CN109206504A - 一种高纯度藻蓝蛋白的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明具体涉及一种高纯度藻蓝蛋白的分离纯化方法，属于藻蓝蛋白的纯化方法技术领域。具体包括如下步骤：取螺旋藻与提取剂混合研磨、超声波破碎、离心得到第一次提取液与沉淀，将沉淀与提取剂混合超声波破碎、离心得到第二次提取液，第二次提取液与第一次提取液混合得到提取液，向所述提取液中加入硫酸铵溶液高速离心，再向上清液中加入硫酸铵使得溶液中硫酸铵的质量分数为55%以上中速离心后取沉淀，将沉淀加入溶解剂进行溶解后高速离心，微孔过滤，双水相体系分离，离子交换柱进行纯化。本发明解决了现有技术中操作步骤复杂、操作周期长以及纯度不够的问题，具有纯化效果好、周期短以及收率高的优点。
Description
技术领域
本发明属于藻蓝蛋白的纯化方法技术领域，具体涉及一种高纯度藻蓝蛋白的分离纯化方法。
背景技术
藻蓝蛋白是从螺旋藻中分离出的一种深蓝色粉末。主要存在于蓝藻、红藻和隐藻中。藻蓝素通常也分为C-藻蓝素和R-藻蓝素，前者主要存在于蓝藻中，后者则主要存在于红藻中，隐藻中该两种都有。其功用为吸收光(橙黄色)能和传递光能。它既是一种蛋白质，又是一种极好的天然食用色素，同时又是良好的保健食品。
藻蓝蛋白是自然界中少见的色素蛋白之一，不仅颜色鲜艳，而且本身是一种营养丰富的蛋白质，其氨基酸组成齐全，必需氨基酸含量高。
藻蓝蛋白具有抗癌、促进血细胞再生、养护卵巢、促使人体内合成弹力蛋白等功效。21世纪初，在欧美、日本等国，藻蓝蛋白广泛用作食品和化妆品的高级天然色素，并被制成生化药品。1986年，由日本康派艾滋病研究所研制、CONFIDENCE藻类营养食品公司生产的康派奇(confident)藻蓝蛋白素作为癌症患者、白血病患者等的康复药品和营养食品，取得突出的配合疗效。
藻蓝蛋白离体实验具有刺激红细胞集落生成，类似红细胞生成素(EPO)的作用。国外已成功的研制出多种藻蓝蛋白复合药品，日本康派艾滋病研究所已有藻蓝蛋白能改善贫血、提高血色素的成功报导。在1982年 Iijima 等曾研究小鼠口服藻蓝蛋白提高注射肝肿瘤细胞小鼠的成活率，且实验组小鼠淋巴细胞活性明显比对照高，他们认为该蛋白有促进免疫和抗疾病功能。1986年美国哈佛医院 Schwartz和Shklar发现螺旋藻藻蓝蛋白对一些癌细胞有抑制作用。
藻蓝蛋白可以帮助调节、合成人体代谢所需要的多种重要的酶，对抑制癌细胞的生长和促进人体细胞再生、保养卵巢、促进人体内合成弹力蛋白具有重要作用，同时藻蓝蛋白还可以调节人体免疫系统，增强免疫系统功能，提高人体对疾病的抵抗力。因此，藻蓝蛋白被食品专家形象地誉为"食物钻石"。它在以下方面具有很好的效果。
在现有技术中用于分离纯化藻蓝蛋白的材料很多，它们在细胞结构、藻蓝蛋白种类和含量等方面差别很大，以至今日都没有形成一个标准的方法来分离纯化藻蓝蛋白。一般藻蓝蛋白的分离纯化流程为三步，首先是植物组织体的破碎，浸提获得粗提液；其次是粗提，此步主要为进一步的分离纯化做准备; 最后就是分离纯化制备出高纯度的藻蓝蛋白。在现有技术中，藻蓝蛋白常用的提纯方法在实际工业化生产过程中存在操作步骤复杂、动力能耗高、操作周期长以及纯度不够的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高纯度藻蓝蛋白的分离纯化方法，解决了现有技术中操作步骤复杂、操作周期长以及纯度不够的问题，具有纯化效果好、周期短以及收率高的优点。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种高纯度藻蓝蛋白的分离纯化方法，包括如下步骤：
步骤一、取螺旋藻与提取剂混合后进行研磨至少30min，再采用超声波破碎，加入离心机中离心得到第一次提取液与沉淀，待用；
步骤二、将步骤一中的沉淀与提取剂混合后进行超声波破碎，加入离心机中离心得到第二次提取液，将第二次提取液与第一次提取液混合得到提取液，待用；
