CN111166896B - 基于小檗碱募集lrsam 1降解bcr-abl1的治疗慢性粒细胞白血病的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于募集LRSAM1降解BCR‑ABL1融合蛋白的治疗慢性粒细胞白血病的试剂盒，所述试剂盒含有高表达LRSAM1基因的重组载体；所述LRSAM1基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。本发明首次发现小檗碱处理后，LRSAM1参与到小檗碱诱导的BCR‑ABL1蛋白的自噬降解中，LRSAM1的高表达直接导致BCR‑ABL1蛋白表达量的降低。这为治疗慢性粒细胞白血病提供新的思路，本发明提供了一种含有高表达LRSAM1基因的重组载体的试剂盒，该重组载体转入慢性粒细胞白血病细胞后，能有效低降低BCR‑ABL1蛋白表达量，并促进BCR‑ABL1蛋白的自噬降解，起到治疗效果。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种基于募集LRSAM 1降解BCR-ABL1融合蛋白的治疗慢性粒细胞白血病(CML)的试剂盒。
背景技术
慢性粒细胞白血病(CML)是BCR-ABL1癌基因转化原始造血细胞的结果。BCR/ABL癌基因表达量的激增和BCR-ABL1融合蛋白的高活性是慢性粒细胞白血病的重要体现。
在先申请CN105616409B和CN107823205A公开了小檗碱(BBR)通过促使BCR-ABL1融合蛋白降解进而治疗CML的报道。然而，上述两份专利对于BBR促使融合蛋白降解的深入的分子机制并未做深入地研究。
发明内容
为了对治疗CML提供新的途径，本发明的目的在于提供一种基于募集LRSAM 1降解BCR-ABL1融合蛋白的治疗慢性粒细胞白血病的试剂盒，该试剂盒含有高表达LRSAM1的重组载体，LRSAM1降解BCR-ABL1融合蛋白，达到治疗CML的目的。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种治疗慢性粒细胞白血病的试剂盒，该试剂盒含有高表达LRSAM1基因的重组载体；
所述LRSAM1基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；
在先前专利(CN105616409B和CN107823205A)研究的基础上，本发明发现BBR通过自噬溶酶体途径募集LRSAM 1降解BCR-ABL1融合蛋白。因此，向白血病细胞中转入高表达LRSAM1的重组载体，是治疗慢性粒细胞白血病慢性粒细胞白血病的新策略。
所述高表达LRSAM1的重组载体，是将LRSAM1基因的核苷酸序列重组于表达载体上得到；
所述的表达载体为易锦生物Lv203载体；
所述的高表达LRSAM1的重组载体，通过以下步骤得到：
(1)在LRSAM1的核苷酸序列的5'端加上NdeI酶切位点，在3'端加上BamHI酶切位点，得到含有NdeI和BamHI双酶切位点的序列；
(2)利用NdeI和BamHI限制性内切酶分别双酶切步骤(1)最终得到的序列以及表达载体；双酶切后的序列与双酶切后的表达载体连接，得到高表达LRSAM1的重组载体。
将试剂盒中的高表达LRSAM1的重组载体按照lipo3000试剂说明书对重组载体进行转化，转化入慢性粒细胞白血病细胞中并使用嘌呤霉素进行筛选，高表达的LRSAM1降解BCR-ABL1融合蛋白，达到治疗慢性粒细胞白血病的目的；
所述的慢性粒细胞白血病细胞是K562、KCL22或BaF3-P210中的一种以上。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明首次发现小檗碱处理后，LRSAM1参与到小檗碱诱导的BCR-ABL1蛋白的自噬降解中，LRSAM1的高表达直接导致BCR-ABL1蛋白表达量的降低。这为治疗慢性粒细胞白血病提供新的思路，本发明提供了一种含有高表达LRSAM1基因的重组载体的试剂盒，该重组载体转入慢性粒细胞白血病细胞后，能有效低降低BCR-ABL1蛋白表达量，并促进BCR-ABL1蛋白的自噬降解，起到治疗效果。
附图说明
图1是小檗碱通过募集LRSAM1诱导BCR-ABL1自噬降解的有关实验结果；其中，A是检测免疫沉淀产物的Western blotting的结果，B是共聚焦显微镜检测结果，C是测定LRSAM1蛋白表达水平的Western blotting的结果，D和F是测定BCR-ABL1蛋白表达水平的Western blotting的结果，E是测定自噬相关蛋白表达水平的Western blotting的结果。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：小檗碱通过募集LRSAM1来介导BCR-ABL1的自噬降解
使用BBR(5μM)处理K562细胞12h、24h、48h后，使用免疫沉淀的方法对细胞中的BCR-ABL1进行免疫沉淀(IP)，并对免疫沉淀的产物进行质谱鉴定，以检测细胞中小檗碱作用前后BCR-ABL1募集了哪些蛋白参与小檗碱介导的BCR-ABL1蛋白的降解。
免疫沉淀具体步骤如下：
(1)收获细胞(K562细胞)，加入适量细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)，冰上或者4℃裂解30min，12,000g离心30min后取上清；
(2)取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg BCR抗体和50μlprotein A/G-beads加入到细胞裂解液，4℃缓慢摇晃孵育过夜；
