区分标准：无为 0分；低为1分；中为2分；高为3分；
单倍型积分值(IHS)＝染色阳性率×染色程度，高于6分为 高表达，低于6分为低表达；
将检测结果进行分组：COPB2低表达、COPB2高表达、NUPR1低 表达、NUPR1高表达、COPB2高表达+NUPR1低表达、COPB2高表达+NUPR1高表达、COPB2低表达+NUPR1低表达、COPB2低表达+NUPR1 高表达；
收集上述200例患者初诊PSA值、病理、预后资料，利用 SPSS、Fisher及卡方检验分析分类变量与COPB2和NUPR1表达量的 关系，利用Cox回归模型预测复发及进展因素，最后采用Kaplan- Meier分析绘制复发及无病生存曲线。
优选的，所述A1中具体操作步骤为：
准备COPB2干扰组和阴性对照组，每组3个复孔，提取总 RNA，RNA质检，芯片杂交、洗染和扫描，最后完成芯片上机分析；
制作火山图、散点图、聚类图、疾病与功能分析、经典通路分 析，并采用IngenuityPathway Analysis软件分析预测COPB2干扰 后关键基因的改变，通过Z-score值，激活预测蛋白NUPR1作为研 究的对象，利用生物信息学及IPA软件制作NUPR1的调控网络图。
优选的，所述A2中包括以下部分：
病毒感染细胞、
增殖、侵袭功能学实验、
裸鼠皮下成瘤实验。
所述病毒感染细胞具体步骤为：
实验设siCOPB2+siNUPR1、OE-COPB2+siNUPR1、siCOPB2、OE- COPB2、对照COPB2和对照NUPR1共6组，病毒感染PC-3/DU- 145/CWR22RV1/LNCaP细胞，预实验确定最佳MOI、感染条件及感染 效率，正式实验为感染3天后观察感染效率，每组细胞分为两份， 一份提取细胞总RNA，一份提取总蛋白，RNA→cDNA→qRT-PCR检测 3组中COPB2mRNA定量表达；根据Western Blot法步骤检测3组中 COPB2蛋白的表达。
优选的，所述增殖、侵袭功能学实验包括以下内容：
CCK8法检测细胞生长、
流式细胞周期、
流式细胞凋亡、
克隆形成检测细胞增殖能力、
划痕愈合实验检测细胞迁移能力、
检测细胞侵袭能力。
优选的，所述裸鼠皮下成瘤实验具体步骤为：
实验设siCOPB2+siNUPR1、OE-COPB2+siNUPR1、siCOPB2、OE- COPB2、对照COPB2和对照NUPR1共6组，收集密度为5×106病毒 感染对数期细胞PC-3/DU-145，与5mg/mL的基底膜基质混匀制成1 mL细胞悬液，在裸鼠右侧腋下注射0.2mL细胞悬液，含1×106细 胞数；
每5天观察记录肿瘤形成、生长情况，游标卡尺记录肿瘤长径 和短径，按公式0.5236×长径×短径2计算肿瘤体积；
接种42天后颈髓离断法处死裸鼠，完整剥出瘤体，称重，根据 测量肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线；
组织一部分Western Blot法检测COPB2和NUPR1表达情况，另 一部分制作石蜡切片，IHC检测COPB2和NUPR1的表达；
IHC和Western blot检测移植瘤组织CD31和VEGFA表达，肿瘤 微血管密度计数。
优选的，所述A3中具体步骤为：
准备PC-3/DU-145细胞，细胞或组织裂解液加入适量的COPB2 一抗，将抗体耦联到protein A sepharose上，根据表达蛋白的量， 加入不等量的细胞裂解液，加1-5μg的抗体和10μL的Protein A，Protein A为50％质量分数的悬液，用细胞裂解液补充至总体积 到1mL于4℃孵育4h；Beads通过离心沉淀下来，然后用1×HNTG buffer洗3次，每次500μL；沉淀用30μL 1×laemmLi loading 缓冲液洗脱上样，100℃加热10min进行SDS-PAGE电泳以及免疫印 迹，检测COPB2与NUPR1结合情况。
优选的，A4中具体步骤为：
