CN104341539B - 一种酶法结合膜技术一步制备精品肝素钠的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从猪小肠粘膜中提取肝素钠的方法，以新鲜猪小肠粘膜为原料，各物质的加入量以小肠粘膜用量为基准。方法是：将新鲜的猪小肠粘膜进行预处理，之后通过碱提和酶解的办法分解和肝素结合在一起的蛋白，利用肝素和其它杂质的分子量差别将酶解液离心后得到的清液采用膜技术除去溶解在里面的多肽、核酸等杂质，膜处理过的液体，采用肝素钠不溶于乙醇的特点进行醇沉处理，得到的沉淀干燥后得到产品肝素钠。本发明充分利用禽内脏资源，生产具有高附加值的产品，工艺简单易行，适合于工业化生产。得到的肝素钠效价150u/mg，其分子量主要分布在200～1000Dal之间。

Description

一种酶法结合膜技术一步制备精品肝素钠的方法

技术领域

本发明涉及一种对猪小肠粘膜进行精深加工的方法，主要涉及一种以猪小肠粘膜为原料，利用生物技术制备精品肝素钠的方法。本发明采用生物酶法与膜分离技术相结合，一步制备高质量的精品肝素钠，避开传统工艺先制备粗品，再以粗品为原料制备精品的繁琐工艺。

背景技术

我国猪小肠资源丰富，肠粘膜又是生产肠衣的废弃物，而肝素含量甚高，所以我国主要从猪小肠粘膜中提取肝素钠。

肝素广泛存在于哺乳动物的各种器官组织中，是一类由结缔组织的肥大细胞产生的粘多糖物质。在自然界中广泛分布在猪、牛、狗等哺乳动物的内脏和肠粘膜中。肝素主要是由D-葡糖胺，L-艾杜糖醛酸，N-乙酰葡萄糖胺及D-葡糖醛酸交替组成的粘多糖硫酸酯，分子量分布在6000～20000。为白色或类白色粉末，无毒无味，有吸湿性。肝素通常以钠盐的形式存在，称为肝素钠（Heparin Sodium）或肝素钙，在使用中尤以肝素钠为主。肝素及其钠盐易溶于水，不溶于乙醇、丙酮、二氧六环等有机溶剂，分子结构单元中含有5个硫酸基和2个羟基，呈强酸性，为聚阴离子，能与阳离子发生反应生成盐。游离酸在乙醚中有一定的溶解度。肝素钠是肝素以钠盐的形式被提取出来，并制成药用制剂。实际上产生药效的是肝素，肝素具有抗凝血作用，是一种应用已久的抗凝血剂。把肝素制成合适的钠盐能便于他的保存，制剂和使用，使其不至于在一定时期内失去活性和药效。

研究肝素钠提取工艺基于以下几点：第一，肝素首先从新鲜的健康生猪的小肠粘膜中提取并制成肝素粗品，肝素粗品中含有病毒及蛋白质，不能直接应用于临床治疗，需进一步提纯以制成肝素原料药，而在我国肝素钠行业，精品制作只掌握在少数一两家企业手中，大部分是以家庭式的作坊为主制作粗品肝素钠，这种方法制得的肝素钠效价低，并且生产过程产生的废水气味难闻，污染大。第二，肝素钠作为一种抗凝血的药物，由于其利润十分的可观，近年来同行业的竞争越来越大。生产精品肝素的专利年限即将到期，而同时仿制药已经在美国上市，出口价必将下降；第三，肝素钠行业产品利润分配极其不均匀，肝素钠的精品和粗品价格相差甚远，精品大多由国外生产，国内精品的生产技术只掌握在如海普瑞等少数厂家手中。而肝素钠的粗品市场很混乱，主要以作坊式的生产方式为主，品质和来源的稳定性不好控制。

发明内容

为了克服现有工艺的问题和缺陷，充分利用动物内脏资源，本发明提供一种从猪小肠粘膜中提取肝素钠的方法。以猪小肠粘膜为原料，采用生物提取技术及膜分离技术生产肝素钠。

本发明的目的可以通过下述技术方案来实现：

1、一种酶法结合膜技术一步制备精品肝素钠的方法，其特征在于按以下步骤进行：

a、将新鲜的猪小肠粘膜按其比重加入0.5倍的水，调节pH为7.0~7.5，置于98℃的水浴锅中，待料液温度上升到95℃时保温30min；

b、将a步骤得到的料液快速降温至50℃左右，调节pH为10.0左右，置于50℃的水浴锅中碱提搅拌2h；

c、将b步骤中得到的碱提液加入水解蛋白复合酶，在温度为55℃的水浴锅中搅拌酶解2h；

d、将c步骤中的酶解液冷却至室温，调节pH为6.5，静置3h以上，离心，得到沉淀和清液；

e、将d步骤中清液升温至30℃，经过压力为0.2～0.25MPa，温度为40～50℃，流量为90L/min条件下的微滤膜进行除杂，得到微滤膜滤液；

f、将e步骤中的透过液经过压力为1.5～2MPa，温度为40～50℃，流量为20L/min的纳滤膜进行浓缩，得到纳滤膜浓缩液，浓缩液即为除去大部分杂质的肝素钠溶液；