(3)免疫沉淀反应后，在4℃以3,000g速度离心5min，将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次；最后加入15μl的2×SDS加样缓冲液，沸水煮10分钟；
(4)Western blotting分析免疫沉淀产物。
用BBR(5μM)处理K562细胞12h、24h、48h，用Western blotting法测定LRSAM1蛋白表达水平，结果表明LRSAM1蛋白被BBR上调(图1C)。
用BBR(5μM)处理K562细胞24h，用抗BCR抗体进行免疫沉淀。为了检测免疫沉淀物中的蛋白质，用BCR和LRSAM1抗体检测免疫沉淀产物(图1A)。结果显示小檗碱可以募集LRSAM1来参与其降解。
K562细胞用BBR(5μM)处理24小时。收集后，用抗ABL(绿色)或抗LRSAM1(红色)抗体染色细胞，用共聚焦显微镜检测信号(图1B)。结果显示小檗碱作用后LRSAM1和BCR-ABL1发生了共定位。
以上实验结果证实小檗碱作用后K562细胞中LRSAM1与BCR-ABL1的相互作用(图1A，B)。这一结果推测出LRSAM1可能被BCR-ABL1招募参与BBR诱导的降解。
实施例2：LRSAM1过表达降低BCR-ABL1蛋白的表达水平
为了验证LRSAM1可能介导BBR引起的BCR-ABL1的蛋白降解的假设，使用LRSAM1过表达质粒在K562细胞中过表达LRSAM1蛋白。
LRSAM1过表达质粒的构建方法如下：
(1)在LRSAM1的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.1)的5'端加上NdeI酶切位点，在3'端加上BamHI酶切位点，得到含有NdeI和BamHI双酶切位点的序列；
(2)利用NdeI和BamHI限制性内切酶分别双酶切步骤(1)最终得到的序列以及表达载体(易锦生物Lv203载体)；双酶切后的序列与双酶切后的表达载体连接，得到LRSAM1过表达质粒。
将LRSAM1过表达质粒按照lipo3000试剂说明书对重组载体进行转化，转化入K562细胞中并使用嘌呤霉素进行筛选。
通过Western blot的方法验证LRSAM1的过表达效果，并检测了细胞中BCR-ABL1蛋白的表达。
结果发现LRSAM1蛋白过表达后，检测到BCR-ABL1的下调(图1D左)。
实施例3：LRSAM1敲低促进了BCR-ABL1蛋白的表达水平
本实施例设计了针对LRSAM1基因的siRNA序列(SEQ.ID.NO.2)，使用lipo2000转染该序列进入K562细胞，来靶向抑制LRSAM1的表达，建立LRSAM1基因敲除K562细胞系。
转染步骤如下：
(1)在24孔板中进行，铺板使得细胞密度为50％。
(2)第二天(24小时后)每个孔转染方式如下：
A将100nmol siRNA溶于50μl Opti-mem无血清培养基中。
B将1μl lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C将A B两管混合，放置20min。
(3)转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400μl。将C管mix加入24孔板对应孔中，6小时候换成有血清培养基。处理48h后，提取蛋白，检测LRSAM1的表达，并同时检测BCR-ABL1蛋白的表达。
建立LRSAM1基因敲除的K562细胞后，检测细胞中BCR-ABL1蛋白的表达。结果发现，LRSAM1表达被抑制后，BCR-ABL1蛋白的表达增加了，说明LRSAM1参与了BCR-ABL1蛋白的降解(图1D右)。
在实施例2和3两个实施例中，LRSAM1的表达与BCR-ABL1的表达呈负相关。
实施例4：LRSAM1参与了小檗碱介导的BCR-ABL1蛋白的自噬降解
为了揭示LRSAM1确实参与了BCR-ABL1的自噬降解，本实施例探究了LC3-II、BECN1和P62自噬溶酶体相关蛋白在K562细胞过度表达LRSAM1前后的表达量。
LRSAM1过表达质粒(构建方法同实施例2)的转染步骤：
(1)接种细胞至70-90％汇合度时转染；
(2)使用Opti-MEM培养基稀释试剂(2管)，充分混匀；
(3)使用Opti-MEM培养基稀释LRSAM1过表达质粒，制备质粒预混液，然后添加P3000TM试剂，充分混匀；
(4)在每管已稀释的试剂中加入稀释的质粒预混液(1:1)，室温孵育5分钟；
(5)加入DNA-脂质体复合物至细胞中，37℃孵育细胞48h。然后分析转染细胞中LRSAM1的表达情况，并同时检测细胞中自噬相关蛋白LC3-II、BECN1和P62的表达情况。
发现LRSAM1过表达后，自噬相关蛋白LC3-II、BECN1表达量提高，P62表达量下降(图1E)，表明LRSAM1激活了自噬途径。
使用自噬抑制剂CQ(10uM，处理细胞LRSAM1过表达的细胞24h)，使用Westernblotting的方法检测细胞中BCR-ABL1蛋白的表达，结果显示自噬抑制剂CQ可逆转LRSAM1过表达降低的BCR-ABL1的表达(图1F)。
结论：LRSAM1参与了小檗碱介导的BCR-ABL1蛋白的自噬降解。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 暨南大学
<120> 基于小檗碱募集LRSAM 1降解BCR-ABL1的治疗慢性粒细胞白血病的试剂盒
