KR101996440B1 - 암 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 자세하게는 REP1(Rab escort protein-1)의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하여, 암 세포의 생존 및 증식을 억제할 수 있는 조성물에 관한 것으로, 암 세포 내에서 EGFR 관련 세포신호전달 활성을 매우 효과적으로 억제함으로써, 암 세포의 증식을 억제할 뿐만 아니라 암 세포의 사멸을 유도하여 암의 예방 또는 치료에 현저한 효과를 발휘할 수 있다. 또한, 상기 REP1 단백질은 정상 대조군과 비교하여 암 환자 및 암 세포 내에서만 현저하게 높게 발현되는 단백질에 해당하여 암을 효과적으로 진단할 수 있는 정보를 제공함으로써, 조기에 암을 진단하여 치료 효과를 상승시킬 수 있다.

Description

암 예방 또는 치료용 약학 조성물{PHAMARCEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING CANCER}

본 발명은 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 자세하게는 REP 1(Rab escort protein-1)의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하여, 암 세포의 생존 및 증식을 억제할 수 있는 조성물에 관한 것이다.

암은 세포가 비 정상적으로 무한히 증식함으로써 정상적인 세포의 기능을 방해하는 질병으로, 주위 조직이나 장기에 침입하여 정상 조직의 파괴를 초래한다. 이와 같은 암은 그 발생 부위가 특별하게 한정되지 않고, 현재까지 발생 원인에 대해 다양한 분야에서 연구 중으로, 정상적인 세포의 유전자에 돌연변이가 생겨난 경우를 그 일 예로 들 수 있다.

유전자 발현의 이상은 대부분 암에서 공통적인 특징으로 나타나는 조절불능의 세포 성장 및 탈분화와 밀접하게 관련되어 있다. 유전자 발현과 암의 발병 또는 진행과의 관계에 기초하여 정상 세포 대비 암 세포에서 특이적으로 과 발현되거나 또는 그 발현이 억제되는 유전자를 탐색하면 암 진단이나 치료의 표적을 개발할 수 있다. 이에, 특정 암에 대한 유전적 원인이 규명되고 그에 근거한 진단 및 치료 방법이 개발을 위하여 연구가 진행 중에 있으나, 보다 더 효과적인 암의 진단과 치료를 위해서는 표적 유전자에 대한 규명이 필요하다.

한편, 표피 성장 인자 수용체(EGFR)의 활성화는 EGF 매개 세포 증식, 분화 세포 운동성 및 세포 생존에 중요한 다양한 세포신호전달 경로의 활성화를 유도한다. 이렇게 활성화가 유도되는 EGFR의 발현과 활성화는 정상 조직에서 항상성을 유지할 수 있도록 엄격하게 유지되어야 한다. 따라서, 특정 단백질의 과발현 또는 돌연변이로 인한 EGFR의 과잉 활성화로 인한 조절 장애 등은 인간의 암의 병인 발생과 매우 밀접하게 연관되어 있다. 상기 EGFR의 엑손 2 ~ 7의 결실은 리간드(ligand)의 결합 없이도 활성화가 유도되는 EGFR 변이 Ⅲ을 유도하며, 이러한 현상은 교모세포종(Glioblastoma)에서 가장 흔하게 발견되는 돌연변이에 해당하며, 엑손 19에서의 EGFR 결실 및 L858R과 같은 돌연변이는 티로신 키나아제 억제제(Tyrosine kinase inhibitor)에 민감한 폐암에서 흔하게 발견되는 돌연변이에 해당한다. EGFR 돌연변이 중에서 가장 흔하게 발견되는 2차 돌연변이는 EGFR의 T790M 돌연변이로, 제피티닙(Gefitinib)에 대한 내성을 유발한다.

세포 표면의 EGFR 수준은 원형질막에서 세포질로의 EGFR 트래피킹에 의해 조절될 수 있으며, 그 반대로의 기작도 가능하다. EGFR에 결합하는 리간드는 EGFR의 엔도사이토시스(endocytosis)를 유도하고, 내부에 위치된 EGFR은 세포 표면으로 재순환되거나, 계속적인 EGFR의 신호 전달을 약화시키기 위해 리소좀에서 분해될 수 있도록 한다. 유전적인 이유 등으로 인한 결함이 있는(Internalization-defective) EGFR 돌연변이는 리간드가 유도하는 리소좀 분해 경로를 회피하여 세포 신호 전달과 종양의 발달을 계속해서 유도할 수 있게 되어, 이와 같은 현상을 억제하는 것이 암 치료에 매우 중요한 것으로 간주되고 있다.

Targeting the EGFR signaling pathway in cancer therapy (Expert Opin Ther Targets. 2012 January; 16(1): 15-31)

본 발명의 일 목적은 REP1(Rab escort protein-1)을 코딩하는 mRNA 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 REP1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 진단용 조성물을 포함하는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명자들은 REP1(Rab escort protein-1) 단백질이 세포 내에서 EGFR과 관련된 세포 신호전달과 관련된 단백질의 발현을 유도하여, 암의 발생 및 암 세포의 생존 유지에 관련이 있고, 상기 REP1을 코딩하는 mRNA에 특이적인 발현 억제제를 투여하는 경우 암 세포의 사멸을 유도하고, 증식을 억제할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 일 구현 예는 REP1(Rab escort protein-1) 단백질을 코딩하는 mRNA의 발현을 억제하는 mRNA 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공할 수 있다.

단, 본 발명에서 상기 "REP1(Rab escort protein-1)"은 EGFR의 재사용이나 리소좀 내에서 분해 시 Rab 게라닐게나닐트랜스퍼라제 2(Rab geranylgeranyltransferase 2)에 의해 매개되는 Rab GTPase의 게라닐-게라닐 변형에 작용한다. REP1을 코딩하는 유전자에 발생하는 돌연변이는 망막 색소 상피(RPE), 광 수용체 및 맥락막의 퇴행을 특징으로 하는 Choroideremia(CHM)으로 알려진 X 유전자 연관된 안 질환을 초래하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 목적상 상기 REP1 단백질을 코딩하는 mRNA는 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나로 표시되는 것으로, 상기 서열번호 1 내지 서열번호 3은 REP1 단백질을 코딩하는 mRNA의 변이체(Variant)일 수 있다.

