CN101575628A - 一种茶多糖的分离纯化制备方法及结构鉴定 - Google Patents

Abstract

一种茶多糖的分离纯化制备方法及结构鉴定，其工艺步骤是：原料→高压气流破碎→过筛→微波辅助溶剂萃取→过滤→真空酶提→过滤→滤液(滤渣重复提取的滤液合并)→离心→径向高效色谱分离→超滤→真空浓缩→冷冻干燥→茶多糖TGC，本发明的技术效果是：提高了茶多糖含量及降血糖活性，缩短提取时间、减少能耗、有效保存茶叶多糖生物活性。

Description

一种茶多糖的分离纯化制备方法及结构鉴定

技术领域

本发明涉及一种茶多糖的制备方法，尤其涉及一种茶多糖的分离纯化制备方法及结构鉴定。

背景技术

茶叶是我国的大宗农副产品，现有茶园面积约100万公顷，年产茶叶约60万吨左右，其中约有10万吨左右的粗老茶叶滞消或积压，如果不考虑这些制茶副产品的综合利用，将造成很大的资源浪费和经济损失。自20世纪80年代始，国内外学者对茶叶中所含的多糖复合物进行了大量的研究，发现茶多糖具有增加机体免疫能力、降血糖、降血脂和减少动脉粥样硬化、抗肿瘤、抗辐射及抗炎等多种生物活性。

关于茶多糖提取的专利报道近年来主要有：张效林“一种从茶叶中提取茶多酚副产咖啡碱和茶多糖的方法”(申请号200510042629.3)，李永泉“从提取过茶多酚的下脚料中提取茶多糖的方法”(申请号03114898.0)，汪叔雄“在茶叶中提取茶多酚及其副产品的方法”(申请号96113134.9)，严良荣“粗、老茶鲜叶提取多糖、多酚混晶工艺方法”(申请号97109115.3)，黄宝生“茶多糖的提取方法”(申请号01134065.7)，惠永正“纯化茶多糖及提成方法”(申请号02110999.0)，江和源“从茶叶中综合提取茶多糖、茶多酚、茶氨酸、咖啡碱的方法”(申请号200410015905.2)，汪东风“茶叶中有效成分综合制备工艺”(申请号200310114694.3)，张守政“从茶叶中提取茶多酚、茶氨酸、茶多糖、茶色素的方法”(申请号200610055145.7)，杨红武“一种茶多糖及其制备方法和用途”(申请号200610125174.6)，这些专利报道极大的丰富了茶多糖提取纯化手段，但并没有从茶叶提取物中纯化出一种单一组分。

本发明的特色在于从茶叶中茶多糖提取工艺中提高提取率、缩短提取时间、减少能耗、有效保存茶叶多糖生物活性等目的，并且纯化得到一个多糖和蛋白的缀合物组分(Tea Glycocongujate，TGC)，并且对该组分的理化性质、分子量、氨基酸组成、单糖组成、一级结构和溶液中的构象等进行了系统的分析鉴定。

发明内容

本发明的目的在于提供一种茶多糖的分离纯化制备方法及结构鉴定，该方法缩短提取时间、减少能耗、有效保存茶叶多糖生物活性。

本发明是这样实现的，其工艺步骤是：

1、原料：以粗老茶叶、低档茶叶或提取茶多酚后的茶叶废渣为原料；

2、高压气流破碎：将原料经50-60℃干燥、-40℃冷冻等预处理后，气流式超微粉碎对原料进行处理，其主要是通过气流的冲击、剪切、碰撞和摩擦对物料进行粉碎，要求气源压力为5MPa，粉碎压力为3-5MPa，从而使原料等活性成分的溶出量提高、粉体粒度减小，以改善原料中茶多糖提取过程中得率低等问题。

3、过筛：高压气流破碎后的原料进行分级过筛40-80目；

4、微波辅助溶剂萃取：采用微波提取主要使原料细胞内温度迅速上升，细胞内液水份汽化产生的压力使细胞膜和细胞壁急剧破碎，形成微小的孔洞，使可溶性物质快速溶出。微波辅助溶剂萃取最佳工艺条件为微波时间75秒，微波强度100％，固液比1∶15；

5、真空酶提：采用Cellubrix^TML纤维素酶(含纤维素酶1500NCU/mL、纤维二糖酶25CbU/mL)，

耐温α-淀粉酶，为保持茶多糖的活性，采用真空低温水提、酶提二次结合法提取茶多糖。第一次在50℃、固液比1∶15、水提取30min，多糖提取率为2.33％，粗多糖(干重)的提取率为6.82％。过滤后，滤渣用pH4.6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液加纤维素酶提取，酶提最佳工艺参数为55℃、固液比1∶14、酶用量2.2μL/g茶叶，120min；