步骤三、向所述提取液中加入质量分数为40%的硫酸铵溶液进行高速离心，高速离心后取上清液，再向上清液中加入硫酸铵使得溶液中硫酸铵的质量分数为55%以上，中速离心后取沉淀，待用；
步骤四、向步骤三中的沉淀中加入溶解剂进行溶解后高速离心，离心后的上清液采用微孔滤膜进行过滤，将滤液再加入双水相体系中进行分离，再经过离子交换柱进行纯化得到高纯度藻蓝蛋白。
进一步地，所述步骤一中螺旋藻与提取剂的添加重量比为1：（3-5），超声波破碎的时间为10-12min，超声温度为0-4℃，离心转速为12000-15000r/min，离心时间为30-40min，离心温度为0-4℃。
进一步地，所述步骤二中沉淀与提取剂的添加重量比为1：（1.5-2.0），超声波破碎的时间为3-5min，超声温度为0-4℃，离心转速为12000-15000r/min，离心时间为15-20min，离心温度为0-4℃。
进一步地，所述提取剂为0.1-0.5mol/L的磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液的pH为7.0。
进一步地，所述步骤三中高速离心转速为12000-15000r/min，高速离心时间为30-40min，高速离心温度为0-4℃，中速离心转速为8000-10000r/min，中速离心时间为30-40min，中速离心温度为0-4℃。
进一步地，所述步骤四中沉淀与溶解剂的添加重量比为1：（2.0-2.5），高速离心的转速为12000-15000r/min，高速离心时间为30-40min，高速离心温度为0-4℃。
进一步地，所述溶解剂为0.001-0.005mol/L的磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液的pH为7.0。
进一步地，所述步骤四中微孔滤膜的孔径为0.22μm。
进一步地，所述步骤四中双水相体系中聚乙二醇的质量分数为12.28%，双水相体系中磷酸缓冲液的质量分数为11.63%。
进一步地，所述磷酸缓冲液的摩尔浓度为0.001-0.005mol/L。
本发明的有益效果是：
1.通过分离纯化方法制备得到的藻蓝蛋白的纯度达到了6.23，回收率达到了59%，纯度高，回收率高，最终得到的产率高；
2.采用研磨和超声波破碎二者结合进行提取，溶出的蛋白较多，提高了藻蓝蛋白的溶出率，二者结合避免了研磨过程中超声波使用时间长导致过热的现象，对藻蓝蛋白的活性影响小，扩大了应用范围；
3.采用硫酸铵两次盐析，使得藻蓝蛋白粗提之后的纯度更高，利于后续步骤制备高纯度的藻蓝蛋白且损耗较小；
4.采用双水相体系进行分离，操作步骤少，周期短，回收率高。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1
一种高纯度藻蓝蛋白的分离纯化方法，包括如下步骤：
步骤一、取螺旋藻与提取剂混合后进行研磨至少30min，再采用超声波破碎，加入离心机中离心得到第一次提取液与沉淀，待用；
步骤二、将步骤一中的沉淀与提取剂混合后进行超声波破碎，加入离心机中离心得到第二次提取液，将第二次提取液与第一次提取液混合得到提取液，待用；
步骤三、向所述提取液中加入质量分数为40%的硫酸铵溶液进行高速离心，高速离心后取上清液，再向上清液中加入硫酸铵使得溶液中硫酸铵的质量分数为55%以上，中速离心后取沉淀，待用；
步骤四、向步骤三中的沉淀中加入溶解剂进行溶解后高速离心，离心后的上清液采用微孔滤膜进行过滤，将滤液再加入双水相体系中进行分离，再经过离子交换柱进行纯化得到高纯度藻蓝蛋白。
具体地，所述步骤一中螺旋藻与提取剂的添加重量比为1：3，超声波破碎的时间为10min，超声温度为0℃，离心转速为12000r/min，离心时间为30min，离心温度为℃。
具体地，所述步骤二中沉淀与提取剂的添加重量比为1：1.5，超声波破碎的时间为3min，超声温度为0℃，离心转速为12000r/min，离心时间为15min，离心温度为0℃。