g、将f步骤中得到的浓缩液调节pH为10.0左右，加入20%的乙醇搅拌，静置6h以上，然后过滤，收集滤液。

h、将g步骤中的滤液调节pH为6.5，补加浓缩液130%的乙醇，搅拌，静置2h，虹吸出上层清液，沉淀烘干即得产品肝素钠。

所述步骤a的操作是将肠粘膜中的蛋白质变性，有利于下一步的酶解，同时使肠粘膜中的肝素酶失活，避免下一步提取过程中肝素过早的分解。

所述步骤b中的调节pH值至10.0是为了将肝素与蛋白拆分。

所述步骤c中的酶解是为了使蛋白水解成多肽。

所述步骤e中的微滤膜除杂，为了截留杂质、纤维和大分子蛋白等。

所述步骤f中的纳滤膜浓缩，其浓缩倍数为10倍左右，也为后续干燥减轻负担。

本发明与已有工艺相比，具有以下优点：

本发明采用生物酶法与膜分离技术相结合，一步制备高质量的精品肝素钠，避开传统工艺先制备粗品，再以粗品为原料制备精品的繁琐工艺。

本发明采用的膜浓缩工艺其滤液基本无杂质，COD＜300mg/L。可回用于碱溶工序，既可节约水资源，又不产生污水，符合清洁生产的要求。

本发明得到的肝素钠的外观为白色粉末，效价为150u/mg，其分子量主要分布在6000～20000Dal之间。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的说明：

实施例1：

取新鲜肠粘膜500g，加入250ml的纯水，搅拌均匀，调节pH为7.5，置于95℃的水浴锅中变性，待温度上升至90℃后，保温30min。变性完毕后，置于冷水浴中迅速降温至50℃，调节pH为10.0，置于55℃的水浴锅中碱提搅拌2h，碱提结束后，水浴温度继续为55℃，加入复合酶，搅拌酶解2h，酶解时维持整个酶解过程中的pH为9.0。酶解结束后将料液降至室温，调节pH为6.5，搅拌10min，置于冷水浴中静置3h，4000r/min的低温（5℃）离心机中离心15min。收集离心所得清液。将清液温度升至30℃，经过微滤膜进行除杂，操作条件为压力为0.2MPa，温度为30℃，流量为90L/min，得到浓缩液和滤液；滤液再用纳滤膜进行浓缩，操作条件为压力为1.5MPa，温度为40℃，流量为20L/min；再将浓缩液，加入150%的乙醇搅拌30min，静置2d，虹吸出上层液体，下层沉淀进行冷冻干燥，得到肝素钠产品。

实施例2：

取新鲜肠粘膜2kg，加入1000ml的纯水，搅拌均匀，调节pH为7.5，置于95℃的水浴锅中变性，待温度上升至90℃后，保温30min。变性完毕后，置于冷水浴中迅速降温至50℃，调节pH为10.0，置于55℃的水浴锅中碱提搅拌2h，碱提结束后，水浴温度继续为55℃，加入复合酶，搅拌酶解2h，酶解时维持整个酶解过程中的pH为9.0。酶解结束后将料液降至室温，调节pH为6.5，搅拌10min，置于冷水浴中静置3h，4000r/min的低温（5℃）离心机中离心15min。收集离心所得清液。将清液温度升至30℃，经过微滤膜进行除杂，操作条件为压力为0.2MPa，温度为30℃，流量为90L/min，得到浓缩液和滤液；滤液再用纳滤膜进行浓缩，操作条件为压力为1.5MPa，温度为40℃，流量为20L/min；再将浓缩液，加入150%的乙醇搅拌30min，静置2d，虹吸出上层液体，下层沉淀进行冷冻干燥，得到肝素钠产品。

Claims (4)

1.一种酶法结合膜技术一步制备精品肝素钠的方法，其特征在于：采用生物酶法与膜分离技术相结合，一步制备高质量的精品肝素钠，避开传统工艺先制备粗品，再以粗品为原料制备精品的繁琐工艺，以新鲜的猪小肠粘膜为原料，按其比重加入一定量的水，调节 pH 碱提搅拌；得到的碱提液加入蛋白水解复合酶加热搅拌酶解 ；酶解液冷却至室温，调节 pH 离心得到沉淀和清液；清液微滤膜进行除杂，纳滤膜浓缩，浓缩液即为肝素钠溶液；将肝素钠溶液调节pH并加入乙醇搅拌，沉淀，过滤，收集滤液；滤液调节pH补加乙醇，搅拌，静置取上层清液，沉淀烘干即得产品肝素钠。

2.根据权利要求 1 所述的制备精品肝素钠的方法，其特征在于：碱提过程中调 pH 为7.0~7.5，温度 95℃时浸提30min；再调pH为10.0，温度50℃碱提2h。

3. 根据权利要求 1 所述的制备精品肝素钠的方法，其特征在于：酶解过程为碱提完成后进行，在温度为55℃下加入水解蛋白复合酶酶解2h。

4. 根据权利要求 1 所述的制备精品肝素钠的方法，其特征在于：膜处理过程中经过压力为0.2～0.25MPa，温度为30～50℃，流量为90L/min条件下的微滤膜进行除杂；经过压力为1.5～2MPa，温度为40～50℃，流量为20L/min的纳滤膜进行浓缩，避免了使用离子交换树脂，节省了制备肝素钠的时间。