CN101941975A - 以动物血球粉为原料制备血红素的方法 - Google Patents

Abstract

以动物血球粉为原料制备血红素的方法。由动物血液分离得到的血球粉、特别是猪血粉为原料，经酸性丙酮法提取和分离得到血红素，其特征是用包括脲或胍类化合物的变性蛋白溶解剂水溶液，将由动物血液分离得到的血球粉原料充分溶解后，向溶解液中加入蛋白沉淀剂，充分沉淀后，收集沉淀并充分洗涤后，以酸性丙酮法提取和分离得到血红素产物。该方法可以使血红素由变性的血蛋白中充分释放出来，制备得到纯度为96％、血红素铁含量达7.5％以上的血红素产品。

Description

以动物血球粉为原料制备血红素的方法

技术领域

本发明涉及一种血红素的制备方法。

背景技术

血红素是医药中的一种高效补铁剂，含铁量高，可以直接被肠黏膜细胞吸收，不产生任何消化道刺激症状，生物利用率高，吸收率比一般铁剂高约3倍。在治疗缺铁性贫血症同时也是抗贫血和抗肿瘤药物的重要原料。在食品行业中，血红素作为色素染剂，无毒、无副作用，安全可靠。以猪血为原料，可生产有重要医药价值、食用价值的血红素。作为副产品，还可以综合利用得到抗衰老、抗肿瘤、治疗高血压、糖尿病的SOD；止血作用的凝血酶；微生物培养基的蛋白胨等。

从血液红细胞中提取制备血红素的的方法，目前已有广泛的研究和报道。如冰醋酸法(钟耀广：利用冰醋酸提取血红素的研究[J].食品科学2004，20(4)：90-95)，丙酮提取法(刘娅等：天然补铁剂-血红素铁的研究进展[J]中国食品添加剂，2005，4：5-8)，等电位法(陈合等：新型食品原料制备技术与应用[M].北京：化学工业出版社，2004)，以及酶水解法和选择溶剂法等。其中的丙酮法可分为酸性丙酮法(宋照军等：血红素提取纯化新技术研究[J].广州食品工业科技，2004，20(1)：6-11)和碱性丙酮法(吴宝庆等：血红素的制备与应用[J].精细与专用化学品，1999，9：20-21)。其中酸性丙酮法，是在鲜血球中加入盐酸丙酮震荡静置，即可得到粗品血红素；碱性丙酮法，则是在pH 12的强碱性环境和40～80℃加热24h后，再调整pH至3～5，得到浓缩的血红素复合体。

上述传统的血红素生产方法，都是直接以猪、羊等动物屠宰后的新鲜血液(全血)或红细胞为原料进行提取。但新鲜动物血液的收集，运输，保存存在明显的条件限制。例如，即使是来源相对集中的鲜猪血，其作为原料既存在原料运输、贮存困难，且因原料中水分含量过高，提取时易造成试剂的大量消耗，产品收率低、纯度低、成本高。而加入抗凝剂后，即使在4℃环境下保存，1周后也明显开始腐败，15天基本完全腐败。腐败后的血液极不利于血红素的提取。

此外，上述文献报道/使用的制备方法，除存在产品纯度不高，需进一步纯化的问题外，还分别存在各自不同的问题和不足。例如，冰醋酸法虽具有简单易行的特点，但收率低，提取温度高(100～105℃)，血蛋白和溶剂回收难，增加了生产成本，废液处理不当还造成污染。酶解法受影响的因素多，且酶解时间相对较长，一般在8小时以上，得到的血红素纯度和得率均较低(纯度～25％，收率＜60％)。碱性丙酮法对温度和时间都有较高的要求，因而酸性丙酮法是目前使用最多的方法。

公开号CN1594337A的中国专利文献及李秀玲等人研究提出的利用蛋白沉淀剂沉淀血红蛋白(李秀玲等：高纯度血红素制备工艺的改进[J].四川大学学报(医学版)，2004，35(5)：738-738，744)中公开了一种对动物全血或红细胞先以蛋白沉淀剂进行沉淀得到血粉，再以其为原料，经酸性丙酮法提取血红素成分的方法，并给出了包括三氯醋酸溶液、磺基水扬酸溶液、单宁酸溶液、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、氯仿、氯化钡、硫酸铵、硫酸铜、硫酸锌等诸多可供选择的有机、无机类蛋白沉淀剂。该方法可以使丙酮的用量降至老工艺的一半，产品纯度可达99％以上，每升红细胞能得到血红素5～6g，铁含量为5.85％，收率约为68％。

公开号101085777A的中国专利文献中提出的羊血血红素生产方法，是在新鲜羊血中加入抗凝剂并离心分离血球，于200-220℃下经喷雾干燥制成血球粉，再以该血球粉为原料，经酸性丙酮法提取、分离了得到血红素。