具体地，所述提取剂为0.1mol/L的磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液的pH为7.0。
具体地，所述步骤三中高速离心转速为12000r/min，高速离心时间为30min，中速离心转速为8000r/min，中速离心时间为30min。
具体地，所述步骤四中沉淀与溶解剂的添加重量比为1：2.0，高速离心的转速为12000r/min，高速离心时间为30min，高速离心温度为0℃。
具体地，所述溶解剂为0.001mol/L的磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液的pH为7.0。
具体地，所述步骤四中微孔滤膜的孔径为0.22μm。
具体地，所述步骤四中双水相体系中聚乙二醇的质量分数为12.28%，双水相体系中磷酸缓冲液的质量分数为11.63%。
具体地，所述磷酸缓冲液的摩尔浓度为0.001mol/L。
实施例2
一种高纯度藻蓝蛋白的分离纯化方法，包括如下步骤：
步骤一、取螺旋藻与提取剂混合后进行研磨至少30min，再采用超声波破碎，加入离心机中离心得到第一次提取液与沉淀，待用；
步骤二、将步骤一中的沉淀与提取剂混合后进行超声波破碎，加入离心机中离心得到第二次提取液，将第二次提取液与第一次提取液混合得到提取液，待用；
步骤三、向所述提取液中加入质量分数为40%的硫酸铵溶液进行高速离心，高速离心后取上清液，再向上清液中加入硫酸铵使得溶液中硫酸铵的质量分数为55%以上，中速离心后取沉淀，待用；
步骤四、向步骤三中的沉淀中加入溶解剂进行溶解后高速离心，离心后的上清液采用微孔滤膜进行过滤，将滤液再加入双水相体系中进行分离，再经过离子交换柱进行纯化得到高纯度藻蓝蛋白。
具体地，所述步骤一中螺旋藻与提取剂的添加重量比为1：5，超声波破碎的时间为12min，超声温度为4℃，离心转速为15000r/min，离心时间为40min，离心温度为4℃。
具体地，所述步骤二中沉淀与提取剂的添加重量比为1：2.0，超声波破碎的时间为5min，超声温度为4℃，离心转速为15000r/min，离心时间为20min，离心温度为4℃。
具体地，所述提取剂为0.5mol/L的磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液的pH为7.0。
具体地，所述步骤三中高速离心转速为15000r/min，高速离心时间为40min，中速离心转速为10000r/min，中速离心时间为40min。
具体地，所述步骤四中沉淀与溶解剂的添加重量比为1：2.5，高速离心的转速为15000r/min，高速离心时间为40min，高速离心温度为4℃。
具体地，所述溶解剂为0.005mol/L的磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液的pH为7.0。
具体地，所述步骤四中微孔滤膜的孔径为0.22μm。
具体地，所述步骤四中双水相体系中聚乙二醇的质量分数为12.28%，双水相体系中磷酸缓冲液的质量分数为11.63%。
具体地，所述磷酸缓冲液的摩尔浓度为0.005mol/L。
实施例3
一种高纯度藻蓝蛋白的分离纯化方法，包括如下步骤：
步骤一、取螺旋藻与提取剂混合后进行研磨至少30min，再采用超声波破碎，加入离心机中离心得到第一次提取液与沉淀，待用；
步骤二、将步骤一中的沉淀与提取剂混合后进行超声波破碎，加入离心机中离心得到第二次提取液，将第二次提取液与第一次提取液混合得到提取液，待用；
步骤三、向所述提取液中加入质量分数为40%的硫酸铵溶液进行高速离心，高速离心后取上清液，再向上清液中加入硫酸铵使得溶液中硫酸铵的质量分数为55%以上，中速离心后取沉淀，待用；
步骤四、向步骤三中的沉淀中加入溶解剂进行溶解后高速离心，离心后的上清液采用微孔滤膜进行过滤，将滤液再加入双水相体系中进行分离，再经过离子交换柱进行纯化得到高纯度藻蓝蛋白。