6、径向高效色谱分离：多糖的凝胶柱纯化：将制备的初步纯化茶多糖溶解于蒸馏水中(或直接用不经干燥的提取液)。过SephadexG100凝胶柱(2.6×70cm)。用10ml进样器逐滴将样液加入柱中，以0.1mol/L NaCl洗脱，流速1.5mL/min，自动分部收集仪每6min收集一管。逐管检测A_280nm(蛋白质吸收峰)、A₆₂₀(多糖的蒽酮硫酸衍生物的吸收峰)。收集含糖部分，浓缩，备用。Sephadex G 100凝胶湿法装柱：取一定量的Sephadex G100凝胶，置于烧杯中，加入足量的蒸馏水浸泡，在100℃水浴中溶胀5到6小时，取出冷却后，于室温放置24小时继续溶胀。溶胀结束后，倾去表面的悬浮物，超声波脱气，即可装柱。本专利采用的是聚四氟乙烯的专用层析柱，在柱中加蒸馏水至一定高度，通过漏斗从柱的顶部将溶胀的凝胶加入柱中，同时柱的底部放水，边加边敲打柱身，直至填柱完成，注意要保持凝胶界面始终处在水面以下。装柱完成后，先用蒸馏水平衡一天，最后用洗脱液平衡，平衡时流速小于洗脱流速。HPLC鉴定纯度及其色谱条件的摸索：HPLC分析时，采用手动进样，每次进样量为20μL，洗脱流速为0.5mL/min。样品溶液和洗脱液分别用0.80μm和0.45μm的滤膜过滤。

7、超滤：选用中空纤维材料，工作压力为28psi，料液温度为29℃，料液pH为6.7，超滤处理40min，膜的渗透通量达最佳值为9.98LHM；

8、冷冻干燥：冷冻干燥条件：-80℃预冻8hr后，-80℃真空冷冻干燥6小时。，

在本发明中，蛋白质含量测定方法如下：

实验使用了两种方法来测定TGC中的蛋白质含量：(1)标准曲线法：以牛血清蛋白为标样，配制成1mg/mL的溶液，间隔吸取一定体积标液于25mL容量瓶中定容，测定各浓度下标液在280nm处的吸光度，作出工作曲线，得方程，同样测定样品在280nm处的吸收值，代入方程计算样品蛋白含量。(2)仪器分析：元素分析仪测定N含量，再乘以6.25，即为蛋白质含量。

在本发明中，氨基酸组成分析如下：

取TGC 3mg，加6mol/L的HCl 5ml，脱气、封管，放入110℃的恒温箱中保温24小时后，取出干燥，然后用0.02mol/L的HCl 0.5ml溶解，离心，取上清液用氨基酸自动分析仪测定。

在本发明中，糖醛酸含量的测定如下：

硫酸-咔唑试剂的配制：取40mg的咔唑，溶于80mL的含0.02mol四硼酸钠的浓硫酸中，避光保存(用时临时配制)。

配半乳糖醛酸标准液0.985mg/mL，取间隔体积标液于25mL容量瓶中定容，从中取1mL液，加入8mL的硫酸-咔唑试剂于具塞试管中，加塞混均后，100℃保温45分钟，冷却至室温，在530nm处测吸光度，以浓度对A作图，得工作曲线和方程。样液同上处理，通过A值计算糖醛酸含量。

在本发明中，茶多糖氨基酸组成如下：

茶多糖的盐酸消解产物，经氨基酸自动分析仪分析检测到17种氨基酸(其中色氨酸由于样品量少而未检测)，列于表3。

表3 Amino Acids and Content of TGC’Protein Part

TGC中，含有17种氨基酸，其中天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)含量高，其总和占了氨基酸总量的43％，胱氨酸(Cys)、蛋氨酸(Met)、组氨酸(His)含量最低，均小于3％，没有检测到天冬酰胺(Asn)和谷酰胺(Gln)，而糖蛋白的N-糖肽连接方式中，必须是Asn和糖链结合，这样就暗示了TGC的糖链和蛋白链可能是以“O-”的方式连接。

