CN103103170B - 牛或羊玻璃酸酶的生产方法 - Google Patents

Abstract

一种牛或羊玻璃酸酶的生产方法，包括原料预处理，匀浆，超声波浸提，搅拌提取，硫酸铵除杂，硫酸铵沉淀，透析，阳离子交换色谱层析，凝胶过滤色谱层析，真空冷冻干燥等工艺步骤。本发明提供的生产工艺所生产的牛或羊玻璃酸酶的质量指标为：外观为微黄色粉末，无臭，易溶于水，不溶于乙醇、丙酮；玻璃酸酶效价≥1500单位，酪氨酸含量＜0.1微克，干燥失重＜5.0%，酸度为6.5。具有提取效率高、纯度高、性质稳定、生产时间短、变废为宝的特点，在医药和保健品领域具有良好的应用前景。

Description

牛或羊玻璃酸酶的生产方法

技术领域

本发明涉及医药及保健品技术领域，是利用牛或羊睾丸作为原料提取纯化玻璃酸酶的生产工艺。

背景技术

玻璃酸酶又名透明质酸酶，是一种能够降低体内透明质酸的活性，从而提高组织中液体渗透能力的酶。玻璃酸酶主要存在于哺乳动物睾丸、蛇毒以及其他动物毒液中。玻璃酸酶根据其种类、分子量大小、最适pH值、降解底物的机理不同被分离。玻璃酸酶用于肿瘤治疗可以降低人膀胱癌的复发率；用于心肌梗塞治疗可使心肌透明质酸含量显著降低，增加血流量；另外用玻璃酸酶的酶液滴注眼前房可以降低白内障病人术后过高的眼内压。玻璃酸酶不但在医药领域有着广泛的应用，而且在保健品领域也有卓越的贡献，人为补充玻璃酸酶可消除皱纹或使局部器官增厚增高，使皮肤保持弹性，从而达到整容效果。

我国是畜牧生产大国，2010年肉牛实际屠宰量达到285万头，屠宰后产生大量的睾丸，将其作为废弃物处理不仅造成了资源浪费还会污染坏境。因此，大力开发利用牛、羊睾丸资源将会带来巨大的经济效益。目前，生产玻璃酸酶普遍采用的提取剂为乙酸或乙酸与盐酸的混合液，这类提取剂不利于保护酶的活力；采用的精制玻璃酸酶的方法多为硫酸铵与乙醇交替沉淀法，企业采用这类方法生产的玻璃酸酶以半成品为主，产品纯度仅有50%，价格低廉，生产成本高，提取时间长，产品质量波动较大。因此，如何提高玻璃酸酶纯度，缩短制备时间，降低生产成本成为玻璃酸酶生产过程中的急需解决问题。

从哺乳动物睾丸中提取玻璃酸酶的工艺虽然已有少量报道，但是至今尚未检索到利用超声波辅助提取—联合色谱层析的方法精制牛或羊玻璃酸酶的工业化生产技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用牛或羊屠宰后的副产物—睾丸，用生物分离技术生产玻璃酸酶的工艺，该工艺得到的玻璃酸酶纯度较高、性质稳定、在医药及保健品领域具有广阔的应用前景，可以更好地满足市场需求。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种牛或羊玻璃酸酶的生产方法，包括A步骤原料预处理，还包括以下主要步骤：

B、匀浆

经步骤A处理的睾丸与0.1~0.5摩尔每升的乙酸-乙酸钠溶液混合，放入组织捣碎机中，搅拌均匀；

C、超声波浸提

将步骤B处理得到的匀浆液泵入超声波提取机中，在15～55千赫兹下超声波浸提15～30分钟，浸提后过不低于100目的网筛，得到的沉淀物进行二次提取，浸提步骤为先B后C，合并两次浸提得到的滤液；

D、搅拌提取

将步骤C得到的滤液泵入搅拌缸中，加入0.1~0.5摩尔每升的氯化钠，持续搅拌3~6小时，搅拌结束后低温离心，弃去沉淀得到玻璃酸酶粗酶液1；

E、硫酸铵除杂

F、硫酸铵沉淀

G、透析

本步骤用到的蒸馏水需要提前预冷，温度为4℃；

将步骤F得到的沉淀用蒸馏水溶解后装入截留分子量为10~14kDa的透析袋，在透析缸中搅拌透析2~5小时，低温离心后将清液过滤，滤膜的孔径为0.2~0.45微米，得到玻璃酸酶粗酶液2；