본 발명에서 상기 "mRNA 발현 억제제"는 mRNA에 상보적으로 결합하여 상기 mRNA가 코딩하는 단백질의 발현을 억제하는 것으로, 바람직하게는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 micro RNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 shRNA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 shRNA는 형질감염 되었을 때, 분해 속도가 낮고, 회전율이 높기 때문에 목적하는 바를 더욱 효과적으로 이룰 수 있다.

본 발명에서 상기 "siRNA"는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA) 또는 침묵 RNA(silencing RNA)로, 길이가 20 내지 25 염기쌍을 가지며, RNAi 경로 내에서 작동하는 이중가닥 RNA 분자이다. 본 발명에서 상기 siRNA는 REP1 단백질을 코딩하는 mRNA의 일부에 상보적인 서열을 가지고, 바람직하게는 서열번호 4 또는 서열번호 5로 표시되는 뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 "상보적인"은 핵산이 전통적인 왓슨 - 크릭 (Watson-Crick) 또는 다른 비 전통적 유형에 의해 또 다른 핵산 서열과 수소 결합을 형성 할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명의 일 구체 예에서 상기 암은 폐암, 대장암, 자궁경부암, 유방암, 항문암, 머리 및 목 암, 아교세포종(Glioblastoma), 난소암, 위암, 방광암, 간암, 백혈병, 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있고, 바람직하게는 폐암, 대장암 및 자궁경부암으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으나, EGFR(Epidermal growth factor receptor)이 높은 수준으로 발현됨으로써 암 세포의 생존 또는 성장을 유지하는 경우를 나타내는 암이라면 이에 제한되지 아니하고 모두 포함될 수 있다.

한편, 본 발명에서, "예방"은 본 발명의 약학 조성물을 이용하여 암으로 인해 발생한 증상을 차단하거나, 그 증상을 억제 또는 지연시키는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서, "치료"는 본 발명의 약학 조성물을 이용하여 암으로 인해 발생한 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 약학 조성물은 단독으로 사용할 수 있지만, 치료 효율을 증가시키기 위해 방사선 요법과 같은 다른 항암 치료법과 병용하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

그 일 예로, 본 발명의 약학 조성물은 추가로 다른 항암제와 병용 투여할 수 있다. 상기 항암제는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 소라페닙, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 카페시타빈, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 나벨빈, 파드라졸, 타목시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴, 5FU, 보리노스텟, 엔티노스텟 및 카르무스틴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약제적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.

한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.

본 발명의 다른 구현 예에서는 REP1(Rab escort protein-1) 단백질의 수준 또는 이를 코딩하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 암 진단용 조성물에서 상기 REP1 단백질, 및 암에 관한 내용은 상기 약학 조성물에서 기재한 바와 중복되어, 이하 구체적인 기재를 생략한다.

본 발명에서, 상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 mRNA와 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 목적상 상기 REP1 단백질을 코딩하는 mRNA의 서열은 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 표시되는 뉴클레오티드 일 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다.

본 발명에서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 REP1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.

본 발명에서 상기 "항체"는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 상기 항체의 단편들도 포함될 수 있다. 또한, 상기 항체는 인간화 항체 등의 특수 항체 및 인간 항체 등도 포함되며, 신규한 항체 외에도 이미 당해 기술분야에서 공지된 항체 역시 포함될 수 있다. 본 발명에서 상기 항체로는 REP1으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 어느 하나의 단백질을 특이적으로 인식하는 결합의 특성을 갖는 경우라면, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적 단편을 포함한다. 상기 기능적 단편이란, 예를 들면 Fab, F(ab'), F(ab')2및 Fv 등이 있으나 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편이라면 이에 제한되지 아니하고 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 암 예후 예측용 조성물은 상기 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 이상의 다른 구성성분 조성물, 또는 용액 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현 예에서는 상기 암 진단용 조성물을 포함하는 암 진단용 키트를 제공할 수 있다.

본 발명의 암 진단용 키트에서 상기 REP1 단백질, mRNA 발현 수준을 측정하는 제제, 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제 및 암에 관한 내용은 상기 약학 조성물 및 암 진단용 조성물에서 기재한 바와 중복되어, 이하 구체적인 기재를 생략한다.

단, 본 발명에서 상기 “키트”는 특정한 목적, 구체적으로 암의 진단을 위해 필요한 조성물 및 부속품을 모아놓은 세트를 의미한다. 구체적으로 상기 키트에는 본 발명에 따른 암 진단용 조성물뿐만 아니라, 상기 단백질 및/또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 분석에 사용되는 본 발명의 해당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함될 수 있다. 상기 도구 또는 시약의 일 예로, 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 발색단(chromophores), 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지를 위한 물질을 포함할 수 있다. 담체는 가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체의 일 예로 당 분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 PBS와 같은 완충액, 불용성 담체의 일 예로 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.

본 발명에서 제공하는 상기 키트를 이용하는 경우, 목적하는 개체로부터 얻어진 시료와 정상 대조군에서 얻어진 시료로부터 REP1 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현 수준을 비교하여, 목적하는 개체에 있어서, 암의 발생 여부 등을 조기에 예측하여 개별화된 환자에게 적극적인 치료 시행 및 세밀한 관찰요법 여부를 결정할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트(이하 ‘RT-PCR 키트’라 한다.); 유전자 칩 분석법을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트(이하 ‘유전자 칩 분석법 키트’라 한다.); 또는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트(이하 ‘ELISA 키트’라 한다.)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

여기서, 상기 “RT-PCR 키트”란, 상기 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있고, 정상 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 “유전자 칩 분석법 키트”란, 상기 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제 및 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 기판에 포함되는 cDNA는 정상 대조군 유전자 또는 그의 단편일 수 있다.

본 발명에서 상기 “ELISA 키트”란 상기 단백질에 특이적인 항체를 포함한다. 상기 항체는 REP1 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 재조합 항체이다. 또한, ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 항체와 컨주게이트 되어 있는 효소 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현 예에서는 (a) 목적하는 개체로부터 분리된 시료의 REP1 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 정상 대조군 시료의 REP1 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 암 진단용 키트에서 상기 REP1 단백질, 및 암에 관한 내용은 상기 약학 조성물에서 기재한 바와 중복되어, 이하 구체적인 기재를 생략한다.

본 발명에서 상기 "목적하는 개체"는 암의 발생 여부를 확인하고자 하는 개체를 의미한다. 또한, 상기 개체의 시료란 암 환자의 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함할 수 있고, 이러한 시료는 상기 목적하는 개체에서 공지의 과정에 의해 수행됨으로써 얻을 수 있다.

