CN116199770B - 一种从钝顶螺旋藻中提取纯化藻蓝蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从钝顶螺旋藻中提取纯化藻蓝蛋白的方法，采用加盐喷雾干燥获得表面富集多糖的干螺旋藻细胞，通过盐溶剂，促进胞内藻蓝蛋白的渗出，提高藻蓝蛋白的提取率，通过对携带螺旋藻细胞的提取液进行均质，得到合适的细胞片段，使得螺旋藻细胞碎片表现出多糖微聚体的特性，在促进分相的同时螺旋藻细胞随着葡聚糖向下相迁移，从而实现藻蓝蛋白的一步法分离与纯化，最后通过聚乙二醇与盐溶剂形成双水相，进行富集纯化；最终藻蓝蛋白的提取率和纯度均得到了很大的提升。本发明操作简单，适于大规模的藻蓝蛋白提取纯化，降低藻蓝蛋白生产的成本，满足规模化应用的要求。
Description
技术领域
本发明属于功能性成分提取的技术领域，具体涉及一种从钝顶螺旋藻(Spirulinaplatensis)干生物量中提取藻蓝蛋白的方法。
背景技术
藻蓝蛋白是一种天然的色素蛋白，主要存在于蓝藻和红藻中，是美国食品和药物管理局批准的免认证颜色添加剂。由于具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、增强免疫力等功能活性，越来越多地被市场、工业和科学领域研究。藻蓝蛋白目前已经从各种藻类中被提取，钝顶螺旋藻被认为是一种廉价且丰富的藻蓝蛋白和多糖来源。但是，螺旋藻细胞的细胞壁很难被破坏，干燥的螺旋藻细胞壁具有更强的刚性，对于胞内蛋白的提取造成了阻碍。所以有很多研究通过改善细胞破碎工艺来提高藻蓝蛋白的提取率，目前细胞破碎主要采用：反复冻融、超声波、微波、化学试剂处理、酶解、溶胀、匀浆、超细剪切和研磨等方法。这些方法都不可避免地造成胞内其他杂质溶出，降低藻蓝蛋白的纯度，所以目前也有很多方法用于分离纯化藻蓝蛋白，例如盐析、色谱分离和萃取等。纯化前期细胞的分离会延长加工时间造成蛋白损失，不仅成本高、耗时且影响蛋白提取率，所以降低处理时间减少蛋白损失的新工艺是必要的。
双水相萃取体系是一种条件温和、处理量大、易于连续操作、环境友好型且可以保持分子生物活性的萃取技术。研究者采用磷酸钾与聚乙二醇形成的双水相通过十级逆流分配对钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)中的藻蓝蛋白进行分离纯化，纯度达到238％(Liu等人，Aqueous two-phase countercurrent distribution for the separation of c-phycocyanin and allophycocyanin from Spirulina platensis,2012，90:111-117)。另外，通过三甲胺和聚乙二醇形成的双水相对钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)中的藻蓝蛋白进行纯化，纯度可增加2.1倍(Wang等人，Application of TMA-PEG to promote C-phycocyanin extraction from S.platensis in the PEG ATPS，2017，52:283-294)。双水相萃取体系对藻蓝蛋白提取液进行纯化可得到理想的纯化效果。然而，传统的藻蓝蛋白纯化需要去除藻体后对提取液进行纯化，双水相纯化通常只能进行液液萃取，不能实现液固分离。
发明内容
本发明针对目前从钝顶螺旋藻中进行藻蓝蛋白提取时需要去除藻体后对提取液进行纯化，双水相纯化通常只能进行液液萃取，不能实现液固分离的缺陷，提供一个新工艺来实现藻蓝蛋白的一步法分离与纯化，同时可以降低加工过程中的蛋白损失和加工成本。
本发明引入聚乙二醇与柠檬酸盐形成的双水相系统，并利用干燥后螺旋藻上附着的葡聚糖与聚乙二醇的相互作用力，在促进分相的同时完成藻体与藻蓝蛋白的分离。该方法能提高藻蓝蛋白的提取率和纯度，并且该方法成本低、操作简单易于放大生产。