具体地，所述步骤一中螺旋藻与提取剂的添加重量比为1：4，超声波破碎的时间为11min，超声温度为2℃，离心转速为13000r/min，离心时间为35min，离心温度为2℃。
具体地，所述步骤二中沉淀与提取剂的添加重量比为1：1.8，超声波破碎的时间为4min，超声温度为2℃，离心转速为13000r/min，离心时间为18min，离心温度为2℃。
具体地，所述提取剂为0.3mol/L的磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液的pH为7.0。
具体地，所述步骤三中高速离心转速为13000r/min，高速离心时间为35min，中速离心转速为9000r/min，中速离心时间为35min。
具体地，所述步骤四中沉淀与溶解剂的添加重量比为1：2.2，高速离心的转速为13000r/min，高速离心时间为35min，高速离心温度为2℃。
具体地，所述溶解剂为0.002mol/L的磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液的pH为7.0。
具体地，所述步骤四中微孔滤膜的孔径为0.22μm。
具体地，所述步骤四中双水相体系中聚乙二醇的质量分数为12.28%，双水相体系中磷酸缓冲液的质量分数为11.63%。
具体地，所述磷酸缓冲液的摩尔浓度为0.002mol/L。
实施例4
一种高纯度藻蓝蛋白的分离纯化方法，包括如下步骤：
步骤一、取螺旋藻与提取剂混合后进行研磨至少30min，再采用超声波破碎，加入离心机中离心得到第一次提取液与沉淀，待用；
步骤二、将步骤一中的沉淀与提取剂混合后进行超声波破碎，加入离心机中离心得到第二次提取液，将第二次提取液与第一次提取液混合得到提取液，待用；
步骤三、向所述提取液中加入质量分数为40%的硫酸铵溶液进行高速离心，高速离心后取上清液，再向上清液中加入硫酸铵使得溶液中硫酸铵的质量分数为55%以上，中速离心后取沉淀，待用；
步骤四、向步骤三中的沉淀中加入溶解剂进行溶解后高速离心，离心后的上清液采用微孔滤膜进行过滤，将滤液再加入双水相体系中进行分离，再经过离子交换柱进行纯化得到高纯度藻蓝蛋白。
具体地，所述步骤一中螺旋藻与提取剂的添加重量比为1：4，超声波破碎的时间为11min，超声温度为0-4℃，离心转速为14000r/min，离心时间为38min，离心温度为3℃。
具体地，所述步骤二中沉淀与提取剂的添加重量比为1：1.6，超声波破碎的时间为3-4min，超声温度为3℃，离心转速为14000r/min，离心时间为18min，离心温度为3℃。
具体地，所述提取剂为0.4mol/L的磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液的pH为7.0。
具体地，所述步骤三中高速离心转速为14000r/min，高速离心时间为38min，中速离心转速为9000r/min，中速离心时间为38min。
具体地，所述步骤四中沉淀与溶解剂的添加重量比为1：2.4，高速离心的转速为14000r/min，高速离心时间为38min，高速离心温度为3℃。
具体地，所述溶解剂为0.004mol/L的磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液的pH为7.0。
具体地，所述步骤四中微孔滤膜的孔径为0.22μm。
具体地，所述步骤四中双水相体系中聚乙二醇的质量分数为12.28%，双水相体系中磷酸缓冲液的质量分数为11.63%。
具体地，所述磷酸缓冲液的摩尔浓度为0.004mol/L。
实施例5
一种高纯度藻蓝蛋白的分离纯化方法，包括如下步骤：
步骤一、取螺旋藻与提取剂混合后进行超声波破碎，加入离心机中离心得到第一次提取液与沉淀，待用；
步骤二、将步骤一中的沉淀与提取剂混合后进行超声波破碎，加入离心机中离心得到第二次提取液，将第二次提取液与第一次提取液混合得到提取液，待用；