H、阳离子交换色谱层析

步骤H和I由联合色谱层析系统完成；纯化步骤描述如下：

平衡预装柱：用纯化样品的平衡液或洗脱液通过平衡柱，当电导率检测线，pH值检测线，紫外检测线都保持平直1~2小时后，平衡预装柱完成；

进样：样品由进样泵流入预装柱，进样完成后将预装柱封口待用；

洗脱：设定好色谱层析系统的参数，洗脱缓冲液进入分离柱开始洗脱样品，被洗脱的液体由自动收集器收集；

阳离子交换色谱层析纯化步骤如下：

平衡阳离子交换预装柱，将玻璃酸酶粗酶液2进样后用50~100毫摩尔每升的乙酸-乙酸钠溶液洗脱杂质，洗脱20~50分钟，洗脱液更换为50~100毫摩尔每升的乙酸-乙酸钠溶液，洗脱前在该溶液中加入氯化钠，使氯化钠的浓度为0~1摩尔每升，洗脱流速每分钟5~13毫升，洗脱时间3~8小时，洗脱后测定每个收集管的酶活力，将有活力的液体全部混合后备用；

I、凝胶过滤色谱层析

平衡凝胶过滤预装柱，将步骤H得到的混合液，经步骤G透析后为凝胶过滤预装柱进样，用50~100毫摩尔每升的乙酸-乙酸钠溶液洗脱，洗脱前在该溶液中加入氯化钠，使氯化钠的浓度为0~0.5摩尔每升，洗脱流速每分钟1~2毫升，洗脱时间2~4小时，洗脱后测定每个收集管的酶活力，将有活力的液体全部混合后用于步骤J；

J、真空冷冻干燥。

本发明提供的牛或羊玻璃酸酶的生产方法，利用牛或羊副产品—睾丸作为原料，在生产过程中首先采用酸性缓冲溶液浸提，保护剂的加入可以有效保护酶的活性，并且采用超声波处理，提高了提取效率，缩短了提取时间；其次选用了搅拌透析的方法，大大缩短了透析时间，降低了生产成本；最后利用联合色谱层析技术（离子交换色谱联合凝胶过滤色谱），显著提高了产品纯度。本发明提供的生产工艺所生产的牛或羊玻璃酸酶具有提取效率高、纯度高、性质稳定、生产时间短、变废为宝的特点，在医药和保健品领域具有良好的应用前景。

中国药典2010版规定玻璃酸酶质量指标为：白色至微黄色粉末，无臭，易溶于水，不溶于乙醇、丙酮；酸度在4.5~7.5; 干燥失重＜5.0%；酪氨酸含量＜0.1微克；玻璃酸酶效价≥300单位。

而本发明的产品依据中国药典2010版测定其质量指标为：外观为微黄色粉末，无臭，易溶于水，不溶于乙醇、丙酮；玻璃酸酶效价≥1500单位，酪氨酸含量＜0.1微克，干燥失重＜5.0%，酸度为6.5。

显然，本发明的产品质量指标远远高于国家标准。

具体实施方式

下述实施例中辅料的质量标准为：乙酸钠，白色粉状固体，乙酸钠≥95.0%，分析纯；氯化钠，白色颗粒状固体，氯化钠≥95.0%，分析纯；硫酸铵，白色颗粒状固体，硫酸铵≥95.0%；分析纯；

联合色谱层析系统（PPS-2蛋白纯化系统）：纯化仪控制中心；中低压恒流泵；紫外检测器；电导率检测器；梯度混合器；自动收集器；进样泵；阳离子交换色谱层析预装柱；凝胶过滤色谱层析预装柱；

实施例1：以牛睾丸为原料生产牛玻璃酸酶的方法：

A、原料预处理

牛屠宰后，立即摘下睾丸，清洗干净，去除附属物，剥除外膜，切成块状，在4℃冰箱中冷藏备用；

B、匀浆

经步骤A处理的50千克睾丸与0.1或0.3或0.5摩尔每升的乙酸-乙酸钠溶液混合，料液比为1:5，搅拌均匀后放入组织捣碎机，持续搅拌10分钟，转速为每分钟2000转；

C、超声波浸提

将步骤B处理得到的匀浆液泵入超声波提取机中，在15或30或50千赫兹下超声波浸提15或20或30分钟，浸提后过不低于100目的网筛，得到的沉淀物进行二次提取，浸提步骤为先B后C，合并两次过浸提得到的滤液；

D、搅拌提取

将步骤C得到的滤液泵入搅拌缸中，加入0.1或0.3或0.5摩尔每升的氯化钠，持续搅拌3或4或6小时，搅拌结束后将其转入高速冷冻离心机，在4℃，离心30分钟，转速为每分钟4000转，弃去沉淀后得到玻璃酸酶粗酶液1；