본 발명의 다른 구체 예에서는 상기 (b) 단계 이후에, 상기 (a) 단계에서 측정된 단백질 또는 mRNA의 발현 수준이 (b) 단계에서 측정된 정상 대조군의 시료의 발현 수준보다 높은 경우 암이 발병될 것으로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다.

구체적으로, 본 발명에서 상기 mRNA의 발현 수준의 측정은 정상 대조군, 즉 암이 발생하지 않은 개체에서의 유전자의 상보적 결합 복합체의 형성량과, 암 환자, 즉 목적하는 개체의 유전자의 상보적 결합 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 상기 유전자들에서 mRNA의 유의한 발현량의 변화 여부를 판단하여, 암의 발생 여부를 예측할 수 있다. 바람직하게는, 상기 mRNA의 측정 수준이 암이 발생하지 않은 정상 대조군의 시료보다 높은 경우에 목적하는 개체에 암이 발생 했을 것으로 예측할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에서 상기 RPE1 단백질 수준의 측정을 통하여, 암이 존재하지 않는 정상 대조군 개체에서의 항원-항체 복합체의 형성량과, 암 환자, 즉 목적하는 개체의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 상기 단백질의 유의한 발현량 변화 여부를 판단하여, 암의 예후를 예측할 수 있다. 바람직하게는, 상기 단백질의 측정 수준이 정상 대조군의 시료보다 높은 경우에 목적하는 개체에 암이 발생 했을 것으로 예측할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

단, 본 발명에서 상기 "항원-항체 복합체"는 상기 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 세기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.

본 발명에서 상기 “유전자 상보적 결합 복합체”는 상기 유전자와 이에 특이적인 프라이머 또는 프로브의 결합물을 의미하고, 유전자 상보적 결합 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 세기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.

본 발명에서 상기 “검출 라벨은 효소”는, 예를 들면 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 구체적으로, 검출 라벨로서 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며. 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 형광물로서 이용 가능한 것에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있고, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한, 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한, 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K₄W(CN)₈, [Os(bpy)₃]^2+, [RU(bpy)₃]²⁺, [MO(CN)₈]^4- 등이 포함되며, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 방사선동위원소에는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re이 포함되며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 상기 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지의 뉴클레오타이드 트리포스페이트(nucleotide tri-phosphate)가 존재하는 조건하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.

본 발명에서 상기 "프로브"는 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 형광성 분자 또는 동위원소 등으로 표지될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 상기의 핵산서열은 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 변형은 예를 들어, 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 또는 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있으나, 이에 제한되지 아니한다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제 등을 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 상기 핵산 서열은 검출 가능한 시그널(signal)을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는, 이에 제한되지 아니하지만 예를 들면 방사성 동위원소, 형광성 분자 또는 바이오틴 등의 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다.

본 발명에서 상기 항체를 이용하여 이와 결합한 표적 단백질의 양을 확인하기 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블럿 분석(Western blot assay), 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되지 아니한다.

본 발명에서 상기 “mRNA 수준의 측정방법”은 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블럿 분석(Northern blot assay) 또는 유전자 칩에 의하여 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 “단백질 수준의 측정 방법”이란 웨스턴 블럿 분석, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, REP1(Rab escort protein-1) 단백질을 코딩하는 mRNA의 발현을 억제하는 mRNA 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 유효량의 약학 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 암의 치료 방법에서 상기 REP1 단백질, mRNA 발현 억제제, 및 암에 관한 내용은 상기 약학 조성물에서 기재한 바와 중복되어, 이하 구체적인 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, (a) 목적하는 개체로부터 분리된 암 세포 또는 암 세포주에 후보 물질을 접촉시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 후보 물질에 접촉시킨 암 세포에서 REP1 단백질 또는 상기 REP1 단백질을 코딩하는 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계; (c) 정상 대조군으로부터 분리된 세포 또는 세포주에 후보 물질을 접촉 시킨 뒤, REP1 단백질 또는 상기 REP1 단백질을 코딩하는 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (d) 상기 (b) 단계의 발현 수준과 (c) 단계의 발현 수준을 비교하여, 상기 (b) 단계의 REP1 단백질 또는 상기 REP1 단백질을 코딩하는 mRNA 발현 수준이 상기 (c) 단계의 REP1 단백질 또는 상기 REP1 단백질을 코딩하는 mRNA 발현 수준에 비하여 감소한 경우 항암제로 선별하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 항암제 스크리닝 방법에서 상기 REP1 단백질, 목적하는 개체, 정상 대조군, 및 암에 관한 내용은 상기 약학 조성물에서 기재한 바와 중복되어, 이하 구체적인 기재를 생략한다.

단, 본 발명에서 상기 "후보물질"은 암에 의해 발생한 증상을 완화 또는 개선 시키거나, 증세가 호전되어 이롭게 변경될 수 있도록 하는 것이 예상되는 물질을 의미한다. 상기 후보 물질은 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들면, 단백질, 유기화합물, 다당류, 폴리뉴클레오타이드 및 임의의 분자를 포함할 수 있다. 상기 물질은 천연 물질로부터 추출된 성분 및 합성 과정에 의해 생산된 물질은 모두 포함할 수 있다.

REP1(Rab escort protein-1) 단백질을 코딩하는 mRNA의 발현을 억제하는 mRNA 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물은 암 세포 내에서 EGFR 관련 세포신호전달 활성을 매우 효과적으로 억제함으로써, 암 세포의 증식을 억제할 뿐만 아니라 암 세포의 사멸을 유도하여 암의 예방 또는 치료에 현저한 효과를 발휘할 수 있다.

또한, 상기 REP1 단백질은 정상 대조군과 비교하여 암 환자 및 암 세포 내에서만 현저하게 높게 발현되는 단백질에 해당하여 암을 효과적으로 진단할 수 있는 정보를 제공함으로써, 조기에 암을 진단하여 치료 효과를 상승시킬 수 있다.