实验设siCOPB2+siNUPR1、OE-COPB2+siNUPR1、siCOPB2、OE- COPB、对照COPB2和对照NUPR1共6组，生长在12mm玻片上的细 胞用冰浴的1×PBS(pH 7.4)洗3遍，然后用–20℃甲醇固定3-5 min，细胞再用0.1-0.5％的Triton X-100通透5-10min，被通透后 的细胞用PBS洗3遍后，用含50mM(NH4)2SO4的1×PBS(pH 7.4)室 温孵育5min以消除醛基，再用1×PBS(pH7.4)洗三遍，被固定后 的细胞在室温用含1％BSA的TBST(pH为7.4)封闭1h，一抗稀释 在TBST-BSA中，一抗稀释比例为：1:100-1:1000，在37℃孵育2h， 然后用TBST-BSA洗5次，每次10min。二抗稀释比例为：1:500- 1:1000，于暗处室温孵育1h，玻片用PERMAFLUOR aqueousmounting medium封闭并在室温风干，然后用激光共聚焦显微镜分析 拍摄图像检测COPB2与NUPR1定位的变化。
将样品分为前列腺癌/癌旁；CRPC/激素依赖前列腺癌两组，冰 冻切片在室温晾干，置于冰丙酮中固定5min，随后在PBS中洗两遍， 以10％羊血清封闭1h，倾去封闭液，滴加适当比例稀释的一抗，室 温孵育1-2h，PBS清洗，5min×3次，再滴加FITC耦联的羊抗兔 的IgG和罗丹明标记的phalloidin，于暗处室温孵育1h，再用PBS 清洗后，以DAPI染色1min，玻片用PERMAFLUOR aqueous mounting medium封闭并在室温风干，荧光图片在激光共聚焦显微镜上拍摄， 检测COPB2与NUPR1定位的变化。
优选的，所述A5中：
先分组：PC-3细胞的COPB2干扰/对照和COPB2过表达/对照， 通过Affymetrix全基因表达谱芯片结合质谱，后续IPA生信分析方 法，筛选下游CRPC肿瘤相关关键信号通路；
Western blot对上述关键信号蛋白进行鉴定，确定关键信号；
采用信号通路抑制剂，设对照组，通过CCK8、克隆形成和 Transwell侵袭实验观察细胞增殖和侵袭的前后变化。
本发明的有益效果是：
通过本系统可对前列腺癌分子的各个阶段的生长机理进行研究， 另一方面可明确COPB2与NUPR1蛋白互相调控的关系和具体机制。
利用本发明系统进行前列腺癌分子分型预测，能更好的判断前 列腺癌生物学行为，本发明的直接目的不是得到诊断结果，而是为 制定个性化治疗方案提供参考依据。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显 然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实 施例。
一种基于COPB2与NUPR1的前列腺癌预测系统，包括以下步骤：
S1、研究COPB2、NUPR1单个或者组合的表达量与临床PCA的关 系，以及与CRPC患者进展及预后相关性；
S2、探索COPB2与NUPR1在前列腺癌中互相调控的关系，并探 索对肿瘤增殖和侵袭的影响及其关键机制，所述S2具体的包括以下 步骤：
A1、Affymetrix全基因表达谱芯片的制作及IPA分析；
A2、研究COPB2与NUPR1在前列腺癌中相互调控并对肿瘤增殖 和侵袭的影响；
A3、Co-IP检测COPB2与NUPR1相互结合；
A4、检测COPB2与NUPR1定位变化；
A5、寻找COPB2与NUPR1互相调控下游关键信号。
所述S1中：
先收集200例前列腺癌组织标本，病理诊断200例癌及癌旁组 织；
免疫组化半定量测定组织中COPB2和NUPR1的表达；
设定染色阳性率评分标准：0％为0分；1-25％为1分；26-50％ 为2分；51-75％为3分；76-100％为4分，染色程度区分标准：无为 0分；低为1分；中为2分；高为3分；
单倍型积分值(IHS)＝染色阳性率×染色程度，高于6分为高 表达，低于6分为低表达；
将检测结果进行分组：COPB2低表达、COPB2高表达、NUPR1低 表达、NUPR1高表达、COPB2高表达+NUPR1低表达、COPB2高表达 +NUPR1高表达、COPB2低表达+NUPR1低表达、COPB2低表达+NUPR1 高表达；
收集上述200例患者初诊PSA值、病理、预后资料，利用 SPSS、Fisher及卡方检验分析分类变量与COPB2和NUPR1表达量的 关系，利用Cox回归模型预测复发及进展因素，最后采用Kaplan- Meier分析绘制复发及无病生存曲线。
所述A1中具体操作步骤为：
准备COPB2干扰组和阴性对照组，每组3个复孔，提取总 RNA，RNA质检，芯片杂交、洗染和扫描，最后完成芯片上机分析；
制作火山图、散点图、聚类图、疾病与功能分析、经典通路分 析，并采用IngenuityPathway Analysis软件分析预测COPB2干扰 后关键基因的改变，通过Z-score值，激活预测蛋白NUPR1作为研 究的对象，利用生物信息学及IPA软件制作NUPR1的调控网络图。