步骤三、向所述提取液中加入质量分数为40%的硫酸铵溶液进行高速离心，高速离心后取上清液，再向上清液中加入硫酸铵使得溶液中硫酸铵的质量分数为55%以上，中速离心后取沉淀，待用；
步骤四、向步骤三中的沉淀中加入溶解剂进行溶解后高速离心，离心后的上清液采用微孔滤膜进行过滤，将滤液再加入双水相体系中进行分离，再经过离子交换柱进行纯化得到高纯度藻蓝蛋白。
具体地，所述步骤一中螺旋藻与提取剂的添加重量比为1：4，超声波破碎的时间为11min，超声温度为0-4℃，离心转速为14000r/min，离心时间为38min，离心温度为3℃。
具体地，所述步骤二中沉淀与提取剂的添加重量比为1：1.6，超声波破碎的时间为3-4min，超声温度为3℃，离心转速为14000r/min，离心时间为18min，离心温度为3℃。
具体地，所述提取剂为0.4mol/L的磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液的pH为7.0。
具体地，所述步骤三中高速离心转速为14000r/min，高速离心时间为38min，中速离心转速为9000r/min，中速离心时间为38min。
具体地，所述步骤四中沉淀与溶解剂的添加重量比为1：2.4，高速离心的转速为14000r/min，高速离心时间为38min，高速离心温度为3℃。
具体地，所述溶解剂为0.004mol/L的磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液的pH为7.0。
具体地，所述步骤四中微孔滤膜的孔径为0.22μm。
具体地，所述步骤四中双水相体系中聚乙二醇的质量分数为12.28%，双水相体系中磷酸缓冲液的质量分数为11.63%。
具体地，所述磷酸缓冲液的摩尔浓度为0.004mol/L。
实施例6
一种高纯度藻蓝蛋白的分离纯化方法，包括如下步骤：
步骤一、取螺旋藻与提取剂混合后进行研磨至少30min，再采用超声波破碎，加入离心机中离心得到第一次提取液与沉淀，待用；
步骤二、将步骤一中的沉淀与提取剂混合后进行超声波破碎，加入离心机中离心得到第二次提取液，将第二次提取液与第一次提取液混合得到提取液，待用；
步骤三、向所述提取液中加入质量分数为40%的硫酸铵溶液进行高速离心，高速离心后取上清液，再向上清液中加入硫酸铵使得溶液中硫酸铵的质量分数为55%以上，中速离心后取沉淀，待用；
步骤四、向步骤三中的沉淀中加入溶解剂进行溶解后高速离心，离心后的上清液采用微孔滤膜进行过滤，再采用常规的羟基磷灰石柱层析进行纯化得到高纯度藻蓝蛋白。
具体地，所述步骤一中螺旋藻与提取剂的添加重量比为1：4，超声波破碎的时间为11min，超声温度为0-4℃，离心转速为14000r/min，离心时间为38min，离心温度为3℃。
具体地，所述步骤二中沉淀与提取剂的添加重量比为1：1.6，超声波破碎的时间为3-4min，超声温度为3℃，离心转速为14000r/min，离心时间为18min，离心温度为3℃。
具体地，所述提取剂为0.4mol/L的磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液的pH为7.0。
具体地，所述步骤三中高速离心转速为14000r/min，高速离心时间为38min，中速离心转速为9000r/min，中速离心时间为38min。
具体地，所述步骤四中沉淀与溶解剂的添加重量比为1：2.4，高速离心的转速为14000r/min，高速离心时间为38min，高速离心温度为3℃。
具体地，所述溶解剂为0.004mol/L的磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液的pH为7.0。
具体地，所述步骤四中微孔滤膜的孔径为0.22μm。