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3450
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens )
<220>
<223> H3334 ORF
<400> 1
atggggcagc agcctggaaa agtacttggg gaccaaagaa ggccaagctt gcctgccctg 60
cattttatca aaggagcagg gaagaaggaa tcatcgaggc atgggggtcc acactgcaat 120
gtttttgtgg aacatgaagc ccttcagcgg ccagtagcat ctgactttga gcctcagggt 180
ctgagtgaag ccgctcgttg gaactccaag gaaaaccttc tcgctggacc cagtgaaaat 240
gaccccaacc ttttcgttgc actgtatgat tttgtggcca gtggagataa cactctaagc 300
ataactaaag gtgaaaagct ccgggtctta ggctataatc acaatgggga atggtgtgaa 360
gcccaaacca aaaatggcca aggctgggtc ccaagcaact acatcacgcc agtcaacagt 420
ctggagaaac actcctggta ccatgggcct gtgtcccgca atgccgctga gtatctgctg 480
agcagcggga tcaatggcag cttcttggtg cgtgagagtg agagcagtcc tggccagagg 540
tccatctcgc tgagatacga agggagggtg taccattaca ggatcaacac tgcttctgat 600
ggcaagctct acgtctcctc cgagagccgc ttcaacaccc tggccgagtt ggttcatcat 660
cattcaacgg tggccgacgg gctcatcacc acgctccatt atccagcccc aaagcgcaac 720
aagcccactg tctatggtgt gtcccccaac tacgacaagt gggagatgga acgcacggac 780
atcaccatga agcacaagct gggcgggggc cagtacgggg aggtgtacga gggcgtgtgg 840
aagaaataca gcctgacggt ggccgtgaag accttgaagg aggacaccat ggaggtggaa 900
gagttcttga aagaagctgc agtcatgaaa gagatcaaac accctaacct ggtgcagctc 960
cttggggtct gcacccggga gcccccgttc tatatcatca ctgagttcat gacctacggg 1020
aacctcctgg actacctgag ggagtgcaac cggcaggagg tgaacgccgt ggtgctgctg 1080
tacatggcca ctcagatctc gtcagccatg gagtacctgg agaagaaaaa cttcatccac 1140
agagatcttg ctgcccgaaa ctgcctggta ggggagaacc acttggtgaa ggtagctgat 1200
tttggcctga gcaggttgat gacaggggac acctacacag cccatgctgg agccaagttc 1260
cccatcaaat ggactgcacc cgagagcctg gcctacaaca agttctccat caagtccgac 1320
gtctgggcat ttggagtatt gctttgggaa attgctacct atggcatgtc cccttacccg 1380
ggaattgacc tgtcccaggt gtatgagctg ctagagaagg actaccgcat ggagcgccca 1440
gaaggctgcc cagagaaggt ctatgaactc atgcgagcat gttggcagtg gaatccctct 1500
gaccggccct cctttgctga aatccaccaa gcctttgaaa caatgttcca ggaatccagt 1560
atctcagacg aagtggaaaa ggagctgggg aaacaaggcg tccgtggggc tgtgagtacc 1620
ttgctgcagg ccccagagct gcccaccaag acgaggacct ccaggagagc tgcagagcac 1680
agagacacca ctgacgtgcc tgagatgcct cactccaagg gccagggaga gagcgatcct 1740
ctggaccatg agcctgccgt gtctccattg ctccctcgaa aagagcgagg tcccccggag 1800
ggcggcctga atgaagatga gcgccttctc cccaaagaca aaaagaccaa cttgttcagc 1860
gccttgatca agaagaagaa gaagacagcc ccaacccctc ccaaacgcag cagctccttc 1920