所述A2中包括以下部分：
病毒感染细胞、
增殖、侵袭功能学实验、
裸鼠皮下成瘤实验。
所述病毒感染细胞具体步骤为：
实验设siCOPB2+siNUPR1、OE-COPB2+siNUPR1、siCOPB2、OE- COPB2、对照COPB2和对照NUPR1等6组。病毒感染PC-3/DU- 145/CWR22RV1/LNCaP细胞，预实验确定最佳MOI、感染条件及感染 效率。正式实验为感染3天后观察感染效率(>70％)，每组细胞分为 两份，一份提取细胞总RNA，一份提取总蛋白。RNA→cDNA→qRT- PCR(按试剂盒说明操作)检测3组中COPB2mRNA定量表达(引物设 计及合成交由上海生工生物)；根据Western Blot法步骤(蛋白提 取、SDS-PAGE胶制备、上样、电泳、电转、加入一抗、清洗、加入 二抗、清洗后ECL发光剂发光检测)检测3组中COPB2蛋白的表达。 NUPR1同COPB2。
所述增殖、侵袭功能学实验包括以下内容：
CCK8法检测细胞生长：实验设siCOPB2+siNUPR1、 OE-COPB2+siNUPR1、siCOPB2、OE-COPB2、对照COPB2和对照NUPR1 等6组。病毒感染细胞后取对数期细胞按照3000cell/well铺96 孔板，每组6重复，于感染后第0、1、2、3、4和5d，培养终止前 3h，吸尽培养液后每孔加入100μL 1640+10μL CCK8混悬液，放入 37℃、5％CO2培养箱，最后酶标仪450nm检测OD值，数据统计分析 并绘制生长曲线图。
流式细胞周期：分组同上。病毒感染细胞收集，4℃预冷 1×PBS洗1次，离心10min，4℃预冷75％乙醇固定细胞过夜(或8 h)。确保每个流式检测管内细胞至少106个，1×PBS洗两次，每次 离心10min，加入2％血清1×PBS洗一次，离心10min，加入相应 细胞染色液PI(购自BD公司)，每管加300μL，重悬，室温避光15 min后，使上机细胞通过率为300-800Cell/s。FACS流式细胞仪检 测、数据分析、绘图。Western bolt检测周期相关蛋白 (CDK2，CDK4，Cyclin D1，P21等)。
流式细胞凋亡：分组同上。病毒感染细胞收集，1×bind buffer重悬细胞，细胞密度≥1×106/mL，每流式检测管100μL重 悬液。加入5μL Annexin V-7AAD及5μL PE染色(试剂盒购自BD公 司)，室温避光15min。检测前每管加入1×bind buffer 500μL，重 悬，FACS流式细胞仪检测、数据分析、绘图。Western blot检测凋 亡相关蛋白(Cleaved Caspase-3，Cleaved PARP等)。
克隆形成检测细胞增殖能力：分组同上。病毒感染细胞收集细 胞，每孔加入1000个细胞，每孔设3个复孔。细胞继续培养至10- 14天。实验终止前荧光显微镜对克隆进行拍照，1×PBS洗一次。每 孔加入1mL 4％多聚甲醛，固定细胞40min，1×PBS洗一次。每孔加 入1％结晶紫染液500μL，染细胞20min。ddH2O洗涤细胞，晾干， 数码相机拍照，克隆计数，绘制图表。
划痕愈合实验检测细胞迁移能力：分组同上。6孔板背后直尺 均匀划线，每隔0.5-1.0cm。每孔加入1×105个细胞，细胞覆盖率 90％时加入慢病毒感染细胞，12h后用20μL枪头比着直尺，垂直于 6孔板背后横线划痕，1×PBS洗3次，去掉划下的细胞，加入无血 清培养基继续培养。按0、6、8和12h取样拍照。
检测细胞侵袭能力：分组同上。人工基质膜制备(按试剂说明 书操作)，细胞无血清培养基培养24h后收集细胞，调整细胞密度 为1×106/mL，每Boyden小室(孔径8μm)上室加入200μL 105个 细胞，Boyden小室下室加入600μL的含血清完全培养基培养24-48 h；去除下室培养基，1mL 4％多聚甲醛，固定细胞40min，1×PBS 洗一次。每孔加入1％结晶紫染液500μL，染细胞20min。吸弃上室 培养基，棉签擦掉上室面细胞，倒置显微镜计数拍照，200×光镜选 择8个视野计数，取其平均值。Western blot检测上皮间质转化 EMT相关蛋白(E-cadherin，N-cadherin，Vimentin，Snail等)。
所述裸鼠皮下成瘤实验具体步骤为：