한편, 앞서 기재된 효과는 예시적인 것에 불과하며 당업자의 관점에서 본 발명의 세부 구성으로부터 예측되거나 기대되는 효과들 또한 본원발명 고유의 효과에 추가될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 암 환자의 면역 조직 염색 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 암 세포의 웨스턴 블롯 분석(Western blot anaylsis)을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 암 세포의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 암 세포의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 암 세포의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 REP1 단백질 발현 억제에 따른 BEAS-2B 세포의 성장 억제 정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 REP1 단백질 발현 억제에 따른 CCD-18Co와 HT-29세포의 성장 억제 정도를 그래프로 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 REP1 단백질 발현 억제에 따른 A431 세포의 성장 억제 정도를 그래프로 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 REP1 단백질 발현 억제에 따른 A431, A549, 및 HT-29 세포의 사멸 정도에 대하여 현미경으로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 웨스턴 블롯 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 웨스턴 블롯 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 정상 폐 세포(BEAS-2B)에 REP1 siRNA를 형질주입(transfection)시킨 뒤, 세포 증식 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 REP1 단백질 발현 벡터 주입에 따른 EGFR 관련 세포 신호전달 단백질의 발현 정도를 웨스턴 블롯 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 REP1 단백질 발현 벡터 주입에 따른 세포의 콜로니를 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 REP1 단백질 발현 벡터 주입에 따른 세포의 콜로니 크기에 따른 개수를 그래프로 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 웨스턴 블롯 분석결과를 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 종양의 크기 측정결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 종양 크기의 사진을 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 종양의 크기 측정결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 종양 크기의 사진을 나타낸 것이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에 따른 면역조직염색결과를 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

[제조예 1] REP1(Rab escort protein-1) mRNA에 특이적인 shRNA 제작

REP1(Rab escort protein-1)를 코딩하는 mRNA에 특이적인 shRNA 벡터를 제작하기 위하여, REP1 shRNA 이중 가닥을 Age1 및 EcoR1 효소로 분해시킨 pLOK.1 puro 벡터에 삽입하는 과정을 통해, 하기 서열번호 6으로 표시되는 염기서열이 포함되어 있는 벡터를 제작하였다.

서열번호 6: 5'-CCGGTCCGGCGGTATGGCAACACTCCATTTCTCGAGAAATGGAGTGTTGCCATACCGTTTTTG-3 '

상기 벡터는 하기 실시예에서 수행되는 각각의 각각의 세포 내로 통상의 방식에 의해 렌티 바이러스(lenti virus) 전달 방식에 의하여 각각 전달 되었다. 상기 렌티 바이러스를 감염시킨 세포를 8 ㎍/ml 폴리브렌(polybrene) 및 2 ㎍/ml 푸로마이신(puromycin)이 포함된 용액으로 선별한 세포를 사용하였다.

[제조예 2] REP1 단백질 발현 벡터 제작

REP1 단백질 발현 벡터 구축을 위하여, Hela 세포의 cDNA로부터 얻은 CHM 유전자를 프라이머 5'-CCATCGATTATGGCGGATACTCTCCCTTCG-3 '및 5'-GTAGGCGCGCCTTCAGAGGACTCCTCTAGGTT-3'를 사용하여 증폭시켰다. 상기 PCR 산물은 myc으로 테그(tag)하여, pCS4+ 벡터의 Cla1과 Asc1 부위에 삽입되도록 하였다.

[준비예 1] 세포 배양

세포 내 REP1의 발현과 세포 성장 억제 및 세포사멸 유도 효과를 확인하기 위하여, 폐암 세포주 A549, 정상 폐 상피 세포(Beas-2B), 대장암 세포인 HT-29, 정상 대장 세포 CCD18Co, 및 자궁경부암 세포 A431을 계대배양 하였다. 상기 A431 세포는 10%(v/v) 우태아혈청(FBS; hyclone, logan, UT)을 포함하는 DMEM 배지를 이용하고, 상기 BEAS-2B 세포는 0.2 ng/ml EGF 및 30 ㎍/ml의 보바인 뇌하수체 추출물(Bovine pituitary extract; BPE)가 포함되어 있는 케라티노사이트-SFM(Keratinocyte-SFM)을 이용하였으며, 나머지 세포는 10%(v/v) 우태아혈청(FBS; hyclone, logan, UT), 100 units/m 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 및 0.25 ㎍/ml 엠포테리신 B(amphotericin)를 포함하는 RPMI 배지를 이용하였다. 단, 배양조건은 모두 37℃, 5 % CO₂ 배양기 내에서 실시하였다.

[실시예 1] 암 환자 조직에서 REP1 발현 증가 확인

REP1 단백질이 암 환자의 조직에서 정상 조직에 비하여 발현이 증가되어 있는지 확인하기 위하여, 조직 마이크로어레이(Tissue microarraqy)를 수행하였다. 단, 실험에 사용된 암 조직은 폐암, 자궁 경부암 및 대장암 환자에서 생검이나 외과적 절제를 통해 얻은 것을 사용하였으며, 정상 조직은 상기 절제 시 떼어낸 주변의 조직을 사용하였다.

상기 조직을 REP1 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 1차 항체와 1시간 동안 배양한 뒤, 항 마우스 비오틴 항체(anti-mouse biotin antibody)(Vector Laboratories, Bulingame, CA, USA)로 2차 배양하였다. 시각화를 위해 발색 반응은 디아미노벤지딘(diaminobenzidine) 용액(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)으로 배양 시켰으며, 카운터 염색은 헤마톡실린(hematoxylin)을 사용하였다. 단, 대조군으로는 상기 REP1 단백질에 특이적인 항체 대신 아이소타입(isotype) IgG를 사용하였다. 상기 전체 염색 결과는 염색의 강도 및 양성율을 기준으로 0점 내지 3점으로 기록하였으며, 염색의 강도는 숙련된 병리학자에 의하여 음성 0, 약함 1, 중간 2, 및 강함 3으로 결정하여, 그 결과를 하기 표 1 및 도 1에 나타내었다.

기관		REP1 발현		개수(N)	P-value
		-/+ N (%)	++/+++ N (%)
자궁경부	정상	4 (100%)	0 (0.0%)	4	0.0000
	암	6 (12.0%)	44 (88.0%)	50
폐	정상	9 (100%)	0 (0.0%)	9	0.0000
	암	12 (30.0%)	28 (70.0%)	40
대장	정상	8 (88.9%)	1 (11.1%)	9	0.0002
	암	10 (25%)	30 (75%)	40

상기 표 1 및 도 1에서 보는 바와 같이 자궁 경부 조직의 경우 REP1 단백질의 발현이 ++/+++인 경우가 정상에서 0.0%인 반면, 암에서 88.0% 존재하였고, 폐 조직의 경우 정상에서 0.0% 인 반면, 암에서 70.0% 존재하였으며, 대장 조직의 경우 정상에서는 11.1% 인 반면, 암에서는 75%에 해당하였다.

상기 결과를 통해 REP1 단백질은 정상 조직에 비하여 암 조직에서 현저하게 발현이 증가되어 있음을 알 수 있다.