在本发明中，图1为混合的标准单糖衍生物的GC-MS分析结果：

多组分共存时，它们的出峰时间和单个组分单独出峰时间会有不同。结果见图1和表1。

表1 MS Signal and Retention Time of Each Monosaccharide Derivative

结果表明，在选定的色谱条件下，六种单糖标准样得到了有效的分离。混合物中各单糖衍生物的出峰时间与单糖独自进样时有差异，六碳糖的差异较为明显，出峰时间延长。

在本发明中，图2为茶多糖的单糖GC-MS分析：

茶多糖经硫酸完全水解后的单糖产物(混合物)进一步制备成糖腈乙酰酯衍生物，对其进行GC-MS分析，图2出现六个峰，各个组分的出峰时间及质谱信号列于表2。

表2 MS Signal，Retention Times and Intensity of Each MonosaccharideDerivative of TGC

将表2结果与表1比较，可明显得出结论：茶多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成。该结果表明多糖蛋白复合物TGC的多糖部分系杂多糖。

在本发明中，茶多糖的一级结构及其在溶液中的构象研究如下：

高碘酸氧化和Smith降解反应：

取6ml的TGC水溶液(约5mg/mL)于容量瓶，加入25mL 0.05mol/L的NaIO₄溶液中，加乙酸调pH值为4，混匀，用超纯水定容至50mL，避光于5℃反应，间隔24小时取样5μL，HPLC分析，不接分离柱，以超纯水洗脱进入DAD检测器，在223nm处测定吸收值。待吸收值稳定后，用乙二醇2mL，振荡以还原剩余的NaIO₄，反应体系用0.01mol/L的NaOH滴定法来计算体系中的HCOOH的生成量。

取20mL的TGC水溶液(约5mg/mL)于容量瓶，加入40mL0.05mol/L的NaIO₄溶液中，加乙酸调pH值为4，混匀，用超纯水定容至80mL，避光于5℃反应，间隔24小时取样5μL，HPLC分析，不接分离柱，以30％乙腈-水洗脱进入DAD检测器，在223nm处测定吸收值。待吸收值稳定后，用乙二醇4mL，振荡以还原剩余的NaIO₄，透析48小时，透析液真空浓缩至50mL，接着加入50mg的KBH₄，在磁力搅拌器上避光反应15小时，然后加入0.1mol/L的乙酸调pH值到5.5，以分解剩余过量的KBH₄，透析48小时，透析液真空浓缩，干燥。取干燥产物20mg，用5mL 3mol/L的硫酸水解，控制反应温度为110℃，时间8hr。水解结束后，用碳酸钡中和反应液至中性，过滤，滤渣用超纯水洗涤，合并滤液和洗液，真空浓缩，干燥得降解产物。

Smith降解产物以盐酸羟胺-乙酸酐方法衍生，单糖标样和丙三醇及丁四醇标样同法衍生。衍生产物用GC-MS仪分析。分离柱采用PET柱(SUPERCO 24135-U，30m×0.25mm×0.25μm)。

部分酸水解：

取10mg TGC干燥样，用3mL 0.1mol/L的硫酸溶解，在90℃水浴中水解2小时，冷却后离心，滤液调pH至中性，加入3倍体积的无水乙醇醇析，冰箱中静置过夜，次日离心得沉淀和上清液，上清液浓缩干燥备用。

沉淀用3mol/L的硫酸100℃水解8小时，碳酸钡中和，过滤，合并滤液和洗液，干燥备用。上清固体和沉淀水解固体样，盐酸羟胺-乙酸酐法衍生，产物经GC-MS分析。单糖混标同法衍生。

NMR分析：

TGC用重水溶解，浓度为2mg/mL。核磁共振仪分析。条件列于表4

表4 Parameters of NMR Analysis

¹H-NMR主要是解决多糖结构中糖苷键构型的问题。通常α型糖苷C-1质子的δ会超过5×10^-6，而β型则小于5×10^-6。茶多糖TGC经重水交换后，¹H-NMR谱如图3

图中最左边的一簇峰是TGC的异头碳(C-1)的信号，它们的化学位移δ小于5×10^-6，说明TGC中的糖苷是以β-型存在，C2-C6的信号出现在4-3×10^-6位置，互相交叉重叠。

在本发明中，CD色谱分析如下：

实验分别对TGC和TGC与刚果红的络合物进行了CD谱分析，取10mL TGC水溶液，定容于50mL的容量瓶中；另取10mL TGC水溶液，加4mL0.2mmol/L的刚果红溶液，加25mL 0.1mol/L的NaOH，定容于50ml的容量瓶中。CD测定条件列于表5。结果如图4，图5所示。

表5 Parameters of CD Analysis

TGC由于是中性多糖，所以其CD谱中缺乏明显的CD信号(Fig 15)。当TGC与刚果红络合后，此络合物的CD谱在270nm附近有正Cotton效应，表明TGC确以有序的结构与刚果红形成络合物；在226nm处有负的Cotton效应，结合各方实验结果，表明TGC在水溶液中为有序的螺旋结构。