实验设siCOPB2+siNUPR1、OE-COPB2+siNUPR1、siCOPB2、OE- COPB2、对照COPB2和对照NUPR1共6组，收集密度为5×106病毒 感染对数期细胞PC-3/DU-145，与5mg/mL的基底膜基质混匀制成1 mL细胞悬液，在裸鼠右侧腋下注射0.2mL细胞悬液，含1×106细 胞数；
每5天观察记录肿瘤形成、生长情况，游标卡尺记录肿瘤长径 和短径，按公式0.5236×长径×短径2计算肿瘤体积；
接种42天后颈髓离断法处死裸鼠，完整剥出瘤体，称重，根据 测量肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线；
组织一部分Western Blot法检测COPB2和NUPR1表达情况，另 一部分制作石蜡切片，IHC检测COPB2和NUPR1的表达；
IHC和Western blot检测移植瘤组织CD31和VEGFA表达，肿瘤 微血管密度计数。
所述A3中具体步骤为：
准备PC-3/DU-145细胞，细胞或组织裂解液加入适量的COPB2 一抗，将抗体耦联到protein A sepharose上，根据表达蛋白的量， 加入不等量的细胞裂解液，加1-5μg的抗体和10μL的Protein A，Protein A为50％质量分数的悬液，用细胞裂解液补充至总体积 到1mL于4℃孵育4h；Beads通过离心沉淀下来，然后用1×HNTG buffer洗3次，每次500μL；沉淀用30μL 1×laemmLi loading 缓冲液洗脱上样，100℃加热10min进行SDS-PAGE电泳以及免疫印 迹，检测COPB2与NUPR1结合情况。
A4中具体步骤为：
实验设siCOPB2+siNUPR1、OE-COPB2+siNUPR1、siCOPB2、OE- COPB、对照COPB2和对照NUPR1共6组，生长在12mm玻片上的细 胞用冰浴的1×PBS(pH 7.4)洗3遍，然后用–20℃甲醇固定3-5 min，细胞再用0.1-0.5％的Triton X-100通透5-10min，被通透后 的细胞用PBS洗3遍后，用含50mM(NH4)2SO4的1×PBS(pH 7.4)室 温孵育5min以消除醛基，再用1×PBS(pH7.4)洗三遍，被固定后 的细胞在室温用含1％BSA的TBST(pH 7.4)封闭1h，一抗稀释在TBST-BSA中，一抗稀释比例为：1:100-1:1000，在37℃孵育2h， 然后用TBST-BSA洗5次，每次10min。二抗稀释比例为：1:500- 1:1000，于暗处室温孵育1h，玻片用PERMAFLUOR aqueousmounting medium封闭并在室温风干，然后用激光共聚焦显微镜分析 拍摄图像检测COPB2与NUPR1定位的变化。
将样品分为前列腺癌/癌旁；CRPC/激素依赖前列腺癌两组，冰 冻切片在室温晾干，置于冰丙酮中固定5min，随后在PBS中洗两遍， 以10％羊血清封闭1h，倾去封闭液，滴加适当比例稀释的一抗，室 温孵育1-2h，PBS清洗，5min×3次，再滴加FITC耦联的羊抗兔 的IgG和罗丹明标记的phalloidin，于暗处室温孵育1h，再用PBS 清洗后，以DAPI染色1min，玻片用PERMAFLUOR aqueous mounting medium封闭并在室温风干，荧光图片在激光共聚焦显微镜上拍摄， 检测COPB2与NUPR1定位的变化。
所述A5中：
先分组：PC-3细胞的COPB2干扰/对照和COPB2过表达/对照， 通过Affymetrix全基因表达谱芯片结合质谱，后续IPA生信分析方 法，筛选下游CRPC肿瘤相关关键信号通路；
Western blot对上述关键信号蛋白进行鉴定，确定关键信号；
采用信号通路抑制剂，设对照组，通过CCK8、克隆形成和Transwell侵袭实验观察细胞增殖和侵袭的前后变化。
本实施例中，通过本系统可对前列腺癌分子的各个阶段的生长 机理进行研究，另一方面可明确COPB2与NUPR1蛋白互相调控的关 系和具体机制。
利用本发明系统进行前列腺癌分子分型预测，能更好的判断前 列腺癌生物学行为，本发明的直接目的不是得到诊断结果，而是为 制定个性化治疗方案提供参考依据。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围 并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技 术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改 变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于COPB2与NUPR1的前列腺癌预测系统，其特征在于，所述系统涉及以下步骤：