cgggagatgg acggccagcc ggagcgcaga ggggccggcg aggaagaggg ccgagacatc 1980
agcaacgggg cactggcttt cacccccttg gacacagctg acccagccaa gtccccaaag 2040
cccagcaatg gggctggggt ccccaatgga gccctccggg agtccggggg ctcaggcttc 2100
cggtctcccc acctgtggaa gaagtccagc acgctgacca gcagccgcct agccaccggc 2160
gaggaggagg gcggtggcag ctccagcaag cgcttcctgc gctcttgctc cgcctcctgc 2220
gttccccatg gggccaagga cacggagtgg aggtcagtca cgctgcctcg ggacttgcag 2280
tccacgggaa gacagtttga ctcgtccaca tttggagggc acaaaagtga gaagccggct 2340
ctgcctcgga agagggcagg ggagaacagg tctgaccagg tgacccgagg cacagtaacg 2400
cctcccccca ggctggtgaa aaagaatgag gaagctgctg atgaggtctt caaagacatc 2460
atggagtcca gcccgggctc cagcccgccc aacctgactc caaaacccct ccggcggcag 2520
gtcaccgtgg cccctgcctc gggcctcccc cacaaggaag aagctggaaa gggcagtgcc 2580
ttagggaccc ctgctgcagc tgagccagtg acccccacca gcaaagcagg ctcaggtgca 2640
ccagggggca ccagcaaggg ccccgccgag gagtccagag tgaggaggca caagcactcc 2700
tctgagtcgc cagggaggga caaggggaaa ttgtccaggc tcaaacctgc cccgccgccc 2760
ccaccagcag cctctgcagg gaaggctgga ggaaagccct cgcagagccc gagccaggag 2820
gcggccgggg aggcagtcct gggcgcaaag acaaaagcca cgagtctggt tgatgctgtg 2880
aacagtgacg ctgccaagcc cagccagccg ggagagggcc tcaaaaagcc cgtgctcccg 2940
gccactccaa agccacagtc cgccaagccg tcggggaccc ccatcagccc agcccccgtt 3000
ccctccacgt tgccatcagc atcctcggcc ctggcagggg accagccgtc ttccaccgcc 3060
ttcatccctc tcatatcaac ccgagtgtct cttcggaaaa cccgccagcc tccagagcgg 3120
atcgccagcg gcgccatcac caagggcgtg gtcctggaca gcaccgaggc gctgtgcctc 3180
gccatctcta ggaactccga gcagatggcc agccacagcg cagtgctgga ggccggcaaa 3240
aacctctaca cgttctgcgt gagctatgtg gattccatcc agcaaatgag gaacaagttt 3300
gccttccgag aggccatcaa caaactggag aataatctcc gggagcttca gatctgcccg 3360
gcgacagcag gcagtggtcc agcggccact caggacttca gcaagctcct cagttcggtg 3420
aaggaaatca gtgacatagt gcagaggtag 3450
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccacgataat cagctgaca 19
Claims (1)
1.一种高表达LRSAM1的重组载体在制备慢性粒细胞白血病治疗药物中的应用，其特征在于：
所述的治疗药物含有高表达LRSAM1基因的重组载体；所述高表达LRSAM1的重组载体，是将LRSAM1基因的核苷酸序列重组于表达载体上得到；
所述的高表达LRSAM1的重组载体，通过以下步骤得到：
（1）在LRSAM1的核苷酸序列的5'端加上NdeI 酶切位点，在3'端加上BamHI 酶切位点，得到含有NdeI 和BamHI 双酶切位点的序列；
（2）利用NdeI 和BamHI 限制性内切酶分别双酶切步骤（1）最终得到的序列以及表达载体；双酶切后的序列与双酶切后的表达载体连接，得到高表达LRSAM1的重组载体；所述的表达载体为Lv203载体；
将治疗药物中的高表达LRSAM1的重组载体转化入慢性粒细胞白血病细胞中并使用嘌呤霉素进行筛选，高表达的LRSAM1降解BCR-ABL1融合蛋白；
所述的慢性粒细胞白血病细胞是K562、KCL22或BaF3-P210中的一种以上。
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