[실시예 2] 암 세포에서 REP1 단백질 발현 증가 확인

REP1 단백질이 암 세포에서도 정상 세포에 비하여 발현이 증가되어 있는지 확인을 위하여, 웨스턴 블롯 분석(Western blot assay)를 수행하였다.

웨스턴 블롯에 사용된 단백질의 준비 방법은 다음과 같다. BEAS-2B, CCD-18Co, A549 및 HT-29 세포를 통상의 방법으로 수득(harvest)하고, PBS로 세척 후 단백질 분해 억제제가 포함되어 있는 세포 용해 버퍼(cell lysis buffer)를 이용하여 용해시켰다. 상기 용해된 용액을 원심분리기를 이용하여 전체 용액을 분획한 뒤, 단백질이 포함된 용액만을 추출하였다. 상기 추출된 단백질은 micro BCA방법에 의해 정량화 하였다. 정량화를 통해 동일 농도의 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드(polyacrylamide) 겔 전기영동을 수행하여 분리한 뒤, PVDF 막에 옮겼다. 단백질이 옮겨진 막은 비 특이적 결합을 줄이기 위하여 5% 탈지유(non-fat milk)가 포함된 TBS-T(Tris-buffered saline/0.05% Tween-20)용액으로 상온에서 1시간 동안 차단(blocking)한 후, 1차 항체를 4℃ 조건에서 하룻밤(overnight) 동안 반응시킨 뒤, 2차 항체를 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 시각화를 위해서는 화학발광 시스템(Enhanced chemiluminescence system)을 이용하였다.

웨스턴 블롯 분석은 REP1 단백질에 특이적인 항체 및 발현의 정량적 비교를 위한 항존 유전자(housekeeping gene)인 β-actin 항체를 이용하여 수행하였고, 그 결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에서 보는 바와 같이, 정상 폐 상피 세포에 해당하는 BEAS-2B에 비하여 폐암 세포인 A549에서 REP1 단백질의 발현이 현저하게 증가하였고, 정상 대장 세포에 해당하는 CCD-15Co에 비하여 대장암 세포인 HT-29에서 REP1 단백질의 발현이 현저하게 증가하였다.

상기 결과를 통해, REP1 단백질은 암 환자의 조직 결과와 일치하게 암 세포에서 역시 REP1 단백질이 정상 세포에 비하여 그 발현이 현저하게 증가되어 있는 것을 알 수 있다.

[실시예 3] 세포 내 REP1을 코딩하는 mRNA 억제로 인한 단백질 발현 변화

암 세포에서 REP1의 발현을 억제 하였을 때, 세포 내 단백질 발현 변화를 확인하였다.

상기 암 세포에서 REP1 단백질의 발현을 억제시키기 위해 BEAS-2B, A549, CCD-18Co, HT-29 및 A431세포에 REP1을 코딩하는 mNRA에 특이적인 하기 서열번호 4 및 5의 siRNA를 세포에 형질주입(Transfection) 시켰다. 형질주입은 RNAimax(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하였으며, 제조사에서 제공하는 프로토콜에 의하여 형질주입을 수행하였다. 단, 대조군(NC)의 siRNA 서열은 한국 바이오니아에서 제공하는서열번호 6의 프라이머를 이용하였다.

서열번호 4 : 5'-CCGGAGAGUUCUGCAUGUU-3 '(siREP1 1-1)

서열번호 5 : 5'-GCAUGAAAGGCACCUAUUU-3' (siREP1 1-2)

서열번호 7: 5'-CCUACGCCACCAAUUUCGU-3 '(대조군)

형질주입된 세포는 상기 실시예 2에서 수행한 웨스턴 블롯 분석과 동일한 방식으로 단백질의 발현 변화를 측정하였고, 그 결과를 도 3 내지 5에 나타내었다.

단, 웨스턴 블롯 분석은 REP1 항체, 세포 사멸과 관련성이 있는 단백질인 PARP 단백질에 특이적인 항체 및 발현의 정량적 비교를 위한 항존 유전자(housekeeping gene)인 β-actin 항체를 이용하여 수행하였다.

도 3 내지 5에서 보는 바와 같이, 암 세포인 A549, HT-29 및 A431 모두에서 정상 세포에 비하여 단백질의 발현이 높게 나타났으며, 서열번호 2 또는 3의 siRNA를 형질감염을 유도하여 그 발현을 억제시킨 결과 세포 사멸과 관련 있는 단백질인 PARP의 절단(Clevage)이 나타났다.

상기 결과를 통해 REP1를 코딩하는 mRNA에 특이적인 siRNA를 세포에 투여함으로써 그 단백질의 발현을 억제시킨 경우, 세포 사멸과 관련된 세포신호전달이 활성화 되어, 암 세포에 특이적인 세포 사멸을 유도할 수 있는 것을 알 수 있다.

[실시예 4] REP1 단백질 발현 억제로 인한 세포 증식 억제 및 세포 사멸 효과 확인

REP1 단백질 발현 억제로 인하여 세포 증식 억제 및 세포 사멸 유도에 효과가 있는지 확인하기 위해, 상기 실시예 3에서 형질주입된 세포에서 세포 사멸 정도를 측정하였다. 이는, 세포 증식 검정 키트(MTS; 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxyme-thoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 제조사에서 제공하는 방식에 의해 측정하였으며, 흡광도는 파워 웨이브 HT 분광 광도계 (Biotek instruments, Winooski, VT, USA) 490 nm에서 측정하였으며, 그 결과를 도 6 내지 도 8에 나타내었다.

또한, 상기 형질주입된 세포를 현미경으로 관찰하여 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 6 내지 도 8에서 보는 바와 같이, 폐암, 자궁경부암 및 대장암 모두에서 유의적인 정도로 세포증식 억제 및 세포의 사멸을 유도하는 것을 알 수 있었다.

또한, 도 9에서 보는 바와 같이, siREP1을 형질주입 시킨 세포의 경우 대조군에 해당하는 siNC로 형질주입 시킨 경우에 비하여 A431, A549 및 HT-29 모든 세포에서 세포의 수가 현저하게 감소되었다.

상기 결과를 통해 암 세포에서 REP1 단백질의 발현을 특이적으로 억제하는 경우 세포의 성장 억제 및 세포의 사멸을 유도할 수 있는 것을 알 수 있다.