S1、研究COPB2、NUPR1单个或者组合的表达量与临床PCA的关系，以及与CRPC患者进展及预后相关性；
S2、探索COPB2与NUPR1在前列腺癌中互相调控的关系，并探索对肿瘤增殖和侵袭的影响及其关键机制，所述S2具体的包括以下步骤：
A1、Affymetrix全基因表达谱芯片的制作及IPA分析；
A2、研究COPB2与NUPR1在前列腺癌中相互调控并对肿瘤增殖和侵袭的影响；
A3、Co-IP检测COPB2与NUPR1相互结合；
A4、检测COPB2与NUPR1定位变化；
A5、寻找COPB2与NUPR1互相调控下游关键信号。
2.根据权利要求1所述的一种基于COPB2与NUPR1的前列腺癌预测系统，其特征在于，所述S1中：
先收集200例前列腺癌组织标本，病理诊断200例癌及癌旁组织；
免疫组化半定量测定组织中COPB2和NUPR1的表达；
设定染色阳性率评分标准：0％为0分；1-25％为1分；26-50％为2分；51-75％为3分；76-100％为4分，染色程度区分标准：无为0分；低为1分；中为2分；高为3分；
单倍型积分值(IHS)＝染色阳性率×染色程度，高于6分为高表达，低于6分为低表达；
将检测结果进行分组：COPB2低表达、COPB2高表达、NUPR1低表达、NUPR1高表达、COPB2高表达+NUPR1低表达、COPB2高表达+NUPR1高表达、COPB2低表达+NUPR1低表达、COPB2低表达+NUPR1高表达；
收集上述200例患者初诊PSA值、病理、预后资料，利用SPSS、Fisher及卡方检验分析分类变量与COPB2和NUPR1表达量的关系，利用Cox回归模型预测复发及进展因素，最后采用Kaplan-Meier分析绘制复发及无病生存曲线。
3.根据权利要求1所述的一种基于COPB2与NUPR1的前列腺癌预测系统，其特征在于，所述A1中具体操作步骤为：
准备COPB2干扰组和阴性对照组，每组3个复孔，提取总RNA，RNA质检，芯片杂交、洗染和扫描，最后完成芯片上机分析；
制作火山图、散点图、聚类图、疾病与功能分析、经典通路分析，并采用IngenuityPathway Analysis软件分析预测COPB2干扰后关键基因的改变，通过Z-score值，激活预测蛋白NUPR1作为研究的对象，利用生物信息学及IPA软件制作NUPR1的调控网络图。
4.根据权利要求1所述的一种基于COPB2与NUPR1的前列腺癌预测系统，其特征在于：所述A2中包括以下部分：
病毒感染细胞、
增殖、侵袭功能学实验、
裸鼠皮下成瘤实验。
5.根据权利要求4所述的一种基于COPB2与NUPR1的前列腺癌预测系统，其特征在于，所述病毒感染细胞具体步骤为：
实验设siCOPB2+siNUPR1、OE-COPB2+siNUPR1、siCOPB2、OE-COPB2、对照COPB2和对照NUPR1共6组，病毒感染PC-3/DU-145/CWR22RV1/LNCaP细胞，预实验确定最佳MOI、感染条件及感染效率，正式实验为感染3天后观察感染效率，每组细胞分为两份，一份提取细胞总RNA，一份提取总蛋白，RNA→cDNA→qRT-PCR检测3组中COPB2mRNA定量表达；根据WesternBlot法步骤检测3组中COPB2蛋白的表达。
6.根据权利要求1所述的一种基于COPB2与NUPR1的前列腺癌预测系统，其特征在于，所述增殖、侵袭功能学实验包括以下内容：
CCK8法检测细胞生长、
流式细胞周期、
流式细胞凋亡、
克隆形成检测细胞增殖能力、
划痕愈合实验检测细胞迁移能力、
检测细胞侵袭能力。
7.根据权利要求4所述的一种基于COPB2与NUPR1的前列腺癌预测系统，其特征在于，所述裸鼠皮下成瘤实验具体步骤为：
实验设siCOPB2+siNUPR1、OE-COPB2+siNUPR1、siCOPB2、OE-COPB2、对照COPB2和对照NUPR1共6组，收集密度为5×106病毒感染对数期细胞PC-3/DU-145，与5mg/mL的基底膜基质混匀制成1mL细胞悬液，在裸鼠右侧腋下注射0.2mL细胞悬液，含1×106细胞数；
每5天观察记录肿瘤形成、生长情况，游标卡尺记录肿瘤长径和短径，按公式0.5236×长径×短径2计算肿瘤体积；
接种42天后颈髓离断法处死裸鼠，完整剥出瘤体，称重，根据测量肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线；