在本发明中，光谱扫描实验如下：

在碱性溶液中，刚果红与具有螺旋构象的多糖可以形成络合物，络合物的最大吸收波长较刚果红移向长波。本发明将刚果红和浓度为0.1mol/L的NaOH溶液加入TGC溶液，Beckman DU 7400紫外可见分光光度仪自动扫描，扫描范围200-800nm。对刚果红空白(含0.1mol/L的NaOH)及TGC和刚果红的混合物(含0.1mol/L的NaOH)分别进行了扫描，扫描范围从200nm到800nm，结果如图6所示。

结果表明，刚果红的最大吸收出现在230nm附近，当加入TGC后，混合体系的最大吸收波长出现在490nm附近，说明刚果红与茶多糖TGC发生了络合反应，这暗示TGC在溶液中呈现螺旋构象。

本发明的技术效果是：提高了茶多糖含量及降血糖活性，提高茶多糖提取率、缩短提取时间、减少能耗、有效保存茶叶多糖生物活性。

附图说明

图1为混合的标准单糖衍生物的GC-MS分析结果。

图2为茶多糖的单糖GC-MS分析。

图3为茶多糖的¹H-NMR谱图。

图4为茶多糖的CD色谱分析。

图5为茶多糖与刚果红的络合物的CD色谱分析。

图6为刚果红空白及茶多糖和刚果红的混合物分别进行的光谱扫描结果。

具体实施方式

实施例1：

将粗老茶叶经50℃干燥、-40℃冷冻等预处理后，气流式超微粉碎对茶叶进行处理，称取40目茶粉100g，微波辅助溶剂萃取，微波时间75秒，微波强度100％，固液比1∶15，双层滤布过滤，①滤渣用热蒸馏水洗涤，合并滤液与洗涤液，得到提取液I；②滤渣用热蒸馏水洗涤，滤渣加pH4.6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，加一定量酶，水浴加热水解，调pH值至中性抑酶，双层滤布过滤，滤渣用热蒸馏水洗涤，合并滤液与洗涤液，得提取液II。

将提取液I和II分别离心，真空浓缩至一定体积，加入无水乙醇，低温过夜醇沉，将乙醇沉淀液离心分离，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤两次，得茶叶粗多糖I(水提)和II(酶提)。

将制备的初步纯化茶多糖溶解于蒸馏水中(或直接用不经干燥的提取液)。过Sephadex G100凝胶柱(2.6×70cm)。用10ml进样器逐滴将样液加入柱中，以0.1mol/L NaCl洗脱，流速1.5mL/min，自动分部收集仪每6min收集一管。逐管检测A_280nm(蛋白质吸收峰)、A₆₂₀(多糖的蒽酮硫酸衍生物的吸收峰)。收集含糖部分，浓缩，备用。

取一定量的Sephadex G100凝胶，置于烧杯中，加入足量的蒸馏水浸泡，在100℃水浴中溶胀5到6小时，取出冷却后，于室温放置24小时继续溶胀。溶胀结束后，倾去表面的悬浮物，超声波脱气，即可装柱。实验采用的是聚四氟乙烯的专用层析柱，在柱中加蒸馏水至一定高度，通过漏斗从柱的顶部将溶胀的凝胶加入柱中，同时柱的底部放水，边加边敲打柱身，直至填柱完成，注意要保持凝胶界面始终处在水面以下。装柱完成后，先用蒸馏水平衡一天，最后用洗脱液平衡，平衡时流速小于洗脱流速。

实施例2

将粗老茶叶经60℃干燥、-40℃冷冻等预处理后，气流式超微粉碎对茶叶进行处理，称取40目茶粉50g，微波辅助溶剂萃取，微波时间75秒，微波强度100％，固液比1∶15，双层滤布过滤，①滤渣用热蒸馏水洗涤，合并滤液与洗涤液，得到提取液I；②滤渣用热蒸馏水洗涤，滤渣加pH4.6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，加一定量酶，水浴加热水解，调pH值至中性抑酶，双层滤布过滤，滤渣用热蒸馏水洗涤，合并滤液与洗涤液，得提取液II。

将提取液I和II分别离心，真空浓缩至一定体积，加入无水乙醇，低温过夜醇沉，将乙醇沉淀液离心分离，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤两次，得茶叶粗多糖I(水提)和II(酶提)。

将制备的初步纯化茶多糖溶解于蒸馏水中(或直接用不经干燥的提取液)。过Sephadex G100凝胶柱(2.6×70cm)。用10ml进样器逐滴将样液加入柱中，以0.1mol/L NaCl洗脱，流速1.5mL/min，自动分部收集仪每6min收集一管。逐管检测A_280nm(蛋白质吸收峰)、A₆₂₀(多糖的蒽酮硫酸衍生物的吸收峰)。收集含糖部分，浓缩，备用。