为实现本发明的目的，本发明提供以下技术方案：
一种从钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)中提取纯化藻蓝蛋白的方法，筛选一种低成本且高效的盐溶剂从螺旋藻中提取藻蓝蛋白，并筛选一种成相盐通过双水相实现一步法藻体分离与藻蓝蛋白的纯化。
具体包括如下步骤：
S1前处理：在喷雾干燥前的藻液中加入NaCl，以促进干燥过程中藻细胞多糖的渗出并附着在藻细胞上，有利于后期纯化中分相和细胞分离。喷雾干燥进料的藻液的固形物含量50-150g/L，向藻液中加入0.5-5％的金属氯代盐，如NaCl，KCl或MgCl2等，进口温度120-180℃，出口温度60-100℃的条件下，对新鲜螺旋藻进行喷雾干燥。
S2将喷雾干燥后的螺旋藻加入到盐溶剂中，如NaCl，KCl或MgCl2等，以液固比10-40v/w，盐浓度20-100g/L，pH 5-10,浸提温度5-25℃，转速50-200rpm，浸提时间6-30h下进行藻蓝蛋白提取。该盐溶剂及其提取条件的使用能够确保藻蓝蛋白最大限度的溶出，提高藻蓝蛋白的稳定性，减少提取过程中藻蓝蛋白失活造成的损失。
S3将S2所得的携带藻细胞的提取液进行均质
螺旋藻细胞表面携带多糖，合适尺寸的细胞碎片表现出多糖微聚体的特性。为了得到合适的螺旋藻细胞碎片，将携带藻细胞的提取液在转速10000-40000rpm下以时间为3-15s进行均质。过大的细胞碎片不能表现出微米聚合体的特性，会导致后续不易形成双相，过小的细胞碎片不能表现出聚糖的特性，导致细胞在后续分离中细胞存在于两相中，无法实现细胞的分离。
S4将均质的提取液稀释1-8倍后加入成相盐，优选的成相盐为C6H5K3O7，C6H5Na3O7或C12H10Mg3O14，以及分子量为400-6000的聚乙二醇。选择最优的成相盐和聚乙二醇，在相图双相区选择盐浓度8-40wt％，聚乙二醇浓度15-40wt％，藻液稀释液与双水相总体积比1：3-1：7。并在温度5-25℃,pH 5-9，时间3-24h下进行藻蓝蛋白的纯化和同步细胞分离，藻蓝蛋白在上相，藻细胞聚集于下相。
S5纯化结束后，测定上相中藻蓝蛋白的提取率和纯度。
进一步的，S1中喷雾干燥进料时藻液的固形物含量可以为50，75，100，125，150g/L，优选为75-125g/L，更优选为100g/L。向浓缩的藻液中加入的NaCl浓度可以为0.5，1，2，3，4，5％，优选为2-4％，更优选为3％。优选地，进口温度可以为120，130，140，150，160，170，180℃，优选为140-180℃，更优选为175℃。优选地，出口温度可以为60，70，80，90，100℃，优选为60-80℃，更优选为75℃。
进一步地，S2中盐溶剂优选为NaCl或KCl，更优选地为NaCl。优选地，液固比为10，20，30，40v/w，优选为10-30v/w，更优选为20v/w。优选地，盐浓度可以为20，40，60，80，100g/L，优选为20-80g/L，更优选为50g/L。优选地，pH可以为5，6，7，8，9，10，优选为6-9，更优选为7。优选地，浸提温度可以为5，10，15，20，25℃，优选为10-20℃，更优选为15℃。优选地，转速可以为50，75，100，125，150，200rpm，优选为100-150rpm，更优选为125rpm。优选地，浸提时间可以为6，9，12，16，20，24，26，30h，优选为12-24h，更优选为24h。
进一步地，S3中转速可以为10000，20000，30000，40000优选为20000-30000rpm，更优选为30000rpm。优选地，时间可以为3，5，10，15s，优选为5-10s，更优选为5s。