组织一部分Western Blot法检测COPB2和NUPR1表达情况，另一部分制作石蜡切片，免疫组织化学(IHC)检测COPB2和NUPR1的表达；
IHC和Western blot检测移植瘤组织CD31和VEGFA表达，肿瘤微血管密度计数。
8.根据权利要求1所述的一种基于COPB2与NUPR1的前列腺癌预测系统，其特征在于，所述A3中具体步骤为：
准备PC-3/DU-145细胞，细胞或组织裂解液加入适量的COPB2一抗，将抗体耦联到protein A sepharose上，根据表达蛋白的量，加入不等量的细胞裂解液，加1-5μg的抗体和10μL的Protein A，Protein A为50％质量分数的悬液，用细胞裂解液补充至总体积到1mL于4℃孵育4h；Beads通过离心沉淀下来，然后用1×HNTG buffer洗3次，每次500μL；沉淀用30μL1×laemmLi loading缓冲液洗脱上样，100℃加热10min进行SDS-PAGE电泳以及免疫印迹，检测COPB2与NUPR1结合情况。
9.根据权利要求1所述的一种基于COPB2与NUPR1的前列腺癌预测系统，其特征在于，A4中具体步骤为：
实验设siCOPB2+siNUPR1、OE-COPB2+siNUPR1、siCOPB2、OE-COPB、对照COPB2和对照NUPR1共6组，生长在12mm玻片上的细胞用冰浴的1×PBS(pH7.4)洗3遍，然后用–20℃甲醇固定3-5min，细胞再用0.1-0.5％的Triton X-100通透5-10min，被通透后的细胞用PBS洗3遍后，用含50mM(NH4)2SO4的1×PBS(pH7.4)室温孵育5min以消除醛基，再用1×PBS(pH7.4)洗三遍，被固定后的细胞在室温用含1％BSA的TBST(pH7.4)封闭1h，一抗稀释在TBST-BSA中，一抗稀释比例为：1:100-1:1000，在37℃孵育2h，然后用TBST-BSA洗5次，每次10min；二抗稀释比例为：1:500-1:1000，于暗处室温孵育1h，玻片用PERMAFLUOR aqueous mountingmedium封闭并在室温风干，然后用激光共聚焦显微镜分析拍摄图像检测COPB2与NUPR1定位的变化；
将样品分为前列腺癌/癌旁；CRPC/激素依赖前列腺癌两组，冰冻切片在室温晾干，置于冰丙酮中固定5min，随后在PBS中洗两遍，以10％羊血清封闭1h，倾去封闭液，滴加适当比例稀释的一抗，室温孵育1-2h，PBS清洗，5min×3次，再滴加FITC耦联的羊抗兔的IgG和罗丹明标记的phalloidin，于暗处室温孵育1h，再用PBS清洗后，以DAPI染色1min，玻片用PERMAFLUOR aqueous mounting medium封闭并在室温风干，荧光图片在激光共聚焦显微镜上拍摄，检测COPB2与NUPR1定位的变化。
10.根据权利要求1所述的一种基于COPB2与NUPR1的前列腺癌预测系统，其特征在于，所述A5中：
先分组：PC-3细胞的COPB2干扰/对照和COPB2过表达/对照，通过Affymetrix全基因表达谱芯片结合质谱，后续IPA生信分析方法，筛选下游CRPC肿瘤相关关键信号通路；
Western blot对上述关键信号蛋白进行鉴定，确定关键信号；
采用信号通路抑制剂，设对照组，通过CCK8、克隆形成和Transwell侵袭实验观察细胞增殖和侵袭的前后变化。
CN201910672776.0A 2019-07-24 2019-07-24 一种基于copb2与nupr1的前列腺癌预测系统 Pending CN111004847A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910672776.0A CN111004847A (zh) 2019-07-24 2019-07-24 一种基于copb2与nupr1的前列腺癌预测系统

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910672776.0A CN111004847A (zh) 2019-07-24 2019-07-24 一种基于copb2与nupr1的前列腺癌预测系统

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111004847A true CN111004847A (zh) 2020-04-14