取一定量的Sephadex G100凝胶，置于烧杯中，加入足量的蒸馏水浸泡，在100℃水浴中溶胀5到6小时，取出冷却后，于室温放置24小时继续溶胀。溶胀结束后，倾去表面的悬浮物，超声波脱气，即可装柱。实验采用的是聚四氟乙烯的专用层析柱，在柱中加蒸馏水至一定高度，通过漏斗从柱的顶部将溶胀的凝胶加入柱中，同时柱的底部放水，边加边敲打柱身，直至填柱完成，注意要保持凝胶界面始终处在水面以下。装柱完成后，先用蒸馏水平衡一天，最后用洗脱液平衡，平衡时流速小于洗脱流速。

Claims (3)

1、一种茶多糖的分离纯化制备方法，其特征在于按下述方法制备：

(1)原料：以粗老茶叶、低档茶叶或提取茶多酚后的茶叶废渣为原料；

(2)高压气流破碎：将原料经50-60℃干燥、-40℃冷冻等预处理后，气流式超微粉碎对原料进行处理，其主要是通过气流的冲击、剪切、碰撞和摩擦对物料进行粉碎，要求气源压力为5MPa，粉碎压力为3-5MPa，从而使原料等活性成分的溶出量提高、粉体粒度减小，以改善原料中茶多糖提取过程中得率低等问题；

(3)过筛：高压气流破碎后的原料进行分级过筛40-80目；

(4)微波辅助溶剂萃取：采用微波提取主要使原料细胞内温度迅速上升，细胞内液水份汽化产生的压力使细胞膜和细胞壁急剧破碎，形成微小的孔洞，使可溶性物质快速溶出，微波辅助溶剂萃取最佳工艺条件为微波时间75秒，微波强度100％，固液比1∶15；

(5)真空酶提：采用纤维素酶，耐温α-淀粉酶，为保持茶多糖的活性，采用真空低温水提、酶提二次结合法提取茶多糖，第一次在50℃、固液比1∶15、水提取30min，茶多糖提取率为2.33％，粗茶多糖的提取率为6.82％，以干重计，过滤后，滤渣用pH4.6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液加纤维素酶提取，酶提最佳工艺参数为55℃、固液比1∶14、酶用量2.2μL/g茶叶，120min；

(6)径向高效色谱分离：茶多糖的凝胶柱纯化：将制备的初步纯化茶多糖溶解于蒸馏水中，过Sephadex G100凝胶柱，用10ml进样器逐滴将样液加入柱中，以0.1mol/L NaCl洗脱，流速1.5mL/min，自动分部收集仪每6min收集一管，逐管检测A_280nm、A₆₂₀，收集含糖部分，浓缩，备用，Sephadex G 100凝胶湿法装柱：取一定量的Sephadex G100凝胶，置于烧杯中，加入足量的蒸馏水浸泡，在100℃水浴中溶胀5到6小时，取出冷却后，于室温放置24小时继续溶胀，溶胀结束后，倾去表面的悬浮物，超声波脱气，即可装柱，本专利采用的是聚四氟乙烯的专用层析柱，在柱中加蒸馏水至一定高度，通过漏斗从柱的顶部将溶胀的凝胶加入柱中，同时柱的底部放水，边加边敲打柱身，直至填柱完成，注意要保持凝胶界面始终处在水面以下，装柱完成后，先用蒸馏水平衡一天，最后用洗脱液平衡，平衡时流速小于洗脱流速。HPLC鉴定纯度及其色谱条件的摸索：HPLC分析时，采用手动进样，每次进样量为20μL，洗脱流速为0.5mL/min。样品溶液和洗脱液分别用0.80μm和0.45μm的滤膜过滤；

(7)超滤：选用中空纤维材料，工作压力为28psi，料液温度为29℃，料液pH为6.7，超滤处理40min，膜的渗透通量达最佳值为9.98LHM；

(8)冷冻干燥：冷冻干燥条件，-80℃预冻8hr后，-80℃真空冷冻干燥6小时。

2、如权利要求1所述的一种茶多糖的分离纯化制备方法及结构鉴定，其特征是，所得到的茶多糖，含有17种氨基酸，分别为：天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸，红外光谱证明了TGC是多糖和蛋白的缀合物。

3、如权利要求1所述的一种茶多糖的分离纯化制备方法及结构鉴定，其特征在于本发明制备的茶多糖的分子量为58884道尔顿。

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