E、硫酸铵除杂

在步骤D得到的粗酶液1中加入固体硫酸铵，添加比例为每升180克，加入时不断搅拌，使硫酸铵完全溶解后静置3小时，然后将含有硫酸铵的粗酶液转入高速冷冻离心机，在4℃，离心30分钟，转速为每分钟6000转，弃去沉淀后得到清液用于步骤F；

F、硫酸铵沉淀

在步骤E得到的清液中加入固体硫酸铵，添加比例为每升380克，加入时不断搅拌，使硫酸铵完全溶解后静置3小时，然后将其转入高速冷冻离心机，离心条件同步骤E，弃去上清液得到含有玻璃酸酶的沉淀；

G、透析

本步骤用到的蒸馏水需要提前预冷，温度为4℃；

将步骤F得到的沉淀用蒸馏水溶解后装入截留分子量为10或12或14 kDa的透析袋中，透析袋两头用棉线扎紧，然后把透析袋固定在透析缸中间的柱子上，透析缸中灌满蒸馏水，使透析袋完全浸没，搅拌2或3或5小时，每隔30分钟更换一次蒸馏水，透析结束后，将透析袋内的沉淀和蒸馏水转入高速冷冻离心机，离心条件同步骤E，弃去沉淀后，将得到的液体过滤，滤膜的孔径为0.2或0.3或0.45微米，得到玻璃酸酶粗酶液2；

H、阳离子交换色谱层析

步骤H和I中用到的联合色谱层析系统主要设备有：纯化仪控制中心、中低压恒流泵、紫外检测器、电导率检测器、梯度混合器、自动收集器、进样泵、预装柱，纯化样品时管路连接顺序为：平衡液或洗脱液→梯度混合器→中低压恒流泵→电导率检测器→预装柱→紫外检测器→自动收集器；

步骤H和I中关键纯化步骤描述如下：

平衡预装柱：将预装柱固定在铁架台上，连接好管路，打开纯化仪所有设备，在控制中心设定好中低压恒流泵的流速，用纯化样品的平衡液或洗脱液流过整个管路，当纯化仪控制中心显示的电导率检测线，pH值检测线，紫外检测线都保持平直1小时后，平衡预装柱完成；

进样：将进样泵与预装柱连接，打开进样泵，设定好进样泵的流速，该流速与中低压恒流泵的流速相同，用平衡液或洗脱液流过进样泵管路，除尽空气后停止泵，样品流过进样泵全部进入预装柱后，断开进样泵和预装柱，将预装柱封口待用；

洗脱：将完成进样的预装柱按照管路连接顺序接好后设定中低压恒流泵的流速、保护压力，梯度洗脱时间和样品采集时间，洗脱缓冲液通过梯度混合器、中低压恒流泵、pH电导检测器之后，进入分离柱开始洗脱样品，被洗脱的液体通过紫外检测器后由自动收集器全部收集；

阳离子交换色谱层析纯化步骤如下：

平衡阳离子交换预装柱，将玻璃酸酶粗酶液2进样后用50或80或100毫摩尔每升的乙酸-乙酸钠溶液洗脱杂质，洗脱20或30或50分钟，洗脱液更换为50或80或100毫摩尔每升的乙酸-乙酸钠溶液，洗脱前在该溶液中加入氯化钠，使氯化钠的浓度为0或0.5或1摩尔每升，洗脱流速每分钟5或9或13毫升，洗脱时间3或5或8小时，洗脱后测定每个收集管的酶活力，将有活力的液体全部混合后备用；

I、凝胶过滤色谱层析

平衡凝胶过滤预装柱，将步骤H得到的混合液，经步骤G透析后为凝胶过滤预装柱进样，用50或70或100毫摩尔每升的乙酸-乙酸钠溶液洗脱，洗脱前在该溶液中加入氯化钠，使氯化钠的浓度为0或0.25或0.5摩尔每升，洗脱流速每分钟1或2毫升，洗脱时间2或4小时，洗脱后测定每个收集管的酶活力，将有活力的液体全部混合后用于步骤J；

J、真空冷冻干燥

将步骤I得到的混合液经步骤G浓缩后置于真空冷冻干燥箱，使真空泵的压力达到300帕、温度在4℃，冷冻干燥10个小时，取出干燥后的玻璃酸酶，将其置于粉碎机中进行粉碎，即得玻璃酸酶；