[실시예 5] 세포신호전달 확인

REP1 단백질 발현의 억제로 인한 세포 증식 억제 및 세포 사멸 유도의 효과가 어떠한 세포신호전달에 의해 일어나는지 확인하기 위하여, 상기 실시예 3에서 형질주입된 세포를 이용해 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.

단, 웨스턴 블롯 분석은 상기 실시예 3에서와 동일한 방식으로 수행하였고, REP1 항체, EGFR 항체, TGF-βRI 항체, IGF-IRβ 항체, 인산화된 AKT 항체, AKT 항체, 인산화된 ERK1/2 항체, ERK1/2 항체, 인산화된 Src 항체, c-Src 항체, 인산화된 STAT3 항체, STAT3 항체 및 발현의 정량적 비교를 위한 항존 유전자(housekeeping gene)인 β-actin 항체를 이용하여 수행하여, 그 결과를 도 10 및 도 11에 나타내었다.

도 10에서 보는 바와 같이, REP1 단백질을 siRNA를 통해 그 발현을 억제시켰을 때, 성장인자 수용체에 해당하는 EGFR, TGF-βRI, 및 IGF-IRβ중에서 특히 EGFR과 그 단백질 발현 억제 패턴이 유사하게 나타났다. 특히, A549 및 HT-29 세포에서는 REP1 단백질의 발현을 억제시킨 경우에 EGFR이 암 세포에서 거의 발현되지 않았다.

상기 결과를 통해, REP1 단백질은 다양한 성장인자 수용체 중 특히 EGFR과 관련된 세포신호전달을 활성화 시킴으로써 암 세포의 증식 및 생존을 조절하는 것을 알 수 있다.

또한, 도 11에서 보는 바와 같이, EGFR관련 세포신호전달에 관련되어 있는 단백질의 발현 패턴을 확인한 결과, HT-29 세포에서 AKT 활성화를 감소 시켰지만 A431 및 A549 세포에서는 거의 영향을 미치지 않았다. ERK1/2 활성화는 A431 및 A549 세포에서 다소 증가되었지만 REP1 단백질의 발현을 억제한 경우의 HT-29 세포에서는 감소하였다. 또한, 모든 세포에서 인산화된 STAT3의 발현은 현저하게 감소되었다.

상기 결과를 통해, REP1 단백질은 EGFR 관련 세포신호전달 중 특히 STAT3의 인산화를 유도함으로써 암 세포의 증식 및 생존을 조절하는 것을 알 수 있다.

[실시예 6] REP1 단백질으로 인한 발암 효과 확인

세포 내 REP1 단백질으로 인한 발암 효과를 확인하기 위하여, 정상 폐 상피 세포에 해당하는 BEAS-2B 세포 내에서 REP1 단백질을 과발현 시켰다.

BEAS-2B 세포에서 REP1 단백질을 과발현 시키기 위하여, 상기 제조예 2에서 제작한 REP1 단백질 발현 벡터를 리포펙타민(lipopectamin) 2000(invitrogen, Carlsbad, CA, USA)으로 제조사가 제공한 프로토콜을 이용하여 형질주입(Transfection) 시켰다. 단, 대조군으로는 REP1 단백질 서열이 포함되어 있지 않은 벡터(Vector)를 사용하여 실험을 수행하였다.

상기 REP1 단백질 발현 벡터가 감염된 BEAS-2B 세포에 대하여, 0 일 내지 3일 동안 세포의 수를 계수하여 그 결과를 도 12에 나타내었다.

또한, 상기 감염된 감염된 BEAS-2B 세포의 EGFR과 관련된 세포 시호전달을 상기 실시예 2에서와 같은 방식으로 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인하여, 그 결과를 도 13에 나타내었다.

도 12에서 보는 바와 같이, REP1 단백질 발현 벡터가 형질주입된 BEAS-2B 세포에서는 0 일에서 3 일로 갈 수록 측정된 세포의 개수가 대조군에 비하여 현저히 높게 나타났다.

또한, 도 13에서 보는 바와 같이, 정상 세포 BEAS-2에 REP1 단백질 발현 벡터를 형질주입시켜 REP1의 발현을 증가시켰을 때, 대조군에 비하여 EGFR의 발현 및 활성이 증가하였고 STAT3의 활성도를 나타내는 인산화(phosphorylation)가 높게 나타났다.

상기 결과를 통해 REP1 단백질은 정상 세포에서 EGFR 신호전달체계를 활성화 시킴으로써 암 발생을 유도하고, 세포의 증식을 현저하게 유도한다는 것을 알 수 있다.

[실시예 7] REP1 단백질으로 인한 콜로니(Colony) 형성 확인

상기 실시예 6에서 REP1 단백질 발현 벡터로 형질주입된 BEAS-2B 세포의 콜로니 형성 능력 여부에 대해 확인하였다.

6 웰 플레이트를 2 ml의 0.9% 아가로스 기저층으로 코팅하고, 0.54% 아가로스를 함유하는 배지에 2000 cells/well 수의 상기 형질주입된 BEAS-2B 세포를 분주(seeding) 하였다. 세포를 최대 22일 동안 배양하고 배지는 3일 내지 4일마다 교체하였다. 현미경을 통해 콜로니의 크기를 확인하고, 광학 현미경을 통해 콜로니를 형성한 세포의 수를 계수하여, 그 결과를 도 14 및 도 15에 나타내었다.

도 14에서 보는 바와 같이, REP1 발현 벡터를 정상 폐 세포인 BEAS-2B에 형질주입시킨 경우, 대조군에 해당하는 벡터를 형질주입시킨 경우에 비하여 , 콜로니의 크기 증가하였고, 도 15에서 보는 바와 같이 대조군에 비하여 REP1 단백질 발현 벡터로 형질감염 시킨 경우에 콜로니의 크기가 200 μM 이상에 해당하는 경우가 약 40%로 현저하게 증가되었다.

상기 결과를 통해 REP1 단백질은 정상 세포에서 콜로니의 형성 유도 및 콜로니의 크기를 현저하게 증가시킴으로써 정상 세포를 암으로 형질 전환이 될 수 있도록 유도하는 것을 알 수 있다.

[실시예 8] REP1 단백질 발현 억제로 인한 생체 내 암 성장 억제 및 암 세포 사멸 효과

REP1 단백질 발현 억제로 인한 생체 내에서의 암 성장 억제 및 암 세포의 사멸 유도 효과를 확인하였다.