进一步地，S4中藻液稀释倍数可以为1，2，4，6，8，优选为1-4，更优选为2。优选地，成相盐可以为C6H5K3O7，C6H5Na3O7或C12H10Mg3O14，优选为C6H5K3O7或C6H5Na3O7，更优选为C6H5K3O7。优选地，聚乙二醇分子量可以为400，600，800，1000，2000，4000，6000，优选为2000-6000，更优选为4000。优选地，盐浓度可以为8，10，20，30，40wt％，优选为8-20wt％，更优选为10wt％。优选地，聚乙二醇浓度可以为15，20，25，30，35，40wt％，优选为15-30wt％，更优选为20wt％。优选地，藻液稀释液与双水相总体积比可以为1：3,1：4,1：5,1：6,1：7,优选地，藻液稀释液与双水相总体积比为1：4，1：5，1：6，更优选为1：5。优选地，萃取温度可以为5，10，15，20，25℃,优选为10-20℃,更优选为15℃。优选地，pH可以为5，6，7，8，9，优选为6-8,更优选为不调节pH(即pH为8)。优选地，时间可以为3，6，12，18，24h，优选为6-18h,更优选为12h。
首先采用加盐喷雾干燥获得表面富集多糖的干螺旋藻细胞，然后选择低成本且高效的盐溶剂，通过破坏螺旋藻细胞的完整性，促进胞内藻蓝蛋白的渗出；盐溶剂通过提高藻蓝蛋白的及水性并保持藻蓝蛋白稳定性和功能活性，从而提高藻蓝蛋白的提取率。再通过对携带螺旋藻细胞的提取液进行均质，得到合适的细胞片段，使得螺旋藻细胞碎片表现出多糖微聚体的特性，在促进分相的同时螺旋藻细胞随着葡聚糖向下相迁移，从而实现藻蓝蛋白的一步法分离与纯化；然后通过聚乙二醇与盐溶剂形成双水相，藻蓝蛋白在双水相体系中，通过疏水作用、静电作用等作用力与成相物质发生相互作用，藻蓝蛋白对上相产生选择性分配行为，形成浓度差，达到富集纯化的目的；此外，本发明的方法，藻蓝蛋白的提取率和纯度均得到了很大的提升。
本发明操作简单，适于大规模的藻蓝蛋白提取纯化，降低藻蓝蛋白生产的成本，满足规模化应用的要求。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
总藻蓝蛋白的提取
总藻蓝蛋白含量是参考中国国家标准SNT1113-2002测定的，将螺旋藻干生物量浸泡在磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH7.0)中，然后在250mL容量瓶中的固定体积中用超声波(100W，40kHZ)处理5min。将250mL混合物转移到300mL塑料瓶中，并在-20℃下冷冻12h。然后，将混合物在25℃下解冻。冷冻-解冻程序重复三次，然后以8000rpm离心15min，收集并混合全部的上清液。
实施例1：藻蓝蛋白的提取纯化
将新鲜的螺旋藻经过过滤浓缩，使得固定物含量达到75g/L，并加入0.5％NaCl，在进出口温度分别为120，70℃的条件下对新鲜螺旋藻进行干燥，获得干螺旋藻。取螺旋藻干生物量(3.3g)和100mL盐浓度为60g/L的NaCl溶液添加到250mL烧瓶中(液固比为30)。调节pH至7，在125rpm，15℃下浸提24h。将携带螺旋藻细胞的提取液经过20000rpm均质3s，将提取液(不稀释)加入到15wt％聚乙二醇2000和8wt％C6H5Na3O7溶液中，藻液与双水相总体积为1：4，混合液总体积为8mL，调节pH至8，在15℃，125rpm震荡1h。在20℃下沉降24h，测定上相中藻蓝蛋白的提取率和纯度。
实施例2：藻蓝蛋白的提取纯化
将新鲜的螺旋藻经过过滤浓缩，使得固定物含量达到50g/L，并加入2％NaCl，在进出口温度分别为140，75℃的条件下对新鲜螺旋藻进行干燥，获得干螺旋藻。取螺旋藻干生物量(5g)和100mL盐浓度为60g/L的KCl溶液添加到250mL烧瓶中(液固比为20)。调节pH至10，在50rpm，25℃下浸提16h。将携带螺旋藻细胞的提取液经过40000rpm均质15s，稀释4倍后，加入到30wt％聚乙二醇800和40wt％C6H5K 3O7溶液中，藻液稀释液与双水相总体积比为1：3，混合液总体积为9mL，调节pH至5，在15℃，125rpm震荡1h。在25℃下沉降12h，测定上相中藻蓝蛋白的提取率和纯度。