K、包装

将玻璃酸酶及时包装，于阴凉干燥处保存。

该实施例生产的产品质量指标为：外观为微黄色粉末，无臭，易溶于水，不溶于乙醇、丙酮；玻璃酸酶效价≥1550单位，酪氨酸含量＜0.1微克，干燥失重＜5.0%，酸度为6.5。

实施例2：以羊睾丸为原料生产羊玻璃酸酶的方法：

A、原料预处理

羊屠宰后，立即摘下睾丸，清洗干净，去除附属物，剥除外膜，切成块状，在4℃冰箱中冷藏备用；

辅料质量标准与实施例1相同；

B、匀浆

经步骤A处理的50千克睾丸与0.2或0.4或0.5摩尔每升的乙酸-乙酸钠溶液混合，料液比为1:3，搅拌均匀后放入组织捣碎机，持续搅拌10分钟，转速为每分钟2000转；

C、超声波浸提

将步骤B处理得到的匀浆液泵入超声波提取机中，在20或40千赫兹下超声波浸提10或20分钟，浸提后过不低于100目的网筛，得到的沉淀物进行二次提取，浸提步骤为先B后C，合并两次过浸提得到的滤液；

D、搅拌提取

将步骤C得到的滤液泵入搅拌缸中，加入0.2或0.4摩尔每升的氯化钠，持续搅拌3或4或6小时，搅拌结束后将其转入高速冷冻离心机，在4℃，离心30分钟，转速为每分钟4000转，弃去沉淀后得到玻璃酸酶粗酶液1；

E、硫酸铵除杂

在步骤D得到的粗酶液1中加入固体硫酸铵，添加比例为每升170克，加入时不断搅拌，使硫酸铵完全溶解后静置5小时，然后将含有硫酸铵的粗酶液转入高速冷冻离心机，在4℃，离心30分钟，转速为每分钟6000转，弃去沉淀后得到清液用于步骤F；

F、硫酸铵沉淀

在步骤E得到的清液中加入固体硫酸铵，添加比例为每升350克，加入时不断搅拌，使硫酸铵完全溶解后静置4小时，然后将其转入高速冷冻离心机，离心条件同步骤E，弃去上清液得到含有玻璃酸酶的沉淀；

G、透析

本步骤用到的蒸馏水需要提前预冷，温度为4℃；

将步骤F得到的沉淀用蒸馏水溶解后装入截留分子量为10或14 kDa的透析袋中，透析袋两头用棉线扎紧，然后把透析袋固定在透析缸中间的柱子上，透析缸中灌满蒸馏水，使透析袋完全浸没，搅拌2或4小时，每隔30分钟更换一次蒸馏水，透析结束后，将透析袋内的沉淀和蒸馏水转入高速冷冻离心机，离心条件同步骤E，弃去沉淀后，将得到的液体过滤，滤膜的孔径为0.3或0.4微米，得到玻璃酸酶粗酶液2；

H、阳离子交换色谱层析

步骤H和I中用到的联合色谱层析系统主要设备有：纯化仪控制中心、中低压恒流泵、紫外检测器、电导率检测器、梯度混合器、自动收集器、进样泵、预装柱，纯化样品时管路连接顺序为：平衡液或洗脱液→梯度混合器→中低压恒流泵→电导率检测器→预装柱→紫外检测器→自动收集器；

步骤H和I中关键纯化步骤描述如下：

平衡预装柱：将预装柱固定在铁架台上，连接好管路，打开纯化仪所有设备，在控制中心设定好中低压恒流泵的流速，用纯化样品的平衡液或洗脱液流过整个管路，当纯化仪控制中心显示的电导率检测线，pH值检测线，紫外检测线都保持平直1小时后，平衡预装柱完成；

进样：将进样泵与预装柱连接，打开进样泵，设定好进样泵的流速，该流速与中低压恒流泵的流速相同，用平衡液或洗脱液流过进样泵管路，除尽空气后停止泵，样品流过进样泵全部进入预装柱后，断开进样泵和预装柱，将预装柱封口待用；

洗脱：将完成进样的预装柱按照管路连接顺序接好后设定中低压恒流泵的流速、保护压力，梯度洗脱时间和样品采集时间，洗脱缓冲液通过梯度混合器、中低压恒流泵、pH电导检测器之后，进入分离柱开始洗脱样品，被洗脱的液体通过紫外检测器后由自动收集器全部收集；

阳离子交换色谱层析纯化步骤如下：

平衡阳离子交换预装柱，将玻璃酸酶粗酶液2进样后用40或80毫摩尔每升的乙酸-乙酸钠溶液洗脱杂质，洗脱20或40分钟，洗脱液更换为40或80毫摩尔每升的乙酸-乙酸钠溶液，洗脱前在该溶液中加入氯化钠，使氯化钠的浓度为0或0.5或1摩尔每升，洗脱流速每分钟6或8或10毫升，洗脱时间5或8小时，洗脱后测定每个收集管的酶活力，将有活力的液体全部混合后备用；