周淡宜等在“血红素制备工艺的实验研究”([J].药物生物技术，2002，9(2)：103-104)中，还报道过以由低温干燥得到的全猪血粉或血球粉为原料制备血红素的方法。虽然以低温冻干得到的血球粉不存在血红素被变性蛋白包裹的问题，但由于低温冷冻干燥技术的能耗相对较高，因此在工业化应用中并不广泛。而在采用高温喷雾干燥时，由于血球中的血红蛋白部分在高温条件下会因变性而将血红素包裹起来，导致一般方法都难以使血红素被充分释放和提取出来。即使采用酶解法等方式处理，最终得到产品的血红素含量一般也只能达到30％左右。这是影响和制约目前各种提取制备方法的重要因素。

发明内容

鉴于此，本发明提供了一种以动物血球粉，特别是以由高温喷雾干燥得到的猪血粉为原料制备血红素的方法，可以满意地解决上述问题。

本发明以动物血球粉为原料制备血红素的方法，是由新鲜动物血液分离得到的血球粉为原料，经酸性丙酮法提取和分离得到血红素。其中，对所说的血球粉原料，首先是用包括脲或盐酸胍等胍类化合物等常用的变性蛋白溶解剂水溶液，将该血球粉原料充分溶解后，再向溶解液中加入蛋白沉淀剂，充分沉淀后，收集沉淀，并充分洗涤，再以常规的酸性丙酮法，特别是上述CN1594337A中国专利文献及李秀玲等人所报道的酸性丙酮法，提取和分离得到血红素产物。

本发明上述方法中所说的血球粉原料，可以按目前已有文献报道/使用的各种方法，首先由新鲜动物血液进行血球与血浆的分离，血浆用于其它有效成分提取，由收集的红血球部分进一步制成所说的血球粉。其中的血球粉的制备方式，除可以采用上述已有文献报道/使用的微波干燥，真空干燥、低温冷冻干燥等各种方法外，由于目前常用的高温喷雾干燥(如一般可≥170℃)方法可以使溶液，乳浊液，悬浮液，熔融液或膏糊状物能迅即蒸发水分，使物料转变为符合生产要求的粉状或颗粒状物，特别是对粘度较高的新鲜动物血球具有干燥速度快和能耗低等优点，因此优选采用的是由常用的喷雾干燥机，以喷雾干燥方式制备得到。

可以作为本发明方法使用的动物血球粉原料中，特别以使用猪血球粉为优选，其来源丰富，量大易得，有利于降低成本。

由于以各种方式、特别是经高温喷雾干燥方式得到的血球粉，其红血球都不可避免地存在着细胞脱水，胞内蛋白质等均存在一定程度变性，将血红蛋白中的血红素包裹，导致在提取血红素时血球粉难以被溶解。因此本发明方法首先须用变性蛋白溶解剂，如常用的脲或盐酸胍等胍类化合物变性蛋白溶解剂的水溶液，将血球粉原料充分溶解。在各种变性蛋白溶解剂中，由于脲的无毒性以及具有价廉、易得、水溶性高、遇酸易分解和安全易处理等优势，因此以使用脲的水溶液为优选。

使用变性蛋白溶解剂的目的及其作用，就是为使已变性的血红蛋白被溶解，以释放和便于对血红素的提取。因此，在能实现充分溶解的前提下，对所用变性蛋白溶解剂水溶液的浓度和/或使用量，无需过多限制。试验显示，所说的脲、盐酸胍等胍类化合物变性蛋白溶解剂水溶液在浓度≥1mol/l，即在1mol/l至接近饱和溶液的各种浓度下，都可以取得所需要的溶解效果。但在兼顾溶解效果以及后续处理的洗涤、沉淀等操作过程中所需的溶剂或试剂量等综合考虑，所说的变性蛋白溶解剂水溶液以4～10mol/l浓度的脲水溶液，或2～6mol/l浓度的盐酸胍水溶液为优选。试验显示，血球粉质地较细小均匀且搅拌效果较好时，溶解血球粉时脲或盐酸胍的水溶液用量可以相对较少，一般情况下，其用量为血球粉质量的7～10倍时，都可以取得满意的效果。

在上述变性蛋白溶解剂溶解后得到溶解液加入蛋白沉淀剂，使血红蛋白充分沉淀后，收集沉淀，并充分洗涤，除净变性蛋白溶解剂，即得到纯净的血红蛋白成分。所说的蛋白沉淀剂可以选择如前述CN1594337A文献中所报道的各种有机、无机类的沉淀剂，如丙酮、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿、饱和硫酸铵、33％氯化钠盐析液等各种常用蛋白沉淀剂中的一种。其中，由于丙酮的毒性低、沉淀效果好，沸点低，易除去等优点，是本发明制备方法中一种优选的蛋白沉淀剂。