实施例3：藻蓝蛋白的提取纯化
新鲜的螺旋藻经过过滤浓缩，使得固定物含量达到125g/L，加入1％NaCl，在进出口温度分别为160，90℃的条件下对新鲜螺旋藻进行干燥，获得干螺旋藻。取螺旋藻干生物量(3.3g)和100mL盐浓度为40g/L的MgCl2溶液添加到250mL烧瓶中(液固比为30)。调节pH至6，在75rpm，5℃下浸提6h。将携带螺旋藻细胞的提取液经过30000rpm均质5s，稀释8倍后，加入到25wt％聚乙二醇1000和30wt％C6H5K3O7溶液中，藻液稀释液与双水相总体积比为1：5，混合液总体积为10mL，调节pH至6，在15℃，125rpm震荡1h。在5℃下沉降6h，测定上相中藻蓝蛋白的提取率和纯度。
实施例4：藻蓝蛋白的提取纯化
将新鲜的螺旋藻经过过滤浓缩，使得固定物含量达到150g/L，加入3％KCl，在进出口温度分别为150，60℃的条件下对新鲜螺旋藻进行干燥，获得干螺旋藻。取螺旋藻干生物量(2.5g)和100mL盐浓度为80g/L的KCl溶液添加到250mL烧瓶中(液固比为40)。调节pH至8，在200rpm，20℃下浸提26h。将携带螺旋藻细胞的提取液经过10000rpm均质10s，稀释6倍后，加入到35wt％聚乙二醇400和10wt％C6H5Na3O7溶液中，藻液稀释液与双水相总体积比为1：7，混合液总体积比为11mL，调节pH至9，在10℃，125rpm震荡1h。在10℃下沉降18h，测定上相中藻蓝蛋白的提取率和纯度。
实施例5：藻蓝蛋白的提取纯化
将新鲜的螺旋藻经过过滤浓缩，使得固定物含量达到100g/L，加入1％KCl，在进出口温度分别为130，100℃的条件下对新鲜螺旋藻进行干燥，获得干螺旋藻。取螺旋藻干生物量(10g)和100mL盐浓度为20g/L的MgCl2溶液添加到250mL烧瓶中(液固比为10)。调节pH至9，在200rpm，25℃下浸提12h。将携带螺旋藻细胞的提取液经过40000rpm均质15s，稀释2倍后，加入到20wt％聚乙二醇6000和20wt％C12H10Mg3O14溶液中，藻液稀释液与双水相总体积比为1：6，混合液总体积为12mL，调节pH至7，在15℃，125rpm震荡1h。在15℃下沉降3h，测定上相中藻蓝蛋白的提取率和纯度。
实施例6：藻蓝蛋白的提取纯化
将新鲜的螺旋藻经过过滤浓缩，使得固定物含量达到150g/L，加入5％MgCl2，在进出口温度分别为180，80℃的条件下对新鲜螺旋藻进行干燥，获得干螺旋藻。取螺旋藻干生物量(10g)和100mL盐浓度为20g/L的MgCl2溶液添加到250mL烧瓶中(液固比为10)。调节pH至5，在100rpm，10℃下浸提20h。将携带螺旋藻细胞的提取液经过20000rpm均质3s，稀释2倍后，加入到40wt％聚乙二醇4000和20wt％C12H10Mg3O14溶液中，藻液稀释液与双水相总体积比为1：5，混合液总体积为10mL，调节pH至8，在15℃，125rpm震荡1h。在15℃下沉降3h，测定上相中藻蓝蛋白的提取率和纯度。
实施例7：藻蓝蛋白的提取纯化
将新鲜的螺旋藻经过过滤浓缩，使得固定物含量达到75g/L，加入3％NaCl，在进出口温度分别为130，75℃的条件下对新鲜螺旋藻进行干燥，获得干螺旋藻。取螺旋藻干生物量(2.5g)和100mL盐浓度为80g/L的NaCl溶液添加到250mL烧瓶中(液固比为40)。调节pH至9，在100rpm，5℃下浸提30h。将携带螺旋藻细胞的提取液经过40000rpm均质5s，稀释6倍后，加入到35wt％聚乙二醇600和30wt％C6H5Na3O7溶液中，藻液稀释液与双水相总体积比为1：3，混合液总体积为9mL，调节pH至7，在15℃，125rpm震荡1h。在10℃下沉降24h，测定上相中藻蓝蛋白的提取率和纯度。
对比实施例1：藻蓝蛋白的提取纯化