I、凝胶过滤色谱层析

平衡凝胶过滤预装柱，将步骤H得到的混合液，经步骤G透析后为凝胶过滤预装柱进样，用60或80毫摩尔每升的乙酸-乙酸钠溶液洗脱，洗脱前在该溶液中加入氯化钠，使氯化钠的浓度为0.25或0.5摩尔每升，洗脱流速每分钟1或2毫升，洗脱时间2或4小时，洗脱后测定每个收集管的酶活力，将有活力的液体全部混合后用于步骤J；

J、真空冷冻干燥

将步骤I得到的混合液经步骤G浓缩后置于真空冷冻干燥箱，使真空泵的压力达到300帕、温度在4℃，冷冻干燥12个小时，取出干燥后的玻璃酸酶，将其置于粉碎机中进行粉碎，即得玻璃酸酶；

K、包装

将玻璃酸酶及时包装，于阴凉干燥处保存。

本发明生产的产品质量指标为：外观为微黄色粉末，无臭，易溶于水，不溶于乙醇、丙酮；玻璃酸酶效价≥1490单位，酪氨酸含量＜0.1微克，干燥失重＜5.0%，酸度为6.5。

以上所述的仅是本发明具体实施例，并不是对本发明的限定。应当指出：对于本领域的技术人员来说，在本发明所提供的技术启示下，做出的其它等同变型和改进都应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种牛或羊玻璃酸酶的生产方法，包括A步骤原料预处理，其特征是还包括以下主要步骤：

B、匀浆

经所述A步骤处理的睾丸与0.1~0.5摩尔每升的乙酸-乙酸钠溶液混合，放入组织捣碎机中，搅拌均匀；

C、超声波浸提

将步骤B处理得到的匀浆液泵入超声波提取机中，在15～55千赫兹下超声波浸提15～30分钟，浸提后过不低于100目的网筛，得到的沉淀物进行二次提取，浸提步骤为先B后C，合并两次浸提得到的滤液；

D、搅拌提取

将步骤C得到的滤液泵入搅拌缸中，加入0.1~0.5摩尔每升的氯化钠，持续搅拌3~6小时，搅拌结束后低温离心，弃去沉淀得到玻璃酸酶粗酶液1；

E、硫酸铵除杂

F、硫酸铵沉淀

G、透析

本步骤用到的蒸馏水需要提前预冷，温度为4℃；

将步骤F得到的沉淀用所述蒸馏水溶解后装入截留分子量为10~14kDa的透析袋，在透析缸中搅拌透析2~5小时，低温离心后将清液过滤，滤膜的孔径为0.2~0.45微米，得到玻璃酸酶粗酶液2；

H、阳离子交换色谱层析

步骤H和I由联合色谱层析系统完成；纯化步骤描述如下：

平衡预装柱：用纯化样品的平衡液或洗脱液通过平衡柱，当电导率检测线，pH值检测线，紫外检测线都保持平直1~2小时后，平衡预装柱完成；

进样：样品由进样泵流入预装柱，进样完成后将预装柱封口待用；

洗脱：设定好色谱层析系统的参数，洗脱缓冲液进入分离柱开始洗脱样品，被洗脱的液体由自动收集器收集；

阳离子交换色谱层析纯化步骤如下：

平衡阳离子交换预装柱，将玻璃酸酶粗酶液2进样后用50~100毫摩尔每升的乙酸-乙酸钠溶液洗脱杂质，洗脱20~50分钟，洗脱液更换为50~100毫摩尔每升的乙酸-乙酸钠溶液，洗脱前在该溶液中加入氯化钠，使氯化钠的浓度为0~1摩尔每升，洗脱流速每分钟5~13毫升，洗脱时间3~8小时，洗脱后测定每个收集管的酶活力，将有活力的液体全部混合后备用；

I、凝胶过滤色谱层析

平衡凝胶过滤预装柱，将步骤H得到的混合液，经步骤G透析后为凝胶过滤预装柱进样，用50~100毫摩尔每升的乙酸-乙酸钠溶液洗脱，洗脱前在该溶液中加入氯化钠，使氯化钠的浓度为0~0.5摩尔每升，洗脱流速每分钟1~2毫升，洗脱时间2~4小时，洗脱后测定每个收集管的酶活力，将有活力的液体全部混合后用于步骤J；

J、真空冷冻干燥。