实施例1-实施例6制备得到的藻蓝蛋白的性能参数如表1所示，实施例1-实施例4为本发明限定的技术参数，实施例5中只采用超声波破碎，实施例6中不采用双水相体系分离，实施例6中采用常规的羟基磷灰石柱层析，实施例5-实施例6为本发明的对照实施例。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种高纯度藻蓝蛋白的分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、取螺旋藻与提取剂混合后进行研磨至少30min，再采用超声波破碎，加入离心机中离心得到第一次提取液与沉淀，待用；
步骤二、将步骤一中的沉淀与提取剂混合后进行超声波破碎，加入离心机中离心得到第二次提取液，将第二次提取液与第一次提取液混合得到提取液，待用；
步骤三、向所述提取液中加入质量分数为40%的硫酸铵溶液进行高速离心，高速离心后取上清液，再向上清液中加入硫酸铵使得溶液中硫酸铵的质量分数为55%以上，中速离心后取沉淀，待用；
步骤四、向步骤三中的沉淀中加入溶解剂进行溶解后高速离心，离心后的上清液采用微孔滤膜进行过滤，将滤液再加入双水相体系中进行分离，再经过离子交换柱进行纯化得到高纯度藻蓝蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种高纯度藻蓝蛋白的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤一中螺旋藻与提取剂的添加重量比为1：（3-5），超声波破碎的时间为10-12min，超声温度为0-4℃，离心转速为12000-15000r/min，离心时间为30-40min，离心温度为0-4℃。
3.根据权利要求1所述的一种高纯度藻蓝蛋白的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤二中沉淀与提取剂的添加重量比为1：（1.5-2.0），超声波破碎的时间为3-5min，超声温度为0-4℃，离心转速为12000-15000r/min，离心时间为15-20min，离心温度为0-4℃。
4.根据权利要求1-3任一项所述的一种高纯度藻蓝蛋白的分离纯化方法，其特征在于，所述提取剂为0.1-0.5mol/L的磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液的pH为7.0。
5.根据权利要求1所述的一种高纯度藻蓝蛋白的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤三中高速离心转速为12000-15000r/min，高速离心时间为30-40min，中速离心转速为8000-10000r/min，中速离心时间为30-40min。
6.根据权利要求1所述的一种高纯度藻蓝蛋白的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤四中沉淀与溶解剂的添加重量比为1：（2.0-2.5），高速离心的转速为12000-15000r/min，高速离心时间为30-40min，高速离心温度为0-4℃。
7.根据权利要求1所述的一种高纯度藻蓝蛋白的分离纯化方法，其特征在于，所述溶解剂为0.001-0.005mol/L的磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液的pH为7.0。
8.根据权利要求1所述的一种高纯度藻蓝蛋白的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤四中微孔滤膜的孔径为0.22μm。
9.根据权利要求1所述的一种高纯度藻蓝蛋白的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤四中双水相体系中聚乙二醇的质量分数为12.28%，双水相体系中磷酸缓冲液的质量分数为11.63%。
10.根据权利要求9所述的一种高纯度藻蓝蛋白的分离纯化方法，其特征在于，所述磷酸缓冲液的摩尔浓度为0.001-0.005mol/L。
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