与实施例7相比，对比实验例1中新鲜的螺旋藻经过过滤浓缩，使得固定物含量达到75g/L，不加入NaCl，在进出口温度分别为130，75℃的条件下对新鲜螺旋藻进行干燥，获得干螺旋藻。取螺旋藻干生物量(2.5g)和100mL去离子水添加到250mL烧瓶中(液固比为40)。调节pH至9，在100rpm，5℃下浸提30h。将携带螺旋藻细胞的提取液在8000rpm离心15min(如不经过离心操作，后续双水相过程中细胞无法分离)，上清液稀释6倍后，加入到35wt％聚乙二醇600和30wt％磷酸盐溶液中(参考Liu等人Aqueous two-phasecountercurrent distribution for the separation of c-phycocyanin andallophycocyanin from Spirulina platensis，2012，9(20)111-117)，上清液稀释液与双水相总体积比为1：3，混合液总体积为9mL，调节pH至7，在15℃，125rpm震荡1h。在10℃下沉降24h，测定上相中藻蓝蛋白的提取率和纯度。
对比实施例2:藻蓝蛋白的提取纯化
与实施例7相比，对比实验例2中将新鲜的螺旋藻经过过滤浓缩，使得固定物含量达到75g/L，不加入NaCl，在进出口温度分别为130，75℃的条件下对新鲜螺旋藻进行干燥，获得干螺旋藻。取螺旋藻干生物量(2.5g)和100mL盐浓度为80g/L的NaCl溶液添加到250mL烧瓶中(液固比为40)。调节pH至9，在100rpm，5℃下浸提30h。将携带螺旋藻细胞的提取液经过40000rpm均质5s，稀释6倍后，加入到35wt％聚乙二醇600和30wt％C6H5Na3O7溶液中，藻液稀释液与双水相总体积比为1：3，混合液总体积为9mL，调节pH至7，在15℃，125rpm震荡1h。在10℃下沉降24h，测定上相中藻蓝蛋白的提取率和纯度。
对比实施例3：藻蓝蛋白的提取纯化
将新鲜的螺旋藻经过过滤浓缩，使得固定物含量达到75g/L，加入3％NaCl，在进出口温度分别为130，75℃的条件下对新鲜螺旋藻进行干燥，获得干螺旋藻。取螺旋藻干生物量(2.5g)和100mL不加NaCl的纯水添加到250mL烧瓶中(液固比为40)。调节pH至9，在100rpm，5℃下浸提30h。将携带螺旋藻细胞的提取液经过40000rpm均质5s，稀释6倍后，加入到35wt％聚乙二醇600和30wt％C6H5Na3O7溶液中，藻液稀释液与双水相总体积比为1：3，混合液总体积为9mL，调节pH至7，在15℃，125rpm震荡1h。在10℃下沉降24h，测定上相中藻蓝蛋白的提取率和纯度。
对比实施例4：藻蓝蛋白的提取纯化
与实施例7相比，对比实验例4中将新鲜的螺旋藻经过过滤浓缩，使得固定物含量达到75g/L，加入3％NaCl，在进出口温度分别为130，75℃的条件下对新鲜螺旋藻进行干燥，获得干螺旋藻。取螺旋藻干生物量(2.5g)和100mL盐浓度为80g/L的NaCl溶液添加到250mL烧瓶中(液固比为40)。调节pH至9，在100rpm，5℃下浸提30h。将携带螺旋藻细胞的提取液不进行均质处理，直接稀释6倍后，加入到35wt％聚乙二醇600和30wt％C6H5Na3O7溶液中，藻液稀释液与双水相总体积比为1：3，混合液总体积为9mL，调节pH至7，在15℃，125rpm震荡1h。在10℃下沉降24h，上相中存在大量藻细胞，上相经8000rpm离心15min除去藻体，测定上相中藻蓝蛋白的提取率和纯度。
对比实施例5：藻蓝蛋白的提取纯化
与实施例7相比，对比实验例5中将新鲜的螺旋藻经过过滤浓缩，使得固定物含量达到75g/L，加入3％NaCl，在进出口温度分别为130，75℃的条件下对新鲜螺旋藻进行干燥，获得干螺旋藻。取螺旋藻干生物量(2.5g)和100mL盐浓度为80g/L的NaCl溶液添加到250mL烧瓶中(液固比为40)。调节pH至9，在100rpm，5℃下浸提30h。将携带螺旋藻细胞的提取液经过40000rpm均质5s，稀释6倍后，加入到35wt％聚乙二醇600和30wt％磷酸盐溶液中(参考Liu等人Aqueous two-phase countercurrentdistribution for the separation of c-phycocyanin and allophycocyaninfrom Spirulina platensis，2012，9(20)111-117)，藻液稀释液与双水相总体积比为1：3，混合液总体积为9mL，调节pH至7，在15℃，125rpm震荡1h。在10℃下沉降24h，上相中存在大量藻细胞，上相经8000rpm离心15min除去藻体，测定上相中藻蓝蛋白的提取率和纯度。
藻蓝蛋白含量和纯度的测定
使用分光光度计测量提取液的吸光度。通过以下公式计算藻蓝蛋白含量以及纯度：
[PC]＝[A620-0.474A652]/5.34 (1)
PC(g/100g)＝[PC]×V×100/m (2)
ER(％)＝PCE/PCT×100％ (3)
EP(％)＝100*A620/A280 (4)
其中[PC]为提取液中藻蓝蛋白的含量(mg/mL)。A是在相应波长(620nm、652nm和280nm)下测量的吸光度。V是蛋白溶液的总体积(mL)，m是藻粉样品质量(mg)，PC是藻蓝蛋白含量(g/100g)，PCE是在不同操作下获得的藻蓝蛋白含量(g/100g)，PCT是总藻蓝蛋白含量(g/100g)，ER是藻蓝蛋白提取率(％)，EP是藻蓝蛋白纯度(％)。
表1藻蓝蛋白提取率和纯度的测定
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种从钝顶螺旋藻中提取纯化藻蓝蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1前处理：
在喷雾干燥前的藻液中加入金属氯代盐，然后进行喷雾干燥；
S2、将喷雾干燥后的螺旋藻加入到盐溶剂中，浸提藻蓝蛋白，得到带藻细胞的提取液；
S3、将S2所得的携带藻细胞的提取液进行均质；均质条件为在转速10000-40000 rpm下以时间为3-15 s进行均质；
S4、双水相提取
将均质的提取液稀释后加入成相盐和聚乙二醇组成的双水相溶液中进行提取，所述的成相盐为C6H5K3O7，C6H5Na3O7或C12H10Mg3O14中的任意一种，收集上相，即得藻蓝蛋白；
S1中在喷雾干燥前的藻液中加入0.5 wt%-5wt%的金属氯代盐，所述金属氯代盐为NaCl，KCl或MgCl2中的任意一种；
S2中盐溶剂为NaCl、KCl或MgCl2中的任意一种；
S4中聚乙二醇的分子量为2000-6000，浓度为15 wt%-40 wt%，盐浓度为8wt%-40wt%。
2.如权利要求1所述的从钝顶螺旋藻中提取纯化藻蓝蛋白的方法，其特征在于，S1中喷雾干燥时进料的藻液的固形物含量50-150 g/L。
3.如权利要求2所述的从钝顶螺旋藻中提取纯化藻蓝蛋白的方法，其特征在于，S1中进口温度120-180℃，出口温度60-100℃的条件下，对新鲜螺旋藻进行喷雾干燥。
4.如权利要求1所述的从钝顶螺旋藻中提取纯化藻蓝蛋白的方法，其特征在于，S2中浸提时液固比为10-40 v/w，盐浓度为20-100 g/L，pH为5-10,浸提温度为5-25℃，浸提时间为6-30 h。
5.如权利要求4所述的从钝顶螺旋藻中提取纯化藻蓝蛋白的方法，其特征在于，S2中浸提时需要进行搅拌，搅拌转速为50-200 rpm。
6.如权利要求1所述的从钝顶螺旋藻中提取纯化藻蓝蛋白的方法，其特征在于，S3中转速为30000 rpm，均质时间为5-10 s。
7.如权利要求1所述的从钝顶螺旋藻中提取纯化藻蓝蛋白的方法，其特征在于，S4中在温度5-25℃,pH 5-9条件下进行双水相提取。
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