Family

ID=70111436

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910672776.0A Pending CN111004847A (zh) 2019-07-24 2019-07-24 一种基于copb2与nupr1的前列腺癌预测系统

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111004847A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024101357A1 (ja) * 2022-11-07 2024-05-16 Ｉｓｍ株式会社 コートマータンパク質複合体サブユニットベータ２に対する抗体

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140045915A1 (en) * 2010-08-31 2014-02-13 The General Hospital Corporation Cancer-related biological materials in microvesicles
CN108490180A (zh) * 2018-03-12 2018-09-04 南通大学附属医院 EphA8基因在制备胃癌药物及其诊断试剂盒中的应用
CN108535480A (zh) * 2018-03-05 2018-09-14 南通大学附属医院 EphA8基因在制备抗乳腺癌药物及其诊断试剂盒中的应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140045915A1 (en) * 2010-08-31 2014-02-13 The General Hospital Corporation Cancer-related biological materials in microvesicles
CN108535480A (zh) * 2018-03-05 2018-09-14 南通大学附属医院 EphA8基因在制备抗乳腺癌药物及其诊断试剂盒中的应用
CN108490180A (zh) * 2018-03-12 2018-09-04 南通大学附属医院 EphA8基因在制备胃癌药物及其诊断试剂盒中的应用

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024101357A1 (ja) * 2022-11-07 2024-05-16 Ｉｓｍ株式会社 コートマータンパク質複合体サブユニットベータ２に対する抗体

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ortiz-Sánchez et al. Characterization of cervical cancer stem cell-like cells: phenotyping, stemness, and human papilloma virus co-receptor expression
Mimeault et al. Pathobiological implications of the expression of EGFR, pAkt, NF-κB and MIC-1 in prostate cancer stem cells and their progenies
Ding et al. Semaphorin 4F as a critical regulator of neuroepithelial interactions and a biomarker of aggressive prostate cancer
SK5592000A3 (en) Determination of cellular growth abnormality
Dalley et al. Organotypic culture of normal, dysplastic and squamous cell carcinoma‐derived oral cell lines reveals loss of spatial regulation of CD44 and p75NTR in malignancy