在所说的溶解液中加入蛋白沉淀剂，是使血红蛋白能充分沉淀，与溶液分离，提高血红素的收得率和血红素铁的含量。因此对蛋白沉淀剂的加入量应以能使沉淀充分、完全为原则。例如，试验显示，在使用丙酮作为蛋白沉淀剂时，其加入量一般可为变性蛋白溶解剂水溶液溶解后的溶解液1～2.5倍的体积量，即可取得满意的沉淀效果。

对经蛋白沉淀剂沉淀并收集的沉淀物，可以使用所用沉淀剂与水的适当浓度的混合溶液进行洗涤。例如，使用丙酮作为蛋白沉淀剂时，对沉淀并收集的沉淀物，一般可以用体积浓度50～80％的丙酮水溶液进行洗涤。

上述的各步处理，通常在0℃至不高于物料体系的溶剂和试剂的沸点温度，特别是在室温条件下，都可以顺利进行和完成。

经上述方法得到的血红蛋白沉淀物，即可采用前述文献报道和使用的酸性丙酮法继续提取得到所说的血红素产品。

血红素产品中的血红素铁作为一种高效补铁剂，其铁含量是一个重要的指标。试验结果显示，采用本发明上述方法由猪血球粉为原料制备得到血红素产品的纯度可达96％、血红素铁含量可高达7.5％以上，显著优于目前文献报道的以全猪血粉或新鲜猪血为原料的血红素和铁的含量。

本发明方法采用首先用变性蛋白溶解剂溶解血球粉中的变性蛋白，使血红蛋白被溶解释放出来，为实现进一步以酸性丙酮等有机溶媒的充分提取创造了有利条件。特别是采用以脲等呈弱碱性和易溶于水的变性蛋白溶解剂后，通过丙酮水溶液等后处理的洗涤可以容易除去，在后期提取过程中的酸性环境下还可以被进一步除净。因此，本发明方法不但实现了血球和血浆有效成分的联产，特别是避免了以来源丰富的鲜猪血为原料给生产带来的不便，使原料易于运输和保存满足集中规模化生产，并大大提高了对猪血和猪血球粉的利用率，提高了产品的质量。

以下通过实施例的具体实施方式再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包括在本发明的范围内。

具体实施方式

实施例1

血球粉制备：在新鲜猪血中加入0.8wt％柠檬酸三钠抗凝剂，搅拌均匀(柠檬酸三钠先用少量蒸馏水完全溶解，并事先加入容器中，待加入鲜猪血时立即摇匀)，16600r/min离心分离，分别收集血球和血浆。血浆用于其它有效成分提取。将收集的血球，在进风温度为200-220℃的条件下，用GPL型离心喷雾干燥机(成都倍力干燥设备有限公司)喷雾干燥制得血球粉。

实施例2

将实施例1制备得到的，或采用前述101085777A文献方式喷雾干燥得到的猪血球粉7.5克，缓慢加入到6mol/l的脲溶液60ml，搅拌溶解30min。缓慢加入2倍体积的丙酮，调节pH近中性，搅拌3.0min，使其充分沉淀，上清液无色透明。3000r/min离心后，收集红色沉淀。沉淀用70(v)％的丙酮水溶液80ml分3次搅拌洗涤，3000r/min离心(或抽滤、过滤等方法)收集沉淀。按前述文献方式，加入80ml酸性丙酮(pH＜3)，搅拌提取30min，抽滤，并用酸性丙酮洗涤，合并滤液约110ml。滤液用1.0mol/l的NaOH溶液调节pH至6～7，析出沉淀，用3000r/min离心10min分离得到沉淀。沉淀用0.1mol/l的NaOH溶液20ml溶解，调节pH5～6，3000r/min离心10min，并用蒸馏水洗涤沉淀至中性，得血红素产品0.1447g。产品纯度为97.51％。血红素铁含量为7.76％。

实施例3

将上述同样的猪血球粉7.5克，缓慢加入到6mol/l盐酸胍溶液60ml中，搅拌溶解30min。缓慢加入2倍体积的丙酮，调节pH近中性，搅拌3.0min，使其充分沉淀，上清液无色透明。后续操作同实施例2。得血红素产品0.1429g。产品纯度为98.01％。血红素铁含量为7.48％。

实施例4

将上述同样的猪血球粉7.5克，缓慢加入到6mol/l的脲溶液中，搅拌溶解30min。缓慢加入约2倍体积的乙醇，调节pH 6-8，搅拌3.0min，使充分沉淀，上清液无色透明。3000r/min离心，收集红色沉淀。沉淀用70(v)％的丙酮水溶液80ml分3次搅拌洗涤，3000r/min离心或抽滤、过滤等方法收集沉淀。加入80ml酸性丙酮(pH＜3)，搅拌提取30min，抽滤，并用酸性丙酮洗涤，合并滤液约110ml。滤液用1.0mol/l的NaOH溶液调节pH至6～7，析出沉淀，用3000r/min离心10min，分离得到沉淀。沉淀用0.1mol/l的NaOH溶液20ml溶解，调节pH5～6，经3000r/min离心10min，分离收集沉淀，并用蒸馏水洗涤至中性，得血红素产品0.1417g。纯度为96.91％，血红素铁含量为7.56％。

实施例5

将上述同样的猪血球粉7.5克，缓慢加入到4mol/l的脲溶液60ml，搅拌溶解30min后，加入2.0倍体积的饱和硫酸铵溶液，调pH2-4，搅拌3.0min。充分沉淀，上清液透明。离心(3000r/min)收集红色沉淀。沉淀用pH 10的70(v)％丙酮水溶液80ml分3次搅拌洗涤后，加入100ml酸性丙酮(pH＜3)，搅拌提取30min，抽滤，收集滤液。酸性丙酮分2洗涤沉淀，洗液并入滤液约130ml，用1.0mol/l的NaOH溶液调节pH至6～7，析出沉淀，经3000r/min离心10min，收集沉淀。沉淀用0.1mol/的NaOH溶液溶解定溶，测A₃₈₅，调pH5～6，3000r/min离心10min，并用蒸馏水洗涤至中性，得血红素产品0.1474g。产品纯度为94.78％。血红素铁含量为7.18％。

实施例6

将上述同样的猪血球粉7.5克，缓慢加入到4mol/l的脲溶液60ml，搅拌溶解30min后，加入1.5倍体积的饱和氯化钠溶液，调pH2-4，搅拌3.0min。充分沉淀，上清液透明。以后的操作同实施例5，得血红素产品0.1344g。产品纯度为97.57％。血红素铁含量为7.54％。

Claims (10)

1.以动物血球粉为原料制备血红素的方法，由动物血液分离得到的血球粉为原料，经酸性丙酮法提取和分离得到血红素，其特征是用包括脲或胍类化合物的变性蛋白溶解剂水溶液，将由动物血液分离得到的血球粉原料充分溶解后，向溶解液中加入蛋白沉淀剂，充分沉淀后，收集沉淀并充分洗涤后，以酸性丙酮法提取和分离得到血红素产物。

2.如权利要求1所述的以动物血球粉为原料制备血红素的方法，其特征是所说的血球粉原料为猪血球粉。

3.如权利要求1所述的以动物血球粉为原料制备血红素的方法，其特征是所说的血球粉原料为由新鲜动物血液分离后的血球成分经≥170℃喷雾干燥后得到的血球粉。

4.如权利要求1至3之一所述的以动物血球粉为原料制备血红素的方法，其特征是所说的变性蛋白溶解剂水溶液为浓度≥1mol/l的脲或胍类化合物的水溶液，其用量为血球粉质量的7～10倍。

5.如权利要求4所述的以动物血球粉为原料制备血红素的方法，其特征是所说的变性蛋白溶解剂水溶液为4～10mol/l浓度的脲水溶液，或2～6mol/l浓度的盐酸胍水溶液。

6.如权利要求1至3之一所述的以动物血球粉为原料制备血红素的方法，其特征是所说的蛋白沉淀剂为丙酮、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿、饱和硫酸铵、33％氯化钠盐析液中的一种。

7.如权利要求6所述的以动物血球粉为原料制备血红素的方法，其特征是所说的蛋白沉淀剂为变性蛋白溶解剂水溶液溶解后的溶解液1～2.5倍体积量的丙酮。

8.如权利要求1至3之一所述的以动物血球粉为原料制备血红素的方法，其特征是所说的经蛋白沉淀剂沉淀并收集的沉淀物，以所用沉淀剂与水的混合溶液进行洗涤。

9.如权利要求7所述的以动物血球粉为原料制备血红素的方法，其特征是所说的经蛋白沉淀剂沉淀并收集的沉淀物，用体积浓度50～80％的丙酮水溶液进行洗涤。

10.如权利要求1至3之一所述的以动物血球粉为原料制备血红素的方法，其特征是所说的用变性蛋白溶解剂水溶液溶解和在溶解液中用蛋白沉淀剂进行沉淀的操作，在0℃～低于物料体系的溶剂和试剂的沸点温度下进行。