6 주령의 Balb/c 누드 마우스의 피하에 A431 세포와, 대조군 벡터(shEV) 또는 서열번호 3의 shREP1을 발현하는 A431 세포를(2.5 X 10⁶ cells) 피하에 주사하였다. A431 세포만을 투여한 경우에는 상기 마우스 종양의 부피가 평균 30 mm³ 수준에 이르면, atelogenes local use(Koken, Japan)을 이용하여 대조군에 해당하는 siNC 및 REP1을 코딩하는 mRNA에 특이적인 서열번호 2의 siRNA를 주입하였다. 상기 REP1의 발현이 잘 억제되었는지 확인하기 위하여 마우스의 암 조직을 적출하여 용해버퍼로 용해하고, REP1 항체 및 β-actin 항체를 이용하여 상기 실시예 2의 방법과 마찬가지로 웨스턴 블롯 분석을 수행한 뒤, 그 결과를 도 16에 나타내었다.

상기 shNC 또는 shREP1을 발현하는 A431 세포를 주입한 경우, 상기 벡터가 잘 발현 되는지 확인하기 위하여 상기 세포를 용해하여, REP1 항체 및 β-actin 항체를 이용하여 상기 실시예 2의 방법과 마찬가지로 웨스턴 블롯 분석을 수행한 뒤, 그 결과를 도 17에 나타내었다.

또한, siRNA를 주입한 경우에는 0일, 5일, 8일 및 12일에 종양의 체적을 측정하였고, shREP1을 발현하는 A431 세포를 주입한 경우에는 6일, 8일, 12일, 15일 및 19일 종양의 부피를 측정하여, 그 결과를 도 18 내지 도 21에 나타내었다. 단, 종양의 체적은 캘리퍼를 이용하여 길이(L)과 너비(W)를 (L X W²)/2으로 계산하였다.

도 16 및 도 17에서 보는 바와 같이, REP1 단백질을 코딩하는 mRNA의 발현 억제제가 효과적으로 REP1 단백질을 억제하였다. 뿐만 아니라, siREP를 주입한 경우에는 세포 결과와 동일하게 EGFR 단백질의 발현을 감소 시켰다. 이를 통해, siREP1 및 shREP1이 생체 내에 적용될 때에도 REP1 단백질의 발현을 억제하는 작용이 제대로 일어나고 있음을 알 수 있다.

도 18 및 도 19에서 보는 바와 같이, siREP1을 투여한 경우에는 대조군에 비하여 5일 이후부터 그 종양 체적의 증가율이 현저하게 감소하여 12일에는 대조군 종양의 체적이 약 600 mm³인 것에 비하여, siREP1을 투여한 경우에는 약 400 mm³으로 종양의 크기가 현저하게 작았다.

또한, 도 20 및 도 21에서 보는 바와 같이, shREP를 투여한 경우에도 대조군에 비하여 12일 이후부터 그 종양 체적의 증가 정도가 현저하게 줄어 19일에는 대조군 종양의 체적이 약 200 mm³인 것에 비하여, shREP1의 경우 약 50 mm³으로 그 체적이 현저하게 감소되었다.

상기 결과를 통해 REP1 단백질의 발현을 억제하는 경우 생체 내에서도 암 세포의 증식을 현저하게 억제하고, 특히 대조군 에 해당하는 siNC 및 shEV에 비하여 siREP1 및 shREP1이 현저하게 암 세포의 증식을 억제할 수 있는 것을 알 수 있다.

[실시예 9] REP1 억제로 인한 생체 내 세포신호전달 확인

상기 실시예 8의 마우스 종양 조직 내에서도 암 세포 내에서 확인한 세포신호전달이 동일하게 활성화되는지 확인하기 위하여 면역조직염색을 수행하였다.

면역조직염색을 위하여 상기 실시예 8에서 siREP1을 투여한 마우스에서 얻은 종양 조직을 10% 중성 완충 포르말린(formalin)으로 고정시켰다. 그 뒤, 고정된 조직을 파라핀으로 고정하고, 4 μm의 크기로 절편화 하였다. 상기 절편을 56 ℃에서 1시간 건조시켰다. 염색을 위하여 탈 파라핀화 하는 과정을 거친 뒤, EZprep으로 조직을 재수화하고, 반응 버퍼(ventana medical systems)로 세척한 뒤, EGFR, 인산화된 STAT3, 및 활성화된 카스파제 3(active-caspase 3) 항체를 Tri-EDTA 완충액과 함께 90 ℃에서 30분 동안 열처리한 뒤, 항체를 제거하고 현미경으로 조직을 확인하여, 그 결과를 도 22에 나타내었다.

도 22에서 보는 바와 같이, EGFR, 및 인산화된 STAT3의 경우 세포 수준의 결과와 마찬가지로 siREP1을 주입한 경우에 그 발현이 현저하게 감소되었고, 활성화된 카스파제 3의 발현은 현저하게 증가되었다.

상기 결과를 통해, 세포 수준과 마찬가지로 생체 내에서 역시 REP1 단백질의 발현을 억제하는 경우 EGFR의 발현 및 STAT3의 활성화를 억제하고, 카스파제 3의 활성화가 유도되어 종양의 성장을 매우 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있다.

이상에서 본 발명에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.

<110> NATIONAL CANCER CENTER <120> PHAMARCEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING CANCER <130> KPA01281 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5462 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 aagtaatagt cacatgacac gtttcccgtc aagatggcgg atactctccc ttcggagttt 60 gatgtgatcg taatagggac gggtttgcct gaatccatca ttgcagctgc atgttcaaga 120 agtggccgga gagttctgca tgttgattca agaagctact atggaggaaa ctgggccagt 180 tttagctttt caggactatt gtcctggcta aaggaatacc aggaaaacag tgacattgta 240 agtgacagtc cagtgtggca agaccagatc cttgaaaatg aagaagccat tgctcttagc 300 aggaaggaca aaactattca acatgtggaa gtattttgtt atgccagtca ggatttgcat 360 gaagatgtcg aagaagctgg tgcactgcag aaaaatcatg ctcttgtgac atctgcaaac 420 tccacagaag ctgcagattc tgccttcctg cctacggagg atgagtcatt aagcactatg 480 agctgtgaaa tgctcacaga acaaactcca agcagcgatc cagagaatgc gctagaagta 540 aatggtgctg aagtgacagg ggaaaaagaa aaccattgtg atgataaaac ttgtgtgcca 600 tcaacttcag cagaagacat gagtgaaaat gtgcctatag cagaagatac cacagagcaa 660 ccaaagaaaa acagaattac ttactcacaa 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gttagggctg cctgtaatcc cagcactttg ggaagctgag gtgggtagat cacttgaggt 3300 caggagttcg agaccagcct ggccaacatg gcgaaaccct gtctctacta aaaatacaaa 3360 attttagctg ggtgttatgg tgggcacctg taatcccagc tactttgaag atgaggtagc 3420 agactcactt gaaccaggga ggcggaggtt gcagtgagcc aagattttgc cactgcactc 3480 cagcctgggt gacagagcaa gactctgtct cacaaaaaaa aaaaaagggg gctgtacata 3540 ggcagcaaac taagctgcag tgatgttgcc tatatttaaa ttttctcaaa tggccaagct 3600 ctgatggtct actttatttg agcaatagtt gagacttata attgcctata aataaacaaa 3660 caaatgaact atttgttttt ttttctcaca acatctggcc tatattgtct gtcaggaagc 3720 catggctcca atgtaaagta catagttctt acatacttca actgcagctg gtccctgacc 3780 tcaccaggtt tcagagatgt tcttaaagga agccagctgt ggcaggtcac agattcatgg 3840 gaaatggaaa gaaccaagga atatagctct tgcctcacct ttctacccac tgcagatata 3900 gttcaagcca gagtaatgga agaacttaac ttactagcct ctcaggctgc tcctatccct 3960 acctcccagt gtacagcccc tccccatctc tttagtcccc tttccctcac ttcccctttt 4020 ataatgtcac acaaatcagg gacagtagga tcacattata acctactttg tcatagggat 4080 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tcctagttgg tgtgcctgct cagaaaaaca tatactgtat gtgtatacat acctgtgtat 4980 atataaaagg tcaatttata tatttttcta taggaaaatg gagtaacaag ttccctatct 5040 cccatattta tttgtccata gtaaaatggc cacattgatg ataatttcta gaactagttt 5100 ctgagattgt cagccctttg tctaaaataa tggcagtatt aatgattgac ttctgtcact 5160 gccatagtta cctggattgt cagccttggt agcctttgtc taaagtccta aagagttcca 5220 aaaaaaatgt gttgaaattt aattgctaaa tagtggttgg tgattcttta cagtaggaat 5280 tgtaataatt ttcttgcaaa taagttattt actgctattg atattgaata atttgtcttt 5340 tattcagata tatttcaaaa agcatgaata tatgattatt cataaattgt atactttacc 5400 agtaagtttt cagaggaaat aaagactttt aaatcctttt caaaaaaaaa aaaaaaaaa 5459 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA REP1 <400> 4 ccggagaguu cugcauguu 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA REP1 <400> 5 gcaugaaagg caccuauuu 19 <210> 6 <211> 63 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA REP1 <400> 6 ccggtccggc ggtatggcaa cactccattt ctcgagaaat ggagtgttgc cataccgttt 60 ttg 63 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA negative control <400> 7 ccuacgccac caauuucgu 19

Claims (17)

1. REP1(Rab escort protein-1) 단백질을 코딩하는 mRNA의 발현을 억제하는 mRNA 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
   상기 mRNA 발현 억제제는 상기 REP1 단백질을 코딩하는 mRNA에 상보적으로 결합할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 micro RNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 약학 조성물.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 REP1 단백질을 코딩하는 mRNA 서열은 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나로 표시되는 것인, 약학 조성물.
3. 삭제
4. 제 1항에 있어서,
   상기 siRNA는 서열번호 4 또는 서열번호 5로 표시되는 뉴클레오티드 서열인 것인, 약학 조성물.
5. 제 1항에 있어서,
   상기 shRNA는 서열번호 6으로 표시되는 뉴클레오티드 서열인 것인, 약학 조성물.
6. 제 1항에 있어서,
   상기 암은 폐암, 대장암, 자궁경부암, 유방암, 항문암, 머리 및 목 암, 아교세포종(Glioblastoma), 난소암, 위암, 방광암, 간암, 백혈병, 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 약학 조성물.
7. 제 6항에 있어서,
   상기 암은 폐암, 대장암 및 자궁경부암으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 약학 조성물.
8. REP1(Rab escort protein-1) 단백질의 발현 수준 또는 이를 코딩하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암 진단용 조성물.
9. 제 8항에 있어서,
   상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것인, 암 진단용 조성물.
10. 제 8항에 있어서,
    상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것인, 암 진단용 조성물.
11. 제 8항에 있어서,
    상기 암은 폐암, 대장암, 자궁경부암, 유방암, 항문암, 머리 및 목 암, 아교세포종(Glioblastoma), 난소암, 위암, 방광암, 간암, 백혈병, 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 암 진단용 조성물.
12. 제 8항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 암 진단용 키트.
13. (a) 목적하는 개체로부터 분리된 시료의 REP1 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 정상 대조군 시료의 REP1 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
14. 제 13항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 측정된 단백질 또는 mRNA의 발현 수준이 (b) 단계에서 측정된 정상 대조군의 시료의 발현 수준보다 높은 경우 암이 발병될 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
15. 제 13항에 있어서,
    상기 암은 폐암, 대장암, 자궁경부암, 유방암, 항문암, 머리 및 목 암, 아교세포종(Glioblastoma), 난소암, 위암, 방광암, 간암, 백혈병, 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
16. (a) 목적하는 개체로부터 분리된 암 세포 또는 암 세포주에 후보 물질을 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 후보 물질에 접촉시킨 암 세포에서 REP1 단백질 또는 상기 REP1 단백질을 코딩하는 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계;
    (c) 정상 대조군으로부터 분리된 세포 또는 세포주에 후보물 질을 접촉 시킨 뒤, REP1 단백질 또는 상기 REP1 단백질을 코딩하는 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (d) 상기 (b) 단계의 발현 수준과 (c) 단계의 발현 수준을 비교하여, 상기 (b) 단계의 REP1 단백질 또는 상기 REP1 단백질을 코딩하는 mRNA 발현 수준이 상기 (c) 단계의 REP1 단백질 또는 상기 REP1 단백질을 코딩하는 mRNA 발현 수준에 비하여 감소한 경우 항암제로 선별하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법.
17. 제 16항에 있어서,
    상기 암은 폐암, 대장암, 자궁경부암, 유방암, 항문암, 머리 및 목 암, 아교세포종(Glioblastoma), 난소암, 위암, 방광암, 간암, 백혈병, 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 항암제 스크리닝 방법.

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