US11292851B2 (en) Synthetic peptide, relative artificial antigen, relative anti-EHD2 antibody and preparation method thereof and use thereof
US11834682B2 (en) Method for identifying anti-cancer agents using an in vitro cell culture system that maintains cancer cell stemness
Pierce et al. SIX2 effects on Wilms tumor biology
Li et al. Biological and clinical significance of p75NTR expression in laryngeal squamous epithelia and laryngocarcinoma
Liu et al. Decreased expression of Sushi Domain Containing 2 correlates to progressive features in patients with hepatocellular carcinoma
Cane et al. Characterization of cancer stem cells in renal clear cell carcinoma
CN111004847A (zh) 一种基于copb2与nupr1的前列腺癌预测系统
Bourouba et al. Epidermal growth factor receptor (EGFR) abundance correlates with p53 and Bcl-2 accumulation and patient age in a small cohort of North African nasopharyngeal carcinoma patients
He et al. Overexpression of amplified in breast cancer 1 (AIB1) gene promotes lung adenocarcinoma aggressiveness in vitro and in vivo by upregulating CXC motif chemokine receptor 4
CN112226508A (zh) 一种与乳腺癌发生发展相关的蛋白/基因ifi30的应用
Lee et al. A novel 3D pillar/well array platform using patient-derived head and neck tumor to predict the individual radioresponse
Lim et al. Expression of cancer stem cell marker during 4-nitroquinoline 1-oxide-induced rat tongue carcinogenesis
CN107236709B (zh) 来源于肺转移灶的高转移人卵巢癌细胞系及其建立和应用
Musielak et al. Biological heterogeneity of primary cancer-associated fibroblasts determines the breast cancer microenvironment
Jiang et al. Visualization of early prostatic adenocarcinoma as a stem cell disease
CN108872603B (zh) 一种用于肝癌干细胞的鉴定方法
Alshammari et al. Expression of CK19, CD56, and Galectin-3 tumor markers in different types of thyroi d carcinoma
CN108931633B (zh) 胆囊癌诊断和预后判断标志物pim1
CN109529018A (zh) Atxn2l用于制备逆转胃癌奥沙利铂耐药的药物的用途
CN108593917A (zh) 脑胶质瘤相关间充质干细胞参与肿瘤血管拟态的检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination